Tutaj przedstawiamy prosty i tani protokół barwienia srebrem, który wymaga tylko trzech odczynników i 7 minut przetwarzania, i jest odpowiedni do szybkiego generowania wysokiej jakości danych SSR w analizie genetycznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybki protokół barwienia srebrem umożliwiający proste i skuteczne wykrywanie markerów SSR przy użyciu niedenaturującego żelu poliakrylamidowego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Proste powtarzanie sekwencji (SSR) jest jednym z najbardziej efektywnych markerów używanych w badaniach genetycznych roślin i zwierząt oraz programach hodowli molekularnej. Barwienie srebrem jest szeroko stosowaną metodą wykrywania markerów SSR w żelu poliakrylamidowym. Jednak konwencjonalne protokoły barwienia srebra są technicznie wymagające i czasochłonne. Podobnie jak wiele innych biologicznych technik laboratoryjnych, protokoły barwienia srebrem są stale optymalizowane w celu poprawy skuteczności wykrywania. W tym miejscu przedstawiamy uproszczoną metodę barwienia srebrem, która znacznie obniża koszty odczynników oraz zwiększa rozdzielczość wykrywania i klarowność obrazu. Nowa metoda wymaga dwóch głównych etapów (impregnacja i rozwój) i trzech odczynników (azotan srebra, wodorotlenek sodu i formaldehyd) oraz tylko 7 minut przetwarzania w przypadku niedenaturującego żelu poliakrylamidowego. W porównaniu z poprzednio opisanymi protokołami, ta nowa metoda jest łatwiejsza, szybsza i wykorzystuje mniej odczynników chemicznych do wykrywania SSR. Dlatego ten prosty, tani i skuteczny protokół barwienia srebrem przyniesie korzyści mapowaniu genetycznemu i hodowli wspomaganej markerami dzięki szybkiemu generowaniu danych markerów SSR.
Wprowadzenie
Rozwój markerów opartych na PCR zrewolucjonizował naukę o genetyce roślin i hodowli1. Markery prostych powtórzeń sekwencji (SSR) należą do najczęściej stosowanych i najbardziej wszechstronnych markerów DNA. Ich szeroki zakres genomu, liczebność, swoistość genomu i powtarzalność to tylko niektóre z zalet markerów SSR, oprócz ich współdominującego dziedziczenia w wykrywaniu heterozygotycznych genotypów2. W kilku badaniach wykorzystano markery SSR do zbadania różnorodności genetycznej, śledzenia przodków, konstruowania map powiązań genetycznych i mapowania genów dla cech ważnych ekonomicznie3,4.
Produkty PCR markerów SSR są zwykle rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, a następnie wizualizowane za pomocą barwienia srebrem lub w świetle UV po barwieniu bromkiem etydyny. Barwienie srebrem fragmentów DNA w żelach poliakryloamidowych jest bardziej czułe niż inne metody barwienia5,6 i jest szeroko stosowane do wykrywania fragmentów DNA, takich jak markery SSR7.
Podobnie jak wiele biologicznych technik laboratoryjnych, barwienie srebrem żeli poliakrylamidowych stale się poprawiało od czasu, gdy po raz pierwszy zostało zgłoszone jako technika wizualizacji fragmentów w 1979 roku8. Technika ta została początkowo zmodyfikowana do wykrywania fragmentów DNA przez Bassama i wsp.6 w 1991 roku, a następnie poprawiony przez Sanguinettiego i współpracowników9 w 1994 roku. W ciągu ostatnich kilku dekad metoda została jeszcze bardziej zoptymalizowana6,7,9,10,11,12,13,14,15. Jednak większość z tych zaktualizowanych wersji protokołów nadal ma pewne wady, takie jak wysokie wymagania techniczne i długi czas przetwarzania na utrwalenie i montaż6, które ograniczają zastosowanie tych protokołów7,11. Optymalny protokół, który łączy niskie koszty z wysoką skutecznością wykrywania fragmentów DNA, jest pilnie potrzebny do rutynowego stosowania barwienia srebrem w badaniach biologicznych.
Ponadto, żel poliakrylamidowy można podzielić na denaturujące i niedenaturujące żele poliakrylamidowe, a oba mogą być używane do wykrywania markerów SSR za pomocą metody barwienia srebrem. Efekt i rozdzielczość nie różnią się znacząco, ale niedenaturujące żele poliakrylamidowe są łatwiejsze w obróbce i zajmują mniej czasu16.
Na podstawie poprzednich badań15, celem obecnego badania jest szczegółowe opisanie zoptymalizowanego protokołu barwienia srebrem w celu szybkiego, łatwego i taniego wykrywania markerów SSR w niedenaturującym żelu poliakrylamidowym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie produktów PCR markerów SSR
- Przygotuj wszystkie chemikalia i odczynniki do reakcji PCR, w tym matrycę DNA (30 ng / μL), 2× główną mieszaninę PCR (zawierającą 2× buforu PCR, 0,4 mM każdego dNTP, 3 mM MgCl2, 0,1 U/μL polimerazy Taq DNA i barwników), 10 μM każdego startera do przodu i do tyłu oraz wodę destylowaną lub dejonizowaną (dH2O).
UWAGA: Markery SSR użyte w niniejszym badaniu to PT51333 (sekwencja startera do przodu: 5 '-GCACCTTTGGTTATCCGACA-3' i odwrotna sekwencja startera: 5 '-TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA-3 ') i PT50903 (sekwencja startera do przodu: 5'-AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG' i odwrotna sekwencja startera: 5'- AGAGACTGCCGTTTGATTTGA -3') dla tytoniu oraz CX-43 (sekwencja startera do przodu: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCTCTCT-3' i odwrotna sekwencja startera: 5'- AGGGTTTTTTGGGGTGATA-3') oraz CX-157 (sekwencja startera do przodu: 5 '-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' i odwrotna sekwencja startera: 5 '-GGACAGCTTCACACATTTGC-3 ') do kwitnienia kapusty pekińskiej. - Przygotować 10 μl mieszanki PCR do amplifikacji, dodając 2 μl matrycy DNA, 5 μl 2× mieszanki wzorcowej PCR, 0,2 μl każdego startera do przodu i startera wstecznego oraz 2,6 μl dodH2O.
- Przeprowadzić reakcję amplifikacji PCR w termocyklerze z początkowym krokiem 94 °C przez 5 minut, następnie 38 cykli po 45 s w temperaturze 94 °C w przypadku denaturacji, 45 s w temperaturze 55 °C w przypadku wyżarzania startera i 1 minutą w temperaturze 72 °C w celu przedłużenia oraz końcowym etapem przedłużania trwającym 10 minut w temperaturze 72 °C; następnie przechowywać produkty PCR w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
2. Przygotowanie roztworów do odlewania żeli poliakrylamidowych
- Przygotować 1 l buforu 5× TBE, rozpuszczając 54 g zasady Tris i 27,5 g kwasu borowego wdH2O, dodając 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) i dostosowując roztwór do końcowej objętości 1 000 ml za pomocą dH2O.
UWAGA: Bufor TBE może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez wiele miesięcy. - Przygotować 2 l buforu o stężeniu 0,5× TBE, dodając 200 ml buforu 5× TBE dodH2O do końcowej objętości 2 l i przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 6% niedenaturujący roztwór żelu poliakryloamidowego, rozpuszczając 29 g akrylamidu klasy biologii molekularnej i 1 g N, N'-metylenobisakryloamidu klasy biologii molekularnej w buforze TBE o 0,5× do końcowej objętości 500 ml. Przykryj butelkę z roztworem folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
Uwaga: Akrylamid jest uważany za silną neurotoksynę i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Zawsze noś rękawice podczas ważenia proszku i obchodzenia się z roztworami, które go zawierają. - Przygotować 20% roztwór nadsiarczanu amonu (APS), rozpuszczając 2 g APS w dH2O do końcowej objętości 10 ml. Może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez wiele miesięcy.
UWAGA: Dla wygody 10 ml 20% roztworu APS można podzielić na 1,5 ml lub 2 ml probówek wirówkowych do przechowywania w temperaturze -20 °C. Rozmrozić i dobrze wymieszać przed użyciem. - Przygotować rozcieńczony roztwór silanu wiążącego, rozpuszczając 3 μl silanu wiążącego w 0,997 ml 95% etanolu zawierającego 0,5% kwasu octowego. Może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez tygodnie.
Uwaga: Bind-silan jest toksyczny, podczas obchodzenia się z roztworem należy nosić rękawice i utrzymywać wentylację pomieszczenia.
3. Przygotowanie żeli poliakrylamidowych do elektroforezy
- Umyj jeden zestaw szklanych talerzy i przekładek z detergentem w wodzie z kranu, a następnie całkowicie spłuczdH2O. Wysusz płytki na powietrzu, umieszczając je na stojaku do suszenia talerzy.
- Rozpuścić 1 ml roztworu silanu wiążącego na wewnętrznej powierzchni prostokątnej płytki szklanej i suszyć przez 5 min.
UWAGA: Jeśli roztwór silanu wiążącego nie zostanie równomiernie rozprowadzony na powierzchni płytki, żel może zostać oderwany podczas barwienia i spowodować niezadowalający efekt barwienia. - Rozprowadzić 1 ml silanu odstraszającego na wewnętrznej powierzchni płytki szklanej z karbem za pomocą wacika, zetrzeć nadmiar silanu odstraszającego bibułką i suszyć na powietrzu przez 5 minut
UWAGA: Jeśli silan odstraszający nie pokryje równomiernie powierzchni płytki szklanej, może uszkodzić żel poprzez częściowe zdzieranie. - Zamontuj szklane płytki z przekładkami z płytką zębatą na górze i clamp obie strony zespołu za pomocą odlewów clamps.
- Wlać odpowiednią ilość (40 ml) 6% roztworu żelu poliakryloamidowego bez denaturacji do zlewki na zestaw płytek o szerokości 33 cm × wysokości 10 cm i grubości przekładki 1,5 mm, dodać 20 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i 200 μLfresh 20% APS i delikatnie wymieszać.
UWAGA: Odpowiednią ilość (40 ml) roztworu żelu obliczono z wewnętrznej objętości dwóch płytek o grubości przekładek (30 cm × 8,5 cm × 0,15 cm). Jeśli chodzi o ilość TEMED i APS do polimeryzacji żelu, istnieje standardowy stosunek roztworu żelu do TEMED i APS oparty na referencji17. Opisany powyżej roztwór żelu jest przechowywany w temperaturze 4°C. Jeśli roztwór żelu jest przechowywany w temperaturze pokojowej, należy użyć 20 μl TEMED i 100 μl 20% APS. Delikatnie wymieszaj mieszaninę roztworu żelu szklanym patyczkiem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w roztworze. - Natychmiast i ostrożnie wlej roztwór do zmontowanych szklanych płytek wzdłuż krawędzi karbowanej płyty, wypełnij przestrzeń prawie do góry i włóż grzebień. Dodać niewielką ilość roztworu żelu na grzebień.
UWAGA: Szklane płytki należy trzymać poziomo, aby zapobiec wyciekaniu żelu. W razie potrzeby usuń wszelkie bąbelki za pomocą haczyka bąbelkowego. - Pozostaw żel na 30 minut do zastygnięcia w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Czas polimeryzacji może się zmieniać w zależności od temperatury roztworu żelu i otoczenia. - Po pełnej polimeryzacji żelu zdejmij zaciski odlewnicze i umieść zestaw płytek w zespole zbiornika do elektroforezy tak, aby płyta z karbem była skierowana w stronę górnego zbiornika buforowego i użyj dużych zacisków, aby przymocować zestaw płyt do zespołu zbiornika.
- Wlej 1 l 0,5× buforu TBE do każdej z górnych i dolnych komór. Wyjmij grzebień i dokładnie przepłucz wszystkie studzienki buforem za pomocą pipety lub strzykawki.
UWAGA: Upewnij się, że kanapka z żelem na dnie płytki jest całkowicie nasączona buforem bez żadnych pęcherzyków.
4. Żele do biegania
- Załadować około 1 μl produktu PCR do każdego dołka żelu poliakrylamidowego. Załaduj drabinkę wielkości DNA po obu stronach żelu wraz z próbkami produktów PCR. Przymocuj pokrywę bezpieczeństwa do górnej komory buforowej.
- Podłącz przewody do zasilania, dopasowując kolor czerwony do czerwonego i do czarnego. Uruchom żel przy stałym napięciu 110 V, aż barwnik osiągnie określoną pozycję, zwykle przez ~70 min.
UWAGA: Napięcie i czas pracy można dostosować do wielkości produktów PCR.
5. Barwienie srebrem do wykrywania markerów SSR w żelu innym niż poliakryloamid
- Po elektroforezie spuścić bufor z górnej komory do dużej zlewki za pomocą zaworu. Odczep boczne zaciski, wyjmij płytki z aparatu, ostrożnie oddziel karbowaną szklaną płytkę wzdłuż jednej strony szpatułką i upewnij się, że żel pozostaje przymocowany do drugiej szklanej płytki pokrytej silanem wiązania.
- Przygotować 1 l świeżego roztworu impregnacyjnego, rozpuszczając 1,5 gAgNO3 w 1 l dH2O. Przygotować 1 l świeżego roztworu rozwojowego, rozpuszczając 10 g NaOH w 900 ml dH2O, dodać 1 ml 37% formaldehydu i dostosować do końcowej objętości 1 l za pomocą dH2O.
UWAGA: Nosić rękawice i ostrożnie obchodzić się z powyższymi chemikaliami i roztworami. Nie jest konieczne przechowywanie roztworów i odpowiadających im kroków w ciemności. - Ostrożnie przepłukać płytkę żelową i szklaną dużą ilością dH2O, aby usunąć bufor do elektroforezy, a następnie umieścić płytkę z żelem skierowanym do góry na plastikowej tacy i zanurzyć żel w 1 l roztworu impregnującego. Umieść tacę na shakerze.
- Delikatnie potrząsaj tacą z prędkością 60 obr/min przez 3-4 min.
UWAGA: Czas wytrząsania można regulować w zależności od grubości żelu i stężenia azotanu srebra w roztworze impregnacyjnym. - Wyjmij płytkę z roztworu impregnującego i umieść ją na innej tacy. Spłucz resztki roztworu impregnującego z powierzchni płytki i żelu za pomocą dużej ilości dH2O dwa razy przez 3-5 s każdy.
- Umieść płytkę żelem skierowanym do góry na innej tacy, zanurz płytkę w 1 l roztworu do wywoływania, a następnie delikatnie potrząśnij tacką z prędkością 50 obr/min przez ~3 min. Monitoruj pojawianie się fragmentów DNA i zatrzymaj rozwój, gdy zaobserwuje się najwyższy stosunek sygnału fragmentów DNA do szumu tła (ten krok trwa ~3 min).
- Dwukrotnie przepłukać płytkę i żel dużą ilościądH2O, a następnie osuszyć płytkę żelową bibułką.
- Zeskanuj żel za pomocą odpowiedniego skanera. Rozdzielczość 300 dpi daje wyraźną wizualizację fragmentów DNA. Żel można również sfotografować za pomocą aparatu.
- Wzór prążkowania markerów SSR można ocenić na podstawie fragmentów DNA na obrazie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Amplikony PCR otrzymano przy użyciu odpowiednich par starterów SSR w kwitnącej kapuście pekińskiej oraz tytoniu. Po elektroforezie żele poliakrylamidowe zabarwiono zgodnie z powyższym protokołem barwienia srebrem, co pozwoliło na jednoznaczne wykrycie wzorów prążkowania markerów SSR (Rycina 1).
Aby porównać wydajność detekcji różnych protokołów barwienia srebrem, produkty PCR markerów SSR tytoniu or...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mycie żelu po impregnacji jest krytycznym krokiem. Zbyt krótki czas mycia i zbyt duża ilość wody mogą spowodować niepełne usunięcie roztworu impregnującego z powierzchni płytki i żelu oraz skutkować ciemnym tłem. Odpowiedni czas rozwoju jest kolejnym kluczowym krokiem, nadmierny rozwój może skutkować ciemnobrązowym tłem z obrazem fragmentów DNA o niskim kontraście. Ponadto etap impregnacji znacząco wpływa na skuteczność barwienia fragmentów DNA. Chociaż wydłużenie czasu impregnacji powyżej 5 minut lub zwiększenie ilości<...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych Guangdong (2015A030313500), Prowincjonalną Kluczową Międzynarodową Platformę Badawczą oraz Główny Projekt Naukowo-Badawczy Szkolnictwa Wyższego w Guangdong (2015KGJHZ015), Plan Nauki i Technologii Guangdong Tobacco Monopoly Administration (201403, 201705), Plan Nauki i Technologii Guangdong w Chinach (2016B020201001), Krajowy Projekt Szkolenia Innowacyjnego dla Studentów Studiów Licencjackich Studenci (201711078001). Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach handlowych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mieszanka wzorcowa PCR (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, Chiny | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA# | 170-8200 | |
| Marker DNA DL500 | Takara Bio Inc., Japonia | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, Chiny | #77-86-1 | |
| Kwas borowy | Sangon Biotech Szanghaj, Chiny | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Fabryka odczynników chemicznych w Kantonie, Chiny# | 6381-92-6 | |
| Akrylamid | Sangon Biotech Szanghaj, Chiny | #79-06-1 | |
| N,N'-metyleno-bis-akryloamid | Sangon Biotech Szanghaj, Chiny# | 110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina | Sangon Biotech Szanghaj, Chiny | #110-18-9 | |
| Nadsiarczan amonu | Guangzhou Chemical Reagent Factory, Chiny | #7727-54-0 | |
| Bind-silan | Solarbio Pekin, Chiny#B8150 | ||
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Chiny | #7761-88-8 | |
| Fabryka odczynników chemicznych Formaldehyd Tianjin DaMao, Chiny | #50-00-0 | ||
| Fabryka odczynników chemicznych NaOH Guangzhou, Chiny | #1310-73-2 | ||
| Kwas octowy | Fabryka odczynników chemicznych w Kantonie, Chiny | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Fabryka odczynników chemicznych Tianjin DaMao, Chiny# | 497-19-8 | |
| Fabryka | odczynników chemicznych etanolu w Kantonie, Chiny | #64-17-5 | |
| HNO< sub>3 | Fabryka odczynników chemicznych w Kantonie, Chiny# | 7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd, Chiny | #10102-17-7 | |
| Eriochromowa czerń T (EBT) | Tianjin DaMao Fabryka odczynników chemicznych, Chiny | #1787-61-7 | |
| Plastikowa taca | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, Chiny-TS-1 | ||
| Wytrząsarka | Qilinbeter JiangSu, Chiny-Skaner | ||
| BenQ M800 BenQ | , Chiny-DYY-6C | ||
| Zasilacz | Beijing Liuyi Instrument Factory, Chiny-High | ||
| w pionowych systemach żelowych, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, Chiny | - |
Bibliografia
- Jiang, G. L. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. Anderson, S. B. , InTech Press. Croatia. 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, PMID:7840973 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, PMID: 8983182 1102-1108 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
