Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt

Podsumowanie

Ten protokół zawiera przegląd procedur izolacji RNA do transkryptomicznego profilowania tkanek węzłów chłonnych od dużych zwierząt, w tym etapy identyfikacji i wycinania węzłów chłonnych od zwierząt gospodarskich i dzikich, podejścia do pobierania próbek w celu zapewnienia spójności wśród wielu zwierząt, oraz rozważania oraz reprezentatywne wyniki dotyczące konserwacji i przetwarzania po pobraniu do analizy RNA.

Streszczenie

Duże zwierzęta (zarówno żywe, jak i dzikie) służą jako ważne rezerwuary patogenów odzwierzęcych, w tym Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella i E. coli, i są przydatne do badania patogenezy i/lub rozprzestrzeniania się bakterii w naturalnych gospodarzach. Ze względu na kluczową funkcję węzłów chłonnych w odpowiedzi immunologicznej gospodarza, tkanki węzłów chłonnych służą jako potencjalne źródło RNA do dalszych analiz transkryptomicznych w celu oceny czasowych zmian w ekspresji genów w komórkach w trakcie infekcji. W artykule przedstawiono przegląd procesu pobierania węzłów chłonnych, pobierania próbek tkanek i dalszego przetwarzania RNA u zwierząt gospodarskich na przykładzie bydła (Bos taurus), z dodatkowymi przykładami z bizona amerykańskiego (Bison bison). Protokół zawiera informacje o lokalizacji, identyfikacji i usunięciu węzłów chłonnych z wielu kluczowych miejsc w organizmie. Dodatkowo przedstawiono metodologię pobierania próbek z biopsji, która pozwala na spójność pobierania próbek od wielu zwierząt. Omówiono kilka kwestii związanych z konserwacją próbek, w tym generowanie RNA odpowiedniego dla dalszych metodologii, takich jak sekwencjonowanie RNA i RT-PCR. Ze względu na duże opóźnienia nieodłącznie związane z badaniami przebiegu czasowego dużych zwierząt i myszy, przedstawiono reprezentatywne wyniki z tkanek węzłów chłonnych żubra i bydła w celu opisania przebiegu degradacji w tym typie tkanki, w kontekście przeglądu wcześniejszych prac metodologicznych dotyczących degradacji RNA w innych tkankach. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten będzie przydatny zarówno dla badaczy weterynarii rozpoczynających projekty transkryptomu na dużych próbkach zwierzęcych, jak i dla biologów molekularnych zainteresowanych poznaniem technik pobierania próbek tkanek in vivo i przetwarzania in vitro.

Wprowadzenie

Analiza sekwencjonowania RNA transkryptomu węzłów chłonnych daje możliwość scharakteryzowania odpowiedzi immunologicznej zwierząt na różne patogeny. Chociaż metodologia ta była szeroko stosowana u myszy, ostatnio analizy rozszerzyły się na większe ssaki^1,2. Węzły chłonne zwierząt gospodarskich/dużych zwierząt mogą być wykorzystywane do charakteryzowania odpowiedzi gospodarza na zakażenie, nie tylko do wykorzystania w badaniach nad szczepionką lub wrażliwością genetyczną oraz do identyfikacji celów rozwoju leków, ale także jako systemy modelowe dla badań nad chorobami odzwierzęcymi u ludzi. Na przykład w przypadku brucelozy (odzwierzęcej choroby bakteryjnej, która każdego roku dotyka pół miliona ludzi na całym świecie), pomimo znacznie zwiększonych kosztów, badania na owcach lub kozach są bardziej istotne dla zakażenia człowieka i opracowania szczepionki dla ludzi niż laboratoryjne modele zwierzęce. Modele infekcji u myszy podsumowują infekcję układu siateczkowo-śródbłonkowego, ale nie podsumowują charakterystycznych objawów klinicznych³_.

W dużych eksperymentach na zwierzętach, w porównaniu do badań na zwierzętach laboratoryjnych, proces pobierania tkanek z konieczności wiąże się z dłuższym opóźnieniem między eutanazją a pobraniem tkanki, co stanowi potencjalne wyzwanie dla zachowania wysokiej jakości RNA. Nienaruszony RNA jest niezbędny do generowania biologicznie istotnych danych transkryptomicznych. Generowanie wysokiej jakości RNA z próbek tkanek jest szczególnie ważne w przypadku dużych badań patogenów zwierzęcych prowadzonych w obiektach przechowawczych. Takie badania są z natury trudniejsze do przeprowadzenia, ponieważ nie tylko wymagają zatwierdzonych obiektów i wysoko wykwalifikowanego personelu, ale także wiążą się ze znacznymi kosztami finansowymi, które w zależności od pracy mogą wynosić od dziesiątek do setek tysięcy dolarów. Tego typu badania obejmują również interdyscyplinarną współpracę i interdyscyplinarną wiedzę na temat ich ukończenia, co zwiększa ich złożoność. W związku z tym szkolenie, opracowywanie i stosowanie się do uproszczonego systemu pobierania i przechowywania próbek zapewnia znaczące korzyści w dalszych badaniach molekularnych tkanek pochodzących od zakażonych zwierząt.

Pobieranie większych węzłów chłonnych stanowi dodatkowe wyzwanie dla pobierania tkanek w porównaniu do podobnego pobierania próbek mysich węzłów chłonnych. Przygotowanie do wycięcia próbki wymaga podstawowej wiedzy na temat anatomii węzła chłonnego, w tym odpowiednich struktur wewnętrznych. Struktura węzła chłonnego składa się ze zrazików limfatycznych otoczonych zatokami wypełnionymi limfą. Struktury te są zamknięte w twardej, włóknistej kapsułce. ⁴ Zrazik limfatyczny jest "podstawową anatomiczną i funkcjonalną jednostką węzła chłonnego" i składa się z pęcherzyków, głębokiej jednostki korowej oraz rdzeni rdzeniowych i zatok⁴ (Rysunek 1A). Limfocyty B i T są domem odpowiednio dla pęcherzyków i głębokich jednostek korowych. Struktury te zapewniają rusztowanie 3D i ułatwiają interakcję między limfocytami a komórkami prezentującymi antygen lub antygen.

Grubo, mieszki włosowe i głębokie jednostki korowe można zidentyfikować na powierzchni cięcia, ponieważ zawierają gęstszą siatkowatą siatkę i wydają się ciemniejsze niż zatoki, które składają się z delikatniejszej siatki siatkowej i wydają się jaśniejsze (Rysunek 1B). Zgodnie z konwencją patolodzy odnoszą się do regionów węzłów chłonnych jako korę powierzchowną (pęcherzyki), parakorę (głębokie jednostki korowe) i rdzeń (rdzenie rdzeniowe i zatoki). Prawidłowe badanie wszystkich trzech regionów zostało uznane za najlepszą praktykę w rutynowych wytycznych dotyczących badań patologicznych węzłów chłonnych⁵. Należy zauważyć, że istnieje znaczna różnica w konsystencji, wielkości i kolorze węzłów chłonnych, nawet w obrębie jednego zwierzęcia. Wraz z wiekiem ich węzły chłonne będą miały tendencję do zmniejszania się i stawania się twardsze niż u młodszych zwierząt, zazwyczaj z powodu wzrostu ich tkanki łącznej i zmniejszenia normalnej struktury limfatycznej^6,7.

Rycina 1. Anatomia węzła chłonnego. (A) Ten obrazek z kreskówki pokazuje anatomię węzła chłonnego, przedstawiając kluczowe struktury. (B) Zdjęcie to pokazuje przecięty w przekroju poprzecznym bydlęcy węzeł chłonny. Odpowiednie struktury/warstwy, które są widoczne gołym okiem, są podświetlone. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W zależności od pytania eksperymentalnego, różne węzły chłonne będą interesujące do pobrania i analizy. Obwodowe węzły chłonne to te, które znajdują się głęboko w tkance podskórnej. U bydła obwodowe lub powierzchowne węzły chłonne często stosowane w praktyce klinicznej i eksperymentalnej obejmują ślinianki przyuszne, podżuchwowe, zagardłowe, przedłopatkowe, przedudkowe (przedczaszkowe) i pachwinowe powierzchowne (nadpiersiowe u samic, moszny u samców) (ryc. 2). W tabeli 1 przedstawiono właściwości kluczowych powierzchownych węzłów chłonnych, zgodnie z opisem w cattle system⁸. Poniżej przedstawiono niektóre potencjalne plany pobierania węzłów chłonnych w kierunku zakaźnych chorób bakteryjnych bydła jako punkt wyjścia do badań.

Brucella abortus/Brucella melitensis: Standardowe sekcje zwłok bydła zakażonego B. aortus i kóz zakażonych B. melitensis w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt odzyskują tkankę węzłów chłonnych nadpiersiowych, przedłopatkowych i przyusznych, zarówno do mielenia do oznaczania bakterii, jak i do przygotowania RNA do profilowania ekspresji RNA gospodarza. B. abortus może być regularnie wykrywany w każdym z tych węzłów chłonnych u eksperymentalnie zakażonego bydła⁹_. Obecność bakterii w każdym z tych typów węzłów chłonnych można wykryć u kóz zakażonych B. melitensis do co najmniej dziewięciu miesięcy po zakażeniu przy użyciu metodologii opartej na RNA z naszych badań (Boggiatto i wsp., niepublikowane). Salmonella sp.: Węzły chłonne przedłopatkowe, podbiodrowe (przedudowe) i krezkowe były przydatne podczas profilowania tusz bydlęcych pod kątem występowania Salmonelli^10,11,12 i byłyby potencjalnie interesujące dla badań transkryptomicznych. E. coli O157:H7: Węzły chłonne krezkowe (w środkowej części jelita cienkiego i dystalnej lokalizacji jelita cienkiego) mogą być miejscami sporadycznego powrotu bakterii u zakażonych cieląt (ale nie u zakażonego dorosłego bydła)¹³. Leptospiroza (Leptospira sp.): Zaobserwowano przewlekłe utrzymywanie się bakterii w węzłach chłonnych drenujących gruczoł sutkowy¹⁴. Mycobacterium bovis: U bydła bakterie zostały odzyskane po eksperymentalnym zakażeniu z węzłów chłonnych śródpiersia i tchawicy i oskrzeli cieląt¹⁵. Dodatkowo, RNA węzłów chłonnych zostało wykorzystane do zbadania odpowiedzi dużych zwierząt gospodarza na wirusy, takie jak wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń². Rycina 2 przedstawia lokalizację podzbioru tych głównych węzłów chłonnych w ciele bydła.

Rycina 2: Rysunek przedstawiający wybrane lokalizacje węzłów chłonnych w Bos taurus. Ponumerowane węzły chłonne są opatrzone adnotacjami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W tym artykule i powiązanym filmie prezentujemy protokół izolacji dużych węzłów chłonnych zwierząt do badań RNA, zaprojektowany jako informacyjny dla biologów molekularnych zaangażowanych w badania transkryptomiczne infekcji dużych zwierząt. Po pierwsze, przedstawiamy przegląd procedury izolacji węzłów chłonnych, na przykładzie pobierania próbek z tkanek bydła i żubrów. Tej demonstracji, jak pokazano na filmie, towarzyszy proces pobierania powtarzalnego próbki tkanki w celu izolacji RNA. Następnie opisujemy ważne kwestie związane z przetwarzaniem zakażonego węzła chłonnego, koncentrując się na bezpieczeństwie, spójności i jakości RNA.

Przygotowanie RNA z tkanki za pomocą zakwaszonego odczynnika izotiocyjanianu fenolu i guanidyny opiera się na oryginalnej metodzie Chomczynskiego i Sacchi^16,17, z oczyszczaniem za pomocą kolumn wirowych na bazie krzemionki w obecności czynników chaotropowych opartych na oryginalnej pracy Vogelsteina i Gillespie¹⁸. Badamy również potencjał odzyskiwania RNA do transkryptomiki z węzłów chłonnych bydła zachowanych metodami alternatywnymi. Na koniec badamy wpływ zmiennej czasowej na jakość RNA w sekcjach zwłok dużych zwierząt, w tym reprezentatywny eksperyment przedstawiający wpływ wydłużenia czasu między eutanazją a pobraniem próbki na odzyskany profil RNA od żubrów i węzłów chłonnych bydlęcych. Artykuł ten będzie przydatny nie tylko dla biologów molekularnych, ale także dla badaczy weterynarii rozpoczynających badania transkryptomiczne.

Protokół

Przedstawione tutaj procedury sekcji zwłok zwierząt są objęte zatwierdzonymi protokołami IACUC w National Animal Disease Center, Ames, IA. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi dotyczącymi opieki i dobrostanu zwierząt.

1. Wstępne planowanie przed sekcją

zwłok

1. Przed sekcją zwłok należy przygotować następujące materiały do transportu do pracowni sekcji zwłok:
   1. Probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 lub 2 ml wypełnione ~ 1,0 ml roztworu konserwującego RNA, w stojaku lub pojemniku transportowym. Należy postępować zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi stosunku objętości roztworu konserwującego do objętości tkanki.
   2. Jednorazowe skalpele i czyste, autoklawizowane kleszcze: jeden zestaw do preparowania skóry i inny zestaw do pobierania węzłów chłonnych (po jednym na każdy węzeł chłonny, na zwierzę), zapobiegając w ten sposób zanieczyszczeniu krzyżowemu skóry i flory środowiskowej z tkankami węzłów chłonnych.
   3. Narzędzia do biopsji dziurkowanej 3 mm, noże do sekcji zwłok, pojemnik na ostre przedmioty na zużyte skalpele i narzędzia do biopsji oraz deski do krojenia lub jednorazowe tacki do stosowania przy rozwarstwianiu węzłów chłonnych.
   4. Stosować środki ochrony osobistej, w tym środki ochrony indywidualnej wymagane do pracy na poziomie BSL odpowiednim dla systemu.
   5. Autoklaw metalowych narzędzi wielokrotnego użytku, w tym kleszczy, w metalowych patelniach przed sekcją zwłok, przy użyciu ustawienia przybory kuchenne/suche produkty.

2. Identyfikacja i pobieranie próbek węzłów chłonnych u bydła i żubrów

Rysunek 3. Węzły chłonne głowy i szyi bydła. (A) Rysunek ten pokazuje wybrane węzły chłonne głowy i szyi Bos taurus. (B) Ten obraz przedstawia węzeł chłonny przyuszny w przekroju (po lewej) w porównaniu z ślinianką przyuszną w przekroju (po prawej). Zwróć uwagę na różnicę w teksturach między tymi dwoma typami tkanek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Izolacja węzłów chłonnych przedłopatkowych u bydła i żubrów
   1. Poddać eutanazji zwierzę (bydło lub żubry w dowolnym wieku, w zależności od potrzeb eksperymentu) w oparciu o lokalny protokół IACUC. Potwierdź zgon metodami szczegółowo opisanymi w instytucjonalnym protokole IACUC, w tym brakiem bicia serca, brakiem oddychania i brakiem odruchu rogówkowego. Przenieś zwierzę na podłogę sekcji zwłok.
      Uwaga: Istnieją różne metody humanitarnej eutanazji stosowane w praktyce laboratoryjnej dużych zwierząt. Jednak dożylne podawanie roztworu pentobarbitalu sodu i fenytoiny sodowej jest najczęściej zatwierdzoną i stosowaną formą. Zapoznaj się z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt. ¹⁹
      UWAGA: Postępuj zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi protokołami bezpieczeństwa biologicznego dotyczącymi sekcji zwłok w instytucji przyjmującej, w tym z wytycznymi dotyczącymi bezpiecznego usuwania ostrych narzędzi w pojemniku odpornym na przebicie oraz odkażania metalowych noży i kleszczy wielokrotnego użytku. Protokół ten generuje odpady ostrych przedmiotów w wyniku użycia jednorazowych skalpeli. Nosić środki ochrony osobistej zgodnie z wytycznymi instytucji, w tym buty, kombinezony, rękawice i ochronę oczu.
   2. Zidentyfikuj 3 uczestników, którzy będą pracować nad tkankami zwierzęcymi.
      Uwaga: W tym przypadku sekcja 1 będzie odpowiedzialna za przekroje na dużą skalę pożądanych tkanek zwierzęcych, sekcja 2 odzyska węzły chłonne z różnych odcinków zwierzęcych, a sekcja 3 będzie pracować przy osobnym stole, aby wyizolować sekcje z każdego węzła chłonnego i przenieść je do probówek z roztworem konserwującym.
   3. Zacznij od umieszczenia zwierzęcia w pozycji bocznej.
   4. Wyprostuj ramię, przesuwając przednią kończynę do tyłu na poziomie kolana (nadgarstka); ten ruch cofnie ramię i pozwoli na łatwiejsze badanie palpacyjne węzła chłonnego. Wyczuj obecność "guzka" węzła chłonnego.
      Uwaga: W stanach chorobowych może występować powiększenie węzłów chłonnych, co ułatwia identyfikację węzłów chłonnych, ale proces ten może również wpływać na konsystencję, skład i architekturę węzła chłonnego.
   5. Po zlokalizowaniu, przy nadal wyprostowanym ramieniu, użyj skalpela lub noża do sekcji zwłok, aby wykonać nacięcie skóry wzdłuż konturu ramienia.
      Uwaga: Nie należy ograniczać wielkości nacięcia, nawet jeśli węzeł chłonny został zlokalizowany w badaniu palpacyjnym. Większe nacięcie zapewnia łatwiejszy dostęp do głębszych tkanek i ułatwia wycięcie węzła chłonnego przez sekcję zwłok.
   6. Za pomocą kleszczy cofnij skórę, aby odsłonić punkt mięśni ramion i szyi.
      Uwaga: Węzeł chłonny przedłopatkowy często znajduje się w tłuszczu podskórnym, zwłaszcza u zwierząt kondycjonowanych.
   7. Jeszcze raz zbadaj palpacyjnie położenie węzła chłonnego (Rysunek 3A).
      Uwaga: W przeciwieństwie do tłuszczu podskórnego, węzeł chłonny zachowa swój kształt po domacaniu palpacyjnym. Dodatkowo węzły chłonne nie przylegają do żadnej otaczającej tkanki, ponieważ są otoczone cienką włóknistą torebką.
   8. Po zlokalizowaniu węzła chłonnego przedłopatkowego należy ostrożnie wyciąć podskórną tkankę tłuszczową za pomocą skalpela i kleszczy oraz wyizolować węzeł chłonny.
      1. Poszukaj obecności cienkiej włóknistej kapsułki, jak pokazano w Rycina 1B, aby odróżnić węzeł chłonny od tkanki tłuszczowej; węzły chłonne nie przylegają do żadnej otaczającej tkanki.
   9. Przenieś węzeł chłonny na stół do wycinki węzłów chłonnych, używając plastikowej tacki do transferu tkanki, w celu dalszego cięcia.
      Uwaga: Wygląd tych węzłów chłonnych u żubrów jest podobny. Powiązany film przedstawia wygląd węzła chłonnego przedłopatkowego wyciętego z prawego ramienia bizona amerykańskiego.
2. Izolacja węzłów chłonnych ślinianek przyusznych u bydła i żubrów
   1. Zacznij od umieszczenia zwierzęcia w pozycji leżącej bocznej na podłodze sekcji zwłok. Zlokalizuj staw skroniowo-żuchwowy (TMJ).
      1. Jeśli jest to trudne do zlokalizowania, poruszaj żuchwą powoli i określ miejsce, w którym żuchwa przyczepia się do czaszki; to jest staw skroniowo-żuchwowy.
   2. Za pomocą skalpela lub noża do sekcji zwłok ostrożnie wykonaj nacięcie w skórze. Rozpocznij nacięcie grzbietowo do stawu i rozciągnij je brzusznie/pionowo wzdłuż linii żuchwy.
   3. Odetnij skórę, aby odsłonić tkankę podskórną. Ślinianka przyuszna będzie widoczna jako pierwsza, ze względu na jej duży rozmiar, zrazikowany wygląd powierzchni i czerwone zabarwienie.
   4. Za pomocą kleszczy i skalpela odsuń śliniankę przyuszną na bok, aby znaleźć węzeł chłonny ślinianki przyusznej znajdujący się tylko czaszkowo i przyśrodkowo do ślinianki (Rysunek 3A). Zbadaj tkankę węzła chłonnego ślinianki przyusznej pod kątem tekstury przed dalszym przetwarzaniem.
      Uwaga: Węzły chłonne twarzy (ślinianka przyuszna i podżuchwowa) są związane z gruczołami ślinowymi, co może zakłócać izolację węzłów chłonnych. W porównaniu z węzłami chłonnymi gruczoły ślinowe są znacznie większe i mają zrazikowany wygląd powierzchni. Co więcej, na powierzchni cięcia gruczoły ślinowe są jednorodne z natury i nie wykazują klasycznego korowego i rdzeniastego wzorca architektonicznego węzłów chłonnych (Ryc. 3B).
   5. Wytnij gruczoł skalpelem. Przenieś go na stół do wycinki węzłów chłonnych, używając plastikowej tacki do transferu tkanki, w celu dalszego cięcia.
3. Izolacja węzłów chłonnych nadsutkowych u samic bydła i żubrów
   1. Umieść zwierzę w pozycji bocznej.
   2. Podnieś tylną nogę, aby odsłonić okolicę pachwinową i zlokalizować wymię.
      Uwaga: U zdrowego zwierzęcia niew okresie laktacji badanie palpacyjne tych węzłów chłonnych może nie być możliwe. U zwierzęcia w okresie laktacji te węzły chłonne mogą być wyczuwalne palpacyjnie na ogonowej granicy podstawy wymienia.
   3. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie tuż nad grzbietem wymienia, biegnąc wzdłuż górnej części nogi, aby odsłonić gruczoły nadsutkowe.
   4. Wypreparuj tkankę podskórną i znajdź węzeł chłonny nadsutkowy osadzony w cienkiej warstwie podskórnej tkanki tłuszczowej. Jeśli nie można go wizualnie odróżnić, należy zbadać palpacyjnie odsłoniętą tkankę pod kątem obecności twardej struktury w podskórnej tkance tłuszczowej.
   5. Za pomocą kleszczy i skalpela ostrożnie wypreparuj węzeł chłonny z tłuszczu. Przenieś go na stół do wycinki węzłów chłonnych, używając plastikowej tacki do transferu tkanki, w celu dalszego cięcia.

3. Cięcie i przechowywanie węzłów chłonnych

1. Przełóż izolowane węzły chłonne z dysektora 2 do dysektora 3 na stole sekcyjnym przylegającym do głównej przestrzeni sekcji zwłok. Umieść każdy węzeł chłonny na świeżym fragmencie deski do krojenia. Wstępnie oznacz deski do krojenia w sekcjach według węzłów chłonnych, aby ułatwić odbiór wielu węzłów chłonnych po kolei. W przypadku próbek zakaźnych należy używać jednorazowych tacek.
2. Za pomocą kleszczy i jednorazowego skalpela lub noża do sekcji zwłok usuń fragment węzła chłonnego. Za pomocą ostrego noża wykonaj cięcie strzałkowe, aby otworzyć węzeł chłonny.
3. Zbadaj wnętrze węzła chłonnego, zwłaszcza w próbkach pochodzących od zakażonych zwierząt, szukając asymetrii, zmian chorobowych, różnic kolorystycznych itp. Zapisz obserwacje.
4. (Opcja 1) Małe skrawki tkanek
   1. Użyj jednorazowych skalpeli, aby wyciąć kawałki każdego węzła chłonnego o grubości mniejszej niż 5 mm i przenieś każdy kawałek do probówki z roztworem konserwującym RNA za pomocą czystych kleszczy.
5. (Opcja 2) Biopsja węzłów chłonnych lub metodologia sekcji
   Uwaga: Biopsje lub metodologie cięcia, gdy są stosowane do równoległych odcinków węzłów chłonnych w różnych węzłach i zwierzętach, zapewniają spójność pobranej tkanki do analizy masowego RNA.
   1. Metoda cięcia klinowego
      1. Po zbadaniu odcinka strzałkowego w celu uchwycenia komórek w poprzek profilu węzła chłonnego, wytnij klin w kształcie ciasta od węzła chłonnego, od środka do zewnętrznej torebki. W przypadku węzła o szerokości 2 cm (rozmiar standardowy; patrz tabela 1), klin przycięty do środka, który ma 4 mm długości łuku zewnętrznego i 5 mm grubości, będzie miał mokrą masę ~ 100 mg.
      2. Za pomocą skalpela pokrój klin na małe kawałki, nie grubsze niż 5 mm i około 50 - 100 mg każdy w masie mokrej tkanki.
         Uwaga: Aby uzyskać spójność, przetrzyj wszystkie kawałki klina z pojedynczego węzła chłonnego w jednej partii lub w oddzielnych probówkach, a następnie połącz RNA, aby uzyskać reprezentatywny profil RNA z interesującego węzła chłonnego.
      3. Umieść fragmenty tkanek za pomocą kleszczyków w probówkach zawierających co najmniej 10 objętości roztworu konserwującego RNA w porównaniu z objętością tkanki.
   2. Metoda biopsji dziurkowej
      1. Wybierz narzędzie do biopsji stempla, jeśli celem jest pobranie określonych odcinków, takich jak określone pęcherzyki z węzła. Wybierz narzędzie zgodne z wielkością próbki pożądanej do pobrania. Narzędzia do biopsji dziurkowej są dostępne w różnych rozmiarach, o średnicy od 1 do 8 mm.
      2. Wizualnie zlokalizuj obszary zainteresowania do pobrania w węźle chłonnym.
      3. Użyj narzędzia do biopsji dziurkowania, aby wyciąć interesujące Cię sekcje, naciskając i obracając narzędzie w tkance, aby utworzyć rdzeń. Przenieś fragment tkanki za pomocą kleszczyków do probówki zawierającej co najmniej 10 objętości roztworu konserwującego RNA. Jeśli jest grubszy niż 5 mm, użyj kleszczy i skalpela, aby dalej podzielić tkankę na mniejsze kawałki.
6. Po przeniesieniu próbek do roztworu konserwującego (np. RNALater) należy je przetransportować z powrotem do laboratorium w temperaturze pokojowej.
7. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić penetrację tkanek.
8. Następnego dnia odlej nadmiar roztworu konserwującego RNA i przechowuj próbki tkanek w temperaturze -80 °C. Przed zamrożeniem próbek należy usunąć jak najwięcej środka konserwującego. Użyj końcówki do mikropipet P1000 i/lub P200, aby skutecznie usunąć roztwór konserwujący RNA.
   UWAGA: Zdekantowany roztwór konserwujący należy odpowiednio wyrzucić, w oparciu o właściwości infekcyjne zastosowanego patogenu, a także zagrożenia chemiczne i środowiskowe związane z roztworem konserwującym, jak określono w karcie charakterystyki.
   Uwaga: Podane tutaj wytyczne dotyczą roztworu do konserwacji RNA opisanego w Tabeli materiałów. Zapoznaj się z wytycznymi producenta w przypadku korzystania z alternatywnych rozwiązań konserwujących.

4. Przetwarzanie z węzłów chłonnych RNA

UWAGA: Nosić fartuch laboratoryjny, rękawice i odpowiednią ochronę oczu podczas etapów przetwarzania.

Uwaga: Użyty tutaj odczynnik na bazie fenolu jest opisany w Tabeli Materiałów (a protokół jest oparty na wytycznych producenta)²⁰. Stosowanie alternatywnych odczynników na bazie fenolu może wymagać modyfikacji procedury, w oparciu o zalecenia producenta dla konkretnego zakupionego produktu.

1. Przed uzyskaniem dostępu do próbek, należy wstępnie podwielokrotnić schłodzony (4 °C) odczynnik na bazie fenolu do probówek homogenizacyjnych (1,5 ml/probówkę) za pomocą pipety.
   UWAGA: Fenol jest toksyczny, i stanowi zagrożenie dla zdrowia. Chloroform jest toksyczny i stanowi zagrożenie dla zdrowia. Wykonaj kroki przetwarzania 4.1 - 4.9 w okapie oparowym chemikaliów i załóż rękawice, aby zapobiec kontaktowi z chemikaliami. W Stanach Zjednoczonych chloroform jest odpadem niebezpiecznym; Probówki zawierające odpady niebezpieczne należy utylizować zgodnie z lokalnymi i instytucjonalnymi wytycznymi. Przetwarzaj próbki tkanek od zwierząt zakażonych patogenami zgodnie z odpowiednimi wytycznymi BSL-2, BSL-3 lub BSL-4.
2. Po odjęciu próbki z probówek do mikrowirówek za pomocą czystych kleszczyków, należy natychmiast przenieść około 50 - 100 mg zakonserwowanej tkanki do probówki homogenizacyjnej zawierającej odczynnik na bazie fenolu.
   1. Ograniczyć rozmrażanie przed dodaniem do odczynnika na bazie fenolu. Przechowywać na suchym lodzie, gdy wiele próbek jest wyjmowanych z zamrażarki w celu przetworzenia.
3. Szczelnie zakryj probówkę, umieść ją na homogenizatorze i homogenizuj próbkę za pomocą homogenizatora tkankowego wirnik-stojan w odczynniku na bazie fenolu. Zakończ przetwarzanie w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu sprawdzić, czy próbka nie jest mętna, aby upewnić się, że została pomyślnie zhomogenizowana; Tkanka powinna być rozproszona w mętnej zawiesinie.
   Uwaga: Stosuje się ustawienie ekstrakcji RNA trwające 2 minuty (wstępnie ustawione ustawienie RNA_02_1 dla homogenizatora opisane w Tabeli Materiałów; przeznaczone dla tkanek mrożonych). Wirnik-stojan określony w niniejszym protokole (patrz tabela materiałów) jest wielkozębny i przystosowany do homogenizacji szeregu rodzajów tkanek, w tym materiału włóknistego. Ustawienie RNA_02_01 zostało zaprojektowane specjalnie dla tkanek mrożonych (w przeciwieństwie do świeżych). Ponieważ węzły chłonne mają włókniste składniki tkanki łącznej, zaleca się podobnie zoptymalizowany homogenizator wirnik-stojan w celu uzyskania skutecznej dysocjacji. Zobacz National Institute of Environmental Health Sciences²¹, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat zaleceń dotyczących homogenizacji.
   1. Jeśli po homogenizacji pozostaną duże fragmenty tkanki, powtórz procedurę homogenizacji. Aby skutecznie odzyskać RNA, tkanka musi być dobrze zdysocjowana.
   2. W przypadku bardziej włóknistych kawałków węzłów chłonnych użyj kleszczy i nożyczek, aby wstępnie posiekać kawałek węzła chłonnego na kilka mniejszych kawałków przed przeniesieniem do probówki homogenizującej. Jak opisano we wprowadzeniu, tkanki węzłów chłonnych starszych zwierząt mogą być bardziej włókniste.
      Uwaga: Jeśli pożądana jest podwójna analiza RNA gospodarza i patogenu, może być konieczne dodatkowe leczenie (takie jak homogenizacja kulek) w celu odzyskania bakteryjnego RNA, zwłaszcza jeśli w tkankach obecne są patogeny Gram-dodatnie.
4. Natychmiast wyjmij homogenizowaną próbkę z probówek i przenieś ją do probówek wirówkowych bez RNaz (o pojemności 2,0 ml) za pomocą mikropipety P1000.
5. Odwirować próbkę przez 5 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich resztek próbki. Za pomocą końcówki do mikropipet P1000 przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki, pozostawiając osad.
6. Inkubować supernatant przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Podziel każdą próbkę na dwie probówki do mikrowirówek po 1,5 metra.
7. Dodać 0,2 ml chloroformu na 1 ml odczynnika na bazie fenolu (tj. 0,3 ml na 1,5 ml próbki); odwrócić go ręcznie przez 1 - 2 minuty w celu wymieszania faz, ale nie należy mieszać próbki. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
8. Odwirowywać przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
9. Ostrożnie usunąć górną, przezroczystą fazę wodną za pomocą końcówki mikropipety (P1000 lub P200), która utworzy górną warstwę, nie przerywając interfazy ani czerwonej warstwy fenolu i chloroformu. Przenieś go do nowej probówki do mikrowirówki.
10. Wymieszaj go z równą objętością 100% etanolu; dokładnie wymieszaj, odwracając rurkę 4 - 5 razy. Rurka często wydaje się mętna.
11. Za pomocą końcówki do mikropipet przenieś ciecz do komercyjnej kolumny wirowej na bazie krzemionki w celu dalszego oczyszczenia i elucji RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta²². Eluować RNA wytworzone z ~ 50 mg tkanki w 50 - 100 μl wody wolnej od RNaz.
    Uwaga: Podczas gdy ekstrakcja odczynnikiem na bazie fenolu usuwa DNA w fazie organicznej, w przypadku dalszego wykorzystania RNA w zastosowaniach qRT-PCR i/lub sekwencjonowania RNA zaleca się dodatkowe traktowanie próbek RNA DNazą.
12. Podwielokrotność wymytego RNA należy rozdzielić do oddzielnych probówek w celu wykorzystania w ocenie ilościowej i jakości, aby zmniejszyć ryzyko zamrożenia i rozmrożenia głównej próbki RNA. Przenieść probówki do temperatury -80 °C w celu przechowywania.
13. W przypadku próbek węzłów chłonnych pochodzących od zwierząt zakażonych patogenami odzwierzęcymi, zwłaszcza na poziomie hermetyczności BSL-3, należy zwalidować otrzymaną próbkę RNA pod kątem braku patogenów, jeśli próbka zostanie przeniesiona do obszaru bezpiecznego przechowywania o niższym poziomie bezpieczeństwa biologicznego w celu analizy jakości, przygotowania biblioteki RT-PCR i/lub sekwencjonowania RNA.
    Uwaga: Bardzo ważne jest, aby wziąć pod uwagę lokalne przepisy, a w przypadku wytycznych CDC (Centers for Disease Control and Prevention) dotyczących inaktywacji pracy z wybranymi czynnikami, konieczne jest zweryfikowanie wszystkich procedur inaktywacji w lokalnej placówce badacza.
    1. Usunąć 1/10 objętości każdej eluowanej próbki RNA z kroku 4.12 (tj. 5 μl z 50 μl całkowitego RNA). Stosując sterylną technikę, wymieszaj próbkę ze 100 μl bulionu z rozwoju bakterii w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Za pomocą sterylnego plastikowego rozsiewacza rozprowadź mieszaninę RNA i bulionu na powierzchni płytki agarowej.
       Uwaga: Wybierz rodzaj bulionu i płytkę agarową zgodnie ze wzrostem patogenu, z którym zwierzętom poddano prowokację.
    2. Inkubować płytkę agarową w warunkach specyficznych dla wzrostu patogenu, którym poddano zwierzę prowokacji. Sprawdź, czy nie ma odzyskanych bakterii przed usunięciem próbek z pojemnika BSL-3.
       Uwaga: Otrzymany elucjowany RNA, po kwantyfikacji i testach integralności, nadaje się do dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania RNA i analizy RT-PCR.
14. Ocenić odzysk i czystość RNA za pomocą spektrofotometru. Aby ocenić jakość RNA, należy załadować 1 - 2 μl eluowanej próbki RNA do spektrofotometru w celu analizy. Zapisać widmo próbki w zakresie ultrafioletu (UV).
    1. Z widma UV zapisać stosunek A₂₆₀/A₂₈₀, stosunek A₂₆₀/A₂₃₀ i wartość A₂₆₀ dla próbki (A = absorbancja).
    2. Ponieważ jednoniciowy RNA o stężeniu 40 μg/ml ma absorbancję 1,0 przy 260 nm, należy obliczyć stężenie RNA (μg/ml), mnożąc A₂₆₀ x 40 dla oczyszczonych próbek.
15. Jako szybką metodę oceny integralności RNA, w celu wykluczenia wszelkich zdegradowanych próbek z dalszej analizy, należy zmieszać 2 μl każdej próbki RNA z 4 μl 1,5x barwnika ładującego formamid [95% dejonizowanego formamidu, 0,025% (w/v) błękitu bromofenolowego, 0,025% (w/v) cyjanolu ksylenowego, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,025% (w/v) SDS] w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml^{23, 24}.
16. Podgrzewać probówki w temperaturze 70 °C przez 1 minutę, a następnie przenieść probówki do lodu na 1 minutę.
17. Załaduj próbki do 1% żelu agarozowego przygotowanego w 1x TBE (pełny opis natywnej elektroforezy w żelu agarozowym dla RNA znajduje się w Rio, Ares Jr., Hannon i Nilsen)²⁴. Rozdzielić próbki za pomocą standardowych metod elektroforezy żelowej i potwierdzić obecność prążków rybosomalnego RNA 28S i 18S.
18. Po elektroforezie żelowej należy zastosować metody analizy ilościowej w celu określenia integralności RNA [np. Bioanalizator i analiza RIN (RNA Integrity Number)], jak opisano w Reprezentatywnych wynikach oraz w Mueller, O. i wsp.²⁵ oraz Schroeder, A. et al.²⁶.

5. Alternatywna metoda ekstrakcji z tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE)

Uwaga: Chociaż konserwacja tkanek FFPE nie stanowi najsolidniejszej metody konserwacji kwasów nukleinowych, protokół przedstawiony poniżej może być sposobem na badanie pewnych zmian transkrypcyjnych, gdy inne zachowane tkanki są niedostępne.

1. Przygotuj odczynniki formalinowe do konserwacji tkanek, dozując formalinę do plastikowych pojemników. Tkanki powinny być konserwowane w formalinie w proporcji 20:1 formalina:objętość tkanki/masa, odpowiednio.
   UWAGA: Formalina jest znanym czynnikiem rakotwórczym dla ludzi i chociaż nie jest ostro toksyczna, przewlekłe narażenie (zwykle przez wdychane opary) może stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia. Właściwa wentylacja i środki ochrony osobistej (tj. stosowanie rękawic nitrylowych, które należy zmienić w ciągu 15 minut po pierwszym narażeniu) są wymagane w celu zminimalizowania zagrożeń dla zdrowia. Zapoznaj się z normą OSHA dotyczącą formaldehydu (29 CFR 1910.1048), aby uzyskać dodatkowe informacje na temat monitorowania narażenia i oceny ryzyka.
   Uwaga: Użycie zbyt małej ilości formaliny może wpłynąć na zdolność tkanki do pełnego zachowania po zanurzeniu w środku konserwującym.
2. Po wyizolowaniu tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, ostrożnie przyciąć tkankę do grubości mniejszej niż 5 mm.
   1. Za pomocą kleszczy ostrożnie zanurz przyciętą tkankę w formalinie, aby zminimalizować rozpryskiwanie.
      Uwaga: Tkanki powinny być całkowicie zanurzone w formalinie, aby umożliwić całkowite utrwalenie. Bardzo ważne jest, aby wszystkie powierzchnie tkanki były całkowicie pokryte formaliną.
3. Po zanurzeniu tkanek w formalinie należy odczekać, aż utrwalenie się tkanki nastąpi przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej.
   Uwaga: Formalina wnika w tkanki powoli, z prędkością 1 mm na godzinę ze wszystkich powierzchni^27,28. Dlatego utrzymanie grubości skrawków tkanki na poziomie mniejszym niż 5 mm powoduje szybkie utrwalenie całej tkanki.
4. Po utrwaleniu przenieść tkanki do odpowiedniego odczynnika do zatapiania parafiny.
   Uwaga: Na przykład tkanki badane w tym manuskrypcie zostały przeniesione do 70% etanolu przed zatopieniem.
5. Zanurz tkanki w parafinie. ²⁹
6. Przekrój tkankę na grubość 10 - 80 μm (użyj 10-20 μm, jeśli chcesz wyekstrahować miRNA)²⁹.
7. Za pomocą skalpela i kleszczy usuń kawałek tkanki o wielkości 40 mg z każdej próbki, która ma być przetworzona i umieść ją w sterylnej, wolnej od nukleaz probówce do mikrofuge.
8. Wykorzystaj komercyjny zestaw przeznaczony do deparafinowania i odzyskiwania kwasów nukleinowych próbek tkanek FFPE do ekstrakcji RNA z zachowanych próbek.
   Uwaga: Zestaw, o którym mowa w Tabeli materiałów, wykorzystuje płukanie ksylenem i etanolem do usuwania parafiny, etap leczenia proteazą oraz filtr z włókna szklanego do oczyszczania RNA.

Wyniki

Wykorzystanie rozważań przedstawionych w tym artykule (kroki 1 - 4 protokołu) pomoże w odzyskaniu RNA z dużych próbek zwierzęcych, które nadają się do dalszej analizy w badaniach ekspresji genów gospodarza. Jakość RNA do dalszych zastosowań jest oceniana za pomocą wielu standardowych miar. W przypadku spektrofotometrii stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ zapewnia miarę zanieczyszczenia białkami, a stosunek A₂₆₀/A₂₃₀ zapewnia inny sposób oceny czystości, który wykrywa zanieczyszczenia chemiczne,...

Dyskusja

Większość badań transkryptomicznych i związanych z nimi protokołów koncentruje się na próbkach pobranych od myszy, szczurów lub pośmiertnych ludzi. Jednak badania na zwierzętach gospodarskich i dzikich dają szeroki zakres możliwości charakterystyki odpowiedzi immunologicznej na chorobę, zarówno w odniesieniu do medycyny weterynaryjnej, jak i, w odniesieniu do chorób odzwierzęcych, do zdrowia publicznego ludzi. Protokół ten zawierał zarys kluczowych zagadnień dotyczących ekstrakcji RNA o wysokiej integralności z tkanek du...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór do konserwacji RNA (do wszystkich eksperymentów używaliśmy RNALater)	ThermoFisher	AM7020
1,5 ml lub 2 ml polipropylenowe probówki wirówkowe	Fisher Scientific	05-408-129
Jednorazowe skalpele	Daigger Scientific	EF7281
Kleszcze do tkanek, ząb szczura	Fisher Scientific	12-460-117	Dostępne inne kleszczyki do tkanek, w tym zakrzywiona końcówka, zwężająca się krawędź itp., W zależności od preferencji użytkownika
Igły do biopsji 3 mm	Fisher Scientific	NC9949469
Pojemnik na ostre przedmioty (mały i przenośny do sekcji zwłok)	Stericycle	8900SA	1 qt. rozmiar pokazany tutaj
Deski do krojenia lub tace jednorazowe	Fisher Scientific	09-002-24A	Dostępne w różnych rozmiarach, w zależności od preferencji użytkownika Środki
		ochrony osobistej	Różni się w zależności od patogenu (rękawice, maski oddechowe, gogle itp.)
Odczynnik do ekstrakcji RNA na bazie fenolu (do wszystkich eksperymentów użyliśmy odczynnika TRIzol)	Zestaw
(do wszystkich eksperymentów użyliśmy zestawu PureLink RNA Mini)	ThermoFisher	12183018A	Zaprojektowany do tkanek do 100 mg
100% etanolu (200 proof dla biologii molekularnej)	Sigma-Aldrich	E7023
Homogenizator tkankowy z dołączonymi probówkami homogenizacyjnymi (do wszystkich eksperymentów używaliśmy dysocjatora gentleMACS)	Miltenyi Biotec	130-093-235
Agaroza (Ogólne, do elektroforezy żelowej)	Sigma-Aldrich	A9539
1X	TBE Fisher Scientific	BP24301	Może również wykonać od podstaw w laboratorium
Dejonizowany formamid	EMD Millipore	S4117
Dodecylosiarczan sodu	Sigma-Aldrich	L3771
Błękit bromofenolowy	Sigma-Aldrich	114391
Cyjanol ksylenowy	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)	UV-Vis Sigma-Aldrich	EDS
(użyliśmy spektrofotometru NanoDrop)	ThermoFisher	ND-2000
Urządzenie do ilościowej oceny RNA (użyliśmy Bioanalizatora, z powiązanymi komponentami i protokołami)	Agilent	G2939BA
Zestaw do ekstrakcji RNA FFPE (użyliśmy zestawu do izolacji całkowitych kwasów nukleinowych RecoverAll do tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie)	ThermoFisher	AM1975
Rozsiewacz z tworzywa sztucznego (rozsiewacz w kształcie litery L)	Fisher Scientific	14-665-231	Potrzebny tylko do badania sterylności próbek od zakażonych zwierząt
Noże do sekcji zwłok	Koncepcje hodowlane	WI-0009209