Wykrywanie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi

Summary

Jako przykład opisujemy protokół wykrywania wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi za pomocą wiązania receptora sortującego, sortyliny, z pierwszą pętlą luminalną białka transportera glukozy, GLUT4.

Abstract

Nasza zdolność do badania interakcji białko-białko jest kluczem do zrozumienia połączeń regulacyjnych w komórce. Jednak wykrycie interakcji białko-białko w wielu przypadkach wiąże się z poważnymi wyzwaniami eksperymentalnymi. W szczególności receptory sortujące oddziałują ze swoim ładunkiem białkowym w świetle przedziałów błonowych, często w sposób wrażliwy na detergenty, co sprawia, że koimmunoprecypitacja tych białek jest bezużyteczna. Wiązanie sortyliny receptora sortującego z transporterem glukozy GLUT4 może służyć jako przykład słabych oddziaływań luminalnych między białkami błonowymi. W tym miejscu opisujemy szybki, prosty i niedrogi test do walidacji interakcji między sortyliną a GLUT4. W tym celu zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy chemicznie peptyd znakowany myc, odpowiadający potencjalnemu epitopowi wiążącemu sortylinę w części świetlnej GLUT4. Sortylina oznaczona sześcioma histydynami ulegała ekspresji w komórkach ssaków i izolowana z lizatów komórkowych za pomocą kulek kobaltowych. Sortylinę unieruchomioną na kulkach inkubowano z roztworem peptydu o różnych wartościach pH, a wymyty materiał analizowano metodą Western blot. Test ten można łatwo dostosować do badania innych wrażliwych na detergenty interakcji białko-białko.

Introduction

GLUT4 to białko transportujące glukozę, które ulega ekspresji głównie w komórkach tłuszczowych i mięśni szkieletowych, gdzie pośredniczy w wpływie insuliny na poposiłkowy poziom glukozy we krwi¹. Będąc bardzo stabilnym białkiem, GLUT4 jest regulowany na poziomie potranslacyjnym. W przypadku braku insuliny, GLUT4 jest w dużej mierze wykluczony z błony plazmatycznej (stąd niska podstawowa przepuszczalność glukozy) i jest zlokalizowany głównie wewnątrz komórki w małych pęcherzykach reagujących na insulinę (IRV) i sieci trans-Golgiego (TGN), która prawdopodobnie reprezentuje przedział dawcy IRV. Po podaniu insuliny IRV łączą się z błoną plazmatyczn....

Protocol

1. Obchodzenie się z peptydem

1. Projektowanie i zamawianie peptydu
   1. Wybierz żądaną sekwencję peptydu i dodaj znacznik, taki jak epitop myc (EQKLISEED) na jego końcu N lub C.
   2. Sprawdź przewidywaną rozpuszczalność peptydu w wodzie, korzystając z kalkulatora rozpuszczalności peptydów http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Jeśli rozpuszczalność jest niska, spróbuj dodać kolejny rozpuszczalny w wodzie znacznik, aby zmienić równowagę ładunku.
      UWAGA: Użyliśmy peptydu odpowiadającego pierwszej pętli świetlnej (fll) GLUT4 oznaczonej epitopem myc (pogrubiona czcionka) na końcu N (Myc-fll-GLUT4): EQKLISEEDLNA....

Results

Lizaty zostały przygotowane z komórek 3T3 L1 stabilnie transfekowanych Sortilin-myc/His⁵ oraz z komórek WT 3T3 L1, użytych jako kontrola negatywna. Oba lizaty inkubowano z kulkami kobaltu o pH 6 lub pH 8 i dokładnie myto. Koraliki z unieruchomionymi białkami inkubowano następnie w roztworze Myc-fll-Glut4. Po dokładnym przemyciu, białka związane z kulkami eluowano 0,25 M Imidazolem. Próbki poddano, wraz z oryginalnymi lizatami, SDS-PAGE w żelu o 10-20% gradiencie tr.......

Discussion

Sortylina jest ewolucyjnie konserwatywnym receptorem białkowym wieloligandowym, który bierze udział zarówno w sygnalizacji na błonie plazmatycznej, jak i w wewnątrzkomórkowych zdarzeniach sortowania ^6,7. Jednak poszukiwanie autentycznych ligandów sortyliny (z których część jest białkami luminalnymi lub integralnymi białkami błonowymi) jest skomplikowane, ponieważ interakcja sortyliny z niektórymi z jej partnerów wiążących wydaje się być wrażliwa na detergenty. W .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma	P8849	do stosowania w oczyszczaniu białka znacznika histydyny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Corning	21-040-CV	PBS
1mL Strzykawka insulinowa U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Zestaw do oznaczania białek	Pierce	23228
Bufor do płukania	Boston BioProducts	BP-234	Do oczyszczania białek His-tag
Żywica kobaltowa	HisPur Thermo Scientific	89964
Bufor do próbki tricine	Bio-Rad	161-0739	z SDS, należy dodać bMerkaptaetanol
Elucja  Bufor	Boston BioProducts	BP-236	Do oczyszczania białka His-tag za pomocą 250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine prefabrykowane żele 10-20%	Bio-Rad	456-3115	Do separacji peptydu i małego białka
Tris/Tricine/SDS bufor do biegania	Bio-Rad	161-0744
Bufor transferowy	Boston BioProducts	BP-190	Dodaj 20% metanolu
Membrana nitrocelulozowa  0,45 mm	Bio-Rad	1620115
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A9647	BSA Przeciwciało
anty Myc	Sygnalizacja komórkowa	2272
Peptyd	królika Genscipt		Dostosuj zamówienie
Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374