Obrazowanie układu sercowo-naczyniowego u płodu myszy za pomocą systemu ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości (30/45 MHZ)

Podsumowanie

Obrazowanie ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości u płodu myszy poprawiło rozdzielczość obrazowania i może zapewnić precyzyjną, nieinwazyjną charakterystykę rozwoju serca i wad strukturalnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest przeznaczony do wykonywania echokardiografii płodu u myszy w czasie rzeczywistym in vivo.

Streszczenie

Wrodzone wady serca (CHD) są najczęstszą przyczyną zachorowalności i wczesnej śmiertelności w dzieciństwie. Prenatalne wykrywanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw choroby niedokrwiennej serca ma kluczowe znaczenie dla wynalezienia nowych strategii profilaktycznych i terapeutycznych. Zmutowane modele myszy są potężnymi narzędziami do odkrywania nowych mechanizmów i modyfikatorów stresu środowiskowego, które napędzają rozwój serca i ich potencjalne zmiany w chorobach niedokrwiennych. Jednak wysiłki zmierzające do ustalenia przyczynowości tych domniemanych czynników ograniczyły się do badań histologicznych i molekularnych w eksperymentach na zwierzętach, w których często nie ma monitorowania kluczowych parametrów fizjologicznych i hemodynamicznych. Technologia obrazowania na żywo stała się podstawowym narzędziem do ustalenia etiologii choroby wieńcowej. W szczególności obrazowanie ultrasonograficzne może być stosowane w okresie prenatalnym bez chirurgicznego odsłaniania płodów, co pozwala na utrzymanie ich wyjściowej fizjologii przy jednoczesnym monitorowaniu wpływu stresu środowiskowego na hemodynamiczne i strukturalne aspekty rozwoju komór sercowych. W tym celu używamy systemu ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości (30/45) do badania układu sercowo-naczyniowego u płodów myszy przy E18,5 w macicy na początku badania i w odpowiedzi na ekspozycję na hipoksję prenatalną. Wykazujemy wykonalność systemu do pomiaru wielkości komory serca, morfologii, funkcji komór, częstości akcji serca płodu i wskaźników przepływu w tętnicy pępowinowej oraz ich zmian u płodów myszy narażonych na przewlekłe niedotlenienie układowe w macicy w czasie rzeczywistym.

Wprowadzenie

Wrodzone wady rozwojowe serca to niejednorodne wady strukturalne, które występują podczas wczesnego rozwoju serca. Obecny postęp techniczny w procedurach operacyjnych doprowadził do znacznej poprawy wskaźników przeżywalności niemowląt z chorobą wieńcową^1,2. Jednak jakość życia jest często pogarszana w wyniku długotrwałej hospitalizacji i konieczności etapowych zabiegów chirurgicznego leczenia^1,2,3,4,5. Prenatalne wykrywanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw choroby niedokrwiennej serca ma kluczowe znaczenie dla planowania wczesnych interwencji, realizacji nowych strategii prewencyjnych i poprawy wyników przez całe życie^6,7.

Chociaż wiele czynników genetycznych i środowiskowych zostało zamieszanych w patogenezę CHD, ustalenie związku przyczynowego pozostaje niezaspokojoną potrzebą poprawy strategii diagnostycznych, terapeutycznych i prewencyjnych^{1,8,9,10,11,12}. Co więcej, zbadanie roli czynników stresowych in utero i modyfikatorów epigenetycznych otwiera nowe możliwości dla przyszłych badań^11,12. W ostatniej dekadzie rzeczywiście nastąpił szybki postęp w technologii sekwencjonowania nowej generacji, w tym mikromacierz polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP), sekwencjonowanie całego egzomu i badania metylacji całego genomu, ich wykorzystanie w badaniu genetycznych przyczyn złożonych chorób człowieka, w tym CHD^1,8,9,10,11torując drogę do identyfikacji nowych mutacji i wariantów genetycznych, które nie zostały jeszcze przetestowane pod kątem patogenności w odpowiednich modelach zwierzęcych.

Wśród różnych systemów modeli chorób, mysz jest modelem zwierzęcym z wyboru, nie tylko do badania mechanizmów CHD podczas wczesnej kardiogenezy^13,14,15,16, ale także do wyjaśnienia ich wpływu na dojrzewanie i funkcjonowanie komory serca w późnym okresie ciąży w prenatalnych i okołoporodowych czynnikach stresowych. W związku z tym przeprowadzenie charakterystyki fenotypowej in vivo zmutowanego płodu myszy serca, zarówno we wczesnych, jak i późnych stadiach rozwoju, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli tych zmian genetycznych i czynników środowiskowych na rozwój serca oraz potencjalnego przyszłego wpływu na specyficzne procesy dojrzewania w komorze u myszy.

Wczesne wykrycie i dokładna diagnoza wad serca podczas rozwoju ma kluczowe znaczenie dla planowania interwencyjnego^17,18. Będąc bezpieczną, prostą, przenośną i powtarzalną, ultrasonografia płodu stała się rzeczywiście standardową techniką obrazowania do oceny serca w klinice. Ocena krążenia płodu za pomocą USG Dopplera jest szeroko stosowana w praktyce klinicznej nie tylko do wykrywania wad serca, ale także do wykrywania nieprawidłowości naczyniowych, niewydolności łożyska i wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrostu, a także do oceny dobrostanu płodu w odpowiedzi na zniewagi in utero, w tym hipoksemię, chorobę matki i toksyczność leków^{17, 18}. Równolegle do swojej wartości w ocenie wad i chorób u ludzi, ocena ultrasonograficzna płodów myszy zyskuje coraz większą użyteczność w warunkach eksperymentalnych^{19,20,21,22,23}. W szczególności ultrasonografia serca płodu (echokardiografia) umożliwia sekwencyjną wizualizację in vivo rozwijającego się serca. W wielu badaniach eksperymentalnych wykorzystano technologię obrazowania ultradźwiękowego do obserwacji rozwoju układu sercowo-naczyniowego płodu u transgenicznych myszy płodowych. Ultrasonografia dopplerowska była szczególnie przydatna do wyjaśnienia parametrów patofizjologicznych, takich jak wzorce przepływu w krążeniu płodu w warunkach wyzwań fizjologicznych lub stanów chorobowych^10,19. Zarówno u ludzi, jak i zwierząt nieprawidłowy przepływ krwi lub dopływ tlenu do płodu może wynikać z różnych warunków, które mogą zakłócać środowisko płodu w macicy i wpływać na oś płodu-łożyska, w tym nieprawidłowości łożyska, niedotlenienie matki, cukrzyca ciążowa i farmaceutycznie wywołane zwężenie naczyń krwionośnych^15,22. W związku z tym ustanowienie ustandaryzowanych metod wykonywania ultrasonografii dopplerowskiej na płodach myszy ogromnie wzmocni przyszłe badania nad chorobą niedokrwienną serca, ułatwiając monitorowanie wzorców przepływu i kluczowych wskaźników hemodynamicznych obwodów sercowo-naczyniowych na różnych etapach rozwoju serca w genetycznych modelach myszy.

Ultrasonografia o wysokiej częstotliwości stała się potężnym narzędziem do pomiaru parametrów rozwojowych i fizjologicznych układu sercowo-naczyniowego w modelach mysich i chorobach ludzkich¹⁸. W ostatnich latach technologia ta została jeszcze bardziej udoskonalona. Wraz z innymi badaczami wykazaliśmy wykonalność tego systemu do przeprowadzania badań ultrasonograficznych o ultrawysokiej częstotliwości na sercu płodu myszy ^{15,19,20,21,22,23}. System jest wyposażony w dopplerowskie mapowanie przepływu kolorów i przetworniki liniowe, które generują dwuwymiarowe, dynamiczne obrazy z częstotliwością odświeżania (od 30 do 50 MHz). Te zalety, w porównaniu z systemami ultrasonograficznymi o niskiej częstotliwości i wcześniejszą generacją ultradźwięków o wysokiej częstotliwości^21,22, zapewniają niezbędną czułość i rozdzielczość do dogłębnej oceny układu krążenia płodu, w tym kompleksowej charakterystyki struktur serca, funkcji komory i wskaźników przepływu płodów myszy w warunkach eksperymentalnych. W niniejszym artykule przedstawiono metody szybkiej oceny krążenia krążeniowo-oddechowego i krążenia płodowo-łożyskowego w dniu embrionalnym E18.5 in vivo przy użyciu systemu wysokiej częstotliwości. Wybraliśmy przetwornik 30/45 MHz, który zapewnia rozdzielczość osiową około 60 μm i rozdzielczość boczną 150 μm. Jednak przetwornik o wyższej częstotliwości (40/50 MHz) może być wybrany do analizy wcześniejszych etapów rozwoju, stosując podobne podejście metodologiczne. Wybrany tryb M umożliwia wizualizację tkanek w ruchu w wysokiej rozdzielczości czasowej (1 000 klatek/s). Wreszcie, wykazujemy wykonalność wysokiej ultrasonografii do szczegółowej, kompleksowej charakterystyki fenotypowej stanu hemodynamicznego i funkcji układu sercowo-naczyniowego płodu u myszy na początku badania i w odpowiedzi na stres związany z hipoksją prenatalną.

Protokół

Uniwersytet Kalifornijski w Los Angeles, Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania zatwierdził wszystkie procedury przedstawione w tym protokole. Eksperymenty zostały przeprowadzone w ramach trwającego badania zgodnie z protokołami aktywnymi zwierzętami zatwierdzonymi przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles, Kalifornia, USA. Obchodzenie się ze zwierzętami i opieka nad nimi były zgodne ze standardami zawartymi w Przewodniku opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywaniu.

1. Przygotowanie systemu obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości

1. Włącz system obrazowania ultrasonograficznego i jednostkę monitorowania fizjologii.
2. Podłączyć przetwornik 30/45 MHz.
3. Umieść odpowiednią głowicę skanującą na uchwycie w pobliżu platformy obrazowania.
4. Wybierz opcję Cardiac Measurement Program (Program do pomiaru pracy serca).
5. Umieść żel ultradźwiękowy do góry nogami w pojemniku do podgrzewania ustawionym na 37 °C.
6. Potwierdzić odpowiedni system przewodów do znieczulenia i sprawdzić poziom tlenu i izofluranu.
7. Zdezynfekuj platformę obrazowania i obszar roboczy.
8. Ustaw poziom ciepła platformy obrazowania, aby utrzymać stałą temperaturę ciała i tętno zapór.

2. Przygotowanie ciężarnej myszy

1. Umieść ciężarną matkę myszy (C57/BL6) w komorze indukcyjnej znieczulenia.
2. Wywołać znieczulenie za pomocą stale dostarczanego wziewnego izofluranu (izofluran 2%-3%) zmieszanego ze 100% tlenem (100%_O2) przy natężeniu przepływu 200 ml/min w komorze indukcyjnej.
3. Przenieść zwierzę w stanie sedacji na platformę obrazowania w pozycji leżącej.
4. Zapewnić sedację w stanie ustalonym za pomocą maski na twarz podłączonej do systemu rurek anestezjologicznych dostarczających izofluran (1,0% - 1,5%) zmieszany ze 100%_O2 w temperaturze 200 ml / min.
   UWAGA: Kontroluj wyciek gazu znieczulającego za pomocą systemu wentylacji wyposażonego w filtr węglowy zawierający zestaw kanistrów.
5. Po nałożeniu żelu elektrodowego delikatnie przyklej kończyny do osadzonych elektrod elektrograficznych, aby uzyskać stałe monitorowanie częstości czynności serca i oddechu matki.
6. Dostosuj poziom izofluranu, aby utrzymać średnie tętno (450 +/- 50 uderzeń/min (bpm)).
7. Utrzymuj temperaturę ciała w zakresie 37.0 °C +/- 0.5 °C. Monitoruj temperaturę ciała i tętno wyświetlane na sterowniku fizjologii.
8. Dokumentuj parametry życiowe myszy poddanej sedacji co 15 minut przez cały czas trwania procedury obrazowania.
9. Oceń poziom znieczulenia, oceniając postawę myszy, tętno i reakcję na uszczypnięcie palca.
10. Nałóż balsam okulistyczny (1 kropla do każdego oka), aby zapobiec wysuszeniu oczu i uszkodzeniu rogówki.
11. Usuń sierść od połowy klatki piersiowej do kończyn dolnych za pomocą kremu do depilacji, aby zminimalizować tłumienie ultradźwięków. Usuń krem 1-1,5 minuty po aplikacji, naprzemiennie chusteczki z gazy mokrej i suchej, aby zapobiec uszkodzeniu skóry.

3. Identyfikacja zarodka

1. Delikatnie dotykaj ściany brzucha, aby zlokalizować płody i rozłożyć je.
2. Opisz każdy zarodek na brzuchu matki i określ jego orientację przednio-tylną i grzbietowo-brzuszną za pomocą markera.
3. Użyj szyjki macicy uspokojonej tamy jako punktu orientacyjnego. Oznacz płody na lewym i prawym rogu macicy odpowiednio jako L1, L2, L 3 itd. (lewa strona) i R1, R2, R3 itd. (prawa strona) (Rysunek 1A).
   UWAGA: Unikaj silnego rozkładania płodów. 1-2 płody w każdym miocie mogą nakładać się na pozostałe, co sprawia, że ich pozycjonowanie i obrazowanie są niewiarygodne. Należy wykluczyć te płody z analizy.

4. Wizualizacja i adnotacja serca płodu

1. Nałóż wstępnie podgrzany żel ultradźwiękowy na brzuch i ostrożnie rozprowadź, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Dodaj dodatkową ilość żelu na obszar obrazowania skanującego.
2. Umieść sondę ultradźwiękową na mechanicznym uchwycie i stopniowo mobilizuj ją w kierunku skóry, aby zetknąć się z grubą warstwą żelu, szukając bijącego serca za pomocą skanowania w trybie B (Rysunek 1).
3. Kliknij przycisk trybu skanowania B, aby uzyskać obrazy 2D. Użyj pęcherza jako punktu orientacyjnego, aby zidentyfikować pierwszy płód umieszczony w prawym lub lewym rogu macicy i oznacz go odpowiednio jako R1 lub L1.
4. Potwierdź prawą i lewą orientację danego płodu w czasie rzeczywistym, przesuwając platformę obrazowania w płaszczyźnie poziomej. Skanuj od głowy do ogona, aby dodać adnotacje do pyska, kończyn i kręgosłupa jako punktów orientacyjnych (Rysunek 1B, Wideo 1).
5. Wizualizuj bijące serce i opisz lewą komorę (LV) i prawą komorę (RV). Użyj trybu kolorowego Dopplera, aby zoptymalizować wizualizację serca (Rysunek 1 CG, Filmy 1-2).
6. Kliknij przycisk trybu skanowania B, aby uzyskać przymostkowy widok krótkiej osi, wyświetl LV i RV w maksymalnej średnicy w środku ramki akwizycji danych. Rozpocznij obrazowanie na żywo (Rysunek 1B-C).
7. Zmień orientację myszy względem płaszczyzn skanowania, aby uzyskać podłużny widok czterokomorowy (Rysunek 1D). Najpierw zidentyfikuj pozostałe struktury serca, takie jak przedsionki, przegroda międzykomorowa oraz lewa i prawa droga odpływowa. Następnie wyświetl komory komorowe i przedsionkowe w ich maksymalnej średnicy. Następnie rozpocznij akwizycję obrazu.
8. Wyklucz nieoptymalne, ukośne obrazy z końcowej analizy. Kliknij przycisk Cini, aby uzyskać ciągłe nagrywanie "Cineloops" przez co najmniej 10 sekund, a następnie zapisz nagrane obrazy.

5. Ocena tętna płodu i funkcji komór

1. Kliknij przycisk skanowania w trybie M, aby uzyskać obrazy serca z czterech płaszczyzn komory (Wideo 3).
2. Wyświetl listę nagrań do analizy po uzyskaniu kompletnych obrazów wszystkich zarodków.
3. Wyklucz nieoptymalne, ukośne obrazy z końcowej analizy.
4. Kliknij przycisk analizy, aby zmierzyć grubość ścianki i wewnętrzną średnicę lewej/prawej komory przy rozkurczu (LVID, d; RVID, d) i skurcz (LVID, s; RVID, s), jak pokazano na Rysunek 2.
5. Określ średnie tętno płodu, odtwarzając każde zarejestrowane śledzenie w trybie M i obliczając pomiar jednego cyklu przepływu do następnego cyklu przepływu (odstępy między sąsiednimi szczytami).
6. Wykonaj wiele pomiarów (co najmniej 5 na śledzenie), aby uzyskać średnie tętno (Rysunek 2).
7. Zmierz zmiany skroniowe między wewnętrzną średnicą rozkurczową lewej komory (LVID, d) a wewnętrzną średnicą lewej komory na końcu skurczu (LVID, s) przez cały cykl pracy serca. Następnie oblicz procent ułamkowego skrócenia (FS%) w następujący sposób: FS%=[(LVID,d-LVID,s)/LVID,d]x100.
8. Wykonaj wiele pomiarów (co najmniej 5 na śledzenie), aby uzyskać średnie wartości FS%.

6. Ocena parametrów przepływu krążeniowo-oddechowego

1. Wyreguluj sektor pod kątem nabycia mniejszym niż 60^o. Kliknij przycisk Dopplera, aby wykonać pomiary dopplerowskie fal pulsacyjnych z czterokomorowej płaszczyzny obrazowania 2D za pomocą przetwornika 45 MHz.
   1. Najpierw zwizualizuj rozwidlenie tętnicy płucnej, aby zidentyfikować prawą drogę odpływu. Następnie kliknij przycisk Dopplera z falą pulsacyjną, aby uzyskać wzorzec przepływu przez zastawkę płucną i aortalną (Rysunek 3A, Wideo 4).
2. Uzyskaj pomiary przepływu w płucach na podstawie śledzenia dopplerowskiego falami pulsacyjnymi, w tym szczytowej prędkości skurczowej (PkV), czasu przyspieszenia (AT) i czasu wyrzutu (ET).
3. Wykonaj wiele pomiarów (co najmniej 5 na śledzenie), aby uzyskać średnie pomiary, jak pokazano na Rysunek 3A (po prawej).
4. Obliczyć stosunek AT/ET dla każdego zaworu odpływowego jako wskaźnik drożności dróg odpływowych i przepływu krwi.
5. Kontynuuj uzyskiwanie wzorców przepływu zastawki mitralnej i aortalnej z czterokomorowych widoków wierzchołkowych 2D za pomocą Dopplera fali pulsacyjnej. Najpierw zidentyfikuj lewy przedsionek i komory lewej komory. Następnie umieść objętość próbki Dopplera z falą pulsacyjną w celu zarejestrowania wzorców dopplerowskich napływu zastawki mitralnej i zmierzenia wczesnej prędkości rozkurczowej (E) i prędkości skurczu przedsionków (A) (Rysunek 3B)^24,25.
6. Dostosuj objętość próbki Dopplera, aby uzyskać wzór strumienia dopplerowskiego aorty. Użyj śledzenia strumienia dopplerowskiego aorty, aby zmierzyć czas przyspieszenia (AT) i czas wyrzutu (ET), jak pokazano na Rysunek 3B (po prawej) (Wideo 5)

7. Ocena osi płodowo-łożyskowej

1. Użyj kolorowego skanu dopplerowskiego, aby uwidocznić tętnicę maciczną i drzewo naczyniowe płodu i łożyska za pomocą przetwornika 45 MHz (Rysunek 4A).
2. Zidentyfikuj naczynia pępowinowe (dwie tętnice i jedną żyłę) w odcinku wewnątrzowodniowym pępowiny, tuż po wyjściu pępowiny z jamy brzusznej płodu.
3. Umieść objętość próbki Dopplera z falą pulsacyjną, aby uzyskać wzorzec przepływu w tętnicy pępowinowej (Rysunek 4A).
4. Zmierz parametry szczytowego przepływu naczyniowego, w tym czas przyspieszenia (AT), czas wyrzutu (ET) i szczytową prędkość przepływu w skurczu końcowym (PkV, s) za pomocą rekordu skanowania dopplerowskiego fali pulsacyjnej (Rysunek 4B).
5. Uzyskaj 5 kolejnych przebiegów w każdym naczyniu, przy braku ruchów płodu i ruchów oddechowych matki, aby zmierzyć średnią prędkość szczytową dla każdego naczynia.
6. Przejdź do następnego zarodka.

8. Monitorowanie zwierząt po obrazowaniu

1. Wyłączyć pojemnik z izofluranem po zakończeniu procesu obrazowania.
2. Kontynuuj monitorowanie temperatury ciała, częstości oddechów i tętna w fazie regeneracji.
3. Zdejmij maskę na twarz i podłączony system rurek, gdy zapora zacznie spontanicznie się poruszać.
4. Umieść zaporę z powrotem w odpowiednim pomieszczeniu i kontynuuj obserwację zgodnie ze standardowymi instytucjonalnymi protokołami po zabiegu.
5. Udokumentuj czas do pełnego wznowienia normalnej aktywności.

9. Wymagania dotyczące wydajności i względy techniczne

1. Skróć czas przetwarzania dla ~8 płodów do około 1 godziny, aby uniknąć niekorzystnego wpływu długotrwałego znieczulenia na parametry życiowe i fizjologiczne.
2. Ukończ szkolenie z 8-10 ciężarnymi myszami, aby zoptymalizować techniki pozyskiwania obrazów i śledzenia wzorców przepływu w krótkim czasie.

Wyniki

Analizy statystyczne wskaźników kardiologicznych i hemodynamicznych przeprowadzono w trybie offline. Obliczono średnie z 5 następujących po sobie pomiarów w 3 optymalnych obrazach. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Test t Studenta t-test został wykorzystany do przeprowadzenia porównań międzygrupowych. A P wartość ≤0,05 uznano za statystycznie istotną.

Postępując zgodnie z powyższym protokołem, scharakteryz...

Dyskusja

Na wady rozwojowe i choroby sercowo-naczyniowe istotny wpływ mają czynniki genetyczne i elementy środowiska¹⁹. Wcześniej wykazaliśmy istotny wpływ ograniczenia kalorii u matki, zainicjowanego w drugim trymestrze ciąży, na krążenie płodu i łożysko i czynność serca płodu⁹.

Niedotlenienie prenatalne jest kolejnym częstym czynnikiem stresowym podczas rozwoju płodu, który może mieć ogromny wpływ na fizjologię płodu i łożyska oraz układ krążenia. Wpływ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Vevo 2100	VisualSonics, Toronto, Ontario, Kanada	Nie	biomikroskopii ultradźwiękowej o wysokiej swobodności. Zestaw jest dostępny w centrum fizjologii zwierząt, oddziale medycyny molekularnej, UCLA.
Myszy wsobne w USA (c57/BL6)	Charles River Laboratories	N/A	Szczep myszy typu dzikiego Inbread

dotyczy