Artykuł metodologiczny

Ultraczułe wykrywanie biomarkerów za pomocą biosensora pojemnościowego opartego na imprintingu molekularnym

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57208

⸱

16 lutego 2018

 , 
1Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Lund University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania i kwantyfikacji nisko obfitych cząsteczek w złożonych roztworach za pomocą imprintingu molekularnego w połączeniu z biosensorem pojemnościowym.

Streszczenie

Zdolność do wykrywania i ilościowego oznaczania biomolekuł w złożonych roztworach zawsze była bardzo poszukiwana w naukach przyrodniczych; była używana do wykrywania biomarkerów, zanieczyszczeń i innych interesujących molekuł. Powszechnie stosowaną techniką w tym celu jest test immunoenzymatyczny (ELISA), w którym często jedno przeciwciało jest kierowane na określoną cząsteczkę docelową, a drugie znakowane przeciwciało jest używane do wykrywania przeciwciała pierwszorzędowego, co pozwala na bezwzględną kwantyfikację badanej biocząsteczki. Jednak wykorzystanie przeciwciał jako elementów rozpoznających ogranicza solidność metody; podobnie jak potrzeba stosowania znakowanych cząsteczek. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wdrożono imprinting molekularny, tworząc sztuczne miejsca rozpoznawania uzupełniające cząsteczkę matrycową i eliminując konieczność stosowania przeciwciał do początkowego wiązania. Ponadto, aby uzyskać jeszcze większą czułość, wtórnie znakowane przeciwciało można zastąpić bioczujnikami opierającymi się na pojemności w celu ilościowego określenia cząsteczki docelowej. W tym protokole opisujemy metodę szybkiego i bezznacznikowego wykrywania i ilościowego oznaczania biomolekuł o niskiej liczebności (białek i wirusów) w złożonych próbkach, z czułością znacznie lepszą niż powszechnie stosowane systemy wykrywania, takie jak ELISA. Wszystko to odbywa się za pośrednictwem imprintingu molekularnego w połączeniu z biosensorem pojemnościowym.

Wprowadzenie

Kwantyfikacja biomolekuł jest stosowana w wielu różnych dziedzinach badawczych w nauce, wykorzystując metody takie jak test radioimmunologiczny (RIA) lub ELISA1. Niektóre z tych metod wymagają znakowanego odczynnika, takiego jak przeciwciało/antygen znakowany radioizotopem lub enzymem, co sprawia, że są one pracochłonne i czasochłonne przy skomplikowanych procedurach2. Co więcej, solidność, selektywność i czułość tych metod nie są wystarczające dla wszystkich analiz; W szczególności nie są one wystarczające, gdy konieczne jest przeanalizowanie ilości w attogramach, a nie w piktogramach3. W tym celu biosensory cieszą się dużym zainteresowaniem4,5, w szczególności w połączeniu z imprintingiem molekularnym w celu zwiększenia odporności.

Imprinting molekularny polega na tworzeniu ubytków poprzez polimeryzację funkcjonalnych monomerów wokół szablonu6, tworząc sztuczne miejsca rozpoznawania, które doskonale przypominają szablon7. Technika ta została wykorzystana w kilku zastosowaniach, w tym w systemach dostarczania leków i separacji analitycznej, ale także jako elementy rozpoznawania biologicznego w biosensorach8,9,10. Jednak nadal istnieją pewne trudności w projektowaniu polimerów z nadrukiem molekularnym (MIP) dla matryc makromolekularnych, takich jak białka i komórki11,12. Z tego powodu wielu badaczy skupiło się na wdrukowaniu białka matrycowego bezpośrednio na substrat, tworząc w ten sposób powierzchnię, która zostanie rozpoznana przez docelowe białko12. Ta technika powlekania powierzchni stosowana do wykorzystywania wgłębień rozpoznawania dużych cząsteczek i zespołów, w tym białek, nazywa się mikrokontaktowym imprintingiem13,14. Ogólna procedura metody zależy od polimeryzacji między dwiema powierzchniami - stemplem matrycowym i nośnikiem polimerowym - na którym matryca jest adsorbowana na jednej powierzchni15,16 i styka się z powierzchnią traktowaną monomerem. W ten sposób na podłożu tworzy się cienka warstwa polimerowa poprzez polimeryzację UV. Na koniec szablon jest usuwany, pozostawiając specyficzne dla szablonu wgłębienia na powierzchni odciśniętej elektrody. Ta metoda ma pewne zalety, w tym zmniejszoną utratę aktywności wdrukowanej cząsteczki, a także wymaga bardzo małych ilości cząsteczek matrycowych do procesu imprintingu16,17. W ten sposób te ekonomiczne, stabilne, czułe i selektywne powierzchnie można tworzyć na powierzchniach czujników, kierując się na dowolny szablon wybrany przez użytkownika.

Biosensor może być używany do wykrywania pojedynczych białek i znacznie większych biomakrocząsteczek, w tym wirusów. Specyficzną grupą wirusów, które w ostatnim czasie zyskują zainteresowanie, jest bakteriofag, czyli wirus infekujący bakterie. Szybkie i czułe wykrywanie bakteriofagów jest ważne podczas procesów biotechnologicznych i biofarmaceutycznych w celu określenia zakażeń kultur bakteryjnych bakteriofagami18. Najczęściej stosowanym testem biologicznym do wykrywania bakteriofagów jest metoda agaru dwuwarstwowego19, która jest pracochłonna i czasochłonna. Podjęto kilka prób opracowania nowatorskich narzędzi diagnostycznych dla wirusów (w tym bakteriofagów), takich jak mikroskopia sił atomowych (AFM)20, interferometria21, electrochemistry22 oraz sensor system23,24. Wiele pracy skupiono się na biosensorach ze względu na ich zalety, takie jak łatwość obsługi, wysoka czułość i możliwość pomiaru w czasie rzeczywistym15,25. Specyficzny typ biosensora opiera się na zmianach pojemności. Te bioczujniki pojemnościowe są czujnikami elektrochemicznymi, które mierzą zmiany właściwości dielektrycznych, gdy analit oddziałuje z elementem biorozpoznającym na powierzchni czujnika, powodując spadek pojemności2,4. Bioczujniki pojemnościowe zostały wykorzystane do wykrywania różnych analitów, takich jak antygeny, przeciwciała, białka i jony metali ciężkich6,26,27,28. Tego typu biosensory mają wiele zalet, takich jak wrodzona szybkość, wysoka czułość, prostota, niski koszt, łatwa manipulacja i pomiar w czasie rzeczywistym bez etykietowania29.

Metoda opisana tutaj ma na celu umożliwienie wykrywania i kwantyfikacji mało obfitych biomolekuł w wysoce złożonych próbkach, bez potrzeby stosowania jakiegokolwiek znakowania. W szczególności technika ta jest najbardziej przydatna w zakresie biomolekuł atto-pikogramowych, w przypadku gdy inne komercyjnie istniejące instrumenty nie są w stanie dokładnie określić ilościowo swojego celu.

Protokół

1. Modyfikacja szklanych szkiełek nakrywkowych (stemple szablonowe)

  1. Aby wyczyścić szkiełka nakrywkowe, zanurz je kolejno w 10 ml odpowiednio 1,0 M HCl, wody dejonizowanej i 1,0 M NaOH na 10 minut w każdym kroku w myjce ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej.
    1. Osusz szkiełka szklanej pokrywy gazowym azotem.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe są suszone przez odparowanie pod strumieniem gazowego azotu.
  2. Zanurzyć oczyszczone i wysuszone szkiełka nakrywkowe w 10% (v/v), 10 ml roztworze 3-amino-propylotrietoksysilanu (APTES) w etanolu na 1 godzinę w celu wprowadzenia grup aminowych na powierzchnię szkła nakrywkowego, w temperaturze pokojowej.
    1. Opłucz szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną.
    2. Osuszyć szkiełka nakrywkowe gazowym azotem.
  3. Zanurzyć szkiełka nakrywkowe modyfikowane APTES w 5% (v/v), 10 ml roztworze aldehydu glutarowego w 10 mM buforze fosforanowym (pH 7,4) na 2 godziny w celu aktywacji grup aminowych na powierzchni, w temperaturze pokojowej6,15.
    1. Przepłukać szkiełka nakrywkowe 10 mM buforem fosforanowym (pH 7,4) w celu usunięcia nadmiaru aldehydu glutarowego z powierzchni.
    2. Osuszyć szkiełka nakrywkowe gazowym azotem.
  4. Przygotować 1,0 ml roztworu matrycowego (białko/bakteriofag) w 10 mM buforze fosforanowym (pH 7,4) w stężeniu 0,1 mg/ml.
    UWAGA: Rozpuścić 0,1 mg białka w 1,0 ml buforu fosforanowego (10 mM, pH 7,4). W razie potrzeby można użyć spektrofotometru (280 nm) w celu oznaczenia stężenia białka.
    1. Upuść 200 μl roztworu szablonowego na zmodyfikowane szkiełka nakrywkowe i inkubuj w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Nadmiar roztworu szablonowego można wykorzystać do przygotowania 1 - 2 dodatkowych stempli szablonowych do wykorzystania w badaniach charakteryzacyjnych.
    2. Przepłukać szkiełka nakrywkowe 10 mM buforem fosforanowym (pH 7,4) w celu usunięcia niezwiązanej matrycy z powierzchni.
      UWAGA: Aby przepłukać elektrody, przepłucz je buforem fosforanowym (10 mM, pH 7,4) przez 30 s.
    3. Osuszyć szkiełka nakrywkowe gazowym azotem.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ich wykorzystania na etapie polimeryzacji.

2. Modyfikacja pojemnościowych złotych elektrod

  1. Aby oczyścić elektrody, zanurz je kolejno w małej zlewce zawierającej 5 ml etanolu (70%), wodę dejonizowaną, aceton, wodę dejonizowaną, kwaśny roztwór piranii (3:1,H2SO4:H2O2, v/v) i wodę dejonizowaną, odpowiednio na 10 minut w każdym etapie, w myjce ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej.
    1. Osuszyć elektrody gazowym azotem.
  2. W celu przeprowadzenia elektropolimeryzacji tyraminy należy przygotować 8 ml 10 mM roztworu tyraminy w 10 mM buforze fosforanowym (pH 7,4) zawierającym etanol (2 ml)15.
    UWAGA: Całkowita objętość roztworu tyraminy musi wynosić łącznie 8 ml, w tym 2 ml etanolu.
    1. Wykonuj cykliczne skany woltamperometryczne (15 cykli) w tym roztworze przy użyciu potencjostatu pokrywającego zakres potencjału 0 - 1,5 V (Ag/AgCl) i szybkość skanowania 50 mV/s30.
    2. Przepłucz elektrody wodą dejonizowaną.
    3. Osuszyć elektrody gazowym azotem.
  3. Zanurz elektrody w roztworze zawierającym 30 mM chlorku akryloylu i 30 mM trimetyloaminy w toluenie (V total = 5 ml) w temperaturze pokojowej przez noc6,15,30.
    1. Przepłukać elektrody wodą dejonizowaną.
      UWAGA: Aby zapewnić lepsze usunięcie nieprzereagowanych pozostałości chlorku akryloylu i trimetyloaminy, możliwe jest również umycie powierzchni NaOH po wodzie dejonizowanej.
    2. Osuszyć elektrody gazowym azotem.

3. Przygotowanie szablonu Nadrukowane Pojemnościowe Złote Elektrody

  1. Przygotowanie złotych elektrod pojemnościowych z nadrukiem bakteriofagów
    1. Przed polimeryzacją należy przygotować roztwór monomeru zawierający monomer (N-hydroksymetyloakrylamid) i środek sieciujący (glikol polietylenowy-400-dimetakrylan) w stosunku 1:5 (mol/mol) w 1 ml 10 mM buforu fosforanowego (pH 7,4).
      UWAGA: Roztwór monomeru zawierający monomer i środek sieciujący może być stosowany w różnych proporcjach lub rodzaje monomeru i środka sieciującego można zmieniać zgodnie z szablonem w celu optymalizacji określonej interakcji.
    2. Dodać 1 mg fotoinicjatora do tego roztworu.
      UWAGA: Jeśli polimeryzacja jest przeprowadzana w świetle UV, do zainicjowania polimeryzacji należy użyć fotoinicjatora. Jeśli polimeryzacja jest wykonywana przez polimeryzację wolnorodnikową, należy zmienić typ inicjatora.
    3. Odpipetować 1,5 μl tego roztworu na złotą powierzchnię zmodyfikowanej złotej elektrody.
      UWAGA: Złota powierzchnia elektrody jest pokazana schematycznie w Rysunek 1.
    4. Doprowadź stempel wzorca do kontaktu z roztworem monomeru na wierzchu powierzchni złotej elektrody.
    5. Rozpocznij polimeryzację UV (365 nm, 400 W) i kontynuuj przez 15 min31.
      UWAGA: Polimeryzacja UV odbywa się w komorze chłodzącej, która jest ustawiona na -25 °C przed rozpoczęciem polimeryzacji. Następnie włącza się system utwardzania światłem UV i polimeryzacja jest kontynuowana przez 15 minut przed wyłączeniem systemu utwardzania światłem UV.
    6. Usuń stempel szablonu z powierzchni za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Podczas usuwania stempla szablonowego z powierzchni, folia polimerowa na powierzchni może ulec uszkodzeniu. Dlatego stempel należy usuwać z powierzchni bardzo ostrożnie i powoli, bez użycia siły.
    7. Opłucz powierzchnię elektrody wodą dejonizowaną i osusz ją gazowym azotem.
    8. Zanurzyć elektrody w 1 ml 10 mM 1-dodekanetiolu przygotowanego w etanolu na 20 minut w celu zakrycia otworów na powierzchni elektrody.
    9. Przepłukać elektrody wodą dejonizowaną i osuszyć elektrody gazowym azotem.
  2. Przygotowanie złotych elektrod pojemnościowych z nadrukiem białkowym
    1. Przed polimeryzacją należy przygotować roztwór monomeru zawierający monomery (akrylamid: 54 mg; N-hydroksymetyloakrylamid: 140 μl; N-izopropyloakrylamid: 85,6 mg) i środek sieciujący (metylenobisakryloamid: 9,5 mg) w 820 μl ultraczystej wody30,32.
    2. Przygotować 5% (v/v) N,N,N',N'-tetrametyloetylodiaminy (TEMED) w ultraczystej wodzie.
    3. Dodać 20 μl roztworu TEMED do roztworu monomeru i przepłukiwać azotem gazowym przez 5 minut.
    4. Przygotować 10% (w/v) nadsiarczan amonu (APS) w ultraczystej wodzie.
    5. Dodać 20 μl roztworu APS do roztworu monomeru.
    6. Odpipetować 1,5 μl roztworu monomeru na zmodyfikowaną powierzchnię złotej elektrody.
    7. Doprowadzić stempel szablonu do kontaktu z powierzchnią pokrytą monomerem.
    8. Rozpocznij polimeryzację w temperaturze pokojowej i kontynuuj przez 5 godzin
      UWAGA: W celu przygotowania złotych elektrod z nadrukiem białka, zamiast polimeryzacji UV, przeprowadza się polimeryzację wolnorodnikową w temperaturze pokojowej (25 °C) przy użyciu APS-TEMED jako inicjatora-katalizatora.
    9. Ostrożnie usuń stempel szablonowy z powierzchni za pomocą kleszczy.
    10. Przepłukać elektrodę wodą dejonizowaną i osuszyć gazowym azotem.
    11. Zanurzyć elektrody w 1 ml 10 mM 1-dodekanetiolu przygotowanego w etanolu na 20 minut w celu zakrycia otworów na powierzchni elektrody.
    12. Przepłukać elektrody wodą dejonizowaną i osuszyć elektrody gazowym azotem.

4. Charakterystyka powierzchni elektrody za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

  1. Zamontuj próbki na aluminiowych uchwytach za pomocą samoprzylepnej taśmy węglowej.
  2. Pokryj elektrody palladem/złotem o długości fali 10 nm.
  3. Zbadaj elektrody za pomocą SEM.

5. Pomiary pojemnościowe w czasie rzeczywistym z nadrukowanymi szablonowymi złotymi elektrodami pojemnościowymi

  1. Włóż nadrukowane pojemnościowe złote elektrody do elektrochemicznej komórki przepływowej zintegrowanej z pojemnościowym bioczujnikiem.
  2. Przygotować 100 ml buforu regeneracyjnego (25 mM glicyny-HCl, pH 2,5, w tym 50 mM Tween-20) i 1 l buforu do biegania (dla układu z nadrukiem bakteriofagów: 10 mM fosforanu, pH 7,4; dla układu z nadrukiem białka: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4).
  3. Analizę należy rozpocząć od wstrzyknięcia bufora regeneracyjnego w celu regeneracji układu i uruchomienia bufora w celu przywrócenia równowagi układu przez 25 minut.
  4. Przygotować wzorcowe roztwory szablonowe w żądanym zakresie stężeń w uruchomionym buforze.
    UWAGA: Najpierw przygotuj wywar z roztworu matrycowego, rozpuszczając 0,1 mg białka lub około 108 bakteriofagów pfu w 1,0 ml buforu fosforanowego (10 mM fosforanu, pH 7,4). Następnie należy przygotować roztwory wzorcowe do krzywej kalibracyjnej, wykonując dziesięć sekwencyjnych 10-krotnych rozcieńczeń z roztworu podstawowego. Roztwory te zostaną przeanalizowane za pomocą biosensora pojemnościowego w kroku 5.5. Stężenie białka można zmierzyć za pomocą spektrofotometru (280 nm). W celu zmierzenia stężenia bakteriofagów można zastosować metodę agaru dwuwarstwowego, która została szczegółowo opisana wcześniej19.
  5. W optymalnych warunkach (natężenie przepływu: 100 μl/min, temperatura: 25 °C) należy kolejno wstrzykiwać do systemu 250 μl roztworów wzorcowych.
    UWAGA: W tym zastosowaniu wzorcowe roztwory białkowe przygotowano w zakresie stężeń 1,0 x 10-4 - 1,0 x 10-14, natomiast stężenia bakteriofagów mieściły się w zakresie 1,0 x 101 - 1,0 x 105 pfu/ml. Roztwory umieszczono w zaworze iniekcyjnym i sekwencyjnie wstrzyknięto do systemu, wstrzykując próbki w trzech porcjach przez pojedynczą pompę strzykawkową i zawór wielodrogowy. Spadek pojemności po wstrzyknięciu roztworów wzorcowych wynikający z wiązania matrycy z nadrukowanymi wnękami jest automatycznie monitorowany przez oprogramowanie urządzenia.

Wyniki

Postępując zgodnie z protokołem i schematem przedstawionym na Rysunku 1, na czystej elektrodzie złotej zostanie wykonany odcisk matrycy reprezentującej strukturę biomakrocząsteczki. Elektrodę tę można zastosować w pojemnościowym biosensorze (Rysunek 2), co umożliwia stabilne naniesienie matrycy na elektrodę oraz pomiar zmian pojemności po związaniu matrycy.

Schematyczne przedstawienie biosensora pojemnościowego pokazano na Rysunku 2. Na rysunku wyraźnie widoczna jest pompa Centris, która odpowiada za ciągłe wstrzykiwanie do celi przepływowej buforu roboczego (10 mM fosforan, pH 7,4) oraz buforu regenerującego (25 mM glicyna-HCl, pH 2,5) podczas procesu regeneracji. Cela przepływowa składa się z elektrody roboczej, referencyjnej i pomocniczej. Zawór wtryskowy zawiera standardowe roztwory białek/bakteriofagów, które najpierw przechodzą przez odgazowywacz, a następnie są sekwencyjnie wstrzykiwane do układu. W momencie, gdy roztwory dotrą do elektrody roboczej umieszczonej w celi przepływowej, wynik jest monitorowany w czasie rzeczywistym. Wartości pojemności można rejestrować, śledząc sensogramy na ekranie komputera.

Rysunek 3 i Rysunek 4 przedstawiają różnice między powierzchnią niezmodyfikowanych a nadrukowanych elektrod złota. Ten etap charakterystyki jest istotny, aby upewnić się, że powstały wnęki polimerowe, widoczne jako chropowatość na powierzchni elektrody po procesie imprintingowania. Oprócz SEM istnieją również inne metody charakterystyki, takie jak AFM, pomiary kąta zwilżania, elipsometria itp., które mogą być wykorzystane do analizy powierzchni po imprintingowaniu. W ten sposób można potwierdzić powodzenie procesu imprintingowania oraz utworzenie się wnęk matrycowych na powierzchni. W obrębie tych wnęk matryca może wiązać się z wysoką specyficznością i powinowactwem.

Po wstrzyknięciu roztworów wzorcowych do układu pojemnościowego oprogramowanie automatycznie obliczyło średnią z pięciu ostatnich odczytów, a wykresy kalibracyjne uzyskano poprzez zestawienie zmiany pojemności w funkcji stężenia analitytu. Spadek zarejestrowanej pojemności wynikał z wiązania matrycy. Zgodnie z ogólną zasadą pomiarów pojemnościowych, im więcej cząsteczek zwiąże się z powierzchnią elektrody złotej, tym większy jest spadek całkowitej pojemności. Rysunek 5 oraz Rysunek 6 pokazują, że wraz ze wzrostem stężenia analitytu wartość ΔC rośnie zgodnie z oczekiwaniami. Zakres dynamiczny (czyli przedział stężeń, w którym układ jest użyteczny do detekcji konkretnego celu) oraz granica detekcji (LOD) mogą zostać ocenione na podstawie analizy tych wykresów. Zgodnie z Rysunkiem 6, pojemnościowy biosensor z odciśniętym przeciwciałem dla bakteriofagów może wykrywać bakteriofagi w zakresie stężeń od 101 do 105 pfu/mL, przy wartości LOD wynoszącej 10 pfu/mL w niniejszym badaniu. Zarówno Rysunek 5, jak i Rysunek 6 podkreślają konieczność wyznaczenia krzywej kalibracyjnej w tym samym przedziale, w którym zakłada się wystąpienie stężenia matrycy, ponieważ liniowość regresji może różnić się w zależności od stężeń (Rysunek 5) lub posiadać różne nachylenia (Rysunek 6). Należy również zauważyć, że ze względu na zastosowane niskie stężenia, układ jest dość wrażliwy na wahania (mętność próbki, przeciągi powietrzne itp.), dlatego zaleca się wykonanie co najmniej trzech powtórzeń, aby zminimalizować ryzyko wystąpienia wartości odstających. Z tego samego powodu odchylenie standardowe może być dość istotne dla próbek silnie rozcieńczonych, co widać na Rysunku 6.

Schemat procesu mikroimprintingu; immobilizacja BSA, polimeryzacja UV na elektrodzie złotej.
Rycina 1Schematyczny przedstawienie metody mikrodośladunku. (A) Przygotowanie szkiełek nakrywkowych (stempli szablonowych), (B) przygotowanie pojemnościowych elektrod złotych, (C) mikroodciskanie matrycy na powierzchni elektrody złotej poprzez polimeryzację UV oraz (D) usunięcie matrycy z powierzchni elektrody (Opracowano na podstawie pracy Ertürka i in., Biotechnology Reports 2014 (3): 65 – 72 za zgodą). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat metody phagingu z układem chromatograficznym do oczyszczania i analizy białek.
Rysunek 2. Schematyczny obraz biosensora pojemnościowego. Ogólny schemat pojemnościowego biosensora wykorzystanego w niniejszym badaniu (Reprodukowano z Ertürk i wsp., Biotechnology Reports 2014 (3): 65 - 72 za zgodą). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza obrazu z transmisyjnego mikroskopu elektronowego; Obraz A: gładka powierzchnia, Obraz B: struktura włóknista; powiększenie 500x.
Rysunek 3. Skaningowa mikroskopia elektronowa elektrod z odciskiem białek. Obrazy SEM (A) goła elektroda złota (skala = 20 µm), i (B) pojemnościowa złota elektroda z odciskiem białkowym (pasek skali = 10 µm). Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy SEM struktur amorficznych; wyniki mikroskopii, analiza powierzchni materiału, badanie morfologii.
Rycina 4. Skaningowa mikroskopia elektronowa elektrod z odciśniętym obrazem bakteriofagów. Obrazy SEM gołej elektrody złotej (pasek skali = 20 µm) (A), oraz pojemnościowa złota elektroda z odciśniętym bakteriofagem przy różnych powiększeniach (600x, pasek skali = 10 µm) (B), i 1 50X, pasek skali = 5 µm) (C); strzałki wskazują przytwierdzone bakteriofagi). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres zależności pojemności od stężenia białek bakteryjnych z równaniami regresji liniowej i wartościami R².
Rysunek 5. Wpływ składu buforu na krzywe kalibracyjne. Krzywa kalibracyjna przedstawiająca zmianę pojemności w funkcji stężenia białka w warunkach optymalnych (bufor roboczy: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; bufor regeneracyjny: 25 mM glicyna-HCl, pH 2,5 z dodatkiem 50 mM Tween-20; szybkość przepływu: 100 µL/min, Objętość próbki: 250 µL; T: 25 °C). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres zmiany pojemności w funkcji stężenia wirusa; słupki błędów wskazujące zmienność danych; analiza trendu.
Rycina 6. Reprezentatywna krzywa kalibracyjna dla dużych biomakrocząsteczek. Krzywa kalibracyjna przedstawiająca zmianę pojemności w funkcji stężenia bakteriofagów w warunkach optymalnych (bufor roboczy: fosforan 10 mM, pH 7,4; bufor regenerujący: glicyna-HCl 25 mM, pH 2,5 z dodatkiem Tween-20 50 mM; szybkość przepływu: 100 µL/min, Objętość próbki: 250 µL; T: 25 °C) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Kiedy ta metoda jest przeprowadzana, istnieje kilka krytycznych kroków, które należy wziąć pod uwagę podczas przestrzegania protokołu. Jednym z krytycznych etapów jest etap czyszczenia kwaśnym roztworem piranii. Krok 2.1 nie może trwać dłużej niż 10 minut. Roztwór matrycy dla kroku 1.4 nie może przekraczać 0,1 mg/ml, ponieważ wartości te zostały wcześniej zoptymalizowane. Cykliczne skany woltametryczne nie mogą przekraczać 15 cykli w celu uzyskania optymalnej grubości. W kroku 3.1.3 1,5 μl jest wartością zoptymalizowaną. Wartość ta nie może być wyższa dla tego konkretnego typu elektrody. Jeśli system utwardzania UV ma moc 400 W, wówczas polimeryzacja musi być prowadzona maksymalnie przez 10 - 15 min. Gdy tylko APS (inicjator) zostanie dodany do roztworu po TEMED, kolejny etap musi być wykonany bardzo szybko, aby uniknąć natychmiastowej polimeryzacji (krok 3.2.5).

Jednym z najbardziej krytycznych etapów jest usunięcie stempla szablonowego z powierzchni po polimeryzacji UV. Jeśli ten krok nie zostanie wykonany prawidłowo, istnieje ryzyko, że folia polimerowa na powierzchni elektrody może zostać usunięta za pomocą stempla. Dlatego zaleca się zanurzenie elektrody i stempla białkowego na wierzchu w roztworze wody po polimeryzacji, a następnie bardzo powolne i ostrożne usuwanie stempla z powierzchni (krok 3.1.6).

Na podstawie zastosowanego szablonu można ocenić modyfikacje rodzaju i proporcji stosowanych monomerów (monomeru funkcjonalnego i sieciownika) pod kątem generowania wyższej czułości. Trzeba to ustalić empirycznie. Co więcej, wiązanie powinowactwa cząsteczki matrycy zwykle obejmuje kilka różnych oddziaływań jednocześnie. W związku z tym może to prowadzić do problemów na etapach regeneracji. Jeśli związany szablon nie zostanie prawidłowo uwolniony z powierzchni, może to wpłynąć na możliwość ponownego użycia elektrody do dalszej analizy. Te wielopunktowe powinowactwa mogą również wynikać z wiązania za pośrednictwem słabszych oddziaływań. W takich systemach może mieć miejsce niespecyficzne wiązanie, co może negatywnie wpłynąć na selektywność systemu16. Są to powszechne i ogólne ograniczenia tej metody.

Poza tymi specyficznymi ograniczeniami, istnieje wiele istotnych przewag omawianej metody nad istniejącymi metodami. Chociaż pomiary RIA, ELISA i fluorometryczne są bardzo czułe, wymagają użycia oznakowanego materiału (szablonu lub detektora), podczas gdy bioczujnik jest całkowicie wolny od znaczników. Metody te są również droższe i bardziej czasochłonne. Podejście oparte na biosensorach pozwala na szybką, równoległą syntezę MIP w różnych składach w tym samym czasie16. Ponieważ do przygotowania potrzeba tylko kilku mikrolitrów roztworu monomeru, metoda ta jest wygodna w przypadku stosowania drogich lub w inny sposób ograniczonych monomerów. Co więcej, pojedyncze elektrody MIP mogą być używane do około 80 analiz bez znacznego spadku wydajności, która jest znacznie wyższa niż w przypadku innych istniejących metod30. Istniejące metody cierpią również, w różnym stopniu, na niską czułość i selektywność, podczas gdy opisana metoda pozwala na wykrywanie i kwantyfikację cząsteczek w zakresie pM z wysoką selektywnością.

Ze względu na opłacalność, łatwość obsługi przyrządu i czułe wykrywanie w czasie rzeczywistym w krótkim czasie w porównaniu z istniejącymi metodami, bioczujniki są bardzo obiecującymi systemami wykrywania w miejscu opieki nad pacjentem w warunkach polowych; np. do monitorowania środowiska i do zastosowań w krajach rozwijających się. W wielu zastosowaniach w diagnostyce chorób wymagane jest czułe, selektywne i szybkie wykrywanie biomarkera w czasie rzeczywistym w złożonej mieszaninie, takiej jak surowica15,25. W tym przypadku bioczujniki przewyższają istniejące metody, w szczególności ze względu na ich solidność i czułość. Bakteriofagi są ostatnio uważane za alternatywny element biorozpoznawania dla biosensorów ze względu na ich specyficzność dla bakterii gospodarza 33,34,35. Zastąpienie przeciwciał bakteriofagami jest bardzo obiecujące, jeśli chodzi o obniżenie kosztów i dalsze zwiększenie stabilności36. Taki system pozwoli również na wykrywanie i kwantyfikację określonych fagów w środowisku i na podstawie próbek klinicznych. Ze względu na rozpowszechnienie bakteriofagów i ich zdolność do transdukcji bakterii z genami oporności na antybiotyki37,38, taka metoda może być cenna w badaniu rozprzestrzeniania się opornych bakterii.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Maria Baumgarten (IQ Biotechnology Platform, Infection Medicine, Lund University) jest znana z wykonywania i dostarczania skaningowych mikrofotografii elektronowych. Prace te były wspierane przez granty Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych Formas (2017-00100) w ramach europejskiej trzeciej wspólnej inicjatywy programowej dotyczącej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (JPIAMR) o nazwie "Dynamika transmisji". Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, interpretacji, pisaniu, przygotowywaniu manuskryptu, podejmowaniu decyzji o złożeniu lub decyzji o publikacji pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka nakrywkoweThermoFisher102222stempel białkowy
HClSigma-AldrichH1758-500MLczyszczenie
NaOHSigma-Aldrich72068-100MLczyszczenie
Myjka ultradźwiękowaBranson Ultradźwiękowamyjka BRANSONIC M1800- Eczyszczenie
3-amino-propylo-trietoksysilanu (APTES)Sigma-AldrichModyfikacja A3648-100ML
EtOHSigma-Aldrich1009836010płukanie/czyszczenie
aldehydu glutarowegoSigma-AldrichG5882-100MLaceton sieciujący
Sigma-Aldrich34850-1L-M czyszczenie
H2SO4Sigma-Aldrich339741-100MLroztwór
piraniiH2O2Sigma-AldrichH1009-500MLroztwór piranii
tyraminaModyfikacja Sigma-AldrichT90344-5G
CompactStatIvium TechnologiesCompactStat.h:Potencjostat
Zestaw platynowej elektrody przeciwelektrodowejEquilabriumAFCTR5potencjostat
Numer Referencyjny ElektrodaEquilabriumRREF0021potencjostat
chlorek akryloyluEMD Millipore8.00826.0100modyfikacja
trietyloaminyEMD Millipore8.08352.0100modyfikacja
toluenuSigma-Aldrich244511-100MLmodyfikacja
N-hydroksymetyloakrylamidSigma-Aldrich245801-100Gfunkcjonalny monomer
glikolu etylenowego-400-dimetakrylanSigma-Aldrich409510-250MLśrodek sieciujący
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenonSigma-Aldrich410896-50Gfunkcjonalny monomer
polimeryzator UVDymaxDymax 5000ECEdo polimeryzacji UV
Sigma-AldrichZ168777-1EAMateriałów eksploatacyjnych
1-dodekanetiolSigma-Aldrich471364-100MLśrodek blokujący
akryloamidSigma-AldrichA3553-100Gfunkcjonalny monomer
N-hydroksymetyloakrylamidSigma-Aldrich245801-100Gfunkcjonalny monomer
N-izopropylokryloamidSigma-Aldrich415324-50Gfunkcjonalny monomer
metylenobisakryloamidMonomer sieciujący Sigma-Aldrich146072-500G
N,N,N',N'-tetrametyhlethylodiamina (TEMED)Sigma-AldrichT9281-25ML
nadsiarczan amonuInicjator Sigma-AldrichA3678-25G
Biosensor pojemnościowyCapSenze
Equipment Bufor regeneracyjny 1042011000 glicynyMerck
Tween-20Sigma-AldrichP9416-50MLbufor regeneracyjny
Trizma baseSigma-Aldrich93352-1KGbufor biegowy
Na2HPO4  i byka; 2H2OCalbiochem567547-1KGbufor roboczy
NaH2PO4  i byka; 2H2OCalbiochem567549-1KGbufor do biegania
DELPHI korelacyjny mikroskop świetlny i elektronowySprzęt Phenom-World
Pojemnościowe złote elektrodyeksploatacyjneCapSenze Biosystems
2,2'-azobis(2-metylopropionitryl)Sigma-Aldrich441090-25Gfotoinicjator
CapSenze Inteligentne oprogramowanieCapSenze Oprogramowanie Biosystems
30mA@10V/3MHz Kleszczyki katalizator Materiały

Bibliografia

  1. Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor. Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).
  2. Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive Biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
  3. Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general. The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).
  4. Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedström, M. Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production. Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).
  5. Limbut, W., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Capacitive biosensor for detection of endotoxin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).
  6. Ertürk, G., Berillo, D., Hedström, M., Mattiasson, B. Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA. Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).
  7. Arshady, R., Mosbach, K. Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization. Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).
  8. Andersson, L. I. Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field. Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).
  9. Li, X., Husson, S. M. Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).
  10. Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis. Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).
  11. Kryscio, D. R., Peppas, N. A. Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin. Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).
  12. Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing. Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).
  13. Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).
  14. Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).
  15. Ertürk, G., Hedström, M., Tümer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors. Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).
  16. Ertürk, G., Mattiasson, B. From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).
  17. Ertürk, G., Mattiasson, B. Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces. Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).
  18. Janczuk-Richter, M., et al. Long-period fiber grating sensor for detection of viruses. Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).
  19. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).
  20. Meillan, M., et al. Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level. RSC Adv. 4 (23), 11927(2014).
  21. Ymeti, A., et al. Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor. Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).
  22. Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -S. Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels. Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).
  23. Guliy, O. I., et al. Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field. Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).
  24. Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Simón, B., Voelcker, N. H. Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage. Biosensors & Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).
  25. Ertürk, G., Özen, H., Tümer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples. Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).
  26. Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedström, M. Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine. Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).
  27. Loyprasert, S., Hedström, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor. Biosensors & Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).
  28. Teeparuksapun, K., Hedström, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor. Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).
  29. Labib, M., Hedström, M., Amin, M., Mattiasson, B. A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).
  30. Ertürk, G., Hedström, M., Mattiasson, B. A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor. Biosensors & Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).
  31. Ertürk, G., Uzun, L., Tümer, M. A., Say, R., Denizli, A. Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection. Biosensors & Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).
  32. El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning. Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).
  33. Wang, F., et al. Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors. Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).
  34. Chin, B. A., et al. Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors. 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).
  35. Park, M. -K., Chin, B. A. Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil. Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).
  36. Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce. Journal of food safety. 37 (2), 12299(2017).
  37. Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples. Plos One. 6 (3), 17549(2011).
  38. Lood, R., Ertürk, G., Mattiasson, B. Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle. Frontiers in microbiology. 8, (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie biomarkerówelektropolimeryzacjaskaningowa mikroskopia elektronowastempel matrycowybufor regenerującydetekcja w czasie rzeczywistymkwantyfikacja bezetykietowaelektrody złote
Ultraczułe wykrywanie biomarkerów za pomocą biosensora pojemnościowego opartego na imprintingu molekularnym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.