Tutaj przedstawiamy prosty i tani protokół barwienia srebrem, który wymaga tylko trzech odczynników i 7 minut przetwarzania, i jest odpowiedni do szybkiego generowania wysokiej jakości danych SSR w analizie genetycznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybki protokół barwienia srebrem umożliwiający proste i skuteczne wykrywanie markerów SSR przy użyciu niedenaturującego żelu poliakrylamidowego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Proste powtarzanie sekwencji (SSR) jest jednym z najbardziej efektywnych markerów używanych w badaniach genetycznych roślin i zwierząt oraz programach hodowli molekularnej. Barwienie srebrem jest szeroko stosowaną metodą wykrywania markerów SSR w żelu poliakrylamidowym. Jednak konwencjonalne protokoły barwienia srebra są technicznie wymagające i czasochłonne. Podobnie jak wiele innych biologicznych technik laboratoryjnych, protokoły barwienia srebrem są stale optymalizowane w celu poprawy skuteczności wykrywania. W tym miejscu przedstawiamy uproszczoną metodę barwienia srebrem, która znacznie obniża koszty odczynników oraz zwiększa rozdzielczość wykrywania i klarowność obrazu. Nowa metoda wymaga dwóch głównych etapów (impregnacja i rozwój) i trzech odczynników (azotan srebra, wodorotlenek sodu i formaldehyd) oraz tylko 7 minut przetwarzania w przypadku niedenaturującego żelu poliakrylamidowego. W porównaniu z poprzednio opisanymi protokołami, ta nowa metoda jest łatwiejsza, szybsza i wykorzystuje mniej odczynników chemicznych do wykrywania SSR. Dlatego ten prosty, tani i skuteczny protokół barwienia srebrem przyniesie korzyści mapowaniu genetycznemu i hodowli wspomaganej markerami dzięki szybkiemu generowaniu danych markerów SSR.
Wprowadzenie
Rozwój markerów opartych na PCR zrewolucjonizował naukę o genetyce roślin i hodowli1. Markery prostych powtórzeń sekwencji (SSR) należą do najczęściej stosowanych i najbardziej wszechstronnych markerów DNA. Ich szeroki zakres genomu, liczebność, swoistość genomu i powtarzalność to tylko niektóre z zalet markerów SSR, oprócz ich współdominującego dziedziczenia w wykrywaniu heterozygotycznych genotypów2. W kilku badaniach wykorzystano markery SSR do zbadania różnorodności genetycznej, śledzenia przodków, konstruowania map powiązań genetycznych i mapowania genów dla cech ważnych ekonomicznie3,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie produktów PCR markerów SSR
- Przygotuj wszystkie chemikalia i odczynniki do reakcji PCR, w tym matrycę DNA (30 ng / μL), 2× główną mieszaninę PCR (zawierającą 2× buforu PCR, 0,4 mM każdego dNTP, 3 mM MgCl2, 0,1 U/μL polimerazy Taq DNA i barwników), 10 μM każdego startera do przodu i do tyłu oraz wodę destylowaną lub dejonizowaną (dH2O).
UWAGA: Markery SSR użyte w niniejszym badaniu to PT51333 (sekwencja startera do przodu: 5 '-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' i odwrotna sekwencja startera: 5 '-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3 ') i PT50903 (sekwencja startera do przodu: 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG' i odwrotna sekwencja startera:....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Amplikony PCR otrzymano przy użyciu odpowiednich par starterów SSR w kwitnącej kapuście pekińskiej oraz tytoniu. Po elektroforezie żele poliakrylamidowe zabarwiono zgodnie z powyższym protokołem barwienia srebrem, co pozwoliło na jednoznaczne wykrycie wzorów prążkowania markerów SSR (Rycina 1).
Aby porównać wydajność detekcji różnych protokołów barwienia srebrem, produkty PCR markerów SSR tytoniu or.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mycie żelu po impregnacji jest krytycznym krokiem. Zbyt krótki czas mycia i zbyt duża ilość wody mogą spowodować niepełne usunięcie roztworu impregnującego z powierzchni płytki i żelu oraz skutkować ciemnym tłem. Odpowiedni czas rozwoju jest kolejnym kluczowym krokiem, nadmierny rozwój może skutkować ciemnobrązowym tłem z obrazem fragmentów DNA o niskim kontraście. Ponadto etap impregnacji znacząco wpływa na skuteczność barwienia fragmentów DNA. Chociaż wydłużenie czasu impregnacji powyżej 5 minut lub zwiększenie ilości<.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych Guangdong (2015A030313500), Prowincjonalną Kluczową Międzynarodową Platformę Badawczą oraz Główny Projekt Naukowo-Badawczy Szkolnictwa Wyższego w Guangdong (2015KGJHZ015), Plan Nauki i Technologii Guangdong Tobacco Monopoly Administration (201403, 201705), Plan Nauki i Technologii Guangdong w Chinach (2016B020201001), Krajowy Projekt Szkolenia Innowacyjnego dla Studentów Studiów Licencjackich Studenci (201711078001). Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach handlowych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Depar....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mieszanka wzorcowa PCR (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, Chiny | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA# | 170-8200 | |
| Marker DNA DL500 | Takara Bio Inc., Japonia | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, Chiny | #77-86-1 | |
| Kwas borowy | Sangon Biotech Szanghaj, Chiny | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Fabryka odczynników chemicznych w Kantonie, Chiny# | 6381-92-6 | |
| Akrylamid | Sangon Biotech Szanghaj, Chiny | #79-06-1 | |
| N,N'-metyleno-bis-akryloamid | Sangon Biotech Szanghaj, Chiny# | 110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina | Sangon Biotech Szanghaj, Chiny | #110-18-9 | |
| Nadsiarczan amonu | Guangzhou Chemical Reagent Factory, Chiny | #7727-54-0 | |
| Bind-silan | Solarbio Pekin, Chiny#B8150 | ||
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Chiny | #7761-88-8 | |
| Fabryka odczynników chemicznych Formaldehyd Tianjin DaMao, Chiny | #50-00-0 | ||
| Fabryka odczynników chemicznych NaOH Guangzhou, Chiny | #1310-73-2 | ||
| Kwas octowy | Fabryka odczynników chemicznych w Kantonie, Chiny | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Fabryka odczynników chemicznych Tianjin DaMao, Chiny# | 497-19-8 | |
| Fabryka | odczynników chemicznych etanolu w Kantonie, Chiny | #64-17-5 | |
| HNO< sub>3 | Fabryka odczynników chemicznych w Kantonie, Chiny# | 7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Chiny | #10102-17-7 | |
| Eriochromowa czerń T (EBT) | Tianjin DaMao Fabryka odczynników chemicznych, Chiny | #1787-61-7 | |
| Plastikowa taca | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, Chiny-TS-1 | ||
| Wytrząsarka | Qilinbeter JiangSu, Chiny-Skaner | ||
| BenQ M800 BenQ | , Chiny-DYY-6C | ||
| Zasilacz | Beijing Liuyi Instrument Factory, Chiny-High | ||
| w pionowych systemach żelowych, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Chiny | - |
Bibliografia
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
