Wytwarzanie kropelek diakrylanu z poli(glikolu etylenowego) o kontrolowanej wielkości za pomocą pół-3-wymiarowych urządzeń mikroprzepływowych z ogniskowaniem przepływu

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół ilustrujący procesy produkcji i eksperymenty weryfikacyjne pół-trójwymiarowego (pół-3D) mikroprzepływowego chipa skupiającego przepływ do tworzenia kropel.

Streszczenie

Jednorodne i kontrolowane pod względem wielkości kropelki diakrylanu poli(glikolu etylenowego) (PEGDA) mogą być wytwarzane poprzez proces ogniskowania przepływu w urządzeniu mikroprzepływowym. W artykule zaproponowano półtrójwymiarowy (pół-3D) mikroprzepływowy chip skupiający się na przepływie do tworzenia kropel. Chip z polidimetylosiloksanu (PDMS) został wytworzony przy użyciu wielowarstwowej metody miękkiej litografii. Jako fazę ciągłą zastosowano surfaktant zawierający heksadekan, a fazę rozproszoną PEGDA z fotoinicjatorem ultrafioletowym (UV). Środki powierzchniowo czynne pozwoliły na spadek lokalnego napięcia powierzchniowego i utworzyły bardziej guzowatą końcówkę, która sprzyjała rozpadaniu się na drobne mikrokropelki. Ponieważ ciśnienie fazy rozproszonej było stałe, wielkość kropel zmniejszała się wraz ze wzrostem ciśnienia fazy ciągłej, zanim przepływ fazy rozproszonej został przerwany. W rezultacie kropelki o średnicy od 1 μm do 80 μm można było selektywnie uzyskać poprzez zmianę stosunku ciśnień w dwóch kanałach dolotowych, a średni współczynnik zmienności oszacowano na poniżej 7%. Co więcej, kropelki mogą zamieniać się w mikrokulki pod wpływem promieniowania UV w celu fotopolimeryzacji. Sprzężenie biomolekuł na powierzchni takich mikrokulek ma wiele potencjalnych zastosowań w dziedzinie biologii i chemii.

Wprowadzenie

Systemy mikroprzepływowe oparte na kropelkach mają zdolność do wytwarzania wysoce monodyspersyjnych kropel o średnicy od nanometrów do mikrometrów¹ i mają duży potencjał w odkrywaniu leków o wysokiej przepustowości², synteza biomolekuł^3,4, oraz testy diagnostyczne⁵. Ze względu na unikalne zalety mniejszych kropel, takie jak większy stosunek powierzchni do objętości oraz zastosowania na dużą skalę z pochłanianiem kilku mikrolitrów próbki, technologia ta wzbudziła duże zainteresowanie w szerokim zakresie dziedzin. Emulgowanie dwóch niemieszających się cieczy jest jedną z najbardziej typowych metod wytwarzania kropel. W poprzednich raportach z tej dziedziny naukowcy opracowali wiele różnych geometrii tworzenia kropel, w tym geometrie skrzyżowania T, ogniskowania przepływu i współprzepływu. W geometrii skrzyżowania T faza rozproszona jest dostarczana przez prostopadły kanał do kanału głównego, w którym przepływa faza ciągła^6,7. W typowej geometrii dwuwymiarowej (2D) skupiającej przepływ^8,9 przepływ fazy rozproszonej jest ścinany od bocznej; Z drugiej strony, dla geometrii współpłynącej^10,11, z drugiej strony, kapilara wprowadzająca przepływ fazy rozproszonej jest umieszczana współosiowo wewnątrz większej kapilary dla geometrii współpłynącej, tak że przepływ fazy rozproszonej jest ścinany ze wszystkich kierunków.

Wielkość kropli jest kontrolowana poprzez dostosowanie rozmiaru kanału i współczynnika przepływu, a minimalny rozmiar wytwarzany przez współprzepływ lub skrzyżowanie T jest ograniczony do kilkudziesięciu mikrometrów. W przypadku systemu tworzenia kropel skupiających przepływ, trzy tryby rozpadu kropel tworzą się poprzez dostosowanie stosunku ciśnień stężenia dwufazowego i surfaktantu, w tym reżim kapania, reżim natryskiwania i strumieniowanie końcówki¹⁵. Tryb strumieniowania końcówki jest również nazywany tworzeniem nici i zaobserwuje się pojawienie się cienkiej nici wyciągającej się z końcówki stożka przepływu fazy rozproszonej. Wcześniejsze badania wykazały, że kropelki o wielkości mniejszej niż kilka mikrometrów mogą być generowane w procesie strumieniowania końcówek w urządzeniu do ogniskowania przepływu 2D lub pół-3D^8,12. Ponieważ jednak jako fazę dyspersyjną zastosowano roztwór wodny zawierający bardzo niskie stężenie PEGDA, współczynnik skurczu cząstek PEGDA wynosił około 60% średnicy pierwotnych kropel po fotopolimeryzacji, podczas gdy PEGDA bez rozcieńczenia jako fazy rozproszonej doprowadziła do niestabilnego trybu strumieniowania końcówki¹². Napięcie międzyfazowe jest ważnym parametrem procesu emulsji i zmniejsza się dzięki dodaniu środka powierzchniowo czynnego do cieczy w fazie ciągłej, co prowadzi do zmniejszenia wielkości kropli, wyższej częstotliwości wytwarzania¹³, wysoce zakrzywiona końcówka i zapobieganie niestabilności¹⁴. Ponadto, gdy stężenie surfaktantu luzem jest znacznie wyższe niż krytyczne stężenie miceli, napięcie międzyfazowe jest w przybliżeniu niezmienne w stanie nasycenia¹³ i może wystąpić tryb strumieniowania końcówki¹⁵.

Na podstawie powyższych obserwacji, w tym artykule, opracowaliśmy proste podejście do generowania kropel PEGDA za pomocą pół-3D skupiającego przepływ urządzenia mikroprzepływowego, wykonanego metodą wielowarstwowej miękkiej litografii. W odróżnieniu od typowego urządzenia do ogniskowania przepływu 2D, urządzenie do ogniskowania przepływu pół-3D ma płytki kanał fazy rozproszonej i głęboki kanał fazy ciągłej, dzięki czemu faza rozproszona może być ścinana od góry ido dołu obok bocznej. Zapewnia to większy zakres regulacji w trybie koncentracji przepływu poprzez zmniejszenie energii i ciśnienia wymaganego do rozdrobnienia kropli. W odróżnieniu od poprzedniego raportu¹², faza rozproszona to czysty fotoinicjator zawierający PEGDA, upewniając się, że współczynnik skurczu cząstek PEGDA jest niższy niż 10%¹⁶; A faza ciągła to mieszanina heksadekanu rozpuszczająca się z wysokim stężeniem nasypowym niejonowego środka powierzchniowo czynnego na bazie silikonu. Jednorodne kropelki o kontrolowanej wielkości uzyskano poprzez regulację stosunku ciśnień dwóch faz. Średnica kropel zmienia się z 80 μm na 1 μm, gdy proces rozpadu kropli zmienia się z trybu natryskiwania na tryb strumieniowania końcówek. Ponadto cząstka PEGDA została zsyntetyzowana w procesie fotopolimeryzacji pod wpływem promieniowania UV. System mikroprzepływowy do generowania kropel z łatwością wytwarzania zapewni więcej możliwości zastosowań biologicznych.

Protokół

1. Produkcja form

1. Zaprojektuj dwie fotomaski za pomocą oprogramowania do rysowania. Opisz zarys struktury mikrokanałów i użyj dwóch oddzielnych warstw dla maski 1 i 2 w tym samym pliku rysunku, aby upewnić się, że wszystkie połączenia między różnymi kanałami. Drukuj różne warstwy niezależnie na chromowanej płycie na szkle przez dostawcę o rozdzielczości 1 μm. Upewnij się, że fotomaski są ciemne z przezroczystymi strukturami, jako polaryzacja ujemna.
   nuta: Maska 1 zawiera kanał wlotowy fazy rozproszonej i kryzę. Maska 2 zawiera kanał wlotowy fazy ciągłej, filtr i wylot.
2. W wyznaczonym laboratorium fotolitograficznym wyczyść płytkę krzemową o średnicy 3 cali. Umieść wafel na powlekarce wirowej, włącz próżnię, aby przymocować wafel do uchwytu wirowego. Przędzić 2-3 ml ujemnego fotorezystu SU-8 2025 na płytce przez 10 s przy 1 000 obr./min, a następnie 30 s przy 3 000 obr./min, uzyskując grubość pierwszej warstwy 20 μm.
3. Pieczenie na miękkości na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez 6 minut. Po ostygnięciu powlekanej płytki do temperatury pokojowej (RT), należy ją wystawić przez maskę 1 pod skolimowanym promieniowaniem UV 15 mW/^cm2, 365 nm przez 18 s. Po ekspozycji piecz na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 6 minut, a następnie pozwól wafli ostygnąć do temperatury RT.
4. Powtórz proces powlekania wirowego. Nałóż 2-3 ml negatywnego fotorezystu SU-8 2100 na płytkę przez 10 s przy 1 000 obr./min, a następnie 30 s przy 2 000 obr./min, zapewniając grubość drugiej warstwy 130 μm. Po miękkim pieczeniu na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 35 minut, umieść maskę 2 na fotorezyście drugiej warstwy, aby naświetlić przez 30 s, który został wyrównany z warstwą rozproszonego kanału fazowego za pomocą nakładki UV. Po ekspozycji piecz na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 7 minut.
5. Rozwinąć wafel, zanurzając go w mieszanej kąpieli 50 ml octanu eteru metylowego glikolu propylenowego, aż cechy płytki staną się wyraźne, a następnie przemyć go alkoholem etylowym. Na koniec umieść wafel na platformie termostatycznej do pieczenia na twardo przez 2 godziny.

2. Produkcja mikroprzepływowych chipów z pół-3D

1. Wymieszaj monomer PDMS i jego utwardzacz w nieco innym stosunku wagowym dla górnej i dolnej warstwy, zwykle 10:1 dla górnej warstwy i 8:1 dla dolnej warstwy, używając automatycznego mieszadła do maści przez 4 min.
   nuta: Górna i dolna płyta PDMS są przygotowane w nieco innym stosunku (odpowiednio 10:1 i 8:1) bazy PDMS do utwardzacza, co zwiększa siłę wiązania. Gdy dla dolnej warstwy zostanie wybrany stosunek 5:1, sztywniejsza dolna płyta PDMS utrudnia wyrównanie i zmniejsza siłę wiązania z powodu braku elastyczności. Dodatkowo grubość dolnej płyty PDMS wynosi około 1 mm w celu dostosowania odległości roboczej mikroskopu. Wiór łatwo odkształca się pod wysokim ciśnieniem, gdy wybrany jest stosunek 15:1.
2. Wlej mieszaninę do gotowej formy silikonowej na 90-milimetrowej szalce Petriego i uzyskaj grubość 2 ~ 3 mm. Umieść ją w komorze próżniowej i odgazowuj, aż wszystkie pęcherzyki powietrza znikną. Utwardzać w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę w piecu.
3. Poczekaj, aż PDMS ostygnie do temperatury cyfrowej. Użyj skalpela, aby odciąć urządzenie w odległości co najmniej 3 mm od elementów i powoli oderwij warstwę PDMS od płytki krzemowej. Przebić wlot fazy rozproszonej, wlot fazy ciągłej i wylot w górnej warstwie PDMS za pomocą stempla o średnicy 0,75 mm.
4. Wyczyść PDMS taśmą klejącą, aby usunąć cząsteczki kurzu. Plazma czyści jednocześnie górną i dolną warstwę PDMS przez 2 minuty w myjce plazmowej o mocy 300 W. Umieść górną warstwę na powierzchni dolnej warstwy i przesuwaj powierzchnie względnie, aż elementy zostaną wyrównane, patrząc przez mikroskop stereoskopowy.
5. Utwardź urządzenie w piekarniku w temperaturze 120 °C przez jeden dzień, aby zwiększyć wytrzymałość i całkowite wiązanie.

3. Przygotowanie odczynników

1. Przygotować roztwór fazy ciągłej: heksadekan, rozpuszczając 18% obj. niejonowy środek powierzchniowo czynny na bazie silikonu.
2. Przygotować roztwór fazy rozproszonej: hydrofilowy dikrylan poli(glikolu etylenowego) (PEGDA, MW 255,) zawierający 2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon (98%, MW 224) o stężeniu 5 mg/ml jako fotoinicjator i rodaminę B (95%, MW 479.01) o stężeniu 1 mmol/L jako barwniki fluorescencyjne.
3. Napełnij zbiorniki 1 ml pneumatycznego regulatora ciśnienia fazą ciągłą. Napełnij końcówkę ładującą żel o pojemności 200 μl fazą zdyspergowaną.

4. Przygotowanie systemu

1. Umieść pół-3D urządzenie mikroprzepływowe na stoliku odwróconego mikroskopu optycznego, oglądając za pomocą szybkiej kamery.
2. Podłącz rurkę z fluorowanym etylenem i propylenem (FEP) do wybitego otworu fazy ciągłej, mocując krótką rurkę ze stali nierdzewnej, a następnie włóż koniec końcówki ładującej żel do wybitego otworu fazy rozproszonej. Włóż rurkę FEP o długości 20 cm do wylotu w urządzeniu i umieść koniec w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
   nuta: Konfiguracja systemu jest zilustrowana na Rysunek 1.

5. Powstawanie kropel

1. Umieść urządzenie na stole warsztatowym odwróconego mikroskopu i upewnij się, że skrzyżowanie różnych kanałów znajduje się mniej więcej w pozycji źródła światła mikroskopu. Ustaw ostrość mikroskopu odwróconego na obszarze, który zawiera przecięcie dwóch faz, obszar kryzy i kanał dolny.
2. Ustaw ciśnienia dwóch faz za pomocą pneumatycznego regulatora ciśnienia, aby powoli dostarczać płyn do obszaru przecinania, z 15 mbar dla fazy rozproszonej i 30 mbar dla fazy ciągłej. Odczekaj 3 minuty na stabilizację i równowagę, aż do ustabilizowania przepływu płynu, bez pęcherzyków i pozostałości PDMS.
3. Wprowadź parametry w interfejsie użytkownika oprogramowania sterującego. Ustaw ciśnienie fazy rozproszonej jako ciśnienie podstawowe układu na stałe, na przykład utrzymuj je na poziomie 45 mbar. Zwiększaj ciśnienie fazy ciągłej, aż tryb rozpadu emulsji zmieni się z trybu natryskiwania na tryb strumieniowania końcówki, a następnie odczekaj 5 minut na stabilizację.
4. Umieść końcówkę rurki FEP łączącą otwór wylotowy z probówką wirówkową, aby zebrać kropelki.

6. Zbieranie i charakterystyka cząsteczek PEGDA

1. Zamocuj rurkę wirówkową pod kątem w uchwycie. Cząstki PEGDA należy uzyskać poprzez szybkie krzepnięcie przez ekspozycję na promieniowanie UV, gdy faza ciekła przepływa do rurki.
2. Po zakończeniu procesu zbierania należy pobrać próbkę i obserwować cząstki PEGDA za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektami odpowiednio 20X lub 60X.
   nuta.Cyfrowe obrazy fluorescencyjne rejestrowane przez kamerę są analizowane za pomocą specjalnego oprogramowania. Obraz jest najpierw dekonwolucyjny w oparciu o algorytm R-L¹⁷ w celu wyeliminowania efektu rozmycia nieostrego światła, a obiekty sferyczne na obrazie są wyodrębniane w oparciu o metodę wykrywania krawędzi Canny; na koniec średnicę każdego obiektu sferycznego można obliczyć za pomocą transformacji Hougha¹⁸. W rezultacie można oszacować średnią i odchylenie standardowe średnic obiektów sferycznych na każdym obrazie.

Wyniki

Pół-3D mikrofluidyczny chip z ogniskowaniem przepływu (flow-focusing) został wykonany przy użyciu technik wielowarstwowej litografii miękkiej, zgodnie z powyższym opisem. Proces wytwarzania oraz wyniki dla formy matrycowej w protokole przedstawiono na Rysunku 2. Pierwsza warstwa, która zapewnia kanał o szerokości 65 µm do wprowadzania fazy rozproszonej oraz otwór o szerokości 50 µm (Rysunek 2a), ma grubość 20 µm....

Dyskusja

Generowanie kropel w trybie ogniskowania przepływu za pomocą urządzenia mikroprzepływowego 2D i pół-3D zostało wcześniej opracowane w różnych raportach 8,9,15,19,20,21. W tych układach jako fazę rozproszoną wybrano ciecz wodną, której nie można było zestalić, taką jak woda dejonizowana

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wafel krzemowy	Huashi Co., Ltd
SU-8 2025, 2100	Microchem Co.
Deweloper SU-8	Microchem Co.
Maska chromowa	Qingyi Precision Mask Making Co., Ltd
polidimetylosiloksan (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
diakrylan poli(glikolu etylenowego) (PEGDA)	Sigma	26570-48-9
2-hydroksy-40-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon	TCI	H1361-5G	fotoinicjator
Heksadekan	Sigma	544-76-3
ABIL EM 90	CHT	144243-53-8	środki powierzchniowo czynne
Rodamina B	Aladdin	81-88-9	barwnik fluorescencyjny
Spin Coater
Maszyna
Automatyczne mieszadło do maści	Thinky	ARV-310
Piekarnik	BluePard
Mikroskop optyczny	OLYMPUS	IX71
Szybki aparat fotograficzny	Hamamatsu, Japonia	ORCA-flash
MAESFLO Mikroprzepływowy system kontroli płynów	Lampa UV FLUIGENT	MFCS-EZ
UV	FUTANSI		365 nm, 8000 MW/CM2

Y111069Y020100do litografiiŚwiatło