System mikrobiomechaniczny do badania powstawania i regeneracji żylaków w aksonach neuronów centralnych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje fizjologicznie istotne, ciśnieniowe podejście do szybkiego i odwracalnego wywoływania żylaków w neuronach.

Streszczenie

Żylaki aksonów to powiększone struktury wzdłuż trzonów aksonów o wysokim stopniu niejednorodności. Są one obecne nie tylko w mózgach z chorobami lub urazami neurodegeneracyjnymi, ale także w normalnym mózgu. W tym miejscu opisujemy nowo opracowany system mikromechaniczny do szybkiego, niezawodnego i odwracalnego wywoływania żylaków aksonów, co pozwala nam zrozumieć mechanizmy rządzące powstawaniem żylaków i niejednorodnym składem białka. System ten stanowi nowatorski sposób oceny wpływu naprężeń ściskających i ścinających na różne subkomórkowe przedziały neuronów, różniący się od innych systemów in vitro, które koncentrują się głównie na efekcie rozciągania. Co ważne, dzięki unikalnym cechom naszego systemu, niedawno dokonaliśmy nowego odkrycia, z którego wynika, że zastosowanie płynu pod ciśnieniem może szybko i odwracalnie wywołać żylaki aksonów poprzez aktywację przejściowego kanału potencjału receptora. Nasz system biomechaniczny może być wygodnie wykorzystywany w połączeniu z perfuzją leków, obrazowaniem żywych komórek, obrazowaniem wapnia i nagrywaniem klamer krosowych. Dlatego metoda ta może być stosowana do badania mechanowrażliwych kanałów jonowych, regulacji transportu aksonalnego, dynamiki cytoszkieletu aksonalnego, sygnalizacji wapniowej i zmian morfologicznych związanych z urazowym uszkodzeniem mózgu.

Wprowadzenie

Powstawanie żylaków, czyli obrzęk/koraliki wzdłuż aksonów, jest charakterystyczną cechą neurodegeneracji obserwowaną w wielu zaburzeniach lub urazach ośrodkowego układu nerwowego, w tym w stwardnieniu rozsianym, chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona i urazowym uszkodzeniu mózgu1^,2. Pomimo znaczącego fizjologicznego wpływu żylaków aksonów na propagację potencjału czynnościowego i przekaźnictwo synaptyczne³, sposób generowania żylaków pozostaje nieznany. Niedawno, korzystając z nowo opracowanego testu mikrobiomechanicznego na hodowanych neuronach hipokampa od gryzoni, odkryliśmy, że bodźce mechaniczne mogą wywoływać żylaki w tych neuronach o bardzo intrygujących cechach. Po pierwsze, indukcja żylaków jest szybka (<10 s) i proces ten jest nieoczekiwanie odwracalny. Po drugie, inicjacja żylaków zależy od siły ciśnienia zaciągania się: im wyższe ciśnienie, tym szybsza inicjacja. Po trzecie, inicjacja żylaków zależy od wieku neuronów. Aksony młodszych neuronów wydają się bardziej wrażliwe na stres mechaniczny w porównaniu ze starszymi neuronami. Po czwarte, żylaki tworzą się wzdłuż aksonów neuronów hipokampa, podczas gdy dendryty i początkowe segmenty aksonów tych neuronów nie wykazują żadnych zmian w tych samych warunkach zaciągania się. W ten sposób nasze badanie ujawniło nową cechę polaryzacji neuronów. Wyniki uzyskane w przypadku systemu in vitro są istotne z fizjologicznego punktu widzenia. Korzystając z modelu in vivo łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (mTBI), wykazaliśmy, że żylaki aksonów rozwinęły się w sposób wieloogniskowy w korze somatosensorycznej myszy natychmiast po uderzeniu w czaszkę, zgodnie z naszymi wynikami in vitro4. Ważne jest, aby pamiętać, że nasze barwienie i obrazowanie myszy mTBI zapewnia jedynie szybki obraz zmian morfologicznych neuronów, ponieważ wykonanie obrazowania poklatkowego in vivo morfologii neuronów podczas uderzenia mechanicznego jest nadal niewykonalne.

Ten system zaciągania płynami pozwolił nam nie tylko uchwycić unikalne cechy związane z powstawaniem żylaków wywołanych naprężeniami mechanicznymi, ale także określić mechanizm leżący u ich podstaw. Testując różne roztwory zewnątrzkomórkowe, blokery i otwieracze różnych kandydatów na mechanowrażliwe kanały jonowe oraz elektrofizjologię komórkową, stwierdziliśmy, że kanał TRPV4 z podrodziny kanałów kationowych o potencjale przejściowym V (TRPV4), który jest przepuszczalny dla Ca²⁺ i Na⁺ i aktywowany przez zaciąganie się, jest głównie odpowiedzialny za wykrywanie początkowego naprężenia mechanicznego podczas tworzenia żylaków aksonów4. Zostało to dodatkowo potwierdzone za pomocą podejścia opartego na nokaucie siRNA. Podsumowując, ten nowy system testów, który opracowaliśmy z hodowlą neuronów hipokampa, jest bardzo cenny dla badania właściwości mikromechanicznych neuronów centralnych, zwłaszcza w połączeniu z innymi technikami.

Ten mikromechaniczny system, który stworzyliśmy, jest unikalny i różni się od poprzednio istniejących systemów w kilku głównych aspektach. Po pierwsze, w tym systemie neurony doświadczają naprężeń mechanicznych poza płaszczyzną w postaci kompresji i ścinania. Podczas uderzenia mechanicznego procesy neuronalne pozostają przyczepione do powierzchni szkiełka nakrywkowego i nie poruszają się. Różni się to od innych systemów eksperymentalnych, które głównie obejmowały zginanie i rozciąganie w płaszczyźnie (lub rozciąganie), na przykład ugięcie wiązek aksonów, takich jak ruchome struny^5,6 lub rozciąganie aksonów wyhodowanych na kanałach z mikrowzorami i rozciągliwych membranach^7,8. Co więcej, chociaż żylaki aksonów mogą być również wywołane w tych testach, takich jak w naszym systemie zaciągania płynem, proces w tych ustawieniach zajmuje znacznie więcej czasu (od 10 minut do kilku godzin^6,7^,8) i wydaje się nieodwracalny. Wreszcie, nasz system wykorzystujący miejscowe zaciąganie płynem pozwala na badanie przestrzennych cech powstawania żylaków (np. dendryty, kolce dendrytyczne, soma, początkowe segmenty aksonów, zakończenia aksonów), oprócz jego cech czasowych. Korzystając z tego systemu, odkryliśmy kilka nieoczekiwanych i unikalnych cech powstawania żylaków aksonów, w szczególności szybki początek, powolną odwracalność i polaryzację akson-dendryt.

System, który omawiamy w tym artykule, jest kompatybilny z wieloma technikami biologii molekularnej i komórkowej. Na przykład, aby zbadać wpływ stresu mechanicznego na morfologię i funkcję neuronów, można go stosować razem z kokulturą mieliny, obrazowaniem poklatkowym transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) i fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), obrazowaniem wapnia i nagrywaniem klamry krosowej. W tym artykule skupimy się na podstawowych elementach systemu. Hodowla neuronów w hipokampie, konfiguracja do wydmuchiwania płynów, obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości do transportu aksonalnego oraz obrazowanie wapnia są zilustrowane krok po kroku poniżej.

Protokół

Wszystkie opisane poniżej metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Ohio.

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

1. Umieścić jedno lub więcej pudełek z szkiełkami nakrywkowymi 12 mm lub 25 mm w szklanej zlewce zawierającej 70% kwasu azotowego i inkubować szkiełka nakrywkowe w temperaturze pokojowej przez noc.
   UWAGA: Szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm nie należy myć w tej samej zlewce, co szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm. Lepiej jest myć je osobno.
2. Przenieść wszystkie szkiełka nakrywkowe do 4-litrowej zlewki wypełnionej 2,5 l ddH₂O i wstrząsać zlewką zawierającą szkiełka nakrywkowe przez 1 godzinę z prędkością 100 obr./min. Użyj gumek, aby przytrzymać zlewkę podczas potrząsania. Powtórzyć płukanie świeżym 2,5 L ddH₂O cztery razy.
3. Przenieść oczyszczone szkiełka nakrywkowe do suchej kolby z metalową pokrywą. Piecz szkiełka nakrywkowe w piekarniku w temperaturze 225 °C przez 6 godzin i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.
   UWAGA: Szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm jest podatne na pękanie. Oddziel szkiełka nakrywkowe jeden po drugim i wysusz je na powietrzu, a następnie upiecz w piekarniku.
4. Wysuszone i oczyszczone szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w temperaturze pokojowej w wysterylizowanym plastikowym pojemniku do czasu użycia.
5. Pokryj szkiełka nakrywkowe w następujący sposób:
   1. Przygotuj świeży roztwór powlekający w probówce wirówkowej.
   2. Umieść każde szkiełko nakrywkowe w jednym dołku na płytce 24-dołkowej (lub 6-dołkowej). Umieścić 30 (lub 100) μl roztworu do powlekania szkiełka nakrywkowego (tabela 1) na szkiełku nakrywkowym o średnicy 12 mm (lub 25 mm) i zawirować. Dodać 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, klasa kultury tkankowej) do studzienki. Płytki te mogą być zużyte natychmiast lub przechowywane w temperaturze 4 °C w sterylnym PBS przez okres do tygodnia.
   3. W dniu sekcji należy usunąć PBS. Wysuszyć na powietrzu i umieścić płytki w świetle UV (30 W) przez 2-4 godziny < / > UWAGA: Ostatni krok należy wykonać przy włączonym świetle UV w okapie z przepływem laminarnym do hodowli komórkowych. Drzwi okapu powinny być lekko podniesione, aby umożliwić przepływ powietrza do suszenia szkiełek nakrywkowych.

2. Sekcja, dysocjacja i kultura neuronów hipokampa u ciężarnej myszy/szczura

1. Sekcja i dysocjacja neuronów hipokampa w celu hodowli
   1. Rozmrozić roztwór enzymu proteazy (3 mg/ml proteazy 23 w SLDS, tabela 1) i wstępnie podgrzać pożywkę galwaniczną (tabela 2) w temperaturze 37 °C.
   2. Wypreparuj hipokamp i przepłucz go SLDS, zgodnie z metodami opisanymi w poprzedniej publikacji¹⁴.
      UWAGA: Cztery hipokampy zapewniają wystarczającą ilość komórek na jedną płytkę 24-dołkową lub jedną 6-dołkową.
   3. Usunąć SLDS, dodać 2 ml roztworu enzymu proteazy i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 15 minut.
   4. Umyj eksplantaty hipokampa dwukrotnie 5-10 ml podłoża galwanicznego. Dodać 5 ml podłoża galwanicznego. Dysocjuj eksplantaty hipokampa na pojedyncze komórki, generując mały wir za pomocą pipety z plastikową końcówką o pojemności 1 ml. Pipetować w górę i w dół około 40 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków tlenu, aż roztwór stanie się mętny i nie pozostaną żadne duże kawałki eksplantatu.
      UWAGA: Pamiętaj, aby podczas mycia zostawić trochę podłoża, eksplantaty hipokampa powinny pozostać zanurzone w pożywce przez cały proces.
   5. Odwirować komórki przy sile 1,125 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant z komórkami zanurzonymi w pożywce. Ponownie zawiesić komórki w 145 ml podłoża galwanicznego. Dodać 1 ml/studzienkę zawiesiny komórkowej do płytki 24-dołkowej (3 ml/dołek do płytki 6-dołkowej).
      UWAGA: 145 ml podłoża galwanicznego służy do wytworzenia zawiesiny komórek o niskiej gęstości komórek. Objętość ta pozwoli na posiew komórek na sześć płytek 24-dołkowych, osiem płytek 6-dołkowych lub różne kombinacje płytek 24- lub 6-dołkowych, w zależności od eksperymentów, które mają być przeprowadzone. Każdy studzienek na płytce 24-dołkowej będzie miał około 3 x 10⁴ komórek⁹.
   6. Inkubować komórki w pożywce galwanicznej w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 2-4 godziny, a następnie usunąć wszystkie podłoża galwaniczne i zastąpić je świeżymi mediami konserwacyjnymi.
   7. Po 2 dniach (2 dni in vitro, 2DIV) zastąp połowę pożywki 2 μM Ara-C (arabinozylocytozyna) rozpuszczona w pożywce podtrzymującej, która hamuje wzrost fibroblastów, śródbłonka i komórek glejowych. Po wystawieniu komórek na działanie Ara-C przez dwa dni, zastąp pożywkę nową pożywką konserwacyjną.
2. Transfekcja do wizualizacji morfologii komórki
   UWAGA: Przetransfekuj komórki fluorescencyjnymi konstruktami białka zielonej fluorescencji (GFP), żółtego białka fluorescencyjnego (YFP), mCherry itp., Aby oświetlić morfologię poszczególnych neuronów.
   1. Rozcieńczyć konstrukty z wyrostu (1 μg/μl) na pożywkę Opti-MEM (0,8 μg konstruktu w 50 μl pożywki Opti-MEM) i odwirować. Przygotować 1 rozcieńczenie konstruktu dla każdej studzienki.
      UWAGA: Płytka 24-dołkowa wymaga 0,8 μg konstruktu w 50 μl pożywki Opti-MEM. Płytka 6-dołkowa wymaga 2,4 μg konstruktu w 150 μl pożywki Opti-MEM.
   2. Rozcieńczyć odczynnik do transfekcji za pośrednictwem liposomów w pożywce Opti-MEM (1,5 μl odczynnika do transfekcji w 50 μl pożywki Opti-MEM) i wirować. Przygotować 1 rozcieńczenie transfekcji dla każdej studzienki.
      UWAGA: Płytka 24-dołkowa wymaga 1,5 μl odczynnika do transfekcji w 50 μl pożywki Opti-MEM. Płytka 6-dołkowa wymaga 4,5 μl odczynnika do transfekcji w 150 μl pożywki Opti-MEM.
   3. Przygotować mieszaninę 1:1 (100 μl) konstruktu w pożywce Opti-Mem i odczynnika do transfekcji w pożywce Opti-MEM i wirze. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 min.
      UWAGA: W każdym dołku powinno znajdować się około 100 μl roztworu zawierającego konstrukt, odczynnik do transfekcji i pożywkę Opti-MEM w przypadku stosowania płytki 24-dołkowej (300 μl dla płytki 6-dołkowej).
   4. Usunąć połowę pożywki (500 μl dla płytki 24-dołkowej, 1,5 ml dla płytki 6-dołkowej) z każdej studzienki i przenieść tę pożywkę do czystej stożkowej probówki. Trzymaj tę probówkę w inkubatorze. Następnie dodać mieszaninę 100 μl (krok 2.2.3) do pozostałej pożywki w studzience. Pozostawić komórki do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 20–30 minut.
   5. Podczas inkubacji (etap 2.2.4) dodać jedną objętość świeżej pożywki do pożywki w stożkowej probówce (etap 2.2.4). Umieścić mieszaninę w tym samym inkubatorze (37 °C i 5% CO₂ ).
   6. Po inkubacji usunąć wszystkie podłoża zawierające roztwór do transfekcji ze studzienek i zastąpić je mieszaniną 1:1 starych i świeżych pożywek konserwacyjnych w probówce stożkowej (krok 2.2.5).
      UWAGA: W zależności od wielkości konstruktów, komórki mogą rozpocząć ekspresję w ciągu 12 godzin; W przypadku większych konstrukcji może być potrzebne 3-4 dni, zanim zostanie osiągnięte szczytowe wyrażenie konstrukcji.

3. Ustawianie urządzenia do pipet

UWAGA: Ten zestaw składa się z pięciu podstawowych elementów: szklana pipeta, rurka, strzykawka, mikromanipulator i bufor (Hanka). W tej konfiguracji można użyć dowolnego buforu, który ma fizjologicznie istotne stężenia soli.

1. Wyciągnąć pipetę borokrzemianową tak, aby końcówka otwierająca miała średnicę około 45 μm za pomocą ściągacza do mikropipet i zgodnie ze specyfikacjami w tabeli 3.
   UWAGA: Stwierdzono, że 45 μm jest odpowiednim rozmiarem dla średnicy otworu pipety w warunkach eksperymentalnych. Niewielkie różnice w wielkości otworu nie powinny znacząco wpłynąć na wyniki. Ważne jest, aby pamiętać, że większe odchylenia od tej liczby powinny nadal działać w przypadku indukcji żylaków poprzez regulację wysokości strzykawki, która jest połączona z pipetą za pomocą rurki, ale będzie to wymagało ponownej kalibracji wartości ciśnienia.
2. Włóż odciągnięty koniec pipety do cienkiej gumowej rurki.
   UWAGA: Ścianka rurki powinna być cienka i sztywna, aby zminimalizować opór płynu, zapewniając, że wysokość strzykawki jest wprost proporcjonalna do ciśnienia płynu przepływającego przez pipetę ze znikomym oporem. Rurka nie powinna być dłuższa niż około 0,6 m, aby jeszcze bardziej zminimalizować opór.
3. Podłącz drugi koniec rurki do plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml przez złącze z zaworem obrotowym.
   UWAGA: Plastikowa strzykawka musi być trzymana na stałej, mierzalnej wysokości, aby zapewnić dokładny pomiar założonego ciśnienia płynącego z pipety. Zastosowano wysokość 190 mm, ponieważ zapewnia to minimalny nacisk, ale niezawodnie wywołuje żylaki w aksonach. Można również zastosować inne wartości wysokości, jeśli ciśnienie powoduje oderwanie komórek od powierzchni szkiełka nakrywkowego. Zaleca się stosowanie tego samego ustawienia przez cały czas trwania eksperymentu.
4. Włóż pipetę do górnej części mikromanipulatora, aby utrzymać pipetę na miejscu. Przykręć metalową, płaską przymocowaną do ramienia mikromanipulatora tak, aby trzymała odciągnięty koniec pipety tuż nad miejscem, w którym przymocowana jest gumowa rurka. Ustawić pipetę pod kątem 45° w stosunku do powierzchni szkiełek nakrywkowych zawierających neurony.
   UWAGA: Mikromanipulator powinien być skonstruowany w taki sposób, aby pipeta mogła być trzymana bez zaciskania gumowej rurki. Mikromanipulator musi umożliwiać ruch pipety w kierunkach x, y i z, aby dokładnie ustawić ją w zasięgu komórek. Grafika jak i zdjęcie aparatu znajdują się poniżej (Rysunek 1).
5. Włącz filtr fluorescencyjny, otwórz przysłonę i upewnij się, że widać fluorescencyjną plamkę przechodzącą przez obiektyw. Za pomocą mikromanipulatora ustawić pipetę w pozycji, która zrównuje końcówkę z plamką fluorescencyjną i opuścić pipetę do pozycji tuż nad wysokością naczynia do hodowli komórkowej (35 mm x 10 mm). Gdy znajdzie się na swoim miejscu, włącz przechodzące światło i wyłącz fluorescencję.
6. Za pomocą pęsety dodaj jedno szkiełko nakrywkowe (z komórkami skierowanymi do góry w kierunku pipety) z płytki do hodowli komórkowej do naczynia do hodowli komórkowej zawierającego około 2 ml buforu Hanka w temperaturze pokojowej.
7. Umieścić naczynie hodowlane zawierające szkiełko nakrywkowe na lunecie.
8. Za pomocą pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości i obiektywu 20X ustaw ostrość na płaszczyźnie około czterech pełnych obrotów nad komórkami (około 0,4 mm). Za pomocą mikromanipulatora ustaw końcówkę pipety tak, aby była skupiona i znajdowała się pośrodku, po lewej stronie płaszczyzny, jak widać przez okulary.
   UWAGA: Dendryty to projekcje, które powinny znajdować się w tej samej ramce, co ciało komórki, z której pochodzą. Aby wywołać żylaki aksonów, należy podążać za dłuższymi wypustkami z ciała komórki do aksonów przyśrodkowych i dystalnych.

4. Kalibracja ciśnienia pipety z wykorzystaniem systemu z rozciągliwą membraną

1. Ustawić pipetę do zaciągania z dokładnie takimi samymi parametrami, jak opisano powyżej, na systemie zawierającym mikrofabrykowaną membranę silikonową (o średnicy 500 μm i grubości 50 μm) i skupić mikroskop na powierzchni membrany.
   UWAGA: Ten system został zaprojektowany do pomiaru małych wartości ciśnienia, a wyjaśnienie systemu zostało opublikowane wcześniej¹⁰. Ten pomiar należy wykonać tylko raz w przypadku eksperymentów z zaciąganiem się, jeśli używane jest dokładnie to samo ustawienie zaciągania się.
2. Ustaw ostrość mikroskopu na układach mikrokropek (o średnicy 4 μm i odległości od siebie 10 μm, mierzone między środkami). Przekręć zawór odcinający i pozwól, aby płyn wypłynął z pipety. Zbadaj ugięcie membrany w odpowiedzi na ciśnienie płynu za pomocą mikroskopu konfokalnego.
3. Wykorzystaj model liniowy, aby określić odpowiednie ciśnienie związane z ugięciem membrany.
   UWAGA: Podczas gdy ostatnie badanie wykazało, że odchylenie w = -3,143 ± 0,69 μm uzyskano dla wysokości strzykawki 190 mm, wytworzyło to ciśnienie 0,25 ± 0,06 nN/^μm2 przy obecnej konfiguracji pipet, które mieści się w zakresie fizjologicznym i patologicznym, chociaż wysokość strzykawki nie jest jedynym wyznacznikiem. Na dokładną wartość ciśnienia w neuronach wpływają również inne czynniki, w tym otwarcie pipety, położenie (odległość i kąt) końcówki pipety względem komórek, a nawet elastyczność rurki^4,10.

5. Zaciąganie się w celu wywołania żylaków

1. Gdy pipeta znajdzie się na swoim miejscu, ustaw ostrość mikroskopu na płaszczyźnie, która zawiera obszar zainteresowania. Umieść komórki i procesy w lewej połowie pola obrazowania (widzianego przez przechwytywanie na żywo przez kamerę) w obszarze zaciągania się, podczas gdy prawa połowa znajduje się poza obszarem zaciągania się.
   UWAGA: Ze względu na rozległy rozrost aksonów i dendrytów neuronów, jest mało prawdopodobne, aby wszystkie procesy neuronu znajdowały się w tym samym obszarze zaciągania się. Jest to właściwie jedna z zalet tego systemu, która pozwala na zbadanie miejscowego efektu zaciągania się. Istnieją dwa rodzaje zaciągania się, które można wykorzystać do wywołania żylaków: długotrwałe zaciąganie się i zaciąganie pulsacyjne.
2. Sapiąc
   1. Długotrwałe zaciąganie się
      1. Umieścić strzykawkę na wysokości, 190 mm nad szkiełkiem nakrywkowym zawierającym hodowane neurony⁴. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe obszaru zainteresowania ze zoptymalizowanym czasem ekspozycji, ujawniając wyraźną morfologię neuronów. Przechwyć co najmniej 15 klatek w odstępie 2 s (łącznie 30 s) jako linię bazową. Interwał można dostosować w zależności od eksperymentu. Przy klatce 16 otwórz obracany zawór odcinający strzykawki i pozwól płynowi płynać przez 75 ramek (150 s). Przy ramie 75 wyłącz zawór, aby zatrzymać przepływ płynu. Zatrzymaj przechwytywanie wideo.
         Uwaga: Powinno to wywołać żylaki aksonów w neuronach 7-9 DIV w ciągu 5-10 s, podczas gdy starsze neurony potrzebują więcej czasu, aby utworzyć żylaki.
   2. Zaciąganie się impulsem (czas trwania 2 s)
      1. Umieścić strzykawkę na odpowiedniej wysokości (190 mm). Rozpocznij obrazowanie poklatkowe i uchwyć co najmniej 15 klatek (30 s) w odstępie 2 s. Przy klatce 16 otwórz zawór strzykawki i pozwól płynowi spłynąć, a następnie zamknij zawór po 2 sekundach. Odczekaj 5-20 s (w zależności od częstotliwości, która ma być testowana) przed ponownym otwarciem zaworu. Powtórz otwieranie i zamykanie zaworu, aby wytworzyć impulsy płynu i kontynuuj przez łączny okres 150-300 s. Kontynuuj obrazowanie poklatkowe przez 20 minut, aby uchwycić etap rekonwalescencji.
         UWAGA: Gdy odstęp jest dłuższy niż 10 s, impulsy wywołują drastycznie mniej żylaków. W odstępie 20 s impulsy nie mogą wywołać żadnych żylaków⁴. Aby uzyskać wiarygodne, spójne tworzenie żylaków, zaleca się, aby wysokość strzykawki wynosiła około 190 mm. Nie należy podnosić wysokości strzykawki i ciśnienia płynu do punktu, w którym komórki zaczynają odrywać się od powierzchni szkiełka nakrywkowego.
   3. Przed dniem użytkowania wyczyść zestaw (pipetę, rurkę i strzykawkę), przepuszczając przez zestaw około 10 ml 70% etanolu. Po przepłukaniu etanolem przepuść 10 ml buforu Hanka (lub żądanego buforu) przez zestaw, aby przygotować system do użycia w tym dniu. Po zakończeniu eksperymentów na cały dzień wyczyść zestaw zgodnie z wcześniejszym opisem etanolem, aby zapobiec rozwojowi zanieczyszczeń przez noc.

6. Metody komplementarne

UWAGA: Test zaciągania się może być połączony z wieloma różnymi technikami, które są omówione w sekcji Wprowadzenie. W tym miejscu skupiono się na podstawowych technikach, które są najczęściej stosowane razem z testem zaciągania się, w tym fluorescencyjnym obrazowaniu poklatkowym o wysokiej rozdzielczości, obrazowaniu wapniowym i testach rekonwalescencji. Zostały one omówione poniżej.

1. Przeprowadź fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości, postępując zgodnie z poniższym protokołem
   1. Śledź ruch znakowanych fluorescencyjnie białek w neuronach za pomocą 100-krotnej soczewki olejowej. Neurony są transfekowane odpowiednim konstruktem cDNA. Rejestrowanie przez 150 klatek (łącznie 300 s) w interwale 2 s.
      UWAGA: Czasami wykonuje się wielokolorowe obrazowanie poklatkowe w celu zobrazowania ruchu więcej niż jednego białka znakowanego fluorescencyjnie jednocześnie.
   2. Wygeneruj kimograf za pomocą oprogramowania do przechwytywania wideo lub za pomocą ImageJ (NIH).
      UWAGA: Prędkość i kierunkowość jazdy można określić za pomocą kimografu. *Pamiętaj, aby zwrócić uwagę na kierunek, w którym znajduje się soma od schwytanego regionu. Podróż w kierunku somy jest wsteczna, podczas gdy podróż od somy do końca aksonu jest następcza.
   3. Powtórz ten proces po zaciągnięciu się lub można utworzyć kimograf na podstawie przechwytywania obrazu podczas testu zaciągania się.
      UWAGA: Wpływ zaciągania się na transport aksonalny mitochondriów i białek synaptycznych został pokazany w niedawnym artykule⁴.
2. Obrazowanie wapnia
   1. Dodać 1 μl (dla płytki 24-dołkowej) lub 3 μl (dla płytki 6-dołkowej) 5 mM Fluo-4 AM do pożywki w jednym dołku i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
   2. Umyj komórki dwukrotnie 1 ml buforu Hanka.
      UWAGA: Naładowane neurony emitują zieloną fluorescencję przez zestaw filtrów FITC. Loci oznaczają obszary znacznego wapnia w komórce. W połączeniu z zaciąganiem się można zaobserwować wzrost intensywności (wzrost wewnętrznego poziomu wapnia).
3. Odzyskiwanie żylaków
   UWAGA: Bezpośrednio po eksperymencie z zaciąganiem się można przeprowadzić 20-minutowy eksperyment regeneracyjny.
   1. Rejestruj obrazy przez 300 klatek (1 200 s) w odstępie 4 s.
      UWAGA: Komórka transfekowana rozpuszczalnym YFP/mCherry/GFP powinna wykazywać umiarkowany poziom (mniej niż 50%) powrotu do zdrowia pod koniec sesji obrazowania. Regeneracja aksonów zależy od wielu czynników, takich jak etap rozwoju hodowanych neuronów⁴. Można to również połączyć z obrazowaniem fluorescencyjnym o wysokiej rozdzielczości i obrazowaniem wapnia opisanym powyżej.

Wyniki

Przed zaciągnięciem aksony zwykle wykazują niewielkie powstawanie żylaków. Po zaciągnięciu się naszym standardowym ciśnieniem (190 mmH₂O wysokość), aksony zaczynają rozwijać wiele żylaków przypominających koraliki. Powstawanie żylaków jest częściowo odwracalne, o czym świadczą regiony aksonu powracające do stanu sprzed nadmuchania po 10-minutowym okresie rekonwalescencji (Rysunek 2A-B). Po dłuższym okresie rekonwalescencji (>20 min) niekt...

Dyskusja

Procedura tego testu mikrobiomechanicznego jest prosta. Przyniesie wiarygodne wyniki, jeśli wszystkie jego kroki zostaną starannie wykonane. Istnieje kilka kluczowych kroków, które, jeśli zostaną niewłaściwie wykonane, utrudnią pomyślne zebranie danych. Krytyczne kroki rozpoczynają się przed faktycznym zastosowaniem bodźca zaciągania się. Staranna sekcja, hodowla i pielęgnacja pierwotnej kultury neuronów są najważniejsze. Jeśli wyhodowane neurony nie są zdrowe, nie będą reagować konsekwentnie, ponieważ mogły być już przy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka nakrywkowe 12 mm	Instrumenty Warnera	64-0702	do płytki 24-dołkowej
Szkiełka nakrywkowe 25 mm	Fisher Naukowy	12-545-102	do płytki 6-dołkowej
Kwas octowy	Fisher Scientific	A38-212
Poli-D-lizyna	Sigma	P6407
Kolagen z ogona szczura	Roche	11 179 179 001
10X PBS	Diagnostyka Krajowa	CL-253
Na2SO4	Fisher Scientific	S373-500
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500
HEPES	Fisher Naukowy	BP410-500
D-glukoza	Fisher Naukowy	D16-500
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
NaOH	Fisher Naukowy	SS255-1
Enzym proteazy	Sigma	P4032
FBS	Gibco	26140
Pirogronian sodu	Gibco	11360-070
L-glutamina	Gibco
Penicylina/Streptomycyna 100x (P/S)	Gibco
MEM Sole Earle'a	Gibco	11090
B27 suplement	Gibco	17504-044
Neurobasal	Gibco	21103-049
Arabinozylocytozyna (Ara-C)	Sigma	147-94-4
Nośniki Opti-MEM	Gibco	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	1854313	odczynnik do transfekcji
Pręty borokrzemianowe	World Precision Instruments Inc.	PG52151-4	do pipety do zaciągania
Rurki gumowe	Fisher Naukowy	14-169-1A
10cc plastikowa strzykawka i tłok	Becton Dickinson
Mikromanipulator	Instrumenty Sutter
NaCl	Fisher Naukowy	S640-3
KCl	Fisher Naukowy	BP366-500
CaCl2	Fisher Naukowy	C70-500
Naczynie do hodowli komórkowych (35 mm x 10 mm)	Corning	3294
Sondy molekularne	Fluo-4 AM	F14201	do obrazowania wapnia
Konstrukcja Mito-YFP	Takara Bio Inc.		do transfekcji komórek
Konstrukcja YFP-N1	Takara Bio Inc.		do transfekcji komórek
Model P-1000 Ściągacz do mikropipet płomieniowych/brązowych	Instrumenty Sutter
Mcroskop Eclipse TE2000-U	Obiektyw Nikon
Plan Fluor ELWD 20x	Obiektyw Nikon	062933
Obiektyw olejowy Apo TIRF 100x/1.49	Obiektyw Nikon	MRD01991