Method Article

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

DOI:

10.3791/57188

⸱

May 31st, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Sackler School of Medicine, Tel-Aviv University, 2Department of Pathology, School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) to heterogeniczne populacje komórek, które różnią się markerami błony komórkowej, wzorcami migracji i dystrybucją, a także prezentacją antygenu i zdolnością aktywacji limfocytów T. Ponieważ większość szczepień eksperymentalnych modeli nowotworowych wymaga milionów DC, są one powszechnie izolowane ze szpiku kostnego lub śledziony. Jednak te DC znacznie różnią się od krwi i guza DC w ich odpowiedziach na kompleksy immunologiczne (IC) i przypuszczalnie na inne receptory lektyny sprzężone z Syk. Co ważne, biorąc pod uwagę wrażliwość DC na cząsteczki związane z niebezpieczeństwem, obecność endotoksyn lub przeciwciał, które sieciują receptory aktywacyjne w jednym z etapów izolacji, może powodować pobudzenie DC, a tym samym wpływać na parametry, a przynajmniej dawkę, wymaganą do ich aktywacji. Dlatego tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolowania MoDC od krwi i guzów przy jednoczesnym unikaniu ich przedwczesnej aktywacji. Ponadto zapewniony jest protokół aktywacji MoDC z IC guza i ich późniejszych analiz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od momentu ich odkrycia, komórki dendrytyczne (DC) były przedmiotem szeroko zakrojonych badań ze względu na ich unikalną zdolność do wypaczania różnicowania limfocytów T1. W ciągu ostatnich kilku dekad szeroko zakrojone wysiłki badawcze miały na celu zdefiniowanie różnych podzbiorów DC i ich funkcji podczas progresji guza i odporności 2. DC składają się z heterogenicznych populacji komórek, które różnią się od siebie receptorami rozpoznawania wzorców, dystrybucją tkanek oraz zdolnościami migracyjnymi i prezentacją antygenów3,4,5. W porównaniu z innymi podzbiorami DC, DC pochodzące z monocytów (MoDC) są znacznie liczniejsze w nowotworach i mogą być łatwo generowane z krążących lub naciekających nowotwór monocytów6,7. Dlatego wiele badań klinicznych mających na celu wykorzystanie ich względnej częstości występowania opiera się na manipulacji autologicznym MoDC in vivo i ex vivo w celu wywołania odporności limfocytów T 8,9.

Podobnie, szczepienie eksperymentalnych modeli nowotworów oparte na DC wymaga 2-3 seryjnych wstrzyknięć, w odstępie 5-7 dni, po 1-2 x 106 aktywowanych DC pulsujących antygenami nowotworowymi. Dlatego, aby osiągnąć tak dużą liczbę DC, większość badań na myszach wykorzystywała przede wszystkim MoDC hodowany z prekursorów szpiku kostnego (BM) w GM-CSF przez 7-9 dni (IL-4 nie jest potrzebna w ustawieniu myszy)10,11. Niemniej jednak, biorąc pod uwagę, że myszy z nokautem GM-CSF mają ogólnie normalny przedział DC 12,13, oraz biorąc pod uwagę mieszane populacje uzyskane z tej hodowli,14, fizjologiczne znaczenie tych DC zostało zakwestionowane.

Alternatywnie, DC może być rutynowo izolowane z komórek śledziony. Jednak DC stanowi tylko około 0,3-0,8% wszystkich komórek śledziony (co daje około 7 x 105 DC/śledzionę), a spośród tych komórek tylko CD103 + DC i MoDC mogą migrować z powrotem do narządów limfatycznych. Ponieważ MoDC stanowią około 10-15% populacji DC śledziony15,16, większość protokołów izolacji daje około 1 x 105 MoDC na śledzionę. Ekspansję MoDC można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie transfekowanych komórek B16, które wydzielają GM-CSF, co powoduje 100-krotny wzrost śledziony MoDC17. Jednak zastosowanie MoDC do opracowywania szczepionek DC jest ograniczone, ponieważ procedury tej nie można wykonać u ludzi, a uzyskane MoDC są już wysoce aktywowane.

Oprócz uzyskania odpowiedniej liczby DC, kolejnym wyzwaniem dla opracowania skutecznych szczepionek DC przeciwko autologicznym komórkom nowotworowym jest brak wystarczających sygnałów zagrożenia w otoczeniu guza, aby w pełni aktywować DC. Indukcja sygnałów kostymulujących jest zwykle osiągana poprzez aktywację receptorów rozpoznawania wzorców (PRR) lub szlaków sygnałowych lektyny typu c18,19,20,21. Dalsze podejście do aktywacji DC wykorzystuje ich zdolność do wychwytywania antygenów poprzez interakcje z powierzchniowymi receptorami Fcγ (FcγR). Rzeczywiście, wiele ważnych manuskryptów wykazało, że wstrzyknięcie MoDC z prekursorów BM aktywowanych za pomocą IC gumor-IgG może zapobiec wzrostowi guza w warunkach profilaktycznych i może prowadzić do wyeliminowania ustalonych nowotworów22,23.

W dwóch ostatnich artykułach, Carmi i wsp. odkryli, że w przeciwieństwie do BMDC i śledziony DC, MoDC z krwi i guzów nie może reagować na IgG IC bez dodatkowych bodźców. Stwierdzono, że jest to spowodowane obecnością wysokich wewnątrzkomórkowych poziomów fosfataz tyrozynowych regulujących sygnalizację FcγR24,25. Definiując krytyczny punkt kontrolny w DC, prace te dostarczyły ważnych informacji na temat wymagań dotyczących udanego szczepienia opartego na DC. Wymóg dodatkowych bodźców, aby umożliwić sygnalizację FcγR i przypuszczalnie sygnalizację z innych receptorów lektyny wykorzystujących podobną kaskadę fosforylacji, podkreśla zatem potrzebę unikania primingu DC podczas ich izolacji.

Dlatego obecny protokół opisuje izolację MoDC od krwi i guzów, które znacznie różnią się od BM i śledziony DC, i podkreśla środki ostrożności, które warto rozważyć podczas tego procesu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższe protokoły odnoszą się do izolacji MoDC myszy, jednak ogólne zasady mogą mieć zastosowanie również do innych komórek podzbiorów DC. 12 - 16-tygodniowe myszy C57Bl/6j były utrzymywane w akredytowanym przez American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care obiekcie dla zwierząt. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Uniwersytet Stanforda i Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Tel-Awiwie.

1. Izolacja DC pochodzącego z monocytów związanych z nowotworem

  1. W kapturze z przepływem laminarnym usuń guzy od myszy poddanych eutanazji CO2 i umieść guzy w pożywce RPMI bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się ogolenie myszy i spryskanie ich 70% etanolem przed usunięciem guzów, aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenia sierści. Upewnij się, że guz nie przekracza 25 - 40 mm2 , ponieważ większe guzy mają mniej DC, które są kruche i podatne na śmierć komórki. Jeśli potrzebna jest większa liczba DC, każdej myszy można wstrzyknąć komórki nowotworowe w wielu miejscach.
  2. Pod sterylnym kapturem laminarnym posiekaj guzy nożyczkami chirurgicznymi na małe kawałki (około 1 x 1 mm2).
    1. Dodaj wszystkie fragmenty guza z jednej myszy do sterylnej probówki o płaskim dnie o pojemności 30 ml z magnetycznymi mieszadłami, która zawiera 5 ml zrównoważonego roztworu soli Hanka (HBSS), 2 mg / ml kolagenazy IV i 0,01 mg / ml DNazy I.
      Uwaga: Komórki szpikowe wytwarzają energię poprzez glikozylację, nawet w stanie stacjonarnym. Dlatego należy używać tylko pożywek zawierających glukozę (np. HBSS, RPMI i DMEM), ponieważ głód glukozy przez zaledwie 10-15 minut spowoduje śmierć komórek i apoptozę w ciągu 24 godzin. Używaj tylko kolagenazy o niskiej zawartości endotoksyn IV, ponieważ kolagenaza jest wytwarzana przez bakterie Gram-dodatnie (Clostridium histolyticum).
  3. Mieszać z prędkością około 200 - 400 obr./min w inkubatorze o temperaturze 37 oC z mieszadłem magnetycznym przez 20-30 min.
  4. Dodać 5 ml kompletnej pożywki i energicznie zawiesić.
  5. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 μm. Wirować w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut w celu osadzania komórek.
    Uwaga: Nie próbuj izolować komórek bezpośrednio po trawieniu enzymatycznym, ponieważ niektóre nowotwory są martwicze i zawierają stosunkowo duże ilości szczątków komórkowych lub macierzy zewnątrzkomórkowej. Zastosuj komórki na podłożu o gradiencie gęstości 15%, aby uzyskać tylko komórki.
  6. Zawiesić 9 ml pożywki o gradiencie gęstości z 1 ml 10x PBS w celu dostosowania osmolalności i uzyskania 100% roztworu podstawowego Percollu. Wymieszaj 1,5 ml pożywki o gradientzie gęstości z 8,5 ml HBSS i energicznie wymieszaj z osadem komórek nowotworowych. Delikatnie ułóż 2 ml DMEM na wierzchu pożywki o gradiencie gęstości 15% i wiruj przy 400 rcf przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć supernatanty, ponieważ komórki utworzą osad na dnie probówki.
    1. Umyj granulowane komórki dwukrotnie, ponownie zawieszając je w 10 ml HBSS zawierającym 2% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 10 mM EDTA (bufor izolacyjny) i odwiruj w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5-10 minut w celu osadzenia komórek.
    2. Policz komórki na hemocytometrze za pomocą błękitu trypanowego pod mikroskopem świetlnym.
  7. Ponownie zawiesić 1 x 108 komórek w 1 ml buforze izolacyjnym i inkubować je w temperaturze 4 oC z 30 μl sprzężonych kulek magnetycznych CD11b+ przez 15 min.
    Ostrzeżenie: Unikaj stosowania koralików sprzężonych z CD11c, ponieważ spowoduje to aktywację prądu stałego i wywołanie śmierci komórki. Nie próbuj blokować FcγRII i FcγRIII za pomocą przeciwciał anty-CD16/32. Przeciwciała blokujące licytują FcγR i indukują silną fosforylację kinaz MAP i pobudzają DC.
    1. Usunąć nadmiar niezwiązanych kulek, dodając 9 ml buforu izolacyjnego i odwirować komórki w temperaturze 400 rcf przez 5-10 minut w temperaturze 4oC.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforze izolacyjnym. Umieść komórki na wstępnie umytej kolumnie magnetycznej. Przemyć kolumnę dwukrotnie 3 ml buforu izolacyjnego.
    1. Zdejmij kolumnę z magnesu. Odpipetować 6 ml buforu izolacyjnego na kolumnę i wypłukać znakowane magnetycznie komórki do sterylnej probówki zbiorczej, naciskając tłok. Odwirować komórki w temperaturze 400 rcf przez 5 - 10 minut w temperaturze 4 oC.
    2. Ponownie zawiesić komórki w ilości 100 μl na 1 x 107 komórek i wybarwić następującymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem: Linage ujemne (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI i Ly6G), MHCII, Ly-6C.
  9. Sortuj komórki, bramkując małe komórki, używając rozpraszania bocznego (SSC) i rozpraszania do przodu (FSC) oraz hoduj w kompletnym pożywce uzupełnionej 5 ng / mL GM-CSF. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 3-7 oC, aby umożliwić makrofagom przyleganie do płytki. Następnie przenieś luźno i nieprzylegające komórki do nowego naczynia hodowlanego.
    UWAGA: Mysz MoDC jest zdefiniowana jako CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/int 7,26,27. Ekspresja Ly6C może się znacznie różnić w zależności od modelu nowotworu, a w niektórych modelach (np. LMP) MoDC całkowicie nie mają ekspresji Ly6C. Ogólnie rzecz biorąc, jeden 100 mm3 B16F10 guz zwykle zawiera 5 x 104 DC, co daje około 4 - 5 x 106 całkowitych komórek. Spośród tych komórek 10 - 15% to komórki odpornościowe, a 8 - 10% to MoDC. Zwiększenie liczby DC można osiągnąć poprzez wstrzyknięcie myszom guzów w wielu miejscach. Sortuj tylko małe komórki SSC/FCS, ponieważ inne komórki szpiku mogą wyrażać markery, takie jak CD11c i Ly6C.
    Opcjonalnie: Posortuj monocyt naciekający nowotwór jako małe komórki SSC / FSC, które wyrażają Ly6Chi i są ujemne dla MHCII. Następnie hoduj monocyty in vitro z 50 ng / mL GM-CSF w celu uzyskania DC.

2. Izolacja DC pochodzącego z monocytów z krwi obwodowej

UWAGA: Ponieważ dojrzałe MoDC są stosunkowo rzadkie we krwi myszy, poniższy protokół odnosi się do ich pochodzenia in vitro z posortowanych monocytów.

  1. Aby zwiększyć poziom monocytów we krwi, znieczulij myszy 4% izofluranem i wstrzyknij im podskórnie (s.c.) 1 μg GM-CSF w 50 μl PBS.
  2. Po 1-2 godzinach uśmierc myszy za pomocą CO2,
    Uwaga: Nie składaj w ofierze myszy przez zwichnięcie szyjki macicy, ponieważ spowoduje to krwawienie wewnętrzne.
  3. Natychmiast po eutanazji spryskaj mysz 70% etanolem i usuń skórę pokrywającą serce za pomocą nożyczek chirurgicznych, pod sterylnym kapturem z przepływem laminarnym. Oczyść nożyczki etanolem i przetnij prawe przedsionek serca. Powoli przepłucz serce przez prawą komorę za pomocą 20 mM EDTA HBSS za pomocą strzykawki 10 ml i igły 25 G.
    1. Pobrać krew za pomocą sterylnej strzykawki z jamy opłucnej do sterylnej probówki zawierającej siarczan heparanu i EDTA. Kontynuuj płukanie serca, aż wątroba i płuca staną się różowe lub białe.
  4. Nanieść krew na podłoże o gradiencie gęstości i odwirować w temperaturze 400 rcf w temperaturze pokojowej przez 15 minut z niskim hamulcem.
    Uwaga: Używaj pożywki o gradiencie gęstości wolnej od endotoksyn (zwykle mniej niż 0,12 UE na ml).
    1. Zbierz komórki jednojądrzaste do nowej probówki. Przemyć komórki, ponownie zawieszając je w 10 ml HBSS zawierającym 2% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 10 mM EDTA (bufor izolacyjny), a następnie odwirowując w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5-10 minut w celu osadzenia komórek.
      Uwaga: Używaj tylko pożywek, które zawierają co najmniej 1 g/l glukozy.
  5. W przypadku selekcji CD11b dodatniej należy ponownie zawiesić 1 x 108 komórek w 1 ml buforze izolacyjnym i inkubować je przez 15 minut z 50 μl kulek magnetycznych sprzężonych z CD11b w temperaturze 4 oC.
    1. Przepłukać nadmiar kulek, dodając 9 ml buforu izolacyjnego i odwirowując w temperaturze 400 rcf przez 5-10 minut w temperaturze 4 oC. Odessać supernatanty i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforze izolacyjnym. Nałóż ogniwa na wstępnie umytą kolumnę magnetyczną zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wyjmij kolumnę z magnesu, odpipetuj 6 ml buforu izolacyjnego na kolumnę i wypłucz magnetycznie znakowane komórki do sterylnej probówki zbiorczej, naciskając tłok. Odwirować komórki w temperaturze 400 rcf przez 5-10 minut w temperaturze 4 oC. Przemyć kolumnę dwukrotnie 3 ml buforu izolacyjnego.
    3. Ponownie zawieś komórki w buforze izolacyjnym 1 x 10 x10 komórek/100 μl i wybarwij następującymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem: 0,1 μg CD115, 0,25 μg MHCII i 0,1 μg Ly-6C/1 x 106 komórek.
  6. Sortuj komórki, bramkując na małych komórkach rozproszenia bocznego (SSC) i małego rozproszenia do przodu (FSC).
    UWAGA: Monocyty zapalne myszy są ogólnie definiowane jako CD115 + / MHCIIlo / neg / Ly6Chi, a monocyty patrolujące są definiowane jako CD115 + / MHCIIlo / neg / Ly6Cneg 4,5. W przypadkach, gdy nie jest wymagana separacja między dwoma podzbiorami, można posortowaćcałkowite komórki SSClo / FCSlo / CD115 + / MHCII. Zarówno myszy naiwne, jak i z nowotworem zawierają około 5 - 8 x 104 MoDC na 1 ml krwi i do 4 - 5 x 105 MoDC po wstrzyknięciu GM-CSF. Spośród nich około 70% to monocyty zapalne, a 30% to monocyty patrolujące.
  7. Umieść komórki w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w kompletnym podłożu uzupełnionym 20 ng/mL GM-CSF. Po 1 dniu przenieś nieprzylegające i luźno przylegające komórki na nową płytkę i hoduj przez dodatkowe 4-5 dni.
    Uwaga: Pożywki DC nie powinny być uzupełniane pirogronianem.

3. Przygotowanie kompleksów immunologicznych Guz-IgG

  1. Hodowla komórek nowotworowych w kolbie hodowlanej o średnicy 75 cm2 do 70% konfluencji w kompletnych pożywkach DMEM.
    1. Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny/EDTA, aby odłączyć komórki od kolby hodowlanej i monitorować morfologię komórek pod mikroskopem świetlnym, aby uniknąć nadmiernej trypsynizacji.
    2. Dodać 8 ml kompletnej pożywki hodowlanej (na 2 ml trypsyny), aby zahamować trawienie trypsyny, i odwirować w temperaturze 4 oC, 400 rcf przez 5-10 minut, aby osadzać komórki.
      UWAGA: Upewnij się, że sprawdziłeś komórki nowotworowe pod kątem Mycoplasma za pomocą komercyjnego zestawu do PCR. Test na obecność bakterii Gram-ujemnych i endotoksyn grzybowych za pomocą testu Limulus Amebocyte Lysate (LAL)28). Surowica musi zostać przefiltrowana przez 0,22 μM i przetestowana na obecność wirusów 9 Kodeksu Przepisów Federalnych. Dodatkowo przetestuj pożywki hodowlane i surowice, upuszczając 100 - 200 μl na agar LB lub bulion i hoduj przez 2 dni w temperaturze 37 oC.
    3. Ponownie umyj komórki z trypsyny i resztek surowicy, ponownie zawieszając je w 10 ml PBS i odwiruj w temperaturze 400 rcf przez 5 - 10 minut. Odessać supernatant i powtórzyć płukanie jeszcze 2 razy.
  2. Utrwal komórki w 1,8% buforowanym paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    1. Umyć komórki, ponownie zawieszając je w 10 ml PBS i odwirować w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut.
    2. Odessać supernatanty i powtórzyć pranie jeszcze dwa razy.
      Opcjonalnie: W przypadku testów wychwytu nowotworu komórki można znakować, inkubując je przez 5 minut w temperaturze 37 oC w PBS zawierającym 1 μM ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE). CFSE jest następnie hartowany z kompletnymi mediami przez 10 minut w lodzie. Komórki należy dokładnie przemyć w PBS zawierającym 2% surowicy w celu usunięcia resztek barwnika.
  3. Ponownie zawiesić komórki w buforze FACS (PBS uzupełniony o 2% FCS + 5 mM EDTA) i 0,5 μg/ml anty-CD16/32 w celu zablokowania potencjalnych niespecyficznych interakcji białko-białko. Płytka w kształcie litery U, 96 dołków/płytka, o stężeniu 1 x 10,5 komórek na 100 μl.
    1. Dodać różne rozcieńczenia przeciwciał wiążących nowotwór w zakresie od 5 μg do 5 ng / 1 x 105 komórek. Inkubować płytkę na lodzie przez 15-20 min.
      UWAGA: Przeciwciała IgG wyizolowano z surowicy naiwnych samic myszy w wieku 20-24 tygodni na kolumnach białka A, zgodnie z opisem24.
  4. Przemyć komórki, dodając 150 μl PBS i odwirowując płytkę w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut.
    1. Wyrzuć supernatanty i powtórz pranie dwukrotnie. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforze FACS zawierającym przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem. Inkubować płytkę na lodzie przez 20 minut.
    2. Przemyć komórki, dodając 200 μl buforu FACS i odwirowując płytkę w temperaturze 400 rcf przez 5 - 10 minut. Odrzucić supernatanty i powtórzyć mycie.
    3. Przeanalizuj wiązanie guza za pomocą cytometrii przepływowej i określ minimalne stężenie wymagane do pokrycia komórek.
      UWAGA: Przeciwciała, które nie zwiększają średniej intensywności fluorescencji (MFI) barwionych komórek nowotworowych co najmniej pięciokrotnie w stosunku do kontroli izotypowej, nie powinny być stosowane w kolejnych testach funkcjonalnych.

4. Aktywacja MoDC za pomocą układu scalonego Gumor-IgG

  1. Pokryć komórki nowotworowe minimalnym stężeniem IgG, jak opisano w sekcjach 3.1 do 3.4.3
    1. Na dzień przed aktywacją MoDC za pomocą IC guza, zastąp pożywkę hodowlaną MoDC, która zawiera GM-CSF. W tym celu należy delikatnie zassać pożywkę i raz umyć komórki wstępnie podgrzaną, kompletną pożywką hodowlaną.
      UWAGA: Izolowany dojrzały MoDC związany z nowotworem powinien być hodowany przez co najmniej 2 - 3 godziny (lub nawet przez noc) po sortowaniu w kompletnych pożywkach bez GM-CSF, a przed aktywacją ich za pomocą IC.
    2. W przypadku analiz wychwytu nowotworu dodaj IC guza znakowany CFSE do MoDC w stosunku 1:5 (IC:MoDC) i inkubuj przez noc przez 12 - 16 godzin w 1 ml kompletnej pożywki na 1 x 106 DC.
    3. W przypadku analiz FACS eksperymentów aktywacji MoDC, dodaj guz-IC w stosunku 1:1 (IC:MoDC) i inkubuj przez noc przez 12 - 16 h.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się włączenie studzienki kontroli pozytywnej, w której MoDC są stymulowane 1 μg/ml LPS lub innych agonistów TLR.
    4. Po aktywacji przez noc odessać supernatanty i delikatnie przemyć komórki trzykrotnie buforem izolacyjnym lub 10 mM EDTA HBSS.
    5. Aby odłączyć prąd stały od płytki, należy inkubować komórki przez 2 - 3 minuty w 1 ml HBSS zawierającym 10 mM EDTA, a następnie odłączyć komórki przez energiczne pipetowanie.
    6. Odwiruj komórki przy 400 rcf i ponownie zawiesij 1 x 106 DC w 90 μl PBS uzupełnionym 2% FCS, 5 mM EDTA (bufor FACS) i 0,5 μg przeciwciał blokujących. Inkubować na lodzie przez 5 - 10 minut.
    7. Dodać 10 μl mieszaniny przeciwciał barwiących do komórek i inkubować na lodzie przez 15 minut.
    8. Dodać 2 ml buforu FACS do komórek i odwirować w temperaturze 4 oC 400 rcf przez 5 - 10 minut.
  2. Ponownie zawieś ogniwa w buforze FACS o pojemności 200 μl.
    1. Dodać 0,5 - 1 μg/ml DAPI 1 - 2 minuty przed uruchomieniem próbek, aby wykluczyć martwe komórki z analiz. Nie należy nadmiernie inkubować DAPI, ponieważ MoDC podejmie go w ciągu 10 - 15 minut.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Początkowo porównaliśmy zdolność przeciwciał od naiwnych myszy syngenicznych i allogenicznych do wiązania się z komórkami nowotworowymi. W tym celu linie komórek nowotworowych B16F10 i LMP utrwalono w paraformaldehydzie i obficie przemyto. B16F10 to linia komórkowa czerniaka, która została pierwotnie wyizolowana z przerzutów do płuc u myszy C57Bl/6. LMP to komórka nowotworowa trzustki, która została wyizolowana z myszy KrasG12D/+, LSL-Trp53R172H/+ i Pdx-1-Cre i rośnie stabilnie u myszy 12...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę dużą liczbę DC wymaganą do szczepienia myszy (około 2-4 x 106 DC na jedną mysz), większość strategii szczepień u myszy opiera się na izolacji DC od BM i śledziony, a następnie ich aktywacji ex vivo. Jednak próby aktywacji DC guza in vivo, przy użyciu tych samych warunków do aktywacji śledziony i BM DC, często kończyły się niepowodzeniem w wytwarzaniu skutecznej odporności. W dwóch kolejnych publikacjach Carmi i wsp. odkryli, że MoDC krwi i guza różnią się znacznie od...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów i że nie mają nic do ujawnienia.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PREMIUMGE-Healthcare17-5442-02
OptiPrepStemCell Technologies07820
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-052-301
Zestaw do izolacji monocytów EasySepStemCell Technologies19861
Kolagenaza IVSigmaC9697-50MGPrzetestuj każdą partię na obecność endotoksyny
DNase ISigmaDN25-10MG
HBSSThermoFisher14025092
FBSThermoFisher16140071Przetestuj każdą partię na obecność endotoksyny
PE-CD11cBiolegend117307
APC-CD11bBiolegend101211
Brilliant Violet 650 MHCIIBiolegend107641
AF48- CD86Biolegend105017
APC/Cy7-Ly-C6Biolegend108423
PE/Cy7-CD15Biolegend135523

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).
  4. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
  5. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  6. Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  7. Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  8. Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).
  9. Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165(2014).
  10. Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).
  11. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
  12. Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).
  13. Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).
  14. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  15. Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
  16. Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).
  17. Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).
  18. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).
  19. Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).
  20. Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).
  21. Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).
  22. Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).
  23. Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).
  24. Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).
  25. Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1 (18), e89020(2016).
  26. Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).
  27. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
  28. Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).
  29. Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).
  30. Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).
  31. Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).
  32. Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).
  33. Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).
  34. Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).
  35. Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).
  36. Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Monocyte derived Dendritic CellsImmune Complex ActivationTumor Cell IsolationBlood Cell IsolationMagnetic Bead SeparationDensity Gradient CentrifugationFlow Cytometry AnalysisCD11b Cell SelectionCFSE labeled Tumor ComplexDendritic Cell Activation

Related Articles