Niedoczynność gruczołów ślinowych jest częstą konsekwencją chorób autoimmunologicznych i radioterapii. Powtarzalna ocena funkcji gruczołów ślinowych w mysich modelach tych chorób jest wyzwaniem technicznym. W tym miejscu opisano prostą metodę dokładnego i powtarzalnego pomiaru produkcji śliny u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda pomiaru funkcji gruczołów ślinowych u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pacjenci z zespołem Sjögrena, chorobą autoimmunologiczną atakującą gruczoły zewnątrzwydzielnicze, rozwijają zapalenie gruczołów ślinowych i mają zmniejszoną produkcję śliny. Podobnie, produkcja śliny jest poważnie upośledzona u pacjentów poddawanych radioterapii z powodu nowotworów głowy i szyi. Modele gryzoni, opracowane w celu naśladowania tych stanów klinicznych, ułatwiają zrozumienie patogenezy choroby i pozwalają na opracowanie nowych strategii terapeutycznych. Dlatego zdolność do dokładnego, powtarzalnego i wielokrotnego pomiaru funkcji gruczołów ślinowych w modelach zwierzęcych ma kluczowe znaczenie. Opierając się na procedurach opisanych wcześniej w literaturze, opracowano metodę, która spełnia te kryteria i została wykorzystana do oceny funkcji gruczołów ślinowych u myszy. Dodatkową zaletą tej nowej metody jest to, że jest łatwa do opanowania i ma niewielkie różnice między operatorami. Czynność gruczołów ślinowych ocenia się jako ilość (masa lub objętość) lub szybkość (ml/min) śliny wytwarzanej w odpowiedzi na stymulację pilokarpiną. Pobrana ślina jest dobrym źródłem do analiz zawartości białka, stężeń immunoglobulin i innych biomolekuł.
Wprowadzenie
Gruczoły ślinowe wytwarzają ślinę w odpowiedzi na różne bodźce neurologiczne i mechaniczne1. Bodźce przenoszone są przez współczulny i przywspółczulny układ nerwowy do receptorów adrenergicznych i cholinergicznych w gruczole. Pilokarpina jest środkiem cholinergicznym, parasympatykomimetycznym, który działa głównie na receptory muskarynowe. W gruczole ślinowym indukuje produkcję śliny, działając na muskarynowy receptor acetylocholiny M31. Wytwarzanie śliny po podaniu pilokarpiny jest wskaźnikiem zdolności gruczołów ślinowych do reagowania na stymulację i jest powszechnie stosowane jako miara funkcji gruczołów ślinowych.
Dokładny pomiar produkcji śliny jest kluczowy w badaniach nad chorobami gruczołów ślinowych, w tym zespołem Sjögrena2 oraz urazami popromiennymi po leczeniu raka głowy i szyi3. Opracowano kilka różnych metod pomiaru produkcji śliny u gryzoni. Należą do nich: bezpośrednia kaniulacja wydalniczego przewodu ślinowego4, pobieranie śliny z jamy ustnej pod próżnią5, oraz pobieranie za pomocą szklanych naczyń włosowatych6 lub mikropipety7,8,9. Bezpośrednia kaniulacja przewodu ślinowego zapewnia najdokładniejszą i najczystszą ślinę. Jest to jednak technicznie trudna procedura, a możliwość spowodowania urazu przewodu wyklucza powtarzalne pobieranie śliny od tego samego zwierzęcia. Zbieranie śliny w próżni może prowadzić do zmiennych wyników z powodu wysuszenia śliny z probówki. Utrata ta jest jeszcze bardziej wyolbrzymiona u myszy ze zmniejszonym wydzielaniem śliny. Szklane naczynia włosowate pozwalają na pobranie śliny do późniejszych analiz, jednak zmiany lepkości śliny wydzielanej w stanie chorobowym uniemożliwiają sprawne wypełnienie naczynia włosowatego. Ponadto próby zamiatania jamy ustnej w celu zebrania resztek śliny mogą prowadzić do obrażeń. Metoda pipetowania pozwala na pełne pobranie, a dla tego samego operatora jest niezwykle spójna między eksperymentami. Jednak z nieznanych przyczyn metoda ta wykazuje znaczne różnice między różnymi operatorami. W związku z tym, aby umożliwić odpowiednie porównania, konieczne staje się, aby ten sam operator wykonywał wszystkie eksperymenty związane z konkretnym projektem. Jest oczywiste, że stanowi to poważną wadę dla laboratorium.
Aby przezwyciężyć te problemy, opracowano procedurę, która łączy metody pobierania śliny stosowane u ludzi i gryzoni. Opisana poniżej metoda wymazu do pomiaru objętości śliny wywołanej pilokarpiną jest prosta, powtarzalna, nie ma na nią wpływu operator i może być wykonywana wielokrotnie u tego samego zwierzęcia. Ponadto umożliwia pobranie śliny do późniejszych analiz białek, immunoglobulin lub innych biomolekuł.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół opisany poniżej został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt i jest zgodny z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez National Institutes of Health. Wszystkie dane przedstawione w tym raporcie zostały wygenerowane przy użyciu samic myszy w wieku 10-12 tygodni. Użyto następujących szczepów myszy: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S i (B6XA/J) F1. Wszystkie myszy trzymano w klatkach barierowych (po 5 zwierząt w klatce) w określonych warunkach wolnych od patogenów i dostarczano im paszę i wodę ad libitum.
1. Przygotowanie
- Aby przygotować roztwór podstawowy chlorowodorku pilokarpiny, odważyć 10 mg związku i rozpuścić go w 1,776 ml sterylnego izotonicznego roztworu soli fizjologicznej przez wirowanie, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 5,63 mg/ml. Nie ma potrzeby sterylizacji tego roztworu. Ale w razie potrzeby przefiltruj go przez filtr 0,2 μM. Roztwór podstawowy należy przechowywać w kilku porcjach w zamrażarce o temperaturze -80 oC przez okres do 3 miesięcy. Każdy zamrożony wywar jest przeznaczony do jednorazowego użytku. Po rozmrożeniu nie zamrażaj ponownie roztworu pilokarpiny.
- Weź 0,6 ml probówki do mikrofuge i ostrożnie przebij mały otwór w dnie każdej probówki za pomocą podgrzanej igły o rozmiarze 18. Umieść te probówki w probówkach o pojemności 2 ml. Probówki nie muszą być sterylne.
- Za pomocą ostrej, sterylnej żyletki pokrój cylindryczne waciki chłonne na kawałki o długości około 2 cm. Wytnij każdy kawałek o długości 2 cm po przekątnej, aby uzyskać 2 waciki w kształcie stożka. Umieść po jednym waciku w każdej z probówek do mikrofuge o pojemności 0,6 ml.
- Zważ 0,6 ml probówki do mikrofuge zawierającej suchy wacik.
- Przenieś myszy, które mają być badane, do nowej, czystej klatki z butelkami z wodą. Trzymaj myszy bez jedzenia przez co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem pobierania śliny, aby zapobiec zanieczyszczeniu zebranej śliny przez cząstki jedzenia.
UWAGA: W przypadku tej procedury nie jest konieczne trzymanie 1 myszy na klatkę. Jednak liczba myszy umieszczonych w każdej klatce zależy od zasad i przepisów obowiązujących w danej instytucji dotyczących wykorzystywania zwierząt. - Tuż przed upływem 2 godzin przygotować roboczy roztwór pilokarpiny (0,0563 mg/ml), rozcieńczając roztwór podstawowy 100x w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Nie jest konieczna dalsza filtracja, sterylizacja tego roztworu. Roztwór pilokarpiny należy zawsze trzymać na lodzie.
UWAGA: Tabela 1 podaje ilość pilokarpiny, która ma być wstrzykiwana dla różnych mas ciała myszy, aby uzyskać ostateczną dawkę 0,375 mg/kg masy ciała.
2. Procedura
- Zważyć każdą mysz i określić dawkę mieszanki środka znieczulającego dla każdej myszy, korzystając z Tabeli 1. Pierwszej myszy wstrzyknąć odpowiednią objętość mieszanki znieczulonej drogą dootrzewnową. Ustaw timer na 2 minuty (większość szczepów myszy testowanych w tym protokole przechodzi w stan uśpienia o 2 minuty). Upewnij się, że mysz jest odpowiednio znieczulona przez brak chodzenia po umieszczeniu na płaskiej powierzchni. Jeśli mysz nadal chodzi, odczekaj dodatkowe 2 minuty przed przejściem do następnego kroku. Nałóż kroplę lubrykantu maści okulistycznej na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
UWAGA: W tabeli 1 dawka mieszanki znieczulającej wynosi 0,007 ml/g masy ciała. Optymalny zakres dla tej procedury wynosi od 0,006 do 0,008 ml/g masy ciała. Jednak po 4 minutach, jeśli mysz nadal chodzi lub wykazuje gwałtowne ruchy, skonsultuj się z weterynarzem w celu odpowiedniego zwiększenia dawki środka znieczulającego. - Oznaczyć dawkę pilokarpiny dla myszy zgodnie z Tabelą 1 i wstrzyknąć odpowiednią ilość drogą dootrzewnową. Ustaw minutnik na 2 minuty i włóż mysz do rurki ograniczającej o pojemności 50 ml, aż głowa i uszy wystaną z odciętego końca. Umieść rurkę pod kątem 45 stopni, głową w dół i powierzchnią brzuszną skierowaną do góry. Przyklej rurkę do płytki zabiegowej, aby się nie poruszała.
UWAGA: Tabela 1 zawiera dawkowanie dla myszy powyżej 17 g, ponieważ tej procedury nie próbowano stosować na myszach o masie ciała poniżej 17 g. - Pod koniec 2 minut delikatnie włóż do ust zamkniętą parę mikrokleszczy preparacyjnych i unieś dolną szczękę do góry, aby otworzyć usta. Wepchnij kleszcze 1-2 mm głębiej w usta, upewniając się, że język spoczywa na górnym ramieniu kleszczy. Za pomocą kolejnej pary cienkich kleszczy przytrzymaj wstępnie zważony suchy wacik blisko jego stożkowej końcówki.
- Delikatnie wsuń stożkową końcówkę wacika do ust. Wyjmij kleszcze, pozostawiając końcówkę wacika w jamie ustnej.
- Chwyć szerszy koniec wacika wystający na zewnątrz ust i obróć go, aby umożliwić maksymalny obszar kontaktu z ustami. Trzymaj wacik w tej pozycji przez 15 minut.
UWAGA: Gwarantuje to, że wacik pozostaje w jamie ustnej przez cały czas pobierania. Należy pamiętać, że stożkowa końcówka wacika działa jak, a szersza część wacika pozostaje na zewnątrz ust. - Po upływie 15 minut delikatnie obróć wacik, aby zebrać ślinę, która nie została wchłonięta, i umieść mokry wacik w probówce do mikrofugi o pojemności 0,6 ml. Zamknij probówkę i umieść ją w probówce o pojemności 2 ml umieszczonej na lodzie.
UWAGA: W tym czasie błona śluzowa jamy ustnej będzie wydawać się całkowicie sucha. Mysz można teraz przenieść z powrotem do klatki w celu odzyskania siły po znieczuleniu. - Przenieś mysz do klatki. Umieść zwilżone granulki żywności w klatce po pobraniu śliny, aby przyspieszyć nawodnienie.
UWAGA: Myszy budzą się w ciągu 10 minut po zakończeniu zbiórki. Można również podać podskórne wstrzyknięcie 0,2 ml wstępnie podgrzanej izotonicznej soli fizjologicznej w celu przyspieszenia powrotu do zdrowia. - Przejdź do następnej myszy. Wszystkie myszy powinny być monitorowane, dopóki całkowicie nie wyzdrowieją i nie będą w stanie chodzić.
3. Pomiary
- Pod koniec wszystkich zbiorów zważ probówki o pojemności 0,6 ml mokrym wacikiem. Oblicz różnicę między mokrą masą a suchą masą, aby uzyskać masę wyprodukowanej śliny. Umieść probówkę o pojemności 0,6 ml ze śliną z powrotem w probówce o pojemności 2 ml.
- Odciąć nakrętki z probówek o pojemności 2 ml. Następnie odwirować probówki o pojemności 2 ml przez 2 minuty w temperaturze 7500 x g, w temperaturze 4oC w mikrowirówce w celu odzyskania śliny. Zmierz objętość uzyskanej śliny za pomocą mikropipety.
- Wyraź wyniki jako masę śliny (mg)10 w ciągu 15 minut lub jako stosunek masy śliny (mg)/masy ciała myszy (g).
UWAGA: Jeśli zmierzono objętość śliny wyekstrahowanej z wacika, wyniki należy wyrazić jako objętość odzyskanej śliny (ml) lub stosunek objętości śliny (ml) do masy ciała myszy (g).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W eksperymentalnych modelach mysich zdolność do produkcji śliny w odpowiedzi na stymulację pilocarpiną jest wykorzystywana jako wskaźnik funkcji gruczołów ślinowych. Produkcja śliny była mierzona metodą wymazową u 1-tygodniowych samic myszy szczepu C57BL/6. Na Rysunku 1A wyniki przedstawiono jako ilość śliny (mg) zebranej po podaniu zwiększających się dawek pilocarpiny. Przy dawce 1 mg/kg masy ciała u niektórych myszy zaczęły występować objawy stresu (mimowol...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Produkcja śliny jest złożonym procesem, na który wpływa wiele czynników. Dlatego pomiar funkcji gruczołów ślinowych u zwierząt laboratoryjnych może być wyzwaniem. Dodatkowym wyzwaniem jest to, że wielokrotne pomiary funkcji gruczołów ślinowych u tego samego zwierzęcia są wymagane w celu ustalenia początku choroby lub wykazania powrotu do zdrowia po leczeniu.
Metoda wymazu opisana w tym raporcie jest technicznie prosta do wykonania z wieloma opcjami reprezentowania danych. Uzyskane wyniki są po...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badanie było wspierane przez grant z National Institutes of Health, National Institute of Dental and Craniofacial Research (DE025030).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chemikalia do zbierania śliny | |||
| Chlorowodorek pilokarpiny | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Rozcieńczony w sterylnym izotonicznym roztworze soli fizjologicznej. Przechowuj jednorazowe porcje bulionu 100X w temperaturze -80oC |
| Nazwa | Company | Numer katalogowy | Komentarze |
| Znieczulenie Mieszanina roztworu | Wymieszaj 1 ml chlorowodorku ketaminy + 0,5 ml ksylazyny + 8,5 ml sterylnego izotonicznego roztworu soli fizjologicznej w sterylnej fiolce. Może być stosowany przez 3 miesiące. | ||
| Zetamine (chlorowodorek ketaminy) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Zapas to 100 mg / ml |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Zapas to 20 mg / ml |
| Izotoniczny sterylny roztwór soli fizjologicznej | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Stosowany jako rozcieńczalnik |
| Sztuczne łzy (lubrykant maść okulistyczna) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Służy do zapobiegania wysuszaniu oczu podczas zabiegu |
| Nazwa | Firma | >Numer katalogowy | Uwagi |
| Materiały do pobierania śliny | |||
| SalivaBio Wacik dla dzieci | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Indywidualnie pakowane waciki |
| 50 ml probówki polipropylenowe | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Odetnij dolny 1 cm probówki. Upewnij się, że krawędź cięcia jest gładka. |
| Probówki do mikrowirówek 0,6 ml | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Wykonaj otwory w dnie probówki za pomocą podgrzewanych igieł o rozmiarze 18 Probówki |
| do mikrowirówek 2 ml | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Strzykawki insulinowe z igłami przymocowanymi na stałe | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| Igły do regularnego skośnego kąta 18 mm | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone | 305195 | |
| Sterylne ostrze skalpela #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Kleszcze do mikropreparacji | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Ząbkowana końcówka kątowa 0,8 mm, długość 4 |
| Taśma do etykiet | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | SC-224487 | |
| 3-kanałowy zegar | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| strong>Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Chemikalia/ odczynniki do indukowania dysfunkcji śliny | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, Stany Zjednoczone | tlrl-b5lps | Rozpuścić w wodzie wolnej od endotoksyn i przechowywać roztwór podstawowy w stężeniu 5 mg/ml . rozcieńczyć w sterylnym HBSS 100 ug/ml - wstrzyknąć 100 μl/m.pl |
| Imject Adiuwant ałunu | Thermo Scientific | 77161 | Rozcieńczyć w stosunku 1:1 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Wstrzyknąć dootrzewnowo 0,1 ml / mysz |
| Surowica anty-Ro52 królika | Wygenerowana w laboratorium | Uodparnianie królików rekombinowaną myszą Ro52 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| >Chemicals/ Zestawy do analizy śliny | |||
| Ocena lizozymu śliny | |||
| EnzChek Zestaw do oznaczania lizozymu | Sondy molekularne, Eugene, OR, USA | E-22013 | Używany zgodnie z instrukcjami producenta |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Ślina Ocena IgA metodą kanapkową ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standardy dla testu ELISA kanapkowego - zakres od 30 ng / ml do 0,5 ng / ml |
| Kozia anty-mysia IgA nieznakowana | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Płaszcz przy 1 ug / ml w buforze wodorowęglanowym |
| Kozioł anty-mysie IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Przeciwciało detekcyjne stosowane w rozcieńczeniu 1:4000 |
| Substrat TMB | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Używany zgodnie z instrukcjami producenta |
| Immulon 4HBX Microtiter 96-dołkowe płytki | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| Ocena białka śliny | |||
| Bio-Rad Protein Assay Koncentrat odczynnika barwnikowego | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | Do oceny białka zgodnie z instrukcjami producenta |
Bibliografia
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
