Wariacje na temat metod mikroskopii elektronowej w barwieniu ujemnym: narzędzia do radzenia sobie z trudnymi systemami

Summary

Negatywna plama EM to potężna technika wizualizacji struktury makromolekularnej, ale różne techniki barwienia mogą dawać różne wyniki w zależności od próbki. W tym miejscu szczegółowo opisano kilka podejść do barwienia negatywnego, aby zapewnić wstępny przepływ pracy w celu rozwiązania problemu wizualizacji trudnych systemów.

Abstract

Mikroskopia elektronowa (EM) pozwala na stosunkowo prostą i szybką obserwację makrocząsteczek i kompleksów makromolekularnych dzięki zastosowaniu odczynnika do barwienia zwiększającego kontrast. Chociaż rozdzielczość jest ograniczona do maksymalnie ~18 - 20 A, barwienie ujemne EM jest przydatne w przypadku różnych problemów biologicznych, a także zapewnia szybki sposób oceny próbek do mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM). Przepływ pracy z negatywnymi plamami jest prostą metodą; Próbka jest adsorbowana na podłożu, a następnie nakładana jest plama, osuszana i suszona w celu wytworzenia cienkiej warstwy barwienia o dużej gęstości elektronów, w której osadzone są cząstki. Poszczególne próbki mogą jednak zachowywać się w bardzo różny sposób w różnych warunkach barwienia. Doprowadziło to do opracowania szerokiej gamy technik przygotowania substratów, odczynników do barwienia ujemnego oraz technik mycia i blottingu siatkowego. Określenie najbardziej odpowiedniej techniki dla każdej pojedynczej próbki musi być wykonywane indywidualnie dla każdego przypadku, a mikroskopista musi mieć dostęp do wielu różnych technik, aby osiągnąć najwyższej jakości wyniki barwienia ujemnego. Przedstawiono szczegółowe protokoły dla dwóch różnych metod przygotowania substratu i trzech różnych technik blottingu, a także pokazano przykład próbki, która wykazuje wyraźnie różne wyniki w zależności od zastosowanej metody. Ponadto opisano przygotowanie niektórych popularnych odczynników do barwienia ujemnego oraz dwóch nowych barwników na bazie lantanowców wraz z dyskusją na temat stosowania każdego z nich.

Introduction

Pomimo niedawnego zwrócenia uwagi na rewolucję rozdzielczości, wynikającą ze znacznego postępu w mikroskopii krioelektronowej¹ (cryo-EM), barwienie ujemne EM pozostaje potężną techniką i kluczowym elementem zestawu narzędzi mikroskopistów elektronowych. Barwienie ujemne nadal pozostaje najlepszą metodą szybkiej oceny próbki przed optymalizacją warunków kriosiatki². Wysoki kontrast i szybkość przygotowania siatki próbek barwionych negatywowo sprawiają, że idealnie nadaje się do oceny czystości próbki, stężenia, niejednorodności i elastyczności konformacyjnej³. Wiele biologicznie pouczających struktur powstało w wyniku rekonstrukcji negatywnych plam, mimo że rozdzielczość techniki była ograniczona do ~18 A rozdzielczość^4,5,6, a niektóre próbki dają lepsze wyniki w barwieniu niż cryo-EM z różnych powodów⁷.

W ujemnym zabarwieniu EM, interesująca cząstka jest adsorbowana na powierzchni siatki EM i otoczona amorficzną matrycą gęstego elektronowo związku barwników. Między tłem a cząstką będącą przedmiotem zainteresowania powstaje wysoki kontrast względny, przy czym cząstka ma mniejszą gęstość elektronów niż otaczająca ją plama⁸. Cząstki pojawiają się jako jasne obszary ze względu na ich niską moc rozpraszania elektronów w stosunku do gęstego otaczającego barwnika, który bardziej rozprasza elektrony i wydaje się ciemniejszy. Cechy substrukturalne cząstek można wywnioskować ze szczegółowego badania wynikowych obrazów, ponieważ plama wnika w każdą szczelinę i wytwarza nieregularne szczegóły kontrastu⁹.

Proces barwienia negatywnego rozpoczyna się od przygotowania podłoża nośnego, na którym wychwytywane są cząstki próbki i podpierana warstwa wyschniętej plamy. Najczęściej stosowanym substratem podporowym jest warstwa węgla amorficznego, czasami podtrzymywana cienką warstwą polimeru poliwinylowego (np. Formvar) lub nitrocelulozowego (np. Kolodion). Podłoża te można zakupić komercyjnie lub przygotować we własnym zakresie przy użyciu protokołów opisanych poniżej.

Po przygotowaniu podłoża nośnego, próbka może zostać nałożona, a nadmiar roztworu usunięty. Próbki powinny być zawieszone w odpowiednim buforze do barwienia ujemnego. Najlepiej jest unikać stosowania buforu fosforanowego i wysokich stężeń soli, które mogą powodować powstawanie krystalicznych osadów, które mogą zasłaniać próbkę. Należy również unikać środków redukujących, detergentów, sacharozy, glicerolu i wysokich stężeń nukleotydów, ponieważ one również wpływają na jakość plam⁴. Gdy nie można zmienić składu buforu, przemycie powierzchni siatki EM wodą lub bardziej odpowiednim buforem po adsorpcji, a przed barwieniem, może ograniczyć tworzenie się artefaktów związanych z buforem i ogólnie poprawić tło barwie. Jeśli podejrzewa się, że artefakty buforu są podejrzane, przydatne może być zabarwienie siatki tylko bufora w celu określenia, czy składniki buforu są źródłem zaobserwowanych artefaktów.

Po zaadsorbowaniu próbki, osuszeniu i umyciu, jeśli to konieczne, nakładany jest odczynnik barwiący. Stwierdzono, że różne odczynniki są skutecznymi barwnikami ujemnymi (tabela 1), ale plama musi być dobrana tak, aby pasowała do próbki. "Halo" plamy tworzy się wokół cząsteczki zarówno z powodu przemieszczenia cząsteczek barwnika przez hydrofobowe regiony białka, jak i odpychania przez naładowane grupy. Dlatego barwienie musi być tak dobrane, aby stan protonacji wszelkich potencjalnie naładowanych grup na białku był taki sam jak w przypadku barwienia przy roboczym pH. Przeciwstawne ładunki na powierzchni białka mogą przyczyniać się do pozytywnego efektu barwienia, który choć sam w sobie jest użyteczną techniką¹⁰ nie wchodzi w zakres tego artykułu. Najczęściej stosowanymi odczynnikami do barwienia ujemnego są octan uranylu i mrówczan uranylu. Plamy te mają stosunkowo drobny rozmiar ziarna (4 - 5 A)⁹ i zapewniają obrazy o wyższej rozdzielczości niż inne plamy, takie jak fosfo-wolframiaty (8 - 9 A wielkość ziarna)9^,11, molibdenian amonu¹¹, oraz niektóre plamy na bazie lantanowców¹². Octan uranylu i mrówczan działają również jako utrwalacz, zachowując wiele interakcji białko-białko w skali milisekundowej¹³, chociaż niskie pH barwnika i jego skłonność do wytrącania się przy fizjologicznym pH mogą być szkodliwe dla niektórych próbek¹⁴. Pomimo swojej użyteczności, sole uranylu stanowią również wyzwanie logistyczne, ponieważ są zarówno toksyczne, jak i umiarkowanie radioaktywne, co może wymagać specjalnych wymagań dotyczących obchodzenia się, przechowywania i usuwania, co skłania niektórych użytkowników do poszukiwania nieradioaktywnych alternatyw.

Istnieje wiele różnych metod opisanych do przygotowania podłoża, aplikacji próbek i barwienia siatek EM. Najodpowiedniejsza metoda jest zależna od próbki i może być trudna do ustalenia w przypadku nowego systemu. W manuskrypcie opisano dwie metody przygotowania podłoża i trzy metody bibułowania; boczne blotting, migotanie^5,i szybkie spłukiwanie¹⁵. Side-blotting jest najprostszą z opisanych metod. Zarówno metoda migotania, jak i metoda szybkiego spłukiwania są trudniejsze do wdrożenia, ale ograniczają czas kontaktu próbki z folią nośną przed utrwaleniem i wykazano, że łagodzą tworzenie się artefaktów plam w przypadku niektórych próbek⁵. Celem tego manuskryptu jest zatem przedstawienie wstępnego przepływu pracy w celu rozwiązania problemu wizualizacji trudnych systemów za pomocą negatywnego zabarwienia EM.

Protocol

1. Przygotowanie siatek EM

1. Metoda arkusza węglowego
   1. Przygotuj świeżo rozcięty arkusz miki.
      1. Delikatnie włóż precyzyjną igłę strzykawki lub żyletkę w jeden róg arkusza miki, kilka mm między warstwami. Włóż narzędzie jak najbliżej pionowego środka arkusza, aby uzyskać dwa kawałki o mniej więcej równej grubości.
      2. Ostrożnie rozsuń dwie połówki arkusza miki. Można to zrobić na oko lub pod mikroskopem preparacyjnym.
      3. Odetnij jeden z rogów każdego z nowo rozciętych arkuszy miki. W przypadku, gdy arkusz przewróci się w parowniku węglowym podczas uwalniania podciśnienia, można zidentyfikować stronę arkusza pokrytą węglem.
   2. Umieść rozcięte arkusze miki w komorze parownika węglowego, świeżo rozciętą powierzchnią skierowaną do góry.
   3. Upewnij się, że parownik węglowy jest prawidłowo ustawiony za pomocą odpowiednio przygotowanej elektrody węglowej.
      UWAGA: Sposób przygotowania prętów węglowych będzie się różnić w zależności od specyfikacji parownika węglowego. Protokół dla jednego instrumentu jest następujący do kroku 1.1.5.
      1. Naostrz pręt węglowy za pomocą ostrzałki, aby miał ostrą końcówkę, a następnie wypoleruj go ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszelkie szorstkie zadziory.
      2. Za pomocą drobnego papieru ściernego spłaszcz koniec drugiego pręta i ponownie wypoleruj go na gładko ręcznikiem papierowym.
      3. Umieść dwa pręty węglowe w parowniku zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że zaostrzony koniec pierwszego pręta mocno styka się ze spłaszczoną powierzchnią drugiego pręta.
   4. Umieść mały kawałek czystej, suchej bibuły filtracyjnej częściowo pod miką, jeśli grubość węgla ma być mierzona wizualnie. Alternatywnie, umieść białe, matowe szkiełko mikroskopowe z niewielką ilością smaru próżniowego obok miki, aby ocenić grubość węgla.
   5. Osadzaj węgiel na mice zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Zmniejsz podciśnienie i poczekaj, aż osiągnie poziom ^10-5 mbar. Ustaw napięcie elektrody na 4,0 V (może być wymagane do 5 V w zależności od źródła pręta węglowego).
      2. Przepuść przez elektrodę wiele krótkich impulsów o czasie trwania około 3,5 s, aby osadzić parowanie węgla o grubości 1-2 nm na powierzchni miki.
         UWAGA: Gdy prąd zostanie przyłożony do pręta węglowego, będzie on świecił na czerwono, a następnie na biało. Nie wpatruj się w jasne światło, ponieważ może to uszkodzić oczy.
      3. Pozwolić, aby węgiel osadził się na mice, aż do osiągnięcia żądanej grubości, mierzonej za pomocą miernika grubości parownika węglowego lub przez wzrokową obserwację węgla osadzonego na bibule filtracyjnej lub szkiełku mikroskopowym. Upewnij się, że końcowa warstwa węgla ma grubość 5-10 nm.
         1. Jeśli grubość węgla jest mierzona wizualnie, porównując matową część szkiełka mikroskopowego pokrytą smarem próżniowym z odsłoniętym obszarem, stanie się ona ciemniejsza w miarę osadzania się większej ilości węgla.
            UWAGA: Nie ma metody ilościowej do określania grubości węgla przy użyciu tej metody.
   6. Odpowietrzyć komorę próżniową i usunąć mikę pokrytą węglem z parownika węglowego.
      UWAGA: Mikę pokrytą węglem można pozostawić na noc do osiadania przed przystąpieniem do kolejnych kroków
   7. Użyj jednego z dwóch pojemników na wodę, aby unieść folię węglową na kratki EM: pojemnik z zaworem spustowym na dole, aby można było odprowadzić wodę i opuścić warstwę węgla na kratki oczekujące lub platformę podnoszącą, na której kratki można ustawić pod powierzchnią wody, które mogą następnie podnieść kratki aż do filmu węglowego na powierzchni wody.
   8. Napełnij pojemnik ultraczystą wodą destylowaną tak, aby powierzchnia wody znajdowała się około 5 mm od góry. Oczyść powierzchnię z wody, przeciągając po niej arkusz lub dwa chusteczki soczewki, aby usunąć wszelkie unoszące się cząstki.
   9. Umieść kawałek czystej siatki ze stali nierdzewnej (1 cal na 2.5 cala to odpowiedni rozmiar) pod powierzchnią wody.
   10. Za pomocą cienkiej pęsety połóż czyste, suche kratki EM stroną zadrukowaną do góry (zgodnie z opisem producenta) na siatce ze stali nierdzewnej. Upakuj siatki tak ciasno, jak to możliwe, ale nie pozwól, aby zachodziły na siebie.
   11. Po ułożeniu kratek mocno chwyć arkusz miki pokryty węglem w pęsetę lub szczypce do wywoływania filmów.
   12. Wprowadź arkusz miki do wody. Upewnij się, że odbywa się to pod bardzo płytkim kątem (~10 stopni).
       UWAGA: Mika powinna przebić się przez powierzchnię wody i zanurzyć się, podczas gdy folia węglowa powinna oddzielić się od miki i unosić się na powierzchni wody. Ten krok nie powinien być wykonywany bezpośrednio nad kratkami, aby uniknąć uszkodzenia i/lub zanieczyszczenia.
       1. Aby zminimalizować możliwość, że folia węglowa nie oddzieli się od arkusza miki, naciąć krawędź arkusza miki żyletką lub odciąć jeden róg małymi nożyczkami przed włożeniem go do wody.
   13. Po oderwaniu się folii węglowej usuń arkusz miki lub pozwól mu opaść na dno pojemnika.
   14. Za pomocą pęsety z cienką końcówką bardzo delikatnie dociśnij i powolnymi ruchami prowadź folię węglową po górnej części siatek.
   15. Doprowadzić arkusz węglowy do kontaktu z powierzchnią kratek, powoli spuszczając wodę lub podnosząc pierścień podnoszący, w zależności od rodzaju używanego urządzenia.
   16. Ostrożnie wyjmij siatkę ze stali nierdzewnej (teraz z kratkami pokrytymi węglem) z urządzenia i odchodź część nadmiaru wody za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej. Upewnij się, że odbywa się to poprzez dotknięcie bibuły filtracyjnej do samej krawędzi stalowej siatki, ale nie stykając się z kratkami lub folią węglową.
   17. Umieść siatkę kratek na szalce Petriego zawierającej suchy kawałek bibuły filtracyjnej i pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
       UWAGA: Najlepiej wpływa to na suszenie przez noc w temperaturze pokojowej, ale krok ten można przyspieszyć, umieszczając kratki w piekarniku w temperaturze około 60 °C.
2. Float and coat (bezpośrednie osadzanie węgla). Ta metoda została szczegółowo opisana wcześniej¹⁶
   1. Całkowicie napełnij czystą, dużą szklaną miskę po brzegi wodą destylowaną, aby na górze utworzył się menisk.
   2. Nanieść pojedynczą kroplę roztworu kolodionu (nitroceluloza w octanie amylu) na powierzchnię wody za pomocą czystej pipety Pasteura, pozostawić kroplę do rozprowadzenia i całkowitego wyschnięcia. Po wyschnięciu widoczna będzie cienka warstwa kolodionu unosząca się na powierzchni wody.
   3. Delikatnie usuń warstwę kolodionu za pomocą wykałaczki, aby usunąć kurz lub inne zanieczyszczenia z powierzchni wody.
   4. Nałóż drugą kroplę kolodionu na wodę i pozwól jej się rozprowadzić i wyschnąć przez 2-3 minuty.
      UWAGA: Powtarzaj kroki 1.2.3-1.2.4, aż do uzyskania płaskiego i pozbawionego zmarszczek arkusza kolodionu.
   5. Za pomocą cienkiej pęsety umieść siatki EM zadrukowane do dołu (zgodnie z opisem producenta) na pływającym arkuszu kolodionowym. Upakuj siatki ciasno razem w sześciokątny układ, ale nie pozwól, aby zachodziły na siebie.
      UWAGA: Jeśli siatka zostanie zgubiona lub umieszczona do góry nogami, generalnie najlepiej jest pozostawić ją na miejscu, niż ryzykować uszkodzenie arkusza kolodionu podczas próby jego przesunięcia.
   6. Po umieszczeniu wszystkich siatek delikatnie połóż na nich arkusz bibuły filtracyjnej. Pozwól, aby papier nasiąknął się kapilarnie.
      UWAGA: Każdy rozmiar i grubość bibuły filtracyjnej jest odpowiednia, jeśli całkowicie zakrywa siatki.
   7. Użyj wykałaczki, aby usunąć folię kolodionową, która wystaje poza bibułę filtracyjną.
   8. Chwyć bibułę filtracyjną za krawędź i oderwij ją od powierzchni wody.
      UWAGA: Kratki powinny przylegać do papieru.
   9. Umieść papier płasko i kolodionem do góry na szalce Petriego i pozostaw do całkowitego wyschnięcia.
   10. Umieścić bibułę filtracyjną wraz z kratkami w komorze parownika węglowego z odpowiednio przygotowaną elektrodą węglową, jak opisano w ppkt 1.1.2.
   11. Postępować zgodnie z procedurą odparowywania węgla opisaną dla metody arkusza węglowego w
3. Odczekaj kilka sekund między impulsami, aby uniknąć przegrzania i uszkodzenia arkusza nitrocelulozy.
   UWAGA: W razie potrzeby warstwę polimeru można usunąć po pokryciu kratek węglem, chociaż ten krok jest rzadko konieczny. Umieść kratki stroną węglową do góry na świeżym kawałku bibuły filtracyjnej i umieść kilka kropli acetonu na bibułę w pobliżu, ale nie na kratkach. Pozwól, aby aceton rozprowadził się pod kratkami i rozpuścił się i wchłonął warstwę polimeru.

2. Przygotowanie odczynników do barwienia negatywnego

1. Przygotowanie octanu uranylu
   1. Doprowadź niewielką ilość ultraczystej wody do wrzenia i gotuj ją przez 10 minut, aby dokładnie odgazować. Pozwól mu lekko ostygnąć, a następnie użyj go do rozpuszczenia octanu uranylu (UA) w stężeniu 1-2 % (w/v).
      UWAGA: Tę procedurę należy wykonać w dygestorium i przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.
   2. Po ostygnięciu roztworu przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm lub bibułę filtracyjną.
   3. Przechowywać UA w bezpiecznym miejscu i w temperaturze 4 °C. Rozwiązanie jest stabilne do 1 roku.
2. Przygotowanie mrówczanu uranylu z proszku. Ta metoda została szczegółowo opisana wcześniej⁸
   1. Rozpuścić 20 mg mrówczanu uranylu (UF) w proszku w 2 ml przegotowanej, odgazowanej wody ultraczystej (jak w kroku 2.1.1) przez mieszanie.
   2. Kontynuując mieszanie, dodać 8 μl 5 M NaOH, roztwór powinien zmienić kolor na ciemniejszy żółty, ale nie powinien powstać osad.
   3. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
   4. Przechowuj plamę UF w bezpiecznym miejscu. Wyrzuć plamę, jeśli zauważysz jakikolwiek osad lub brązowe przebarwienia. Roztwór jest stabilny tylko przez 1-2 dni.
3. Przygotowanie mrówczanu uranylu z octanu uranylu
   1. Wytrącić 1 ml 1% (w/v) barwnika UA, dodając 100 μL 1 M NaOH.
   2. Odwirowywać mieszaninę przez 2 minuty z maksymalną prędkością w wirówce stołowej.
   3. Odrzucić sklarowany osad i rozpuścić osad w 100 μl 5% (v/v) kwasu mrówkowego poprzez energiczne wirowanie.
   4. Rozcieńczyć do końcowej objętości 1 ml ultraczystą wodą o objętości 900 μl, aby uzyskać plamę UF w 0,5% (v/v) kwasie mrówkowym.
   5. Przechowuj plamę UF w bezpiecznym miejscu. Wyrzuć plamę, jeśli zauważysz jakikolwiek osad lub brązowe przebarwienia.
4. Przygotowanie innych odczynników barwiących
   1. Przygotowanie plam z octanu lantanowca
      1. Rozpuść octan samaru (SmAc), octan gadolinu (GdAc), octan tulu (TmAc) lub octan erbu (ErAc) w stężeniu 1-2% (w/v) w ultraczystej wodzie.
         UWAGA: Jeśli próbki wykazują dodatnie barwienie lub słabą przyczepność do siatki podczas stosowania tych barwników, można je zakwasić do 0,5% (v/v) kwasem mrówkowym. Pozytywne barwienie powoduje, że próbka wygląda jak ciemny obiekt otoczony białym halo. Słabe przyleganie do siatki spowoduje, że na siatce zaobserwuje się mniej cząsteczek niż oczekiwano.
   2. Otrzymywanie molibdenianu amonu i fosforondoganowi sodu
      1. Rozpuść plamę w stężeniu 1-3% (w/v) w ultraczystej wodzie. W razie potrzeby dostosować pH do 7,0 za pomocą 5 M NaOH.

3. Adsorpcja próbek na podłożu węglowym i barwienie

1. Przygotowanie powierzchni siatki do nałożenia próbki poprzez nadanie jej hydrofilowości
   1. Umieść siatkę skierowaną do góry na szkiełku mikroskopowym w jednostce wyładowczej jarzeniowej.
   2. Traktuj siatkę przez co najmniej 30 s w temperaturze 10 mA.
      UWAGA: Dokładna metoda wyładowania jarzeniowego będzie zależeć od specyfikacji konkretnego używanego urządzenia.
   3. Alternatywnie można to osiągnąć poprzez naświetlanie promieniami UV przez 10 minut przy użyciu stacjonarnej lampy UV ⁴.
2. Metoda blottingu bocznego. Ta metoda została szczegółowo opisana wcześniej⁸
   1. Chwyć krawędź siatki pęsetą podciśnieniową i nałóż 3-5 μl próbki na powierzchnię podparcia.
   2. Pozwól próbce zaadsorbować się na powierzchni siatki przez 10 s do 1 minuty. Zoptymalizuj czas adsorpcji dla poszczególnych próbek.
   3. Dotknij krawędzią siatki arkusza bibuły filtracyjnej i pozwól, aby działanie kapilarne ściągnęło płyn.
   4. Opcjonalnie: Umyj ruszt. Umieścić 50 μl kropli ultraczystej wody lub odpowiedniego lotnego roztworu buforowego na arkuszu folii laboratoryjnej. Delikatnie dotknij węglowej powierzchni siatki do kropli i oderwij małą kroplę na powierzchnię siatki. Dotknij krawędzią siatki arkusza bibuły filtracyjnej i pozwól, aby działanie kapilarne ściągnęło płyn.
   5. Powtórz ten krok prania tyle razy, ile chcesz.
   6. Umieść dwie krople odczynnika barwiącego o pojemności 50 μl na arkuszu folii laboratoryjnej.
   7. Delikatnie dotknij węglową powierzchnią siatki do kropli i oderwij małą kroplę na górną powierzchnię siatki.
      UWAGA: Jeśli plama przeniesie się na tył siatki, należy ją wyrzucić.
   8. Dotknij krawędzią siatki arkusza bibuły filtracyjnej i pozwól, aby działanie kapilarne odciągnęło ciecz. Wykonaj ten krok barwienia dwukrotnie.
   9. Pozostaw kratkę do wyschnięcia na powietrzu lub do wyschnięcia pod żarówką lampa.
3. Metoda migotania
   1. Chwyć krawędź siatki pęsetą podciśnieniową i nałóż 3-5 μl próbki na powierzchnię podparcia.
   2. Trzymając pęsetę w jednej ręce, tak aby siatka była nachylona pod kątem około 45° skierowanym w bok, szybko przesuń nadgarstek tej dłoni, aby "strzepnąć" większość kropli znajdującej się na górze siatki.
   3. Fakultatywnie: Za pomocą szklanej pipety Pasteura nanieść kroplę roztworu myjącego na powierzchnię podparcia i "strzepnąć" jak w ppkt 3.2.2. Powtórz w razie potrzeby.
   4. Za pomocą szklanej pipety Pasteura nanieść kroplę odczynnika barwiącego na powierzchnię podłoża i "strzepnąć", jak w ppkt 3.2.2. Powtórz 1-3 razy w zależności od głębokości plamy wymaganej do wizualizacji próbki.
      UWAGA: Nie jest to jedyny czynnik, który przypisuje się końcowej głębokości plamy (patrz dyskusja).
   5. Usuń nadmiar plamy, dotykając rozdartą krawędzią kawałka bibuły filtracyjnej do krawędzi siatki.
   6. Pozostaw kratkę do wyschnięcia na powietrzu lub do wyschnięcia pod żarówką lampa.
4. Metoda szybkiego spłukiwania
   1. Pobrać 30-70 μl barwnika (zwykle stosuje się 1 % UA) do końcówki pipety o pojemności 200 μl, obrócić pokrętło głośności, aby pobrać 5 μl powietrza, następnie pobrać odczynnik do mycia/mieszania (5-30 μl), jeśli to wymagane, a następnie kolejną małą szczelinę powietrzną, a następnie pobrać 5 μl próbki.
   2. Chwyć krawędź siatki pęsetą podciśnieniową, przytrzymując pęsetę tak, aby siatka była ustawiona pod kątem około 45° skierowanym w stronę przeciwną od badacza, wyrzuć całą zawartość końcówki pipety w poprzek powierzchni pokrytej węglem siatki EM.
   3. Usuń nadmiar plamy, dotykając rozdartą krawędzią kawałka bibuły filtracyjnej do krawędzi siatki.
   4. Pozostaw ruszt do wyschnięcia na powietrzu lub do wyschnięcia pod żarówką lamp.
      UWAGA: W przypadku wszystkich metod zaleca się przesuwanie podartej krawędzi arkusza bibuły filtracyjnej wzdłuż kleszczy, aż dotrze do siatki, ponieważ usuwa to roztwór uwięziony między dwiema stronami kleszczy, który może wciągnąć wysuszoną siatkę do szczęk kleszczy po ich otwarciu. Siatkę w pęsetie można również umieścić na krawędzi dygestorium do wyschnięcia. Stały przepływ powietrza może pomóc w uzyskaniu bardziej równomiernego barwienia.

Results

Wszystkie testowane odczynniki do barwienia do pewnego stopnia dały ujemne barwienie, przy czym UF dało próbki o największym kontraście i najostrzejszych, najbardziej szczegółowych cząstkach. W przypadku głęboko osadzonych próbek (Rysunek 1) barwienia na bazie lantanowców ErAc i TmAc wytwarzały ujemne barwienie o jakości równoważnej UA, oceniane na podstawie pozornego kontrastu i ostrości barwionych cząstek, przy czym TmAc dawał wyraźniejsze, bardziej wyraźne obrazy niż ErAc. Chociaż większy rozmiar ziarna TmAc staje się widoczny przy dużym powiększeniu, gdy cząstki wirusa mozaiki tytoniu (TMV) zostały zabarwione 1% TmAc, ~23 A powtórzenie cząstki TMV¹⁷ było nadal wyraźnie widoczne gołym okiem i jako południkowa linia warstwy w transformacji Fouriera surowego obrazu. Żadne z innych testowanych barwników lantanowców, ErAc, SmAc lub GdAc, nie było w stanie rozwiązać tej funkcji. Średnie klasowe zostały wygenerowane przez wyodrębnienie nakładających się segmentów z cząstek TMV, w których widoczne było powtórzenie spiralne. Wyodrębnione segmenty zostały następnie wyrównane i sklasyfikowane za pomocą RELION¹⁸, aby lepiej zobrazować cechę okresową (Rysunek 2).

Niektóre próbki są szczególnie wrażliwe na metodę barwienia, takie jak białko C pochodzenia mięśniowego. Białko C, które składa się z elastycznego ciągu domen podobnych do Ig i Fn, wytwarza znacząco różne obrazy za pomocą ujemnego barwienia EM w zależności od zastosowanej metody barwienia (Ryc. 3). Podczas stosowania metody blottingu bocznego obserwuje się zapadnięte struktury przypominające pierścienie, podczas gdy po barwieniu metodami szybkiego spłukiwania lub strzepywania, białko C jest obserwowane jako szereg domen, które przypominają koraliki na sznurku.

. . Runda Runda

Odczynnik	koncentracja	ph	typ
Molibdenian amonu	1 - 2 %	5 – 7	Anionowych
Octan erbu (ErAc)	1 – 2%	6	Kationowe
Octan gadolinu (GdAc)	1 – 2%	6	Kationowe
Wolframian metyloaminy	2 proc	6 – 7	Anionowych
Octan samaru (SmAC)	1 proc	6	Kationowe
Krzemowolfroman sodu	1 – 5 %	5 – 8	Anionowych
Fosfowolfmian sodu	1 -3 %	5 – 8	Anionowych
Octan tulu (TmAc)	1 – 2%	6	Kationowe
Octan uranylu (UA)	1 – 3%	3 – 4	Kationowe
Mrówczan uranylu (UF)	0,75 – 1%	3 – 4	Kationowe

Tabela 1: Niektóre popularne odczynniki do barwienia ujemnego.

Rysunek 1: Przykładowe mikrofotografie wirusa mozaiki tytoniu barwionego różnymi odczynnikami do barwienia ujemnego (A) 1% UF (B) 2,5% TmAc (C) 2,5% ErAc. (D) 1% UA (E) 2,5% GdAc i (F) 2,5% SmAc. Podziałka skali wynosi 100 nm. Reprezentatywne obrazy z wielu powtórzeń z wieloma obszarami zobrazowanymi na replikę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Barwienie wirusa mozaiki tytoniu octanem tulu (A) Duże powiększenie obszaru z mikrofotografii TMV zabarwionej 1% TmAc. Podziałka wynosi 20 nm. (B) Średnia klasowa wyodrębnionych segmentów TMV. (C) Transformata Fouriera obrazu w panelu A pokazująca odbicia linii warstwy pod kątem ~23 A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wpływ metody blottingu na konformację białka C. (A) białko C barwione UA metodą blot boczny i (B) metoda migotania. Podziałka na górnym panelu wynosi 50 nm, a dolna na 20 nm. Reprezentatywne obrazy z wielu powtórzeń z wieloma obszarami zobrazowanymi na replikę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym manuskrypcie opisano wiele metod barwienia ujemnego próbek do mikroskopii elektronowej przy użyciu różnych odczynników barwiących, w tym dwóch nowych odczynników lantanowców (TmAc i ErAc). Wiele etapów procesu barwienia negatywnego musi być zoptymalizowanych dla poszczególnych próbek, w tym wybór barwie, wymagana ilość mycia, jeśli występuje, oraz technika blottingu. Manuskrypt ten stanowi zatem podstawę dla mikroskopistów do opracowania własnych metod radzenia sobie z negatywnymi zabarwieniami trudnych systemów.

Wybór bejcy jest w dużym stopniu zależny od próbki. Próbki, które są szczególnie wrażliwe na niskie pH, mogą ulec degradacji przez UA i/lub UF, pomimo właściwości utrwalających tych plam¹⁹. W takich przypadkach barwienie na bazie lantanowców, takie jak TmAc lub ErAc, może być bardziej odpowiednie, chociaż ogólne pH preparatu musi być utrzymywane poniżej punktu izoelektrycznego białka próbki, aby zapobiec dodatniemu barwieniu. Można to osiągnąć poprzez zakwaszenie plamy kwasem octowym, jeśli to konieczne. W przypadku próbek szczególnie wrażliwych na niskie pH anionowe barwienie wolframianem lub molibdenianem może być bardziej skuteczne. Chociaż stwierdzono, że plamy te indukują tworzenie się artefaktów w niektórych przypadkach, takich jak tworzenie się rouleaux w próbkach lipoprotein²⁰. Ponownie, może być konieczne dostosowanie pH barwnika, tym razem powyżej punktu izoelektrycznego próbki, aby zapobiec dodatniemu barwieniu.

Mycie próbki przed barwieniem może być konieczne, jeśli bufor, w którym przechowywana jest próbka, zawiera składnik o wysokiej zawartości soli lub fosforanu. W wielu przypadkach mycie można przeprowadzić wodą ultraczystą, ale w przypadku bardziej wrażliwych próbek, które mogą ulec degradacji lub ulec zmianom strukturalnym pod wpływem samej wody, może być konieczne przemycie z użyciem lotnego buforu o niskiej sile jonowej⁸. Nawet w ściśle kontrolowanych warunkach mycie może spowodować pewne przegrupowanie strukturalne na powierzchni węgla²¹.

Metoda, za pomocą której przygotowuje się siatkę pod względem adsorpcji, blottingu i barwienia próbki, może również znacząco wpłynąć na to, co jest obserwowane. Najwłaściwsza metoda jest zatem w dużym stopniu zależna od próby. Białko C, na przykład, jest obserwowane jako kulista struktura przypominająca pierścień po barwieniu bocznym, ale wydaje się, że jest to artefakt procesu barwienia, co ujawnia się, gdy siatki są przygotowywane metodą migotania (lub metodą szybkiego spłukiwania) (Figura 3). W metodach migotania i szybkiego płukania czas, w którym próbka musi oddziaływać z powierzchnią nośną węgla przed utrwaleniem, jest zminimalizowany¹⁵. Próbka doświadcza również mniejszych sił ze strony cofającej się łąkotki podczas osuszania przed utrwaleniem. Oznacza to, że zmiany strukturalne w próbce, które mogą wystąpić po wydłużeniu czasu absorpcji na filmie węglowym lub w wyniku działania kapilarnego, są zminimalizowane. Metoda szybkiego płukania może być również stosowana do analizy próbek w czasie rozdzielczym. Próbkę można mieszać z ligandem lub dodatkiem w końcówce pipety przez określony czas przed nałożeniem na siatkę lub tylko na chwilę na powierzchni siatki przed utrwaleniem w ciągu milisekund.

Głębokość barwienia wymagana do uzyskania optymalnych obrazów konkretnej próbki jest ponownie zależna od próbki². Jeśli plama jest zbyt płytka, cząsteczki mogą zostać uszkodzone przez wiązkę elektronów, ale jeśli plama jest zbyt gruba, cechy strukturalne mogą zostać utracone. Na głębokość plamy ma wpływ wiele czynników, takich jak hydrofilowość powierzchni siatki, równość warstwy węgla, ilość plamy nałożonej na siatkę, czas kontaktu plamy z siatką przed osuszeniem, stopień plamy i czas potrzebny do całkowitego wyschnięcia siatki. Siatka nigdy nie będzie miała równomiernego rozkładu plam na całej swojej długości, dlatego obszary siatki odpowiednie do obrazowania muszą być starannie wybrane. Rzeczywiście, kratki często różnią się jakością, nawet jeśli są przygotowywane tego samego dnia w tych samych warunkach. Dobrym przykładem tego, jak zmienność głębokości barwienia wpływa na wygląd cząsteczek i odpowiednią głębokość barwienia do obrazowania, są Burgess i^wsp.5.

Pomimo tego, że barwienie ujemne jest bardzo wszechstronną, szybką i prostą metodą, nie wszystkie próbki biologiczne można uwidocznić tą metodą. Delikatne zespoły mogą się zapaść lub rozmontować po adsorpcji, plamieniu lub wyschnięciu na siatce EM²². Barwienie ujemne może również prowadzić do spłaszczenia cząsteczek i indukować preferowane orientacje cząsteczek na węglowej folii nośnej⁷.

Barwienie ujemne jest cennym narzędziem do oceny próbek samo w sobie, a także przed analizą krio-EM, ale wiele sił fizycznych, jakie próbka napotyka podczas procesu, jest słabo poznanych. Dlatego najlepsze podejście do użycia jest w dużym stopniu zależne od próbki i musi być określane metodą prób i błędów, a nie nauczane zgodnie z ustalonym protokołem.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siatki miedziane EM o siatkach 200	Sigma-Aldrich	G4776-1VL	Można również stosować inne materiały i/lub rozmiary oczek
Molibdenian amonu	Sigma-Aldrich	277908
Parownik węglowy	Ted Pella Inc.	9620	Cressington 208 lub równoważny
Roztwór kolodionu 2% w octanie amylu	Pęseta podciśnieniowa Sigma-Aldrich	9817
Dumont #5	World Precision Instruments	501202	Lub inna pęseta jako preferowana
Octan erbu	Sigma-Aldrich	325570
Octan gadolinu	Sigma-Aldrich	325678
Arkusze miki. 75x25x0,15mm.	AGAR Scientific	AGG250-1
Szkiełka mikroskopowe, białe matowe	Fisher Scientific	12607976	Lub równoważne
Parafilm	Fisher Scientific	10018130	Lub równoważne
Pipeta Pasteura (szkło)	Fisher Scientific	10343663	Lub równoważne
Żyletka	Fisher Scientific	11904325	Lub równoważne
Papier ścierny	Sklep		Mokry i suchy papier ścierny o ziarnistości drobniejszej niż 200 (sugerowane 600)
Octan samaru	Sigma-Aldrich 325872
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	1.06462
Fosfotungian sodu	Sigma-Aldrich	P6395
Siatka ze stali nierdzewnej, 150x150 mm (przycięta na wymiar).	AGAR Scientific	AGG252
Octan tulu	Sigma-Aldrich	367702
Dwustopniowy pręt węglowy Sharper, do prętów 1/4"	Ted Pella Inc.	57-10	Lub odpowiednik dla parownika węglowego
używany Ultra czysta woda
Octan uranylu	Mikroskopia elektronowa Sciences	22400
Mrówczan uranylu	Mikroskopia elektronowa Sciences	22450
Smar próżniowy	Fisher Scientific	12719406	Lub odpowiednik
Whatman #1 Bibuła filtracyjna.	Fisher Scientific	1001 090	Lub odpowiednik
Whatman #40 bibuła filtracyjna	Fisher Scientific	10674122	Lub równoważny