Aneuploidia prowadzi do niestabilności genomu, co ostatecznie prowadzi do powstania komórek o skomplikowanych kariotypach. W artykule przedstawiono prostą i wygodną metodę izolowania komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, które przestają się dzielić.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie i izolacja komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Błędna segregacja chromosomów prowadzi do aneuploidii, stanu, w którym komórki mają niezrównoważoną liczbę chromosomów. Kilka linii dowodów silnie wskazuje, że aneuploidia wyzwala niestabilność genomu, ostatecznie generując komórki ze złożonymi kariotypami, które zatrzymują ich proliferację. Izolacja i charakterystyka komórek zawierających złożone kariotypy mają kluczowe znaczenie dla zbadania wpływu niezrównoważonej liczby chromosomów na fizjologię komórki. Do tej pory nie opracowano żadnych metod, które pozwoliłyby wiarygodnie wyizolować takie aneuploidalne komórki. W artykule przedstawiono protokół wzbogacania i analizy komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach z wykorzystaniem standardowych, niedrogich technik hodowli tkankowych. Protokół ten może być wykorzystany do analizy kilku cech komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, w tym ich fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się, właściwości prozapalnych i zdolności do interakcji z komórkami odpornościowymi. Ponieważ komórki rakowe często mają nierównowagę w liczbie chromosomów, ważne jest, aby rozszyfrować, w jaki sposób aneuploidia wpływa na fizjologię komórki w normalnych komórkach, a ostatecznym celem jest odkrycie zarówno jej pro-, jak i przeciwnowotworowego działania.
Wprowadzenie
Błędy w procesie segregacji chromosomów prowadzą do aneuploidii, stanu charakteryzującego się liczbą chromosomów, która nie jest wielokrotnością haploidalnego dopełniacza1,2,3,4. Kariotypy aneuploidalne wywołują stres replikacyjny, który generuje dalszą niestabilność genomu5,6,7,8,9,10, zwiększa złożoność kariotypu i ostatecznie prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego subpopulacji komórek10. Celem przedstawionej tutaj metody jest wygenerowanie i oddzielenie takiej subpopulacji od komórek cyklicznych. Dzięki zastosowaniu niedrogich technik hodowli tkankowej, protokół ten ułatwia izolację i charakterystykę komórek aneuploidalnych zatrzymanych w cyklu komórkowym o złożonych kariotypach. Komórki te są określane jako komórki ArCK (Arrested with Complex Karyotype), a ich euploidalne odpowiedniki cykliczne jako kontrole.
Ten protokół jest pierwszym, który został ustanowiony w tym celu i pozwala na izolację i dalsze badanie linii ArCK, w tym, ale nie tylko, ich indukowanego starzenia się i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się (SASP), ich cech prozapalnych i zdolności do interakcji z komórkami odpornościowymi. Przedstawiona tu metoda została opracowana w nieprzekształconych, unieśmiertelnionych komórkach ludzkich, ale nie została jeszcze przetestowana na liniach nowotworowych. Niektóre przekształcone komórki mogą być niewrażliwe na zatrzymanie cyklu komórkowego z powodu tłumienia jednego lub wielu szlaków; W związku z tym dalsza walidacja powinna być przeprowadzana na innych liniach komórkowych.
Protokół
Warunki hodowli
Linię komórkową RPE-1 hTERT hodowano w podłożu Dulbecco's Modified Eagle Medium (Tabela materiałów) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (Fetal Bovine Serum), 2 mM L-glutaminy oraz 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w warunkach zwiększonej wilgotności. Poniższy protokół opracowano z wykorzystaniem szalek o średnicy 10 cm i wszystkie podane szczegóły techniczne odnoszą się do tych naczyń. W przypadku użycia szalek o innym rozmiarze, należy odpowiednio przeskalować ilości.
1. Synchronizacja komórek RPE-1
- Do wszystkich eksperymentów należy używać świeżo rozmrożonych komórek, które nie przeszły więcej niż 15 pasaży. W dniu 1. rozmrozić i rozsiać ok. 2,5 - 5,0 x 105 komórek RPE-1 hTERT do 10-cm szalki hodowlanej. Dodać 8 mL standardowej pożywki wzrostowej i inkubować przez noc. Liczbę komórek określić za pomocą standardowego licznika komórek (np. hemocytometru).
UWAGA: Gęstość komórek odnosi się do warunków wzrostu komórek RPE-1. Warunki wzrostu mogą się różnić w zależności od linii komórkowej; należy rozważyć ich odpowiednie dostosowanie. - W dniu 2. zsynchronizować komórki na granicy faz G1/S poprzez odessanie zwykłej pożywki wzrostowej i dodanie 8 mL pożywki zawierającej 5 mM tymidyny.
UWAGA: Stężenie tymidyny i czas trwania traktowania mogą się różnić w zależności od linii komórkowej. Zaleca się przeprowadzenie eksperymentów pilotażowych w celu ustalenia optymalnych warunków dla testowanych linii komórkowych. - W dniu 3., 24 h po dodaniu pożywki z tymidyną (krok 1.2), uwolnić komórki z blokady tymidynowej poprzez odessanie pożywki i trzykrotne przemycie komórek 1x PBS. Dodać 8 mL zwykłej pożywki wzrostowej i przenieść szalki z powrotem do inkubatora.
2. Generowanie komórek aneuploidalnych poprzez zakłócanie aktywności kinazy mitotycznej Mps1
- W 3. dniu, 6 h po zniesieniu blokady tymidyną (krok 1.3; następuje to około 3 - 6 h przed wejściem komórek w fazę mitozy), odessać medium, wypłukać raz 1x PBS i zastąpić medium zawierającym 500 nM rewersyny (inhibitora Mps1).
UWAGA: Komórki RPE-1 wchodzą w fazę mitozy 9 - 12 h po wypłukaniu tymidyny10,11. Jednak kinetyka cyklu komórkowego różni się w zależności od linii komórkowej. Dlatego kluczowe jest określenie tej kinetyki w eksperymentach pilotażowych poprzez przeprowadzenie analizy cyklu komórkowego uznanymi metodami (np. poprzez pomiar zawartości DNA za pomocą analizy FACS). Dodatkowo optymalne stężenie robocze inhibitora Mps1 może się różnić między liniami komórkowymi. Wcześniejsze eksperymenty z użyciem komórek RPE1 zakończyły się sukcesem przy zastosowaniu rewersyny w stężeniu roboczym 500 nM10,11,12. Zaleca się przeprowadzenie eksperymentów pilotażowych w celu ustalenia optymalnego stężenia dla badanej linii komórkowej. - W 4. dniu, 12 h po traktowaniu rewersyną (około 6 h po tym, jak komórki znajdowały się w fazie mitozy), odessać medium z rewersyną i wypłukać komórki trzy razy 1x PBS. Dodać do płytki 8 mL zwykłego medium wzrostowego i przenieść komórki z powrotem do inkubatora.
3. Usuwanie cyklujących komórek aneuploidalnych i wzbogacanie populacji ArCK
- W 6. dniu, około 72 h po wejściu komórek w pierwszą mitozę (krok 2.2; jest to około 66 h po wypłukaniu rewersyny, co odpowiada około 2 - 3 cyklom komórkowym), odessać medium, przepłukać raz 1x PBS i zastąpić medium zawierającym 300 nM nocodazole.
UWAGA: Niedawne prace wykazały, że komórki RPE-1 posiadające kariotypy aneuploidalne są genomowo niestabilne i zatrzymują swoją proliferację około 2 - 3 cykle komórkowe po pierwszej błędnej mitozie10. Jednak kinetyka ta może się różnić w zależności od linii komórkowej. Dlatego kluczowe jest przeprowadzenie eksperymentów pilotażowych w celu ustalenia odpowiedniego czasu usunięcia aneuploidalnych komórek cyklujących. - W 7. dniu, 12 h po traktowaniu nocodazole, odessać medium i dodać do płytki 3 mL 1x PBS. Odtrzepać komórki mitotyczne, opukując bok płytki. Obracać płytkę między uderzeniami, aby umożliwić równomierne usunięcie komórek mitotycznych.
- Aby zapewnić całkowite usunięcie komórek mitotycznych, powtórzyć proces odtrzepywania w kilku rundach (zaleca się 3 - 5 razy), odsysając i dodając 3 mL 1x PBS pomiędzy każdą rundą.
- Po odtrzepaniu delikatnie odessać wszelki płyn, który przywarł do pokrywki lub krawędzi płytki. Krótko sprawdzić płytkę pod mikroskopem przy powiększeniu 10X. Upewnić się, że obserwuje się niewiele komórek mitotycznych. Jeśli pod obiektywem 10X widocznych jest więcej niż pięć komórek mitotycznych, przeprowadzić kolejną rundę odtrzepywania.
UWAGA: Komórki mitotyczne będą wyglądać na zaokrąglone i mogą być częściowo odklejone po odtrzepaniu. Kluczowe jest zapewnienie całkowitego usunięcia komórek mitotycznych przed poddaniem komórek kolejnej rundzie traktowania nocodazole. Zaniechanie tego może prowadzić do śmierci komórek mitotycznych i/lub skutkować powstaniem komórek tetraploidalnych. - Po końcowym odtrzepaniu przepłukać komórki raz 5 mL 1x PBS. Dodać do płytki 8 mL medium zawierającego 330 nM nocodazole i inkubować przez 12 h.
- Powtarzać traktowanie nocodazole/odtrzepywanie (kroki 3.1 - 3.5) co 12 h, aż do momentu, gdy po inkubacji nie będą obserwowane żadne komórki mitotyczne. Zazwyczaj zaleca się 4-5 rund traktowania/odtrzepywania.
UWAGA: Podane tutaj informacje odnoszą się do komórek RPE-1. Liczba rund traktowania/odtrzepywania może się różnić w zależności od linii komórkowej. Aby uniknąć przedłużonej i niepotrzebnej ekspozycji na nocodazole, kluczowe jest dokładne ustalenie w eksperymencie pilotażowym liczby rund wymaganych do wydajnego i całkowitego usunięcia aneuploidalnych komórek cyklujących. - Po 4 - 5 rundach traktowania nocodazole/odtrzepywania (kroki 3.1 - 3.6), dodać 10 mL zwykłego medium wzrostowego i inkubować. Pozostawić komórki do odpoczynku na 12 - 24 h przed dalszą manipulacją lub zastosowaniem w analizie.
UWAGA: Po końcowym odtrzepaniu komórki pozostające na płytce mają zatrzymany cykl komórkowy i, jak wykazano niedawno10, posiadają złożone kariotypy. Komórki te określa się jako komórki ArCK (Arrested with Complex Karyotype). Zaleca się przeprowadzanie analiz na populacjach ArCK w ciągu tygodnia od izolacji. - Opcjonalnie, aby ocenić procent zatrzymanych komórek o złożonych kariotypach, zebrać i policzyć komórki z każdego odtrzepywania, korzystając ze standardowego licznika komórek.
Rycina 1: Ogólny schemat metody wykorzystanej do generowania i izolacji komórek aneuploidalnych o złożonym kariotypie (ArCK) oraz reprezentatywne obrazy. (A) Schemat protokołu generowania i izolacji komórek ArCK. (B) Reprezentatywne obrazy komórek RPE-1 hTERT na każdym etapie procesu. Ostatni panel (obramowany na czerwono) przedstawia izolowane komórki ArCK. Pasek skali 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
4. Charakterystyka populacji ArCK
- Potwierdź pomyślną izolację populacji ArCK, wykonując następujące analizy.
- Oceń barwienie beta-galaktozydazą (marker starzenia komórkowego), korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu (patrz Tabela materiałów).
- Zmierz wydzielanie cytokin prozapalnych, takich jak CCL2, stosując dostępne komercyjnie zestawy (patrz Tabela materiałów).
- Potwierdź zwiększone poziomy inhibitorów cyklu komórkowego p53, p21, p16 za pomocą analizy Western Blot.
UWAGA: Aby prawidłowo kontrolować te analizy, populacje ArCK należy porównać zarówno z euploidalnymi, jak i aneuploidalnymi komórkami w cyklu komórkowym. Te pierwsze to komórki RPE-1 hTERT typu dzikiego o niskim numerze pasażu, rosnące wykładniczo. Te drugie można uzyskać poprzez indukcję błędnej segregacji chromosomów w komórkach RPE-1 hTERT i zebranie komórek 72 h po pierwszej aberrantnej mitozie. W tym celu należy postępować zgodnie z opisanym powyżej protokołem od kroku 1.1 i zebrać komórki tuż przed pierwszą obróbką nocodazolem (krok 3.1).
- Wykonaj sekwencjonowanie pojedynczych komórek, aby ocenić kariotyp zatrzymanych komórek.
UWAGA: Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest ugruntowaną metodą określania zmian chromosomowych i podchromosomowych w populacji komórek na poziomie pojedynczej komórki13. Szczegółowe procedury dotyczące przeprowadzania sekwencjonowania pojedynczych komórek można znaleźć w innym źródle10.
Wyniki
Metoda ta wykorzystuje system hodowli tkankowej in vitro do izolacji komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, których proliferacja została zahamowana. Populacja ta jest określana jako komórki ArCK (Arrested with Complex Karyotypes). Rysunek 1A przedstawia schemat eksperymentu. Komórki RPE-1 hTERT typu dzikiego w cyklu komórkowym są synchronizowane na granicy fazy G1/S za pomocą tymidyny i traktowane inhibitorem Mps1 w celu wywołania błędnej segregacji chromosomów. 72 h po indukcji błędnej segregacji chromosomów do komórek dodawany jest nocodazol, trucizna wrzeciona. 12 h po traktowaniu nocodazolem komórki aneuploidalne, które wciąż są zdolne do proliferacji, wchodzą w fazę mitozy i zostają w niej zatrzymane z powodu zakłócenia polimeryzacji mikrotubul. Tak zatrzymane komórki są następnie łatwo usuwane poprzez delikatne wytrząsanie (shake-off). Proces wytrząsania powtarza się 3–5 razy, aby zapewnić całkowite usunięcie komórek cyklicznych. Rysunek 1B przedstawia reprezentatywne obrazy komórek RPE-1 na każdym etapie traktowania.
Komórki ArCK wykazują zwiększone poziomy inhibitorów cyklu komórkowego, takich jak p53, p21 i p16, w porównaniu z euploidnymi i aneuploidnymi komórkami w cyklu, co przedstawiono na Rysunku 2A. Ponadto Rysunek 2B pokazuje pozytywne barwienie na β-galaktozydazę w komórkach ArCK w porównaniu z euploidnymi komórkami kontrolnymi, co stanowi uznany marker starzenia się komórek.
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki z wykorzystaniem komórek ArCK. (A) Western blot oceniający poziomy inhibitorów cyklu komórkowego w komórkach euploidalnych, aneuploidalnych cyklujących oraz komórkach ArCK. Poziomy p53, p21 oraz p16 określono za pomocą analizy Western blot. Aktyna posłużyła jako kontrola ładowania. (B) Barwienie β-galaktozydazą oceniające poziom starzenia się w komórkach ArCK. Aktywność β-galaktozydazy (β-Gal) związanej ze starzeniem określono w komórkach euploidalnych i komórkach ArCK. Pasek skali 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Zatrzymanie cyklu komórkowego jest charakterystyczną cechą komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, co wykazuje reprezentatywna analiza kariotypu z sekwencjonowania pojedynczych komórek na Rysunku 3, gdzie komórki ArCK wykazują liczne, przypadkowe przyrosty i ubytki chromosomów. Wynik ten jest w pełni zgodny z poprzednimi doniesieniami10.
Rycina 3: Reprezentatywne sekwencjonowanie pojedynczych komórek ArCK. Wykresy segmentacji przedstawiające kariotyp sześciu reprezentatywnych komórek ArCK. Wykresy segmentacji ukazują liczbę kopii wszystkich chromosomów od 1 do X w stosunku do euploidalnej referencji w skali log2 (dziki typ RPE-1 to diploidowa linia komórkowa pochodzenia żeńskiego). Przyrosty chromosomów są zaznaczone na czerwono, a straty chromosomów na zielono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Ta nowatorska metoda generowania i wzbogacania zatrzymanych komórek o złożonych kariotypach (ArCK) pozwala na badanie komórek, które mają wiele przyrostów lub strat chromosomów i przestają się dzielić. Konfiguracja metody została zaprojektowana tak, aby ułatwić izolację komórek ArCK w szybki i niezawodny sposób.
Najważniejszym krokiem w tym teście jest rygorystyczne kontrolowanie harmonogramu leczenia farmakologicznego i, co najważniejsze, usuwanie aneuploidalnych komórek cyklicznych. W celu uzyskania optymalnych wyników, czas leczenia nokodazolem i otrząśnięcia ma szczególne znaczenie, aby zapewnić, że komórki cykliczne są usuwane z płytki, gdy są jeszcze zaokrąglone i mitotyczne, zapobiegając możliwości śmierci komórki mitotycznej lub ześlizgnięcia się do G1, potencjalnie tworząc populację tetraploidalną. Nie zaleca się, aby czas wytrząsania odbiegał o więcej niż dwie godziny od zalecanej 12-godzinnej inkubacji nokodazolu.
Przyszłe badania nad komórkami ArCK mogą potencjalnie ułatwić głębsze zrozumienie, w jaki sposób złożone kariotypy wpływają na fizjologię komórki. W szczególności niedawne badanie wykazało, że komórki układu odpornościowego są zdolne do interakcji i wywoływania klirensu immunologicznego komórek ArCK10. Opisana tutaj metoda stanowi doskonały punkt wyjścia do dalszej charakterystyki komórek ArCK, w tym wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw klirensu immunologicznego w komórkach nieprzekształconych oraz zbadania, w jaki sposób transformacja onkogenna może ominąć ten mechanizm nadzoru, co jest kluczowym pytaniem w tej dziedzinie14,15.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez Grant P30-CA 14051 od National Cancer Institute, przez National Institutes of Health Grant (CA206157-22 i GM118066) oraz Curt Marble Cancer Research Fund dla Angeliki Amon. Angelika Amon jest również badaczką w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa i Fundacji Glenna na rzecz Badań Biomedycznych. S. S. był wspierany przez Amerykańsko-Włoską Fundację na rzecz Walki z Rakiem (AICF), stypendium w dziedzinie badań nad rakiem od działań Marie Curie i Włoskiego Stowarzyszenia Badań nad Rakiem (AIRC) oraz przez stypendium KI Quinquennial Cancer Research Fellowship. E.M. był wspierany przez stypendium z Howard Hughes Medical Institute.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM (Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł Średni) | Thermofisher | 11995-073 | |
| Tymidyna | Sigma Aldrich | T1859 | |
| Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
| Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
| Przeciwciało anty-p53 | Santa Cruz | sc-126 | |
| Przeciwciało anty-p21 | Santa Cruz | sc-6246 | |
| Anty-p16 przeciwciało | BD | 554079 | |
| Starzenie się Zestaw do barwienia b-galaktozydazy | Technologia sygnalizacji komórkowej | 9860 | |
| Zestaw macierzy cytokin ludzkich Proteome Profiler | R& D Systems | ARY005B |
Bibliografia
- Santaguida, S., Amon, A. Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).
- Pfau, S. J., Amon, A. Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man. EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).
- Meena, J. K., Cerutti, A., et al. Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion. The EMBO Journal. , 1-14 (2015).
- Ohashi, A., Ohori, M., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668(2015).
- Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. The presence of extra chromosomes leads to genomic instability. Nature Communications. 7, 10754(2016).
- Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. Aneuploidy drives genomic instability in yeast. Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).
- Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast. PLoS Genetics. 8 (5), e1002719(2012).
- Santaguida, S., Richardson, A., et al. Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System. Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).
- Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation. Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).
- Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes. Trends in cell biology. , 1-4 (2017).
- Watson, E. V., Elledge, S. J. Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown! Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).
Przedruki i uprawnienia
