Method Article

Szybki protokół barwienia srebrem umożliwiający proste i skuteczne wykrywanie markerów SSR przy użyciu niedenaturującego żelu poliakrylamidowego

DOI:

10.3791/57192

⸱

April 20th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Guangzhou University, 2Hard Winter Wheat Genetics Research Unit, United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service, 3The UWA Institute of Agriculture, University of Western Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy prosty i tani protokół barwienia srebrem, który wymaga tylko trzech odczynników i 7 minut przetwarzania, i jest odpowiedni do szybkiego generowania wysokiej jakości danych SSR w analizie genetycznej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proste powtarzanie sekwencji (SSR) jest jednym z najbardziej efektywnych markerów używanych w badaniach genetycznych roślin i zwierząt oraz programach hodowli molekularnej. Barwienie srebrem jest szeroko stosowaną metodą wykrywania markerów SSR w żelu poliakrylamidowym. Jednak konwencjonalne protokoły barwienia srebra są technicznie wymagające i czasochłonne. Podobnie jak wiele innych biologicznych technik laboratoryjnych, protokoły barwienia srebrem są stale optymalizowane w celu poprawy skuteczności wykrywania. W tym miejscu przedstawiamy uproszczoną metodę barwienia srebrem, która znacznie obniża koszty odczynników oraz zwiększa rozdzielczość wykrywania i klarowność obrazu. Nowa metoda wymaga dwóch głównych etapów (impregnacja i rozwój) i trzech odczynników (azotan srebra, wodorotlenek sodu i formaldehyd) oraz tylko 7 minut przetwarzania w przypadku niedenaturującego żelu poliakrylamidowego. W porównaniu z poprzednio opisanymi protokołami, ta nowa metoda jest łatwiejsza, szybsza i wykorzystuje mniej odczynników chemicznych do wykrywania SSR. Dlatego ten prosty, tani i skuteczny protokół barwienia srebrem przyniesie korzyści mapowaniu genetycznemu i hodowli wspomaganej markerami dzięki szybkiemu generowaniu danych markerów SSR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój markerów opartych na PCR zrewolucjonizował naukę o genetyce roślin i hodowli1. Markery prostych powtórzeń sekwencji (SSR) należą do najczęściej stosowanych i najbardziej wszechstronnych markerów DNA. Ich szeroki zakres genomu, liczebność, swoistość genomu i powtarzalność to tylko niektóre z zalet markerów SSR, oprócz ich współdominującego dziedziczenia w wykrywaniu heterozygotycznych genotypów2. W kilku badaniach wykorzystano markery SSR do zbadania różnorodności genetycznej, śledzenia przodków, konstruowania map powiązań genetycznych i mapowania genów dla cech ważnych ekonomicznie3,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie produktów PCR markerów SSR

  1. Przygotuj wszystkie chemikalia i odczynniki do reakcji PCR, w tym matrycę DNA (30 ng / μL), 2× główną mieszaninę PCR (zawierającą 2× buforu PCR, 0,4 mM każdego dNTP, 3 mM MgCl2, 0,1 U/μL polimerazy Taq DNA i barwników), 10 μM każdego startera do przodu i do tyłu oraz wodę destylowaną lub dejonizowaną (dH2O).
    UWAGA: Markery SSR użyte w niniejszym badaniu to PT51333 (sekwencja startera do przodu: 5 '-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' i odwrotna sekwencja startera: 5 '-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3 ') i PT50903 (sekwencja startera do przodu: 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG' i odwrotna sekwencja startera:....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amplikony PCR zostały wyprodukowane przy użyciu odpowiednich par starterów SSR w kwitnącej kapuście pekińskiej i tytoniu. Po elektroforezie, żele poliakryloamidowe zostały wybarwione przy użyciu powyższego protokołu barwienia srebrem, który jednoznacznie wykrył wzory prążków markerów SSR (Rysunek 1).

Aby porównać skuteczność wykrywania różnych protokołów barwienia srebrem, produkty PCR markerów SSR w .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycie żelu po impregnacji jest krytycznym krokiem. Zbyt krótki czas mycia i zbyt duża ilość wody mogą spowodować niepełne usunięcie roztworu impregnującego z powierzchni płytki i żelu oraz skutkować ciemnym tłem. Odpowiedni czas rozwoju jest kolejnym kluczowym krokiem, nadmierny rozwój może skutkować ciemnobrązowym tłem z obrazem fragmentów DNA o niskim kontraście. Ponadto etap impregnacji znacząco wpływa na skuteczność barwienia fragmentów DNA. Chociaż wydłużenie czasu impregnacji powyżej 5 minut lub zwiększenie ilości<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych Guangdong (2015A030313500), Prowincjonalną Kluczową Międzynarodową Platformę Badawczą oraz Główny Projekt Naukowo-Badawczy Szkolnictwa Wyższego w Guangdong (2015KGJHZ015), Plan Nauki i Technologii Guangdong Tobacco Monopoly Administration (201403, 201705), Plan Nauki i Technologii Guangdong w Chinach (2016B020201001), Krajowy Projekt Szkolenia Innowacyjnego dla Studentów Studiów Licencjackich Studenci (201711078001). Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach handlowych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Depar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mieszanka wzorcowa PCR (Green Taq Mix)Vazyme Biotech Co. Ltd, Chiny#P131-03
50-2000 bp DNA LadderBio-Rad, USA#170-8200
Marker DNA DL500Takara Bio Inc., Japonia#3590A
Tris baseSangon Biotech Shanghai, Chiny#77-86-1
Kwas borowySangon Biotech Szanghaj, Chiny#10043-35-3
EDTA-Na2Fabryka odczynników chemicznych w Kantonie, Chiny#6381-92-6
AkrylamidSangon Biotech Szanghaj, Chiny#79-06-1
N,N'-metyleno-bis-akryloamidSangon Biotech Szanghaj, Chiny#110-26-9
N,N,N',N'-TetrametyloetylenodiaminaSangon Biotech Szanghaj, Chiny#110-18-9
Nadsiarczan amonuGuangzhou Chemical Reagent Factory, Chiny#7727-54-0
Bind-silanSolarbio Pekin, Chiny#B8150
AgNO3Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Chiny#7761-88-8
Fabryka odczynników chemicznych Formaldehyd Tianjin DaMao, Chiny#50-00-0
Fabryka odczynników chemicznych NaOH Guangzhou, Chiny#1310-73-2
Kwas octowyFabryka odczynników chemicznych w Kantonie, Chiny#64-19-7
Na2CO3Fabryka odczynników chemicznych Tianjin DaMao, Chiny#497-19-8
Fabrykaodczynników chemicznych etanolu w Kantonie, Chiny#64-17-5
HNO< sub>3Fabryka odczynników chemicznych w Kantonie, Chiny#7697-37-2
Na2S2O3.5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Chiny#10102-17-7
Eriochromowa czerń T (EBT)Tianjin DaMao Fabryka odczynników chemicznych, Chiny#1787-61-7
Plastikowa tacaShanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, Chiny-TS-1
WytrząsarkaQilinbeter JiangSu, Chiny-Skaner
BenQ M800 BenQ, Chiny-DYY-6C
ZasilaczBeijing Liuyi Instrument Factory, Chiny-High
w pionowych systemach żelowych, JY-SCZFBeijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Chiny-

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
  2. Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
  3. Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Silver StainingSSR MarkersNon denaturing GelPolyacrylamide GelGenetic ResearchMarker DetectionImpregnation DevelopmentDNA Fragment AnalysisGel ElectrophoresisChemical Reagents

Related Articles