Method Article

Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

DOI:

10.3791/57183

⸱

April 12th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Huashan Hospital, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia kompleksową procedurę oceny in vitro, czy klasyczna angiogeneza nowotworów występuje w naczyniakach zarodkowych (HBs) i jaka jest jej rola w HBs. Wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji HB i sugerują, że ta powszechna forma angiogenezy jest jedynie mechanizmem uzupełniającym w neowaskularyzacji HB.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inaktywacja genu supresorowego nowotworu von Hippel-Lindau (VHL) odgrywa kluczową rolę w rozwoju naczyniaków zarodkowych (HBs) w ludzkim ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Jednak zarówno pochodzenie cytologiczne, jak i proces ewolucyjny HBs (w tym neowaskularyzacja) pozostają kontrowersyjne, a antyangiogeneza VHL-HBs, oparta na klasycznej angiogenezie HBs, przyniosła rozczarowujące wyniki w badaniach klinicznych. Jedną z głównych przeszkód w skutecznym klinicznym przełożeniu leczenia przeciwnaczyniowego jest brak dokładnego zrozumienia neowaskularyzacji w tym guzie naczyniowym. W tym artykule przedstawiono kompleksową procedurę oceny in vitro, czy w HBs występuje klasyczna angiogeneza guza, a także jej rola w HBs. Dzięki tej procedurze naukowcy mogą dokładnie zrozumieć złożoność neowaskularyzacji HB i zidentyfikować funkcję tej powszechnej formy angiogenezy w HBs. Protokoły te można wykorzystać do oceny najbardziej obiecującej terapii przeciwnaczyniowej nowotworów, która ma wysoki potencjał translacyjny zarówno w leczeniu nowotworów, jak i w optymalizacji leczenia antyangiogennego HBs w przyszłych translacjach. Wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji HB i sugerują, że ta powszechna forma angiogenezy jest jedynie mechanizmem uzupełniającym w neowaskularyzacji HB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemangioblastoma (HBs) to łagodne guzy naczyniowe, które występują wyłącznie w ludzkim ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Rozwijają się one u pacjentów z chorobą von Hippla-Lindaua (VHL) lub zmianami sporadycznymi. VHL-HBs są trudne do wyleczenia poprzez leczenie chirurgiczne ze względu na częste nawroty i liczne zmiany wynikające z tego zaburzenia genetycznego1. Chociaż inaktywacja genu supresorowego guza VHL została uznana za główną przyczynę nowotworzenia VHL-HBs, pochodzenie cytologiczne (w tym neowaskularyzacja) i proces ewolucyjny HBs pozostają w dużej mierze kontrowersyjne2. W związku z tym lepsze zrozumienie mechanizmów biologicznych HB-neowaskularnych może dostarczyć użytecznych informacji na temat najbardziej obiecujących strategii przeciwnaczyniowych dla VHL-HBs.

Ostatnie badania sugerują, że neowaskularyzacja HB jest podobna do embriologicznej waskulogenezy3,4,5. Klasyczna angiogeneza za pośrednictwem czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), która wywodzi się ze śródbłonka naczyniowego i jest napędzana utratą funkcji VHL, spowodowała proliferację i tworzenie się neowaskularne, co zostało zakwestionowane6. W 1965 roku Cancilla i Zimmerman odkryli, używając mikroskopii elektronowej, że HB pochodzą z endothelium7. Później okazało się, że komórki zrębu pochodzą z elementu wazoformatywnego8. W 1982 roku Jurco i wsp. odkryli, że komórki zrębu są pochodzenia śródbłonkowego9. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że ludzkie komórki śródbłonka naczyniowego są oryginalnymi komórkami HB-neowaskularyzacji10. Chociaż lepiej jest używać pierwotnych kultur z komórek HB pochodzących z operacji pacjentów z VHL, nasze poprzednie badania wykazały, że pierwotne kultury z HB nie są stabilne i nie można ustalić linii komórkowych3. Co więcej, pierwotne kultury w środowisku 3D nie mogły zidentyfikować cytologicznego pochodzenia HB-neowaskularyzacji, ponieważ zawierają one przodków składników naczyniowych HB10,11. Dlatego, jako prymitywny i klasyczny model komórek śródbłonka, ludzkie komórki śródbłonka naczyniowego (HUVEC) mogą służyć jako alternatywny model komórkowy dla HBs.

Test kiełkowania sferoidów to nowy model w inżynierii tkankowej12,13. W tym artykule opracowano system kokultury 3D oparty na kolagenie in vitro z wykorzystaniem testu kiełkowania sferoidalnego, którego ogólnym celem była ocena, czy w HBs występuje klasyczna angiogeneza guza, a także jej rola w HBs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda została wykonana zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi i przepisami Komisji Etyki Badań Szpitala Huashan Uniwersytetu Fudan. Na każdym etapie przestrzegano odpowiednich standardowych środków bezpieczeństwa. Aby zapoznać się ze schematyczną prezentacją, zapoznaj się z rysunkiem 1.

1. Hodowla komórkowa i konstrukt plazmidu

  1. Rutynowo utrzymuj ludzką komórkę śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostkami/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Trawi plazmid PLKO.1 z ApaI i EcoRI do syntezy fragmentu shRNA. Upewnij się, że sekwencja oligonukleotydowa wektora shRNA VHL to CCGGGATCTGGAAGACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTCTCTCAGATCTTTTTG14.
  3. Następnie zmieszać układ 20 μΜ z 5 μL oligonugolituzy, 5 μl odwróconego oligo, 5 μL 10x buforu NEB i 35 μL ddH2O razem (całkowita objętość wynosi 50 μL). Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 98 °C przez 4 minuty i powoli schładzać do temperatury pokojowej w ciągu kilku godzin.
  4. Związać wyżarzone oligonukleocyty i plazmid PLKO.1 razem z ligazą T4 w temperaturze 4 °C przez noc. 16 godzin później dodać 5 μl mieszanki ligacyjnej do 25 μl kompetentnych komórek DH5α. Następnie należy przeprowadzić badania przesiewowe pomyślnie podwiązanych plazmidów i zweryfikować wstawiony fragment za pomocą sekwencjonowania.

2. Pakiet lentiwirusa i infekcja

  1. W sumie wymieszaj 10 μg wektora PLKO.1-shVHL lub PLKO.1-shScramble, 7,5 μg plazmidu pakującego psPAX2 i 2,5 μg plazmidu otoczkowego pMD2.G w 500 μl pożywki DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS) przez 25 min.
  2. Dodać 7 mLDMEM bez FBS do roztworu przygotowanego powyżej.
  3. Hodowla komórek 293FT w DMEM bez FBS w szalkach do hodowli tkankowych o średnicy 10 cm. Upewnij się, że liczba komórek 293FT wynosi 1 x 107 za pomocą licznika komórek.
  4. Dodać 1 ml przygotowanego powyżej roztworu do pożywki z komórek 293FT w celu transfekcji.
    nuta: Linia komórkowa 293FT wywodzi się z linii komórkowej 293F i stabilnie eksprymuje duży antygen T SV40. Dlatego jest odpowiednim gospodarzem do produkcji lentiwirusa.
  5. Po 6 godzinach zastąpić pożywkę hodowlaną DMEM zawierającym 10% FBS.
  6. Zebrać pożywkę za pomocą pipety po 48 godzinach od transfekcji.
    nuta: Wirus występuje w DMEM zawierającym 10% FBS. Martwe komórki unoszą się na podłożu. Użyj sterylnej membrany 0,45 μm do przefiltrowania martwych komórek i zanieczyszczeń. Ogólnie rzecz biorąc, nie ma potrzeby sprawdzania mnogości infekcji (MOI). Ma to na celu ustanowienie stabilnej linii komórek. W ostatnim kroku wszystkie żywe komórki bez udanej infekcji umrą przez puromycynę. Grupa shScramble i komórki HUVEC są grupą kontrolną. Upewnij się, że wszystkie komórki HUVEC umrą przy zastosowanym stężeniu puromycyny przez 72 godziny. Każda studzienka ma taką samą liczbę komórek.
  7. Hodować komórki HUVEC w pożywce lentiwirusowej przez 72 godziny. Następnie dodać puromycynę do pożywki komórek HUVEC w stężeniu 2 μg/ml przez 24 godziny. Jako grupę kontrolną należy stosować komórki HUVEC bez żadnego leczenia. Upewnij się, że do tego czasu wszystkie komórki kontrolne umrą.
    nuta: Żywe komórki reprezentują stabilną linię komórkową komórek knockdown VHL i komórek shSramble. Gęstość posiewu wynosi 5,000/dołek w płytkach 96-dołkowych.

3. Generowanie sferoidów komórek śródbłonka

  1. Trypsynizuj komórki HUVEC i ponownie zawieś w pożywce DMEM z 10% FBS. Mając umiarkowaną liczbę komórek w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym, dodaj 1 ml typsyny-EDTA.
  2. Zasiej komórki na 96-dołkowej płytce 3D z okrągłym dnem, o gęstości komórek 1 × 103 komórek/dołek. Użyj studzienki, która może pomieścić sferoidę o pojemności 0,50 μl, aby zawiesić sferoidę. Policz komórki za pomocą systemu licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sposób ciągły przez 72 godziny. W tych warunkach upewnij się, że zawieszone komórki automatycznie tworzą sferoidy komórek. Po 36 godzinach wymienić połowę pożywki hodowlanej.

4. Test angiogenezy in vitro

  1. Rozmrozić roztwór żelu w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć go zredukowaną pożywką surowicy w stosunku rozcieńczenia 1:5.
  2. Odessać sferoidy z pożywki hodowlanej DMEM za pomocą mikropipety. Po umyciu sferoid 5 ml zredukowanej pożywki surowicy, delikatnie i ostrożnie zawiesić sferoidy w rozcieńczonym żelu. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
  3. Zanurz 300 μl zmieszanej cieczy w 15-dołkowej płytce. Po inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę dodać 400 μl zredukowanej pożywki surowicy do każdej studzienki. Napełnij sterylną wodą wokół studni, aby wytworzyć nawilżone środowisko utrudniające parowanie.
  4. Następnie hodować płytkę w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przy 100% wilgotności przez 1 godzinę.
  5. Ostrożnie odessać starą pożywkę i zastąpić ją 600 μl zredukowanej pożywki surowicy z 1% suplementami wzrostu komórek śródbłonka w każdym dołku.
  6. Po 12 godzinach lub 24 godzinach wykonaj zdjęcia pod mikroskopem światła odwróconego (40*).

5. Analiza danych

  1. Prześlij obrazy na internetową platformę analizy obrazów, aby uzyskać dane o długości kiełków (tabela materiałów).
  2. Na stronie internetowej utwórz konto przez e-mail.
  3. Następnie prześlij obrazy, klikając przycisk przesyłania.
  4. Pobierz wynik, klikając przycisk pobierania.
    nuta: Oprogramowanie wygeneruje przetworzony obraz i dane. Dane składają się z pięciu części: skumulowanej długości kiełków, średniej długości kiełków, odchylenia standardowego długości kiełków, powierzchni kiełków i powierzchni sferoidalnej. Na przetworzonym obrazie każdy parametr jest obrysowany innym kolorem, aby ułatwić identyfikację na przetworzonym obrazie: czerwony reprezentuje szkielet kiełków, żółty liczbę kiełków, niebieski strukturę kiełków, biały koniec kiełka i pomarańczową sferoidę.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oryginalne obrazy są wykonywane przez mikroskop z odwróconym światłem. Typowe obrazy grupy kontrolnej i grupy VHL są pokazane w Rysunek 2-A1 i Rysunek 2-A2. Długość kiełkowania w grupie kontrolnej jest krótsza niż w grupie VHL.

Po przesłaniu obrazów, platforma internetowa dostarcza wyniki analizy bezpośrednio. Dane wyjściowe składają się z ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio wiele dziedzin badań biologii naczyniowej zostało pobudzonych przez badanie śródbłonka angiogennego15. W tym artykule opracowaliśmy technikę kiełkowania sferoidy śródbłonka jako model eksperymentalny do badania tworzenia naczyń, które wynikają z utraty funkcji genu VHL w zmanipulowanych komórkach śródbłonka w celu identyfikacji nowych cząsteczek kandydujących kaskady angiogennej. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwszy raport, w którym zbadano angiogenne działanie endogennych z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Szanghajskiego Komitetu Nauki i Technologii (15411951800, 15410723200). Autorzy pragną podziękować prof. YuMei Wen i prof. Chao Zhao z Wydziału Mikroorganizmów Chorobotwórczych Uniwersytetu Fudan za pomoc techniczną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ludzka komórka śródbłonka żyły pępowinowejFudan IBS Cell CenterFDCC-HXN180
dulbecco' s zmodyfikowany orzeł" s średni Gibco11995040
płodowa surowica bydlęcaGibco 
PLKO.1-puro vectorAddgene#8453
plazmid upakowania psPAX2 Addgene#12260
plazmid kopertowy pMD2.GAddgene#12259
3D okrągłodenne 96-dołkowe płytkiS-BioMS-9096M
matrigelBD Biosciences354234
Opti-MEM podłożeGibco31985-070zredukowana pożywka surowicy 
Płytka 15-dołkowaIbidi81501Pęcherzyki powietrza w żelu można zredukować poprzez wyrównanie μ – Przesuń angiogenezę przed użyciem w inkubatorze na noc
suplementy wzrostu komórek śródbłonkaSciencell#1052
10-centymetrowe naczynie hodowlaneCorningScipu000813
PuromycinGibcoA1113802
typsin-EDTAGibco25200056
Automatyczny system licznika komórek  biotechnologicznego
 Winmasishttp://mywim.wimasis.com 
26400044Oprogramowanie do analizy obrazu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).
  2. Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint. Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).
  3. Ma, D., et al. Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche. Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).
  4. Zhuang, Z., et al. Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors. Sci Rep. 4, 4102(2014).
  5. Glasker, S., et al. VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma. Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).
  6. Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).
  7. Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma. J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).
  8. Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells. Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).
  9. Jurco, S., et al. Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry. Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).
  10. Ma, D., et al. Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas. Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).
  11. Ma, D., et al. CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma. Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).
  12. Sharifpanah, F., Sauer, H. Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis. Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).
  13. Cai, H., et al. Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma. Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).
  14. Xu, J., et al. Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP. Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).
  15. Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).
  16. D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease. Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).
  17. Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model. Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).
  18. Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
  19. Blacher, S., et al. Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour. PLoS One. 9 (5), 97019(2014).
  20. Straume, O., et al. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).
  21. Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch. Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).
  22. Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment. Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).
  23. Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice. Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).
  24. Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).
  25. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hemangioblastoma NeovascularizationSpheroid Sprouting AssayVHL Gene SilencingEndothelial Cell CultureLentiviral Vector TransfectionHUVEC Cell LineSprout Length AnalysisIn Vitro AngiogenesisTumor VasculogenesisCapillary Formation Assay

Related Articles