Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt

28K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57195

⸱

19 maja 2018

 ,  ,  , 
1National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zawiera przegląd procedur izolacji RNA do transkryptomicznego profilowania tkanek węzłów chłonnych od dużych zwierząt, w tym etapy identyfikacji i wycinania węzłów chłonnych od zwierząt gospodarskich i dzikich, podejścia do pobierania próbek w celu zapewnienia spójności wśród wielu zwierząt, oraz rozważania oraz reprezentatywne wyniki dotyczące konserwacji i przetwarzania po pobraniu do analizy RNA.

Streszczenie

Duże zwierzęta (zarówno żywe, jak i dzikie) służą jako ważne rezerwuary patogenów odzwierzęcych, w tym Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella i E. coli, i są przydatne do badania patogenezy i/lub rozprzestrzeniania się bakterii w naturalnych gospodarzach. Ze względu na kluczową funkcję węzłów chłonnych w odpowiedzi immunologicznej gospodarza, tkanki węzłów chłonnych służą jako potencjalne źródło RNA do dalszych analiz transkryptomicznych w celu oceny czasowych zmian w ekspresji genów w komórkach w trakcie infekcji. W artykule przedstawiono przegląd procesu pobierania węzłów chłonnych, pobierania próbek tkanek i dalszego przetwarzania RNA u zwierząt gospodarskich na przykładzie bydła (Bos taurus), z dodatkowymi przykładami z bizona amerykańskiego (Bison bison). Protokół zawiera informacje o lokalizacji, identyfikacji i usunięciu węzłów chłonnych z wielu kluczowych miejsc w organizmie. Dodatkowo przedstawiono metodologię pobierania próbek z biopsji, która pozwala na spójność pobierania próbek od wielu zwierząt. Omówiono kilka kwestii związanych z konserwacją próbek, w tym generowanie RNA odpowiedniego dla dalszych metodologii, takich jak sekwencjonowanie RNA i RT-PCR. Ze względu na duże opóźnienia nieodłącznie związane z badaniami przebiegu czasowego dużych zwierząt i myszy, przedstawiono reprezentatywne wyniki z tkanek węzłów chłonnych żubra i bydła w celu opisania przebiegu degradacji w tym typie tkanki, w kontekście przeglądu wcześniejszych prac metodologicznych dotyczących degradacji RNA w innych tkankach. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten będzie przydatny zarówno dla badaczy weterynarii rozpoczynających projekty transkryptomu na dużych próbkach zwierzęcych, jak i dla biologów molekularnych zainteresowanych poznaniem technik pobierania próbek tkanek in vivo i przetwarzania in vitro.

Wprowadzenie

Analiza sekwencjonowania RNA transkryptomu węzłów chłonnych stwarza możliwość charakterystyki odpowiedzi immunologicznej zwierząt na różnorodne patogeny. Choć metodologia ta była szeroko wykorzystywana u myszy, w ostatnim czasie analizy te zaczęto rozszerzać na większe ssaki.1,2Węzły chłonne zwierząt hodowlanych/dużych zwierząt mogą być wykorzystywane do charakterystyki odpowiedzi gospodarza na infekcję, nie tylko w badaniach nad szczepionkami lub podatnością genetyczną oraz w identyfikacji celów dla rozwoju leków, ale także jako systemy modelowe dla badań nad zoonozami u ludzi. Na przykład w przypadku brucelozy (bakteryjnej choroby odzwierzęcej, która każdego roku dotyka pół miliona ludzi na świecie), mimo znacznie wyższych kosztów, badania na owcach lub kozach są bardziej relewantne dla infekcji u ludzi oraz rozwoju ludzkich szczepionek niż modele zwierząt laboratoryjnych. Modele infekcji u myszy odwzorowują zakażenie układu retikuloendotelialnego, ale nie charakterystycznych objawów klinicznych.3.

W eksperymentach na dużych zwierzętach, w porównaniu do badań na zwierzętach laboratoryjnych, proces pobierania tkanek wiąże się z koniecznością dłuższego czasu oczekiwania między eutanazją a zbiorem tkanek, co stanowi potencjalne wyzwanie dla zachowania wysokiej jakości RNA. Nienaruszony RNA jest niezbędny do wygenerowania biologicznie istotnych danych transkryptomicznych. Uzyskanie wysokiej jakości RNA z próbek tkanek jest szczególnie krytyczne w przypadku badań nad patogenami dużych zwierząt prowadzonych w placówkach izolacyjnych. Takie badania są z natury trudniejsze do przeprowadzenia, ponieważ wymagają nie tylko zatwierdzonych placówek i wysoko wykwalifikowanego personelu, ale wiążą się również ze znacznymi kosztami finansowymi, które w zależności od zakresu prac mogą wynosić od dziesiątek do setek tysięcy dolarów. Tego typu badania wymagają również współpracy oraz wiedzy interdyscyplinarnej do ich ukończenia, co potęguje ich złożoność. Dlatego też szkolenie, opracowanie i przestrzeganie usprawnionego systemu pobierania i konserwacji próbek przynosi znaczące korzyści dla późniejszych badań molekularnych tkanek pochodzących od zainfekowanych zwierząt.

Pobieranie większych węzłów chłonnych stwarza dodatkowe wyzwania w zakresie kolekcji tkanek w porównaniu do analogicznego pobierania węzłów chłonnych u myszy. Przygotowanie do wycięcia próbki wymaga podstawowej znajomości anatomii węzła chłonnego, w tym odpowiednich struktur wewnętrznych. Budowa węzła chłonnego składa się z grudek chłonnych otoczonych zatokami wypełnionymi limfą. Struktury te są zamknięte w twardej, włóknistej torebce4. Grudka chłonna jest „podstawową jednostką anatomiczną i funkcjonalną węzła chłonnego” i składa się z mieszków, głębokiej warstwy korowej oraz sznurów i zatok rdzeniowych4 (Rycina 1A). Limfocyty B i T znajdują się odpowiednio w mieszkach oraz w głębokich jednostkach korowych. Struktury te stanowią rusztowanie 3D i ułatwiają interakcje między limfocytami a antygenem lub komórkami prezentującymi antygen.

Makroskopowo na przekroju można zidentyfikować mieszki i głębokie jednostki korowe, ponieważ zawierają one gęstszą sieć retikularną i wydają się ciemniejsze niż zatoki, które składają się z delikatniejszej sieci retikularnej i mają jaśniejszy kolor (Rysunek 1B). Zgodnie z przyjętą konwencją patolodzy określają obszary węzłów chłonnych jako korę powierzchowną (mieszki), parakorę (głębokie jednostki korowe) oraz rdzeń (sznury i zatoki rdzeniowe). Właściwa ocena wszystkich trzech regionów jest uznawana za najlepszą praktykę w rutynowych wytycznych badania patomorfologicznego węzłów chłonnych5. Należy zauważyć, że istnieje znaczna zmienność w konsystencji, wielkości i kolorze węzłów chłonnych, nawet u jednego zwierzęcia. Wraz z wiekiem zwierząt ich węzły chłonne mają tendencję do zmniejszania się i stają się twardsze niż u młodszych osobników, co zazwyczaj wynika ze wzrostu ilości tkanki łącznej i redukcji prawidłowej struktury limfoidalnej6,7.

Schemat anatomiczny węzła chłonnego oraz przekrój tkanki z zaznaczeniem struktur kory, przykory i rdzenia.
Rysunek 1. Anatomia węzła chłonnego. (A) Ten schemat przedstawia anatomię węzła chłonnego, obrazując kluczowe struktury. (BZdjęcie przedstawia węzeł chłonny bydlęcy przekrojony w poprzek. Zaznaczono odpowiednie struktury/warstwy widoczne gołym okiem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W zależności od pytania badawczego, do pobrania i analizy wybiera się różne węzły chłonne. Węzły chłonne obwodowe to te zlokalizowane głęboko w tkance podskórnej. U bydła do obwodowych lub powierzchownych węzłów chłonnych często wykorzystywanych w praktyce klinicznej i eksperymentalnej należą węzły: przyuszne, podżuchwowe, zakątkowe, przedłopatkowe, przedudowe (przedpiszczelowe) oraz powierzchowne pachwinowe (nadwymionowe u samic, mosznowe u samców) (Rycina 2). W Tabeli 1 przedstawiono właściwości kluczowych powierzchownych węzłów chłonnych, zgodnie z opisem dla systemu bydła8. Poniżej, jako punkt wyjścia do badań, zaprezentowano kilka potencjalnych planów pobierania węzłów chłonnych w przypadku zakaźnych chorób bakteryjnych bydła.

Brucella abortus/Brucella melitensis: Standardowe sekcje zwłok bydła zakażonego B. abortus oraz kóz zakażonych B. melitensis w Narodowym Ośrodku Chorób Zwierząt (National Animal Disease Center) obejmują pobranie tkanek z węzłów chłonnych nadwymieniowych, przylopatkowych i przyusznych, zarówno w celu ich rozcierania do oznaczania liczby bakterii, jak i do przygotowania RNA do profilowania ekspresji RNA gospodarza. B. abortus może być regularnie wyizolowana z każdego z tych węzłów chłonnych u bydła zakażonego eksperymentalnie9. Obecność bakterii w każdym z tych typów węzłów chłonnych może być wykryta u kóz zakażonych B. melitensis do co najmniej dziewięciu miesięcy po zakażeniu przy użyciu metod opartych na RNA z naszych badań (Boggiatto et al., niepublikowane). Salmonella sp.: Węzły chłonne przylopatkowe, podbiodrowe (przedudowe) i krezkowe okazały się przydatne podczas profilowania tusz bydlęcych pod kątem zapadalności na Salmonella10,1,12 i mogłyby stanowić potencjalne zainteresowanie dla badań transkryptomicznych. E. coli O157:H7: Węzły chłonne krezkowe (w lokalizacjach środkowej i dystalnej części jelita cienkiego) mogą być miejscami okazjonalnego wyizolowania bakterii u zakażonych cieląt (ale nie u zakażonego dorosłego bydła)13. Leptospiroza (Leptospira sp.): Przewlekła persistencja bakterii została zaobserwowana w węzłach chłonnych drenujących gruczoł mlekowy14. Mycobacterium bovis: U bydła bakterie te wyizolowano po zakażeniu eksperymentalnym z węzłów chłonnych śródpiersnych i tchawkopowietrznych cieląt15. Dodatkowo RNA z węzłów chłonnych wykorzystywano do badania odpowiedzi gospodarzy dużych zwierząt na wirusy, takie jak wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń2. Rycina 2 przedstawia lokalizację części tych głównych węzłów chłonnych w organizmie bydła.

Schemat węzłów chłonnych krowy; przyuszny, podżuchwowy, za gardłowy, przedłopatkowy, przedudowy, nadwymiowy.
Rycina 2: Schemat przedstawiający wybrane lokalizacje węzłów chłonnych w Bos taurus. Ponumerowane węzły chłonne zostały opisane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W niniejszej pracy oraz towarzyszącym jej filmie przedstawiamy protokół izolacji węzłów chłonnych dużych zwierząt do badań nad RNA, opracowany z myślą o biologach molekularnych zajmujących się badaniami transkrypcyjnymi infekcji u dużych zwierząt. W pierwszej kolejności przedstawiamy przegląd procedury izolacji węzłów chłonnych, wykorzystując jako przykłady pobieranie próbek z tkanek bydła i żubra. Towarzyszy temu, jak pokazano w filmie, schemat powtarzalnego pobierania tkanek do izolacji RNA. Następnie opisujemy kluczowe kwestie dotyczące przetwarzania zainfekowanego węzła chłonnego, koncentrując się na bezpieczeństwie, powtarzalności oraz jakości RNA.

Preparatyka RNA z tkanki z użyciem zakwaszonego odczynnika fenolowo-guanidynian izotiocyjanianowego opiera się na oryginalnej metodzie Chomczynskiego i Sacchiego16,17, z oczyszczaniem na kolumnach wirowych opartych na krzemionce w obecności czynników chaotropowych na podstawie pierwotnych prac Vogueleinstena i Gillespii18. Badamy również możliwość odzyskania RNA do analiz transkryptomicznych z węzłów chłonnych bydła utrwalonych alternatywnymi metodami. Na koniec analizujemy wpływ zmiennej czasu na jakość RNA podczas sekcji zwłok dużych zwierząt, w tym przedstawiamy reprezentatywny eksperyment obrazujący wpływ wydłużenia czasu między eutanazją a pobraniem próbek na profil odzyskanego RNA z węzłów chłonnych żubrów i bydła. Artykuł ten będzie przydatny nie tylko dla biologów molekularnych, ale także dla badaczy z zakresu weterynarii rozpoczynających badania transkryptomiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przedstawione tutaj procedury nekropsji zwierząt są objęte zatwierdzonymi protokołami IACUC w National Animal Disease Center w Ames, IA. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich dobrostanu.

1. Planowanie przed sekcją zwłok

  1. Przed sekcją zwłok przygotuj następujące materiały do transportu do pomieszczenia sekcyjnego:
    1. probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 lub 2 mL wypełnione ok. 1,0 mL roztworu do stabilizacji RNA, umieszczone w statywie lub pojemniku transportowym. Należy ściśle przestrzegać wytycznych producenta dotyczących stosunku objętości roztworu stabilizującego do objętości tkanki.
    2. jednorazowe skalpele oraz czyste, autoklawowane pęsety: jeden zestaw do nacinania skóry i osobny zestaw do pobierania węzłów chłonnych (jedna pęseta dla każdego węzła chłonnego w każdym zwierzęciu), aby zapobiec kontaminacji tkanek węzłów chłonnych florą skórną i środowiskową.
    3. narzędzia do biopsji typu punch o średnicy 3 mm, noże sekcyjne, pojemnik na odpady ostre dla zużytych skalpeli i narzędzi do biopsji oraz deski do krojenia lub jednorazowe tacki do wykorzystania podczas wycinania węzłów chłonnych.
    4. stosuj środki ochrony osobistej, w tym PPE wymagane do pracy na odpowiednim poziomie BSL dla danego systemu.
    5. metalowe narzędzia wielokrotnego użytku, w tym pęsety, autoklawuj w metalowych kuwetach przed sekcją, korzystając z programu do przyborów/wyrobów suchych.

2. Identyfikacja i pobieranie próbek węzłów chłonnych u bydła i żubrów

Anatomia węzłów chłonnych bydła, gruczoł ślinowy przyuszny; porównanie schematu z tkanką po sekcji.
Rysunek 3Węzły chłonne głowy i szyi bydła. (A) Ten schematyczny rysunek przedstawia wybrane węzły chłonne głowy i szyi u Bos taurus. (B) Na tym obrazie przedstawiono węzeł chłonny przyuszny w przekroju poprzecznym (po lewej) w porównaniu z gruczołem ślinowym przyusznym w przekroju poprzecznym (po prawej). Należy zwrócić uwagę na różnice w strukturze obu typów tkanek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Izolacja węzłów chłonnych przedłopatkowych u bydła i żubrów
    1. Uśmierć zwierzę (bydło lub bizona w dowolnym wieku, zgodnie z wymaganiami eksperymentu) w oparciu o lokalny protokół IACUC. Potwierdź zgon metodami ściśle określonymi w instytucjonalnym protokole IACUC, w tym poprzez stwierdzenie braku akcji serca, braku oddechu oraz braku odruchu rogówkowego. Przenieś zwierzę na salę sekcyjną.
      Uwaga: W praktyce laboratoryjnej z dużymi zwierzętami stosuje się różne metody humanitarnej eutanazji. Jednak najczęściej zatwierdzaną i wykorzystywaną formą jest dożylne podanie roztworu pentobarbitalu sodu i fenytoiny sodu. Należy zapoznać się z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt.19
      OSTROŻNIE: Należy przestrzegać wszystkich odpowiednich protokołów bezpieczeństwa biologicznego dotyczących sekcji zwłok obowiązujących w jednostce gospodarza, w tym wytycznych dotyczących bezpiecznej utylizacji przedmiotów ostrych w pojemniku odpornym na przebicie oraz dekontaminacji wielorazowych metalowych noży i pęset. Protokół ten generuje odpady ostre w wyniku użycia skalpeli jednorazowych. Należy stosować środki ochrony osobistej zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, w tym buty, kombinezony, rękawiczki i ochronę oczu.
    2. Wyznacz 3 osoby do pracy z tkankami zwierzęcymi.
      Uwaga: W tym przypadku osoba preparująca 1 będzie odpowiedzialna za wielkoskalowe sekcjonowanie wybranych tkanek zwierzęcych, osoba preparująca 2 będzie pobierać węzły chłonne z poszczególnych fragmentów ciała zwierząt, a osoba preparująca 3 będzie pracować przy osobnym stole, izolując fragmenty z każdego węzła chłonnego i przenosząc je do probówek z roztworem konserwującym.
    3. Zacznij od ułożenia zwierzęcia w pozycji bocznej.
    4. Wyprostuj bark, przesuwając kończynę przednią do tyłu na wysokości kolana (nadgarstka); ruch ten odsunie łopatkę do tyłu i ułatwi palpację węzła chłonnego. Wyczuj obecność „guzka” stanowiącego węzeł chłonny.
      Uwaga: W stanach chorobowych może wystąpić limfadenopatia, co ułatwia identyfikację węzłów chłonnych, jednak proces ten może również wpłynąć na konsystencję, skład i architekturę węzła chłonnego.
    5. Po zlokalizowaniu miejsca i przy zachowaniu wyprostu barku, należy za pomocą skalpela lub noża do sekcji wykonać nacięcie skóry wzdłuż obrysu barku.
      Uwaga: Nie należy ograniczać wielkości nacięcia, nawet jeśli węzeł chłonny został zlokalizowany poprzez palpacja. Większe nacięcie zapewnia łatwiejszy dostęp do głębszych tkanek i ułatwia operatorowi wycięcie węzła chłonnego.
    6. Za pomocą pęsety odciągnąć skórę, aby odsłonić wyrostek barkowy oraz mięśnie szyi.
      Uwaga: Węzeł chłonny przedłopatkowy często znajduje się w tkance tłuszczowej podskórnej, szczególnie u zwierząt z nadwagą.
    7. Ponownie zbadaj palcowo miejsce położenia węzła chłonnego (Rycina 3A).
      Uwaga: W przeciwieństwie do tkanki tłuszczowej podskórnej, węzeł chłonny zachowuje swój kształt podczas palpacji. Ponadto węzły chłonne nie są zrośnięte z żadną z otaczających tkanek, ponieważ są otoczone cienką torebką włóknistą.
    8. Po zlokalizowaniu węzła chłonnego przedłopatkowego należy ostrożnie wypreparować tkankę tłuszczową podskórną za pomocą skalpela i pęsety, a następnie wyizolować węzeł chłonny.
      1. Należy sprawdzić obecność cienkiej torebki włóknistej, zgodnie z przedstawionym na Rycina 1B, aby odróżnić węzeł chłonny od tkanki tłuszczowej; węzły chłonne nie przylegają bezpośrednio do żadnej z otaczających tkanek.
    9. Przenieś węzeł chłonny na stół do sekcji węzłów chłonnych, używając plastikowej kuwety do transferu tkanki, w celu dalszego krojenia.
      Uwaga: Wygląd tych węzłów chłonnych u bizonów jest podobny. Dołączony film przedstawia wygląd węzła chłonnego przedłopatkowego po wypreparowaniu go z prawego barku bizona amerykańskiego.
  2. Izolacja węzłów chłonnych przyusznych u bydła i żubrów
    1. Zacznij od ułożenia zwierzęcia na boku na stole do sekcji. Zlokalizuj staw skroniowo-żuchwowy (TMJ).
      1. Jeśli zlokalizowanie tego miejsca jest trudne, należy powoli poruszać żuchwą i określić punkt, w którym żuchwa łączy się z czaszką; jest to staw skroniowo-żuchwowy (TMJ).
    2. Za pomocą skalpela lub noża do sekcji starannie wykonaj nacięcie skóry. Rozpocznij nacięcie grzbietowo w stosunku do stawu, a następnie przedłuż je w kierunku brzusznym/pionowo wzdłuż linii żuchwy.
    3. Odwarstw skórę, aby odsłonić tkankę podskórną. Jako pierwsza będzie widoczna ślinianka przyuszna ze względu na jej duży rozmiar, płatkowatą powierzchnię i czerwonawy kolor.
    4. Za pomocą pęsety i skalpela odsuń śliniankę przyuszny, aby odsłonić węzeł chłonny przyuszny znajdujący się bezpośrednio powyżej i przyśrodkowo od ślinianki (Rysunek 3A). Przed dalszą obróbką należy ocenić strukturę tkanki węzła chłonnego ślinianki przyusznej.
      Uwaga: Węzły chłonne twarzy (przyuszne i podżuchwowe) są powiązane ze śliniankami, co może utrudnić izolację węzłów chłonnych. W porównaniu do węzłów chłonnych ślinianki są znacznie większe i mają lobulowany wygląd powierzchni. Ponadto w przekroju ślinianki mają strukturę jednorodną i nie wykazują klasycznego wzorca architektonicznego kory i rdzenia charakterystycznego dla węzłów chłonnych (Rysunek 3B).
    5. Wyciąć gruczoł za pomocą skalpela. Przenieść go na stół do wycinania węzłów chłonnych, używając plastikowej tacki do transportu tkanki, w celu dalszego krojenia.
  3. Izolacja węzłów chłonnych nadwymieniowych u krów i bisonów
    1. Umieść zwierzę w pozycji bocznej.
    2. Unieś tylną kończynę, aby odsłonić obszar pachwinowy i zlokalizować wymię.
      Uwaga: U zdrowego zwierzęcia nieprodukującego mleka palpacja tych węzłów chłonnych może być niemożliwa. U zwierzęcia laktującego węzły chłonne te mogą być wyczuwalne przy tylnej krawędzi podstawy wymienia.
    3. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie bezpośrednio grzbięcie w stosunku do wymienia, prowadząc je wzdłuż górnej części kończyny, aby odsłonić gruczoły nadwymieniowe.
    4. Przetnij tkankę podskórną i zlokalizuj węzeł chłonny nadpiersiowy zatopiony w cienkiej warstwie tkanki tłuszczowej podskórnej. Jeśli nie jest on widoczny, przeprowadź palpację odsłoniętej tkanki w celu wykrycia twardej struktury w obrębie tkanki tłuszczowej podskórnej.
    5. Za pomocą pęsety i skalpela ostrożnie wypreparuj węzeł chłonny z tkanki tłuszczowej. Przenieś go do stołu do sekcji węzłów chłonnych, używając plastikowej kuwety do transportu tkanki, w celu dalszego cięcia.

3. Sekcjonowanie i przechowywanie węzłów chłonnych

  1. Przekaż wyizolowane węzły chłonne od sekcjonującego 2 do sekcjonującego 3 na stole sekcyjnym znajdującym się obok głównej przestrzeni sekcyjnej. Umieść każdy węzeł chłonny na nowej sekcji deski do cięcia. Wcześniej oznakuj sekcje desek do cięcia zgodnie z typem węzła chłonnego, aby ułatwić odbiór wielu węzłów chłonnych jeden po drugim. W przypadku próbek z materiału zakaźnego należy używać jednorazowych tacek.
  2. Za pomocą pęsety i jednorazowego skalpela lub noża sekcyjnego wyciśnij fragment węzła chłonnego. Używając ostrego noża, wykonaj cięcie strzałkowe, aby otworzyć węzeł chłonny.
  3. Zbadaj wnętrze węzła chłonnego, szczególnie w przypadku okazów od zwierząt zakażonych, zwracając uwagę na asymetrię, zmiany chorobowe, różnice w zabarwieniu itp. Zapisz obserwacje.
  4. (Opcja 1) Małe fragmenty tkanki
    1. Używając jednorazowych skalpeli, wytnij fragmenty każdego węzła chłonnego o grubości mniejszej niż 5 mm i przenieś każdy fragment czystą pęsetą do probówki z roztworem do stabilizacji RNA.
  5. (Opcja 2) Metodyki biopsji lub sekcjonowania węzłów chłonnych
    Uwaga: Biopsje lub metodyki sekcjonowania, stosowane w odniesieniu do równoległych sekcji różnych węzłów chłonnych i zwierząt, zapewniają spójność pobranej tkanki do analizy całkowitego RNA (bulk RNA).
    1. Metoda sekcjonowania klinowego
      1. Po zbadaniu przekroju strzałkowego w celu uchwycenia komórek w całym profilu węzła chłonnego, wytnij z węzła chłonnego klin w kształcie kawałka ciasta, od centrum do torebki zewnętrznej. Dla węzła o szerokości 2 cm (rozmiar standardowy; patrz Tabela 1), klin wycięty do centrum o długości łuku zewnętrznego 4 mm i grubości 5 mm będzie miał masę mokrą ok. 10 mg.
      2. Używając skalpela, podziel klin na małe kawałki, nie grubsze niż 5 mm, o masie mokrej tkanki około 50 – 10 mg każdy.
        Uwaga: Dla zachowania spójności należy przetwarzać wszystkie fragmenty klinowe z jednego węzła chłonnego albo w jednej partii, albo w oddzielnych probówkach, a następnie połączyć RNA, aby uzyskać reprezentatywny profil RNA z analizowanego węzła chłonnego.
      3. Przenieś fragmenty tkanki pęsetą do probówek zawierających co najmniej 10 objętości roztworu do stabilizacji RNA w stosunku do objętości tkanki.
    2. Metoda biopsji grubo-igłowej (punch biopsy)
      1. Wybierz narzędzie do biopsji grubo-igłowej, jeśli celem jest pobranie konkretnych sekcji, np. określonych mieszek z węzła. Wybierz narzędzie zgodne z pożądaną wielkością próbki. Narzędzia do biopsji grubo-igłowej są dostępne w różnych rozmiarach, o średnicy od 1 do 8 mm.
      2. Wizualnie zlokalizuj w węźle chłonnym obszary interesujące do pobrania próbek.
      3. Użyj narzędzia do biopsji grubo-igłowej, aby wyciąć interesujące sekcje, naciskając i obracając narzędzie w tkance w celu utworzenia rdzenia. Przenieś fragment tkanki pęsetą do probówki zawierającej co najmniej 10 objętości roztworu do stabilizacji RNA. Jeśli fragment jest grubszy niż 5 mm, użyj pęsety i skalpela, aby dalej podzielić tkankę na mniejsze kawałki.
  6. Po przeniesieniu próbek do roztworu stabilizującego (np. RNALater), przetransportuj je z powrotem do laboratorium w temperaturze pokojowej.
  7. Przechowuj próbki w temperaturze 4 °C przez noc, aby umożliwić penetrację tkanki.
  8. Następnego dnia odlej nadmiar roztworu stabilizującego RNA i przechowuj próbki tkanki w temperaturze -80 °C. Usuń jak najwięcej stabilizatora przed zamrożeniem próbek. Do wydajnego usunięcia roztworu stabilizującego RNA użyj końcówki do mikropipety P100 i/lub P20.
    OSTROŻNIE: Zutylizuj odlany roztwór stabilizujący w odpowiedni sposób, w zależności od właściwości zakaźnych użytego patogenu oraz zagrożeń chemicznych i środowiskowych roztworu stabilizującego, zgodnie z Kartą Charakterystyki.
    Uwaga: Przedstawione tutaj wytyczne dotyczą roztworu do stabilizacji RNA opisanego w Tabeli Materiałów. W przypadku stosowania alternatywnych roztworów stabilizujących zapoznaj się z wytycznymi producenta.

4. Przetwarzanie RNA z węzłów chłonnych

UWAGA: Podczas etapów przetwarzania należy stosować fartuch laboratoryjny, rękawiczki oraz odpowiednią ochronę oczu.

Uwaga: Odczynnik na bazie fenolu użyty w tej procedurze został opisany w Tabeli materiałów (a protokół opiera się na wytycznych producenta)20. Stosowanie alternatywnych odczynników na bazie fenolu może wymagać modyfikacji procedury, zgodnie z zaleceniami producenta dla konkretnego zakupionego produktu.

  1. Przed uzyskaniem dostępu do próbek należy przygotować alikwoty schłodzonego (4 °C) odczynnik na bazie fenolu do probówek do homogenizacji (1,5 ml/probówka) za pomocą pipety.
    OSTRZEŻENIE: Fenol jest toksyczny, żrący i stanowi zagrożenie dla zdrowia. Chloroform jest toksyczny i stanowi zagrożenie dla zdrowia. Kroki przetwarzania od 4.1 do 4.9 należy przeprowadzić w dygestorium chemicznym, używając rękawic w celu zapobiegania jakimolwiek kontaktom z odczynnikami. W Stanach Zjednoczonych chloroform jest uznawany za odpad niebezpieczny; probówki zawierające odpady niebezpieczne należy utylizować zgodnie z lokalnymi i instytucjonalnymi wytycznymi. Próbki tkanek pobrane od zwierząt zainfekowanych patogenami należy przetwarzać zgodnie z odpowiednimi wytycznymi BSL-2, BSL-3 lub BSL-4.
  2. Gdy próbkę można będzie oddzielić od probówek do mikrowirówki za pomocą czystej pęsety, należy niezwłocznie przenieść około 50–10 mg utrwalonej tkanki do probówki do homogenizacji zawierającej odczyn na bazie fenolu.
    1. Ogranicz rozmrażanie przed dodaniem do odczynnika na bazie fenolu. W przypadku wyjmowania z zamrażarki wielu próbek do procesu przetwarzania, przechowuj je na suchym lodzie.
  3. Szczelnie zakręć probówkę, umieść ją w homogenizatorze i zhomogenizuj próbkę za pomocą homogenizatora tkankowego z układem rotor-stator w odczynniku na bazie fenolu. Cały proces przeprowadź w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu sprawdź, czy zawiesina jest mętna, aby upewnić się, że próbka została skutecznie zhomogenizowana; tkanka powinna zostać rozproszona w postaci mętnej zawiesiny.
    Uwaga: Zastosowano 2-minutowe ustawienie ekstrakcji RNA (predefiniowane ustawienie RNA_02_1 dla homogenizatora opisanego w Tabela materiałów; przeznaczony do tkanek zamrożonych). Wirnik i stator określone w niniejszym protokole (patrz w Tabela materiałów) posiada duże zęby i jest przystosowany do homogenizacji różnych rodzajów tkanek, w tym materiałów włóknistych. Ustawienie RNA_02_01 zostało opracowane specjalnie dla tkanek zamrożonych (w przeciwieństwie do świeżych). Ponieważ węzły chłonne zawierają komponenty włóknistej tkanki łącznej, w celu uzyskania skutecznej dysocjacji zaleca się stosowanie podobnie zoptymalizowanego homogenizatora rotorowo-statorowego. Zob. National Institute of Environmental Health Sciences21 w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat zaleceń dotyczących homogenizacji.
    1. Jeśli po homogenizacji pozostaną duże fragmenty tkanki, należy powtórzyć procedurę homogenizacji. Aby efektywnie odzyskać RNA, tkanka musi zostać dobrze zdysocjowana.
    2. W przypadku bardziej włóknistych fragmentów węzłów chłonnych należy użyć pęsety i nożyczek, aby wstępnie podzielić fragment węzła chłonnego na kilka mniejszych części przed przeniesieniem go do probówki do homogenizacji. Jak opisano we wstępie, tkanki węzłów chłonnych pochodzące od starszych zwierząt mogą być bardziej włókniste.
      Uwaga: Jeśli wymagana jest analiza porównawcza RNA gospodarza i patogenu, może być konieczne dodatkowe opracowanie (np. homogenizacja za pomocą kulek) w celu odzyskania bakteryjnego RNA, zwłaszcza w przypadku obecności patogenów Gram-dodatnich w tkankach.
  4. Należy niezwłocznie wyjąć zhomogenizowaną próbkę z probówek i przenieść ją do probówek do mikrocentryfugi wolnych od RNazy (o objętości 2,0 ml) za pomocą mikropipety P100.
  5. Wiruj próbkę przez 5 min przy 12 0 x g przy 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczeń z próbki. Za pomocą końcówki do mikropipety P100 przenieść supernatant do nowej probówki do mikrocentryfugi, pozostawiając osad.
  6. Inkubować supernatant przez 5 min w temperaturze pokojowej. Rozdzielić każdą próbkę do dwóch probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  7. Dodać 0,2 ml chloroformu na każdy 1 ml odczynnika na bazie fenolu (t.j., 0,3 ml dla próbki o objętości 1,5 ml); odwracać probówkę ręcznie przez 1–2 min w celu wymieszania faz, ale nie mieszać próbki wstrząsarku vortex. Inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej.
  8. Wirować przez 15 min przy 12 0 x g przy 4 °C.
  9. Ostrożnie usuń górną, przezroczystą fazę wodną za pomocą końcówki mikropipety (P10 lub P20), która tworzy górną warstwę, uważając, aby nie naruszyć interfazy ani czerwonej warstwy fenolowo-chloroformowej. Przenieś ją do nowej probówki do mikrocentryfugi.
  10. Wymieszać z równą objętością 10% etanolu; wymieszać dokładnie, odwracając probówkę 4–5 razy. Zawartość probówki często będzie wydawać się mętna.
  11. Za pomocą końcówki mikropipety przenieś ciecz do komercyjnej kolumny wirowej opartej na krzemionce, aby dalej oczyścić i eluować RNA, zgodnie z instrukcją producenta.22. Eluuj RNA wyizolowany z ok. 50 mg tkanki do 50 - 100 µl wody wolnej od RNaz.
    Uwaga: Chociaż ekstrakcja odczynnikiem na bazie fenolu usuwa DNA do fazy organicznej, w przypadku dalszego wykorzystania RNA w aplikacjach qRT-PCR i/lub sekwencjonowaniu RNA zaleca się dodatkową obróbkę próbek RNA za pomocą DNazy.
  12. Przenieś eluowane RNA do oddzielnych probówek w celu przeprowadzenia ilościowej i jakościowej oceny próbki, aby ograniczyć liczbę cykli zamrażania i rozmrażania głównej próbki RNA. Przenieś probówki do -80 °C do przechowywania.
  13. W przypadku próbek węzłów chłonnych pochodzących od zwierząt zakażonych patogenami odzwierzęcymi, zwłaszcza w obszarach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL-3, należy potwierdzić brak patogenów w otrzymanej próbce RNA, jeżeli próbka ta ma zostać przeniesiona do obszaru o niższym poziomie bezpieczeństwa biologicznego w celu przeprowadzenia analizy jakościowej, RT-PCR i/lub przygotowania bibliotek do sekwencjonowania RNA.
    Uwaga: Kluczowe jest uwzględnienie lokalnych przepisów, a w przypadku wytycznych CDC (Centers for Disease Control and Prevention) dotyczących inaktywacji w pracy z wybranymi czynnikami (select agents), konieczna jest walidacja wszystkich procedur inaktywacji w lokalnej placówce badawczej.
    1. Usuń 1/10th objętość każdej eluowanej próbki RNA z kroku 4.12 (t. j., 5 µl z 50 µl całkowitego RNA). Stosując technikę sterylną, wymieszaj próbkę z 100 µl pożywki z hodowlą bakterii w sterylnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Za pomocą sterylnego plastikowego rozprowadzacza rozprowadź mieszaninę RNA z pożywką na powierzchni płytki z agarem.
      Uwaga: Należy wybrać rodzaj pożywki płynnej oraz szalki z agarem zgodne z warunkami wzrostu patogenu, którym zainfekowano zwierzęta.
    2. Inkubować płytkę z agarem w warunkach specyficznych dla wzrostu patogenu, którym zakażono zwierzęta. Przed wyjęciem próbek z obszaruy zabezpieczonego BSL-3 sprawdzić brak odzyskanego wzrostu bakterii.
      Uwaga: uzyskany eluat RNA, po przeprowadzeniu kwantyfikacji i testów integralności, nadaje się do dalszych zastosowań, w tym do sekwencjonowania RNA oraz analizy RT-PCR.
  14. Oceń odzysk i czystość RNA za pomocą spektrofotometru. Aby ocenić jakość RNA, nanieś 1 - 2 µl próbki elowanych RNA do spektrofotometru w celu przeprowadzenia analizy. Należy zarejestrować widmo próbki w zakresie ultrafioletu (UV).
    1. Z widma UV odczytaj wartość A260/A280 stosunek, A260/A230 stosunek oraz A260 wartość dla próbki (A = absorbancja).
    2. jako jednoniciowy RNA o stężeniu 40 µg/mL posiada absorbancję 1,0 przy 260 nm, oblicz stężenie RNA (µg/mL) poprzez pomnożenie A260 x 40 dla próbek oczyszczonych.
  15. W celu szybkiej oceny integralności RNA i wykluczenia próbek zdegradowanych z dalszej analizy, wymieszać 2 µl każdej próbki RNA za pomocą 4 µl barwnika do nakładania próbek z 1,5x formamidem [95% formamid dejonizowany, 0,025% (m/v) błękitu bromofenolowego, 0,025% (m/v) ksylen cyjanolu, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,025% (m/v) SDS] w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml23,24.
  16. Podgrzać probówki w temperaturze 70 °C przez 1 min, a następnie przenieść probówki na lód na 1 min.
  17. Nałóż próbki na żel agarozowy o stężeniu 1% przygotowany w 1x TBE (pełny opis natywnej elektroforezy RNA w żelu agarozowym znajduje się w pracy Rio, Ares Jr., Hannon i Nilsen)24Próbki należy rozdzielić standardowymi metodami elektroforezy żelowej i potwierdzić obecność prążków rybosomalnego RNA 28S i 18S.
  18. Po elektroforezie w żelu przeprowadź ilościową analizę metodami służącymi do oznaczenia integralności RNA [np., analizator Bioanalyzer oraz analiza RIN (RNA Integrity Number)] zgodnie z opisem w Reprezentatywne wyniki oraz w Mueller, O. i wsp.25 or Schroeder, A. i inni26.

5. Alternatywna metoda ekstrakcji z tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE)

Uwaga: Chociaż utrwalanie tkanek w FFPE nie jest najskuteczniejszą metodą zachowania kwasów nukle innych, poniższy protokół może stanowić sposób badania niektórych zmian transkrypcyjnych w sytuacjach, gdy inne utrwalone tkanki są niedostępne.

  1. Przygotuj odczynniki formalinowe do konserwacji tkanek, rozlewając formalinę do plastikowych pojemników. Tkanki powinny być konserwowane w formalinie w stosunku 20:1 (objętość formaliny do objętości/masy tkanki).
    OSTRZEŻENIE: Formalina jest znanym kancerogenem ludzkim i choć nie wykazuje toksyczności ostrej, przewlekła ekspozycja (zazwyczaj poprzez wdychanie oparów) może stanowić istotne zagrożenie dla zdrowia. Właściwa wentylacja i Środki Ochrony Indywidualnej (PPE) (t.j.(stosowanie rękawiczek nitrylowych, które należy zmienić w ciągu 15 minut od pierwszej ekspozycji) jest wymagane w celu zminimalizowania ryzyka dla zdrowia. Dodatkowe informacje na temat monitorowania narażenia i oceny ryzyka znajdują się w normie OSHA dotyczacej formaldehydu (29 CFR 1910.1048).
    Uwaga: Zastosowanie zbyt małej ilości formaliny może wpłynąć na zdolność tkanki do pełnej konserwacji podczas zanurzenia w środku utrwalającym.
  2. Po wyizolowaniu interesującej tkanki należy ją ostrożnie przyciąć tak, aby jej grubość nie przekraczała 5 mm.
    1. Używając pęsety, ostrożnie zanurz przyciętą tkankę w formalinie, aby zminimalizować ryzyko rozpryskiwania cieczy.
      Uwaga: Tkanki powinny być całkowicie zanurzone w formalinie, aby zapewnić ich pełną fiksację. Kluczowe jest, aby wszystkie powierzchnie tkanki były całkowicie pokryte formaliną.
  3. Po zanurzeniu tkanek w formalinie należy pozostawić je do utrwalenia na co najmniej 24 h w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: Formalina przenika tkanki powoli, w tempie 1 mm na godzinę z każdej powierzchni.27,28Zatem utrzymanie grubości przekrojów tkankowych poniżej 5 mm zapewnia szybką fiksację całej tkanki.
  4. Po utrwaleniu przenieść tkanki do odpowiedniego odczynnika służącego do zatapiania w parafinie.
    Uwaga: Na przykład tkanki badane w niniejszym manuskrypcie zostały przeniesione do 70% etanolu przed zatopieniem.
  5. Zatopić tkanki w parafinie.29
  6. Wyciąć preparat tkankowy w grubości 10 – 80 µm grubości (użyć 10-20 µm (jeżeli zamierzono wyekstrahować miRNA)29.
  7. Za pomocą skalpela i pęsety należy pobrać fragment tkanki o masie 40 mg z każdej próbki przeznaczonej do obróbki i umieścić go w sterylnej, wolnej od nukleaz probówce do wirówki.
  8. W celu wyekstrahowania RNA z zakonserwowanych próbek należy wykorzystać komercyjny zestaw przeznaczony do deparafinacji i odzyskiwania kwasów nukleinowych z próbek tkanek utrwalonych w FFPE.
    Uwaga: Zestaw wspomniany w Tabela materiałów wykorzystuje płukanie ksylenem i etanolem w celu usunięcia parafiny, etap obróbki proteazą oraz filtr z włókna szklanego do oczyszczania RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie uwag przedstawionych w niniejszym artykule (kroki 1 - 4 protokołu) pomoże w odzyskaniu z próbek dużych zwierząt RNA nadającego się do dalszych analiz w badaniach ekspresji genów gospodarza. Jakość RNA dla zastosowań w dalszych etapach ocenia się za pomocą wielu standardowych pomiarów. W spektrofotometrii stosunek A260/A280 pozwala ocenić stopień zanieczyszczenia białkami, natomiast stosunek A260/A230 stanowi inny sposób oceny czystości, pozwalający wykryć zanieczys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Większość badań transkryptomicznych i związanych z nimi protokołów koncentruje się na próbkach pobranych od myszy, szczurów lub pośmiertnych ludzi. Jednak badania na zwierzętach gospodarskich i dzikich dają szeroki zakres możliwości charakterystyki odpowiedzi immunologicznej na chorobę, zarówno w odniesieniu do medycyny weterynaryjnej, jak i, w odniesieniu do chorób odzwierzęcych, do zdrowia publicznego ludzi. Protokół ten zawierał zarys kluczowych zagadnień dotyczących ekstrakcji RNA o wysokiej integralności z tkanek du...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów. Wszystkie badania są finansowane z funduszy krajowych Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Służby Badań Rolniczych. Wszystkie odniesienia do konkretnych produktów są podane w celu odtworzenia eksperymentalnego i nie stanowią żadnego poparcia dla tych produktów przez rząd federalny.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Jamesowi Fosse za jego doskonałą pracę nad wszystkimi filmami i przetwarzaniem wideo; Michaelowi Marti za znakomitą pracę nad generowaniem zdigitalizowanych zdjęć bydła; Lilia Walther za pomoc w ekstrakcji RNA i biegach z bioanalizatorem; Mitch Palmer i Carly Kanipe za pomocny przegląd i opinie na temat obrazów węzłów chłonnych; oraz personelowi opieki nad zwierzętami i weterynarzom w Narodowym Centrum Chorób Zwierząt za ich ciężką pracę i pomoc w hodowli zwierząt i przygotowaniach do sekcji zwłok

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór do konserwacji RNA (do wszystkich eksperymentów używaliśmy RNALater)ThermoFisherAM7020
1,5 ml lub 2 ml polipropylenowe probówki wirówkowe Fisher Scientific05-408-129
Jednorazowe skalpeleDaigger ScientificEF7281
Kleszcze do tkanek, ząb szczuraFisher Scientific12-460-117Dostępne inne kleszczyki do tkanek, w tym zakrzywiona końcówka, zwężająca się krawędź itp., W zależności od preferencji użytkownika
Igły do biopsji 3 mmFisher ScientificNC9949469
Pojemnik na ostre przedmioty (mały i przenośny do sekcji zwłok)Stericycle8900SA1 qt. rozmiar pokazany tutaj
Deski do krojenia lub tace jednorazoweFisher Scientific09-002-24ADostępne w różnych rozmiarach, w zależności od preferencji użytkownika Środki
ochrony osobistejRóżni się w zależności od patogenu (rękawice, maski oddechowe, gogle itp.)
Odczynnik do ekstrakcji RNA na bazie fenolu (do wszystkich eksperymentów użyliśmy odczynnika TRIzol)Zestaw
(do wszystkich eksperymentów użyliśmy zestawu PureLink RNA Mini)ThermoFisher12183018AZaprojektowany do tkanek do 100 mg
100% etanolu (200 proof dla biologii molekularnej)Sigma-AldrichE7023
Homogenizator tkankowy z dołączonymi probówkami homogenizacyjnymi (do wszystkich eksperymentów używaliśmy dysocjatora gentleMACS)Miltenyi Biotec130-093-235
Agaroza (Ogólne, do elektroforezy żelowej)Sigma-AldrichA9539
1XTBE Fisher ScientificBP24301Może również wykonać od podstaw w laboratorium
Dejonizowany formamidEMD MilliporeS4117
Dodecylosiarczan soduSigma-AldrichL3771
Błękit bromofenolowySigma-Aldrich114391
Cyjanol ksylenowy Sigma-AldrichX4126
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)UV-Vis Sigma-AldrichEDS
(użyliśmy spektrofotometru NanoDrop)ThermoFisherND-2000
Urządzenie do ilościowej oceny RNA (użyliśmy Bioanalizatora, z powiązanymi komponentami i protokołami)AgilentG2939BA
Zestaw do ekstrakcji RNA FFPE (użyliśmy zestawu do izolacji całkowitych kwasów nukleinowych RecoverAll do tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie)ThermoFisherAM1975
Rozsiewacz z tworzywa sztucznego (rozsiewacz w kształcie litery L)Fisher Scientific14-665-231Potrzebny tylko do badania sterylności próbek od zakażonych zwierząt
Noże do sekcji zwłokKoncepcje hodowlaneWI-0009209
do ekstrakcji RNA na bazie kolumny krzemionkowej ThermoFisher 15596026 Spektrofotometr

Bibliografia

  1. Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10 (6), e0131459(2015).
  2. Miller, L. C., et al. Analysis of the swine tracheobronchial lymph node transcriptomic response to infection with a Chinese highly pathogenic strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. BMC Veterinary Research. 8, 208(2012).
  3. Silva, T. M. A., Costa, E. A., Paixao, T. A., Tsolis, R. M., Santos, R. L. Laboratory animal models for brucellosis research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 518323(2011).
  4. Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
  5. Elmore, S. A. Histopathology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34 (5), 425-454 (2006).
  6. Luscieti, P., Hubschmid, T. h, Cottier, H., Hess, M. W., Sobin, L. H. Human lymph node morphology as a function of age and site. Journal of Clinical Pathology. 33 (5), 454-461 (1980).
  7. Hadamitsky, C., et al. Age-dependent histoarchitectural changes in human lymph nodes: an underestimated process with clinical relevance? Journal of Anatomy. 216 (5), 556-562 (2010).
  8. Sisson, S., Grossman, J. D., Getty, R. Sisson and Grossman’s The Anatomy of Domestic Animals, Volume 1. , Fifth Edition, W.B. Saunders Company. Philadelphia, PA. (1975).
  9. Olsen, S. C., Johnson, C. Comparison of abortion and infection after experimental challenge of pregnant bison and cattle with Brucella abortus strain 2308. Clinical and Vaccine Immunology. 18 (12), 2075-2078 (2011).
  10. Brichta-Harhay, D. M., et al. Microbiological analysis of bovine lymph nodes for the detection of Salmonella enterica. Journal of Food Protection. 75 (5), 854-858 (2012).
  11. Samuel, J. L., O’Boyle, D. A., Mathers, W. J., Frost, A. J. Isolation of Salmonella from mesenteric lymph nodes of healthy cattle at slaughter. Research in Veterinary Science. 28 (2), 238-241 (1980).
  12. Arthur, T. M., et al. Prevalence and characterization of Salmonella in bovine lymph nodes potentially destined for use in ground beef. Journal of Food Protection. 71 (8), 1685-1688 (2008).
  13. Cray, W. C., Moon, H. W. Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7. Applied and Environmental Microbiology. 61 (4), 1586-1590 (1995).
  14. Thiermann, A. B. Experimental leptospiral infections in pregnant cattle with organisms of the Hebdomadis serogroup. American Journal of Veterinary Research. 43 (5), 780-784 (1982).
  15. Palmer, M. V., Waters, W. R., Whipple, D. L. Investigation of the transmission of Mycobacterium bovis from deer to cattle through indirect contact. American Journal of Veterinary Research. 65 (11), 1483-1489 (2004).
  16. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA, and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  17. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  18. Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
  19. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx. (2013).
  20. TRIzol Reagent Manual. , ThermoFisher Scientific. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf (2016).
  21. Disruption and Homogenization of Tissue for the Extraction of RNA. , National Institute of Environmental Health Sciences . https://www.niehs.nih.gov/research/resources/protocols/extraction/disruption/index.cfm (2014).
  22. PureLink RNA Mini Kit Protocol . , Life Technologies. https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/purelink_rna_mini_kit_man.pdf (2012).
  23. RNA Gel-loading Buffer. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec397 (2006).
  24. Rio, D. C., Ares, M. Jr, Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing Agarose Gel Electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  25. Mueller, O., et al. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation. Electrophoresis. 21 (1), 128-134 (2000).
  26. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  27. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingstone. China. (2012).
  28. Medawar, P. B. The rate of penetration of fixatives. Journal of Microscopy. 61 (1-2), 46-57 (1941).
  29. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  30. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, 126-139 (2006).
  31. Fajardy, I., et al. Time course analysis of RNA stability in human placenta. BMC Molecular Biology. 10 (21), (2009).
  32. Bahar, B., et al. Long-term stability of RNA in post-mortem bovine skeletal muscle, liver and subcutaneous adipose tissues. BMC Molecular Biology. 8, 108(2007).
  33. Yamagishi, A., et al. Gene profiling and bioinformatics analyses reveal time course differential gene expression in surgically resected colorectal tissues. Oncology Reports. 31 (4), 1532-1538 (2014).
  34. Choi, S., Ray, H. E., Lai, S. H., Alwood, J. S., Globus, R. K. Preservation of multiple mammalian tissues to maximize science return from ground based and spaceflight experiments. PLoS One. 11 (12), e0167391(2016).
  35. Almeida, A., Thiery, J. P., Magdelenat, H., Radvanyi, F. Gene expression analysis by real-time reverse transcription polymerase chain reaction: influence of tissue handling. Analytical Biochemistry. 328 (2), 101-108 (2004).
  36. Lee, S. M. L., Schelcher, C., Thasler, R., Schiergens, T. S., Thasler, W. E. Pre-analytical determination of the effect of extended warm or cold ischaemia on RNA stability in the human ileum mucosa. PLoS One. 10 (9), e0138214(2015).
  37. Kap, M., et al. The influence of tissue procurement procedures on RNA integrity, gene expression, and morphology in porcine and human liver tissue. Biopreservation and Biobanking. 13 (3), 200-206 (2015).
  38. Hong, S. H., et al. Effects of delay in the snap freezing of colorectal cancer tissues on the quality of DNA and RNA. Journal of the Korean Society of Coloproctology. 26 (5), 316-325 (2010).
  39. Lee, S. M., et al. RNA stability in human liver: comparison of different processing times, temperatures and methods. Molecular Biotechnology. 53 (1), 1-8 (2013).
  40. Morrison, P. K., et al. Post-mortem stability of RNA in skeletal muscle and adipose tissue and the tissue-specific expression of myostatin, perilipin and associated factors in the horse. PLoS One. 9 (6), e100810(2014).
  41. Seear, P. J., Sweeney, G. E. Stability of RNA isolated from post-mortem tissues of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish Physiology and Biochemistry. 34 (1), 19-24 (2008).
  42. Marchuk, L., Sciore, P., Reno, C., Frank, C. B., Hart, D. A. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon, and cartilage. Biochimica et Biophysica Acta. 1379 (2), 171-177 (1998).
  43. Inoue, H., Kimura, A., Tuji, T. Degradation profile of mRNA in a dead rat body: basic semi-quantification study. Forensic Science International. 130 (2-3), 127-132 (2002).
  44. Micke, P., et al. Biobanking of fresh frozen tissue: RNA is stable in nonfixed surgical specimens. Laboratory Investigation. 86 (2), 202-211 (2006).
  45. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  46. Ahmed, A. M., et al. Variation in the ovine abomasal lymph node transcriptome between breeds known to differ in resistance to the gastrointestinal nematode. PLoS One. 10 (5), e0124823(2015).
  47. Russell, G. C., et al. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus Research. 169 (1), 246-254 (2012).
  48. Avraham, R., et al. A highly multiplexed and sensitive RNA-seq protocol for simultaneous analysis of host and pathogen transcriptomes. Nature Protocols. 11, 1477-1491 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pobieranie w z w ch onnychkonserwacja RNApobieranie pr bek tkanekekstrakcja RNAmetodologia biopsjisekcja zw ok du ych zwierz tocena jako ci RNAizolacja w z w ch onnychanaliza degradacji RNA
Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.