Method Article

Wytwarzanie i izolacja komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami

DOI:

10.3791/57215

⸱

April 13th, 2018

 ,  , 
1Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aneuploidia prowadzi do niestabilności genomu, co ostatecznie prowadzi do powstania komórek o skomplikowanych kariotypach. W artykule przedstawiono prostą i wygodną metodę izolowania komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, które przestają się dzielić.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błędna segregacja chromosomów prowadzi do aneuploidii, stanu, w którym komórki mają niezrównoważoną liczbę chromosomów. Kilka linii dowodów silnie wskazuje, że aneuploidia wyzwala niestabilność genomu, ostatecznie generując komórki ze złożonymi kariotypami, które zatrzymują ich proliferację. Izolacja i charakterystyka komórek zawierających złożone kariotypy mają kluczowe znaczenie dla zbadania wpływu niezrównoważonej liczby chromosomów na fizjologię komórki. Do tej pory nie opracowano żadnych metod, które pozwoliłyby wiarygodnie wyizolować takie aneuploidalne komórki. W artykule przedstawiono protokół wzbogacania i analizy komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach z wykorzystaniem standardowych, niedrogich technik hodowli tkankowych. Protokół ten może być wykorzystany do analizy kilku cech komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, w tym ich fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się, właściwości prozapalnych i zdolności do interakcji z komórkami odpornościowymi. Ponieważ komórki rakowe często mają nierównowagę w liczbie chromosomów, ważne jest, aby rozszyfrować, w jaki sposób aneuploidia wpływa na fizjologię komórki w normalnych komórkach, a ostatecznym celem jest odkrycie zarówno jej pro-, jak i przeciwnowotworowego działania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błędy w procesie segregacji chromosomów prowadzą do aneuploidii, stanu charakteryzującego się liczbą chromosomów, która nie jest wielokrotnością haploidalnego dopełniacza1,2,3,4. Kariotypy aneuploidalne wywołują stres replikacyjny, który generuje dalszą niestabilność genomu5,6,7,8,9,10, zwiększa złożoność kariotypu i ostatecznie prowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego subpopulacji komórek10. Celem przedstawionej tutaj metody jest wygenerowanie i oddzielenie takiej subpopulacji od komórek cyklicznych. Dzięki zastosowaniu niedrogich technik hodowli tkankowej, protokół ten ułatwia izolację i charakterystykę komórek aneuploidalnych zatrzymanych w cyklu komórkowym o złożonych kariotypach. Komórki te są określane jako komórki ArCK (Arrested with Complex Karyotype), a ich euploidalne odpowiedniki cykliczne jako kontrole.

Ten protokół jest pierwszym, który został ustanowiony w tym celu i pozwala na izolację i dalsze badanie linii ArCK, w tym, ale nie tylko, ich indukowanego starzenia się i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się (SASP), ich cech prozapalnych i zdolności do interakcji z komórkami odpornościowymi. Przedstawiona tu metoda została opracowana w nieprzekształconych, unieśmiertelnionych komórkach ludzkich, ale nie została jeszcze przetestowana na liniach nowotworowych. Niektóre przekształcone komórki mogą być niewrażliwe na zatrzymanie cyklu komórkowego z powodu tłumienia jednego lub wielu szlaków; W związku z tym dalsza walidacja powinna być przeprowadzana na innych liniach komórkowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Warunek kultury

Linia komórkowa hTERT RPE-1 została wyhodowana w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco (tabela materiałów) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminą i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny. Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w wilgotnym środowisku. Opisany poniżej protokół został opracowany z wykorzystaniem naczyń 10-centymetrowych, a wszystkie podane szczegóły techniczne odnoszą się do tych szalek. Jeśli używasz różnych naczyń, odpowiednio zwiększaj lub zmniejszaj.

1. Synchronizacja komórek RPE-1

  1. Do wszystkich eksperymentów używaj świeżo rozmrożonych komórek, które nie przeszły więcej niż 15 pasaży. W pierwszym dniu rozmrozić i dozować ~2,5 - 5,0 x 105 komórek RPE-1 hTERT do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej. Dodać 8 ml standardowej pożywki wzrostowej i inkubować przez noc. Określ numer komórki za pomocą standardowego licznika komórek (takiego jak hemocytometr).
    UWAGA: Gęstość komórek odnosi się do warunków wzrostu komórek RPE-1. Warunki wzrostu mogą się różnić w zależności od linii komórkowych; Rozważ ich odpowiednie dostosowanie.
  2. W dniu 2 zsynchronizuj komórki na granicy G1 / S, odsysając zwykłą pożywkę wzrostową i dodając 8 ml pożywki zawierającej 5 mM tymidyny.
    UWAGA: Stężenie tymidyny i czas trwania leczenia mogą się różnić w zależności od linii komórkowych. Zaleca się przeprowadzenie eksperymentów pilotażowych w celu określenia najlepszych warunków dla testowanych linii komórkowych.
  3. W 3, 24 godzinach po dodaniu pożywki tymidynowej (krok 1.2), uwolnij z bloku tymidynowego poprzez zasysanie pożywki i trzykrotne mycie komórek 1x PBS. Dodać 8 ml zwykłej pożywki wzrostowej i włożyć płytki z powrotem do inkubatora.

2. Generowanie komórek aneuploidalnych przez interferencję z aktywnością kinazy mitotycznej Mps1

  1. W 3 dniu, 6 godzin po uwolnieniu z bloku tymidynowego (krok 1.3; jest to około 3 - 6 godzin przed wejściem komórek w mitozę), odessać pożywkę, przemyć raz 1x PBS i zastąpić pożywką zawierającą 500 nM rewersyny (inhibitor Mps1).
    UWAGA: Komórki RPE-1 wchodzą w mitozę 9 - 12 godzin po wypłukaniu tymidyny10,11. Jednak kinetyka cyklu komórkowego różni się w zależności od linii komórkowych. Dlatego tak ważne jest określenie tej kinetyki w eksperymentach pilotażowych poprzez przeprowadzenie analizy cyklu komórkowego przy użyciu uznanych metod (np. poprzez pomiar zawartości DNA za pomocą analizy FACS). Dodatkowo optymalne stężenie robocze inhibitora Mps1 może się różnić w zależności od linii komórkowych. Poprzednie eksperymenty z wykorzystaniem komórek RPE1 zakończyły się sukcesem przy użyciu reversine o stężeniu roboczym 500 nM10,11,12. Wskazane jest przeprowadzenie eksperymentów pilotażowych w celu określenia optymalnego stężenia dla badanej linii komórkowej.
  2. W 4 dniu, 12 godzin po leczeniu reversine (około 6 godzin po tym, jak komórki były w mitozie), odaspiruj pożywkę reversine i przemyj komórki trzykrotnie 1x PBS. Dodać 8 ml zwykłej pożywki wzrostowej do płytki i wstawić komórki z powrotem do inkubatora.

3. Usuwanie aneuploidalnych komórek cyklicznych i wzbogacanie populacji ArCK

  1. W 6 dniu, około 72 godziny po wejściu komórek w pierwszą mitozę (krok 2.2; jest to około 66 godzin po odwróconym wypłukaniu, co odpowiada około 2 - 3 cyklom komórkowym), odessać pożywkę, przemyć raz 1x PBS i zastąpić pożywką zawierającą 300 nM nokodazolu.
    UWAGA: Ostatnie prace wykazały, że komórki RPE-1 zawierające kariotypy aneuploidalne są genomowo niestabilne i zatrzymują swoją proliferację około 2 - 3 cykli komórkowych po pierwszej wadliwej mitozie10. Jednak ta kinetyka może się różnić w zależności od różnych linii komórkowych. Dlatego tak ważne jest przeprowadzenie eksperymentów pilotażowych w celu określenia właściwego czasu na usunięcie aneuploidalnych komórek cyklicznych.
  2. W 7, 12 godzinach po leczeniu nokodazolem należy odessać pożywkę i dodać 3 ml 1x PBS do płytki. Strząśnij komórki mitotyczne, stukając w bok płytki. Obracaj płytkę między każdym kranem, aby umożliwić równomierne usunięcie komórek mitotycznych.
  3. Aby zapewnić całkowite usunięcie komórek mitotycznych, powtórz proces wytrząsania dla wielu rund (zalecane 3 - 5 razy), zasysając i dodając 3 ml 1x PBS między każdą rundą.
  4. Po strząśnięciu delikatnie zassać płyn, który przylgnął do pokrywki lub krawędzi płytki. Krótko mówiąc, sprawdź płytkę pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu. Upewnij się, że zaobserwowano kilka komórek mitotycznych. Jeśli pod obiektywem 10X widać więcej niż pięć komórek mitotycznych, powtórz kolejną rundę otrząsania.
    UWAGA: Komórki mitotyczne wydawałyby się zaokrąglone i mogą być częściowo oderwane po otrząśnięciu. Bardzo ważne jest, aby zapewnić całkowite usunięcie komórek mitotycznych przed wystawieniem ich na kolejną rundę leczenia nokodazolem. Niezastosowanie się do tego może prowadzić do śmierci komórki mitotycznej i/lub spowodować powstanie komórek tetraploidalnych.
  5. Po ostatnim strząśnięciu umyj komórki raz 5 ml 1x PBS. Dodać do płytki 8 ml pożywki zawierającej 330 nM nokodazol i inkubować przez 12 godzin.
  6. Powtarzać leczenie nokodazolem (etapy 3.1 - 3.5) co 12 godzin, aż po inkubacji nie zaobserwuje się żadnych komórek mitotycznych. Zwykle zaleca się 4-5 rund leczenia/otrząsania.
    UWAGA: Podane tutaj informacje odnoszą się do ogniw RPE-1. Liczba rund leczenia/otrząsania może się różnić w zależności od linii komórkowych. Aby uniknąć długotrwałego i niepotrzebnego narażenia na nokodazol, konieczne jest dokładne określenie, w eksperymencie pilotażowym, liczby rund wymaganych do skutecznego i całkowitego usunięcia aneuploidalnych komórek cyklicznych.
  7. Po 4 - 5 rundach leczenia/otrząsania nokodazolem (kroki 3.1 - 3.6), dodać 10 ml zwykłej pożywki wzrostowej i inkubować. Pozwól komórkom odpocząć przez 12 - 24 godziny przed przyszłą manipulacją lub użyciem testu.
    UWAGA: Po ostatecznym otrząśnięciu, komórki pozostające na płytce są zatrzymywane w cyklu komórkowym i, jak pokazano niedawno10, są siedliskiem złożonych kariotypów. Komórki te są określane jako komórki ArCK (Arrested with Complex Karyotype). Wskazane jest wykonanie testów na populacjach ArCK w ciągu tygodnia od izolacji.
  8. Opcjonalnie, aby ocenić procent zatrzymanych komórek ze złożonymi kariotypami, należy zebrać i policzyć komórki z każdego wstrząsu za pomocą standardowego licznika komórek.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Ogólny schemat metody zastosowanej do generowania i izolowania komórek aneuploidalnych o złożonym kariotypie (ArCK) i obrazach reprezentatywnych. (A) Schemat protokołu generowania i izolacji komórek ArCK. (B) Reprezentatywne obrazy komórek hTERT RPE-1 na każdym etapie leczenia. Ostatni panel (zaznaczony na czerwono) reprezentuje izolowane komórki ArCK. Podziałka 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Charakterystyka populacji ArCK

  1. Potwierdź pomyślną izolację populacji ArCK, wykonując następujące testy.
    1. Ocenia barwienie beta-galaktozydazą (marker starzenia) przy użyciu dostępnego w handlu zestawu (patrz tabela materiałów).
    2. Zmierz wydzielanie cytokin prozapalnych, takich jak CCL2, za pomocą dostępnych na rynku zestawów (patrz tabela materiałów).
    3. Potwierdź podwyższony poziom inhibitorów cyklu komórkowego p53, p21, p16 za pomocą Western Blot.
      UWAGA: Aby prawidłowo kontrolować te testy, populacje ArCK należy porównać zarówno z euploidalnymi, jak i aneuploidalnymi komórkami cyklicznymi. Pierwsza z nich to komórki hTERT RPE-1 o niskim pasażu, typu dzikiego, które rosną wykładniczo. Tę ostatnią można uzyskać poprzez indukcję błędnej segregacji chromosomów w RPE-1 hTERT i pobranie komórek 72 godziny po pierwszej nieprawidłowej mitozie. W tym celu należy postępować zgodnie z opisanym powyżej protokołem z kroku 1.1 i pobrać komórki tuż przed pierwszym leczeniem nokodazolem (krok 3.1).
  2. Wykonaj sekwencjonowanie pojedynczych komórek, aby ocenić kariotyp zatrzymanych komórek.
    UWAGA: Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest dobrze ugruntowaną metodą określania zmian chromosomowych i subchromosomalnych w populacji komórek na poziomie pojedynczej komórki13. Szczegółowe procedury dotyczące sekwencjonowania pojedynczych komórek można znaleźć gdzie indziej10.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda wykorzystuje system hodowli tkanek in vitro do izolowania komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, które hamują ich proliferację. Populacja ta jest określana jako komórki ArCK (Arrested with Complex Karyotypes). Rysunek 1A pokazuje schemat eksperymentu. Cykliczne komórki hTERT RPE-1 typu dzikiego są synchronizowane na granicy G1 / S z tymidyną i traktowane inhibitorem Mps1 w celu wywołania błędnej segregacji chromosomów. Trucizna wrzecionowata nokodazol jest dodawana do komórek 72 godziny po indukcji błędnej segregacji chromosomów. 12 godzin po leczeniu nokodazolem komórki aneuploidalne, które nadal są zdolne do namnażania się, wchodzą w mitozę i są uwięzione w tym etapie cyklu komórkowego z powodu interferencji polimeryzacji mikrotubul. Te uwięzione komórki są następnie łatwo usuwane przez delikatne strząsanie. Proces wytrząsania powtarza się 3 - 5 razy, aby zapewnić całkowite usunięcie komórek cyklicznych. Rysunek 1B pokazuje reprezentatywne obrazy komórek RPE-1 na każdym etapie leczenia.

Komórki ArCK wykazują podwyższony poziom inhibitorów cyklu komórkowego, takich jak p53, p21 i p16 w porównaniu do euploidalnych i aneuploidalnych komórek cyklicznych, jak pokazano na Rysunek 2A. Dodatkowo, Rysunek 2B pokazuje dodatnie barwienie β-galaktozydazą w komórkach ArCK w porównaniu z euploidalnymi komórkami kontrolnymi, dobrze znanym markerem starzenia się komórek.

figure-results-1
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki z wykorzystaniem komórek ArCK. (A) Western blot oceniający poziomy inhibitorów cyklu komórkowego w komórkach euploidalnych, aneuploidalnych i ArCK. Poziomy p53, p21 i p16 określono za pomocą analizy western blot. Aktyna służyła jako kontrola załadunku. (B) barwienie β-galaktozydazą oceniające poziom starzenia się komórek ArCK. Aktywność β-galaktozydazy (β-Gal) związaną ze starzeniem określono w komórkach euploidalnych i komórkach ArCK. Podziałka 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

To zatrzymanie cyklu komórkowego jest charakterystyczną cechą komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, jak pokazuje reprezentatywna analiza kariotypów z sekwencjonowania pojedynczych komórek w Rysunek 3, w którym komórki ArCK wykazują wiele, losowych przyrostów i strat chromosomów. To odkrycie jest w pełni zgodne z poprzednimi raportami10.

figure-results-2
Rysunek 3: Reprezentatywne sekwencjonowanie pojedynczych komórek ArCK. Wykresy segmentacji przedstawiające kariotyp sześciu reprezentatywnych komórek ArCK. Wykresy segmentacji pokazują liczbę kopii wszystkich chromosomów od 1 do X w stosunku do odniesienia euploidalnego w skali logarytmicznej2 (RPE-1 typu dzikiego to diploidalna linia komórkowa pochodzenia żeńskiego). Przyrosty chromosomów są zaznaczone na czerwono, a ubytki chromosomów na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta nowatorska metoda generowania i wzbogacania zatrzymanych komórek o złożonych kariotypach (ArCK) pozwala na badanie komórek, które mają wiele przyrostów lub strat chromosomów i przestają się dzielić. Konfiguracja metody została zaprojektowana tak, aby ułatwić izolację komórek ArCK w szybki i niezawodny sposób.

Najważniejszym krokiem w tym teście jest rygorystyczne kontrolowanie harmonogramu leczenia farmakologicznego i, co najważniejsze, usuwanie aneuploidalnych komórek cyklicznych. W celu uzyskania optymalnych wyników, czas leczenia nokodazolem i otrząśnięcia ma szczególne znaczenie, aby zapewnić, że komórki cykliczne są usuwane z płytki, gdy są jeszcze zaokrąglone i mitotyczne, zapobiegając możliwości śmierci komórki mitotycznej lub ześlizgnięcia się do G1, potencjalnie tworząc populację tetraploidalną. Nie zaleca się, aby czas wytrząsania odbiegał o więcej niż dwie godziny od zalecanej 12-godzinnej inkubacji nokodazolu.

Przyszłe badania nad komórkami ArCK mogą potencjalnie ułatwić głębsze zrozumienie, w jaki sposób złożone kariotypy wpływają na fizjologię komórki. W szczególności niedawne badanie wykazało, że komórki układu odpornościowego są zdolne do interakcji i wywoływania klirensu immunologicznego komórek ArCK10. Opisana tutaj metoda stanowi doskonały punkt wyjścia do dalszej charakterystyki komórek ArCK, w tym wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw klirensu immunologicznego w komórkach nieprzekształconych oraz zbadania, w jaki sposób transformacja onkogenna może ominąć ten mechanizm nadzoru, co jest kluczowym pytaniem w tej dziedzinie14,15.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Grant P30-CA 14051 od National Cancer Institute, przez National Institutes of Health Grant (CA206157-22 i GM118066) oraz Curt Marble Cancer Research Fund dla Angeliki Amon. Angelika Amon jest również badaczką w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa i Fundacji Glenna na rzecz Badań Biomedycznych. S. S. był wspierany przez Amerykańsko-Włoską Fundację na rzecz Walki z Rakiem (AICF), stypendium w dziedzinie badań nad rakiem od działań Marie Curie i Włoskiego Stowarzyszenia Badań nad Rakiem (AIRC) oraz przez stypendium KI Quinquennial Cancer Research Fellowship. E.M. był wspierany przez stypendium z Howard Hughes Medical Institute.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM (Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł Średni) Thermofisher11995-073
TymidynaSigma AldrichT1859
ReversineCayman Chemical Company10004412
NocodazoleSigma AldrichM1410
Przeciwciało anty-p53Santa Cruzsc-126
Przeciwciało anty-p21Santa Cruzsc-6246
Anty-p16 przeciwciałoBD554079
Starzenie się Zestaw do barwienia b-galaktozydazyTechnologia sygnalizacji komórkowej 9860
Zestaw macierzy cytokin ludzkich Proteome Profiler R& D SystemsARY005B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santaguida, S., Amon, A. Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).
  2. Pfau, S. J., Amon, A. Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man. EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).
  3. Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).
  4. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).
  5. Meena, J. K., Cerutti, A., et al. Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion. The EMBO Journal. , 1-14 (2015).
  6. Ohashi, A., Ohori, M., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668(2015).
  7. Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. The presence of extra chromosomes leads to genomic instability. Nature Communications. 7, 10754(2016).
  8. Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. Aneuploidy drives genomic instability in yeast. Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).
  9. Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast. PLoS Genetics. 8 (5), e1002719(2012).
  10. Santaguida, S., Richardson, A., et al. Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System. Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).
  11. Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation. Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).
  12. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  13. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
  14. López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes. Trends in cell biology. , 1-4 (2017).
  15. Watson, E. V., Elledge, S. J. Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown! Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle ArrestComplex KaryotypesAneuploid CellsThymidine SynchronizationMps1 InhibitorNocodazole TreatmentMitotic Shake offImmunoblot AnalysisSenescence Associated Beta GalactosidaseSegmentation Plots

Related Articles