Wykrywanie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi

Podsumowanie

Jako przykład opisujemy protokół wykrywania wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi za pomocą wiązania receptora sortującego, sortyliny, z pierwszą pętlą luminalną białka transportera glukozy, GLUT4.

Streszczenie

Nasza zdolność do badania interakcji białko-białko jest kluczem do zrozumienia połączeń regulacyjnych w komórce. Jednak wykrycie interakcji białko-białko w wielu przypadkach wiąże się z poważnymi wyzwaniami eksperymentalnymi. W szczególności receptory sortujące oddziałują ze swoim ładunkiem białkowym w świetle przedziałów błonowych, często w sposób wrażliwy na detergenty, co sprawia, że koimmunoprecypitacja tych białek jest bezużyteczna. Wiązanie sortyliny receptora sortującego z transporterem glukozy GLUT4 może służyć jako przykład słabych oddziaływań luminalnych między białkami błonowymi. W tym miejscu opisujemy szybki, prosty i niedrogi test do walidacji interakcji między sortyliną a GLUT4. W tym celu zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy chemicznie peptyd znakowany myc, odpowiadający potencjalnemu epitopowi wiążącemu sortylinę w części świetlnej GLUT4. Sortylina oznaczona sześcioma histydynami ulegała ekspresji w komórkach ssaków i izolowana z lizatów komórkowych za pomocą kulek kobaltowych. Sortylinę unieruchomioną na kulkach inkubowano z roztworem peptydu o różnych wartościach pH, a wymyty materiał analizowano metodą Western blot. Test ten można łatwo dostosować do badania innych wrażliwych na detergenty interakcji białko-białko.

Wprowadzenie

GLUT4 to białko transportujące glukozę, które ulega ekspresji głównie w komórkach tłuszczowych i mięśni szkieletowych, gdzie pośredniczy w wpływie insuliny na poposiłkowy poziom glukozy we krwi¹. Będąc bardzo stabilnym białkiem, GLUT4 jest regulowany na poziomie potranslacyjnym. W przypadku braku insuliny, GLUT4 jest w dużej mierze wykluczony z błony plazmatycznej (stąd niska podstawowa przepuszczalność glukozy) i jest zlokalizowany głównie wewnątrz komórki w małych pęcherzykach reagujących na insulinę (IRV) i sieci trans-Golgiego (TGN), która prawdopodobnie reprezentuje przedział dawcy IRV. Po podaniu insuliny IRV łączą się z błoną plazmatyczną i dostarczają GLUT4 do miejsca jej funkcjonowania. Zwiększa to przepuszczalność błony komórkowej dla glukozy, dzięki czemu wychwyt glukozy z krwi do adipocytów i miocytów szkieletowych wzrasta od 10 do 40 razy. Po odstawieniu insuliny GLUT4 jest internalizowany do endosomów wczesnych/sortujących, a następnie pobierany do TGN, gdzie IRV są ponownie formowane. Oba etapy sortowania w szlaku GLUT4, tj. pobieranie z obwodowych wczesnych endosomów do okołojądrowego TGN, jak i tworzenie IRV na błonach donorowych TGN są możliwe dzięki członkowi rodziny Vps10p, sortylinie, która reprezentuje białko transbłonowe typu I i receptor sortujący. Według jednego z modeli, sortylina działa jako transbłonowe białko rusztowania: wiąże GLUT4 w świetle endosomów i TGN oraz rekrutuje adaptory retromeru lub klatryny do cytoplazmatycznej strony błony dawcy za pośrednictwem swojego C-końca ^2,3. Ułatwia to dystrybucję GLUT4 do nośników pęcherzykowych, które przemieszczają GLUT4 między przedziałami wewnątrzkomórkowymi.

Interakcja cytoplazmatycznego ogona sortyliny z retromerem i różnymi białkami adaptorowymi została dobrze udokumentowana. Jednak wiązanie sortyliny z GLUT4 (i kilkoma innymi ligandami białkowymi) było trudne do udowodnienia. W szczególności próby koimmunoprecypitacji sortyliny i GLUT4 nie powiodły się, prawdopodobnie ze względu na wrażliwy na detergenty charakter interakcji między tymi dwoma białkami. Ponadto, jako typowe białko transportowe, GLUT4 ma 12 domen transbłonowych i 6 pętli luminalnych, których dowolna kombinacja może potencjalnie reprezentować miejsce wiązania sortyliny. Jednocześnie duża liczba dowodów pośrednich, takich jak znaczna kolokalizacja w komórce, sieciowanie z przepuszczalnym przez błonę DSP oraz interakcja w systemie hybrydowym drożdży sugeruje, że sortylina może wiązać się z GLUT4. Ponadto, stosując to drugie podejście w połączeniu z mutagenezą skaningową alaniny, ustaliliśmy wcześniej, że domena Vps10p sortyliny wiąże się przede wszystkim z pierwszą pętlą luminalną GLUT4. Do tej pory brakowało jednak dowodu na taką interakcję w komórkach ssaków. Tutaj wyizolowaliśmy sortylinę znakowaną przez Hisa z transfekowanych komórek 3T3-L1 za pomocą żywicy kobaltowej i wykazaliśmy, że może ona oddziaływać z chemicznie zsyntetyzowanym peptydem odpowiadającym pierwszej pętli świetlnej GLUT4 przy pH 6 i pH 8, które przypominają kwaśne środowisko w świetle endosomalnym i neutralne środowisko w świetle błon TGN. Nie wykryto wiązania peptydów w eksperymentach kontrolnych, w których ekstrakt przygotowany z komórek nietransfekowanych został załadowany na te same kulki.

Protokół

1. Obchodzenie się z peptydem

1. Projektowanie i zamawianie peptydu
   1. Wybierz żądaną sekwencję peptydu i dodaj znacznik, taki jak epitop myc (EQKLISEED) na jego końcu N lub C.
   2. Sprawdź przewidywaną rozpuszczalność peptydu w wodzie, korzystając z kalkulatora rozpuszczalności peptydów http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Jeśli rozpuszczalność jest niska, spróbuj dodać kolejny rozpuszczalny w wodzie znacznik, aby zmienić równowagę ładunku.
      UWAGA: Użyliśmy peptydu odpowiadającego pierwszej pętli świetlnej (fll) GLUT4 oznaczonej epitopem myc (pogrubiona czcionka) na końcu N (Myc-fll-GLUT4): EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA, który ma "dobrą" przewidywaną rozpuszczalność w wodzie.
   3. Zamów niestandardowy peptyd o czystości co najmniej 75%, która jest wystarczająca do testu, i poproś dostawcę o test rozpuszczalności. Rozdzielić zamówienie na co najmniej dwie podwielokrotności na wypadek nieprzewidzianych problemów z rozpuszczeniem peptydu.
      UWAGA: Myc-fll-GLUT4 został zamówiony w dwóch porcjach. Jego deklarowana rozpuszczalność w wodzie ultraczystej wynosi ≤10 mg/ml.
2. Rozpuszczanie peptydu
   Uwaga: Najlepszym rozpuszczalnikiem jest woda ultraczysta. Jeśli peptyd nie wydaje się być rozpuszczalny w wodzie, zapoznaj się z http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html, aby uzyskać instrukcje.
   1. Przygotować 100-krotny roztwór roboczy peptydu w wodzie ultraczystej lub w wybranym buforze o stężeniu 100 μg/ml.
   2. Rozdzielić roztwór na 50-100 μl podwielokrotności i przechowywać je w temperaturze -20 °C.

2. Postępowanie z komórkami

1. Hodowla komórkowa
   1. Użyj komórek typu dzikiego (WT) jako kontroli negatywnej i komórek wyrażających docelowe białko oznaczone sześcioma histydynami (HisP).
      UWAGA: Użyliśmy preadipocytów 3T3 L1 stabilnie transfekowanych Sortilin-myc/His⁵.
   2. Hoduj komórki w zmodyfikowanym podłożu Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości cukru, uzupełnionym 10% surowicą bydlęcą cielęcą, glutaminą (2 mM) i penicyliną/streptomycyną (5 μg/ml) w temperaturze 37 °C w 10% CO₂ .
   3. Ułóż cztery 10-centymetrowe szalki komórek, transfekuj dwie z nich HisP i transfekuj pozostałe dwie plazmidem kontrolnym (WT). 48 godzin po transfekcji komórki powinny osiągnąć 80 - 90% konfluencji.
2. Przygotowanie lizatów komórkowych
   1. Przygotować bufor do lizy (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5% glicerolu, 10 mM Imidazolu, 0,5% Triton X-100 i koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA do izolacji białek znakowanych His, pH 7,4) i utrzymywać go w temperaturze 4 °C:
   2. Przemyć komórki trzykrotnie 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C.
   3. Ułóż naczynia na lodzie i dodaj 500 μl buforu do lizy do każdego naczynia. Zbierz lizaty komórkowe za pomocą skrobaka do komórek.
   4. Umieść lizat komórkowy z każdej płytki w innej probówce o pojemności 1,5 ml. Oznacz probówki jako WT-pH6, WT-pH8, HisP-pH6, HisP-pH8.
   5. Przepuść lizaty komórek przez strzykawkę z igłą 26G pięć razy w górę iw dół, aby zakończyć lizę.
   6. Odwirować lizaty komórkowe przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   7. Przenieść supernatanty do nowych, identycznie oznakowanych probówek.
   8. Analizuj stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA lub innego zestawu.
   9. Za pomocą buforu do lizy wyrównaj stężenie białka we wszystkich czterech lizatach.
   10. Oddzielić małą (ok. 20 μl) porcję każdego lizatu i utrzymywać ją w temperaturze -20 °C do celów ewentualnych eksperymentów kontrolnych i/lub rozwiązywania problemów.

3. Wiązanie białek oznaczonych przez HisPur z kulkami kobaltowymi HisPur

1. Użyj dostępnego w handlu buforu do płukania lub przygotuj go (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8) i utrzymuj go w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować bufor do przemywania o pH 6, mieszając bufor do przemywania o pH 8 z HCl. Przechowywać go w temperaturze 4 °C.
3. Delikatnie zakręć butelką z koralikami kobaltu, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
4. Dozować 40 μl zawiesiny kulek kobaltu do czterech probówek o pojemności 1,5 ml oznaczonych jak powyżej (krok 2.2.4).
5. Dodać 1 ml buforu do lizy do każdej probówki i odwirować probówki o stężeniu 1000 x g przez 5 s. Odessać supernatant i dodać 40 μl buforu do lizy do osiadłych kulek.
6. Dodaj lizaty komórkowe do odpowiednich probówek.
7. Inkubować probówki przez 90 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze probówkowym przy 20 obr./min.
8. Odwirować probówki o stężeniu 1000 x g przez 5 s i zebrać supernatant. Przechowywać supernatant w temperaturze 4 °C.
9. Dodaj 500 μl buforu do płukania o pH 8 lub pH 6 do odpowiednich probówek i delikatnie ponownie zawiesić kulki.
10. Odwirować probówki o stężeniu 1000 x g przez 5 s i odrzucić supernatanty.
11. Powtórz kroki 3.9 i 3.10 cztery razy.

4. Wiązanie peptydu z białkiem oznaczonym przez Hisa unieruchomionym na koralikach

1. Używając 100x roztworu roboczego peptydu (krok 1.2.1), przygotuj 1x roztwory robocze w buforze do płukania o pH 6 lub pH 8 (dwie podwielokrotności po 100 μl na każdy, 1 μg/ml).
2. Dodaj 100 μL 1x roztworu peptydu do umytych kulek o odpowiednim pH.
3. Inkubować kulki przez 30 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze rurowym z prędkością 20 obr./min.
4. Odwirować probówki o stężeniu 1 000 x g przez 5 s, zebrać supernatant i utrzymywać go w temperaturze -20 °C.
5. Powtórz kroki 3.9 i 3.10 cztery razy.
   UWAGA: Aby zmniejszyć możliwe tło, poniższe kroki mogą zastąpić kroki 4.4 i 4.5.
6. Weź cztery mikrokolumny z porami 30 μm, oznacz je jak w kroku 2.2.4 i umieść kolumny w probówkach zbiorczych.
7. Po zakończeniu kroku 4.3 przenieść mieszaninę inkubacyjną do kolumn, pozwolić, aby roztwór przeszedł grawitacyjnie. Utrzymać przepływ w temperaturze -20 °C.
8. Przepuścić grawitacyjnie 500 μl buforu do przemywania o pH 6 lub pH 8 przez odpowiednie kolumny. Odrzuć przepływ.
9. Powtórz krok 4.8 cztery razy.
10. Po ostatnim płukaniu odwirować kolumny o stężeniu 1 000 x g przez 15 s.

5. Elucja z koralików kobaltowych

1. Użyj komercyjnego buforu do próbek tricine (200 mM Tris-HCl, 40% glicerol, 2% SDS, 0,04% Coomassie Blue, pH 6,8) i dodaj β-merkaptoetanol do końcowego stężenia 2%.
2. Dodać 40 μl buforu do próbek Tricine (z β-merkaptoetanolem) do przemytych kulek i ponownie zawirować próbkę.
3. Podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 100 °C, ponownie wirować próbki i odwirować probówki przy 1 000 x g przez 5 s.
   UWAGA: W celu zmniejszenia możliwego niespecyficznego wiązania w elucji, następujące kroki mogą zastąpić kroki 5.1 - 5.3.
4. Dodać 40 μl elucyjnego buforu imidazolowego (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 0,25 M imidazolu) do przemytych kulek, wirować i inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 20 min.
5. Odwirować probówki o sile 3 000 x g przez 30 s, zebrać supernatant (eluowane próbki) i przenieść go do nowych, oznakowanych probówek.
6. Dodać 40 μl buforu do próbek Tricine do każdej probówki, podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 100 °C, wirować i odwirowywać probówki przy 1 000 x g przez 5 s.
   UWAGA: Jeśli używane są mikrokolumny, dodać bufor elucyjny do przemytych kulek, inkubować przez 20 minut i zebrać elucję przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 2 min.
   UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia elektroforezy.

6. Elektroforeza i Western blotting

Uwaga: Próbki są gotowe do separacji za pomocą SDS-PAGE i późniejszego Western blot. Postępuj zgodnie z protokołem elektroforezy żelowej (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) z następującymi modyfikacjami.

1. Używaj dostępnych w handlu żeli gradientowych 10 - 20% Tricine.
2. Na żel naładować 20 μl eluowanych próbek i 20 μl lizatów (etap 2.2.10). W celu rozwiązywania problemów zaleca się załadowanie 20 μl niezwiązanego materiału (krok 3.8) i 10 ng peptydu; przed załadowaniem dodać równą ilość buforu do próbek Tricine do tych próbek.
3. Przeprowadź elektroforezę w komercyjnym buforze do pracy Tris/Tricine/SDS (100 mM Tris, 100 mM Tricine i 0,1% SDS, pH 8,3).
4. Przenieść materiał z żelu na membranę nitrocelulozową o wielkości 0,45 μm za pomocą buforu transferowego (25 mM zasada Tris, 192 mM glicyna, pH 8,4) uzupełnionego 20% metanolem.
5. Zablokuj błonę 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Używając wstępnie wybarwionych markerów masy cząsteczkowej jako przewodników, przetnij błonę poziomo, osusz górną część przeciwciałem przeciwko HisP i osusz dolną część przeciwciałem przeciwko epitopowi myc, aby zidentyfikować peptyd znakowany myc.
   UWAGA: W naszym konkretnym przypadku przecięcie membrany nie jest wymagane, ponieważ zarówno HisP, jak i Myc-fll-GLUT4 można wykryć za pomocą przeciwciała anty-myc.

7. Analiza wyników

1. Określ ilościowo intensywność wszystkich sygnałów Western blot za pomocą programu Image Station lub ImageJ.
2. Znormalizuj sygnał z peptydu znakowanego myc względem sygnału z HisP przy obu wartościach pH.

Wyniki

Lizaty przygotowano z komórek 3T3 L1 stabilnie transfekowanych Sortilin-myc/His⁵ oraz z komórek 3T3 L1 typu WT, które posłużyły jako kontrola negatywna. Oba lizaty inkubowano z koralikami kobaltowymi przy pH 6 lub pH 8, a następnie dokładnie przemyto. Koraliki z unieruchomionymi białkami inkubowano w roztworze Myc-fll-Glut4. Po dokładnym przemyciu białka związane z koralikami eluowano za pomocą 0,25 M Imidazolu. Próbki, wraz z oryginalnymi lizatami, poddano elektro...

Dyskusja

Sortylina jest ewolucyjnie konserwatywnym receptorem białkowym wieloligandowym, który bierze udział zarówno w sygnalizacji na błonie plazmatycznej, jak i w wewnątrzkomórkowych zdarzeniach sortowania ^6,7. Jednak poszukiwanie autentycznych ligandów sortyliny (z których część jest białkami luminalnymi lub integralnymi białkami błonowymi) jest skomplikowane, ponieważ interakcja sortyliny z niektórymi z jej partnerów wiążących wydaje się być wrażliwa na detergenty. W ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma	P8849	do stosowania w oczyszczaniu białka znacznika histydyny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Corning	21-040-CV	PBS
1mL Strzykawka insulinowa U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Zestaw do oznaczania białek	Pierce	23228
Bufor do płukania	Boston BioProducts	BP-234	Do oczyszczania białek His-tag
Żywica kobaltowa	HisPur Thermo Scientific	89964
Bufor do próbki tricine	Bio-Rad	161-0739	z SDS, należy dodać bMerkaptaetanol
Elucja  Bufor	Boston BioProducts	BP-236	Do oczyszczania białka His-tag za pomocą 250mM Imidazole
Mini-Protean Tris-Tricine prefabrykowane żele 10-20%	Bio-Rad	456-3115	Do separacji peptydu i małego białka
Tris/Tricine/SDS bufor do biegania	Bio-Rad	161-0744
Bufor transferowy	Boston BioProducts	BP-190	Dodaj 20% metanolu
Membrana nitrocelulozowa  0,45 mm	Bio-Rad	1620115
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A9647	BSA Przeciwciało
anty Myc	Sygnalizacja komórkowa	2272
Peptyd	królika Genscipt		Dostosuj zamówienie
Precision Plus Protein Dual color Standarts	BioRad	161-0374