Izolacja komórek tucznych pochodzących z otrzewnej i ich charakterystyka funkcjonalna za pomocą Ca2+-obrazowania i testów degranulacji

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek tucznych otrzewnej. Opisujemy również dwa protokoły ich funkcjonalnej charakterystyki: obrazowanie fluorescencyjne wewnątrzkomórkowego stężenia wolnego Ca^{2 +} oraz test degranulacji oparty na kolorymetrycznej ocenie ilościowej uwolnionej β-heksozaminidazy.

Streszczenie

Komórki tuczne (MC), jako część układu odpornościowego, odgrywają kluczową rolę w obronie gospodarza przed wieloma patogenami i w inicjowaniu alergicznej odpowiedzi immunologicznej. Aktywacja MC poprzez sieciowanie powierzchniowych IgE związanych z receptorem IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI), a także poprzez stymulację kilku innych receptorów, inicjuje wzrost wolnego wewnątrzkomórkowego poziomu Ca^{2 +} ([Ca^{2 +} ]_i), który sprzyja uwalnianiu mediatorów stanu zapalnego i alergicznego. Identyfikacja składników molekularnych zaangażowanych w te szlaki sygnałowe ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia regulacji funkcji MC. W tym artykule opisano protokół izolacji mysich MC typu tkanki łącznej poprzez płukanie otrzewnowe i hodowlę MC otrzewnej (PMC). Hodowle MC z różnych modeli myszy z nokautem za pomocą tej metodologii stanowią użyteczne podejście do identyfikacji białek zaangażowanych w szlaki sygnałowe MC. Ponadto opisujemy również protokół obrazowania Fura-2 pojedynczej komórki jako ważną technikę kwantyfikacji sygnalizacji Ca^{2 +} w MC. Monitorowanie [Ca^{2 +} ] _i oparte na fluorescencji jest wiarygodnym i powszechnie stosowanym podejściem do badania zdarzeń sygnalizacyjnych Ca^{2 +}, w tym wejścia wapnia w magazynie, które ma ogromne znaczenie dla aktywacji MC. Do analizy degranulacji MC opisujemy test uwalniania β-heksozaminidazy. Ilość β-heksozaminidazy uwolnionej do pożywki hodowlanej jest uważana za marker degranulacji dla wszystkich trzech różnych podzbiorów wydzielniczych opisanych w MCs. β-heksosaminidazę można łatwo określić ilościowo przez jej reakcję z substratem barwnikowym w teście kolorymetrycznym na płytce z mikromiareczkowaniem. Ta wysoce powtarzalna technika jest opłacalna i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Ogólnie rzecz biorąc, dostarczony protokół wykazuje wysoką wydajność MC wyrażających typowe markery powierzchniowe MC, wykazując typowe cechy morfologiczne i fenotypowe MC oraz wykazując wysoce powtarzalne odpowiedzi na sekretagogi w testach obrazowania Ca²⁺ i degranulacji.

Wprowadzenie

MCs odgrywają znaczącą rolę podczas wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych. W szczególności MC uczestniczą w zabijaniu patogenów, takich jak bakterie i pasożyty, a także rozkładają potencjalnie toksyczne endogenne peptydy lub składniki jadów (przegląd patrz Galli et al. 2008¹). Fizjologiczna rola MC w odporności wrodzonej i nabytej jest przedmiotem gorącej debaty. W związku z tym liczne rozbieżności w danych w badaniach przeprowadzonych na różnych modelach myszy z niedoborem MC wymagają systematycznej ponownej oceny funkcji immunologicznych MC poza alergią². Dojrzałe MC są najczęściej zlokalizowane w tkankach i narządach, takich jak skóra, płuca i jelita, i zwykle występują tylko w niewielkich ilościach we krwi. MC wywodzą się z prekursorów hematopoetycznych, takich jak progenitorzy MC, i kończą swoje różnicowanie i dojrzewanie w mikrośrodowiskach prawie wszystkich unaczynionych tkanek¹. Interleukina (IL)-3 pochodząca z limfocytów T selektywnie promuje żywotność, proliferację i różnicowanie pluripotencjalnej populacji mysich MC od ich hematopoetycznych przodków³. Czynnik komórek macierzystych (SCF) jest wytwarzany przez komórki strukturalne w tkankach i odgrywa kluczową rolę w rozwoju, przetrwaniu, migracji i funkcji MC⁴. Właściwości poszczególnych MC mogą się różnić w zależności od ich zdolności do syntezy i magazynowania różnych proteaz czy proteoglikanów. U myszy tak zwane MC typu tkanki łącznej różnią się od MC błony śluzowej na podstawie ich lokalizacji anatomicznej, morfologii oraz zawartości heparyny i proteaz⁵.

W MCs, wzrost wolnego cytozolu Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) jest niezbędny do degranulacji i produkcji eikozanoidów, a także do syntezy cytokin i aktywacji czynników transkrypcyjnych w odpowiedzi na antygen i różne sekretagogi⁶. Głównym celem tych bodźców jest fosfolipaza C, która hydrolizuje 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu do diacyloglicerolu (DAG) i 1,4,5-trifosforanu inozytolu. DAG aktywuje kinazę białkową C, a IP3 uwalnia jony^Ca2+ z retikulum endoplazmatycznego. Wyczerpywanie się tych zapasów aktywuje napływ Ca²⁺ przez kanały Ca²⁺ błony komórkowej, co prowadzi do wejścia wapnia przez magazyn (SOCE). Proces ten jest wywoływany poprzez interakcję czujnika Ca²⁺, cząsteczki interakcji zrębowej-1 (Stim1), w retikulum endoplazmatycznym z Orai1⁷, a także poprzez aktywację białek kanału przejściowego potencjału receptora kanonicznego (TRPC) (przegląd patrz Freichel i wsp. 2014⁸) w błonie plazmatycznej.

Aby zbadać fizjologiczną rolę tych kanałów, zazwyczaj stosuje się kilka podejść farmakologicznych (stosowanie blokerów kanałów) lub genetycznych. W tym drugim przypadku supresję ekspresji białka uzyskuje się poprzez celowanie w mRNA (knockdown) lub edycję genomowego DNA za pomocą globalnej lub specyficznej dla tkanki delecji klasy ⁹ eksonu kodującego podjednostkę tworzącą pory kanału (knockout). Dostępność blokera o wystarczającej swoistości dla tych kanałów jest ograniczona. Ponadto podejście knockdown wymaga starannej kontroli jego skuteczności za pomocą np. analizy Western blot i jest w wielu przypadkach utrudnione przez niedostępność specyficznych przeciwciał dla docelowego białka kanałowego. W związku z tym wykorzystanie modeli myszy z nokautem jest nadal uważane za złoty standard dla takiej analizy. Preferowanym modelem in vitro do badania funkcji MC jest hodowla PMC, które mogą być izolowane ex vivo jako w pełni dojrzała populacja (w przeciwieństwie do różnicowania MC in vitro od, np. komórek szpiku kostnego)¹⁰. W porównaniu z MC pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMMC), które są również powszechnie stosowane do badania funkcji MC in vitro, stymulacja FcεRI i uwalnianie beta-heksozaminidazy jest zwiększona odpowiednio 8-krotnie i 100-krotnie w PMC. W artykule opisano metodę izolacji i hodowli mysich PMC, która pozwala na uzyskanie po 2 tygodniach hodowli dużej liczby czystych MC typu tkanki łącznej, wystarczającej do dalszej analizy.

Pomimo niedawnego postępu w rozwoju i zastosowaniu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, ich użycie jest nadal ograniczone przez trudności w dostarczaniu genów do komórek docelowych, szczególnie w wysoce wyspecjalizowanych komórkach, takich jak MC hodowane pierwotnie. Ponadto w tej grupie wskaźników fluorescencyjnych do pomiarów [Ca²⁺]_i nadal brakuje barwników ratiometrycznych o wysokim zakresie dynamiki. Z tych powodów preferowaną metodą pomiaru ratiometrycznego [Ca²⁺]_i jest nadal użycie barwnika fluorescencyjnego "Fura-2"¹¹.

Obecnie, najczęściej stosowanym podejściem do oceny aktywacji i degranulacji MC jest pomiar aktywności β-heksosaminidazy. β-heksosaminidaza, mediator alergiczny, jest jednym ze składników granulek MC, który jest współuwalniany z histaminą w stałej proporcji z MCs¹². β-heksosaminidaza może być łatwo i dokładnie zmierzona poprzez jej reakcję z określonym substratem, który wytwarza mierzalną ilość produktu barwnikowego, która jest łatwo wykrywalna w teście kolorymetrycznym na mikropłytce. W artykule przedstawiono zastosowanie tej techniki do analizy degranulacji PMC w odpowiedzi na różnorodne bodźce.

Agregacja plazmalemalnego receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcɛRI) aktywuje w MCs wszechstronny wewnątrzkomórkowy szlak sygnałowy, prowadząc do uwolnienia zawartości granulek wydzielniczych w otaczającej przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Oprócz specyficznego antygenu, wiele innych bodźców może aktywować MC do uwalniania różnorodnego zestawu mediatorów immunomodulujących, takich jak anafilatoksyny dopełniacza (np. C3a i C5a)¹³, peptyd zwężający naczynia krwionośne endothelin 1 (ET1)¹⁴, a także liczne substancje kationowe i leki wywołujące reakcje pseudoalergiczne (np. ikatybant)¹⁵ poprzez wiązanie z MRGPRX2¹⁶. Wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe zaangażowane w degranulację MC indukowaną przez MRGPR są słabo scharakteryzowane w porównaniu z sygnalizacją wewnątrzkomórkową za pośrednictwem FcɛRI; Szlaki te zaczęły być intensywnie badane dopiero w ciągu ostatnich kilku lat¹⁷ po identyfikacji receptora¹⁶. W dużej mierze kanały jonowe błony komórkowej zaangażowane w wnikanie wapnia, a następnie stymulację MRGPRX2, pozostają do zrozumienia. W związku z tym w niniejszym artykule skupiono się również na wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej i degranulacji MC stymulowanych agonistami MRGPR.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckimi wytycznymi prawnymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (oficjalnie zatwierdzonymi przez radę regionalną Karlsruhe).

1. Izolacja i hodowla PMC za pomocą płukania dootrzewnowego

1 lód cyfra arabska Strzykawki 10 ml 3 Igły 27 G 4 Igły 20 G 5 Blok styropianowy i kołki 6 Probówki zbiorcze (plastikowe probówki wirówkowe 50 ml) 7 70% etanolu 8 RPMI Medium (wstępnie schłodzone i przechowywane na lodzie) 9 PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (płodowa surowica cielęca) + 1% roztwór penicyliny Streptomycyny (Pen-Strep) 10 Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco - DPBS (bez Ca²⁺ i Mg²⁺) 11 Kolby hodowlane (25 cm) 12 Roztwory podstawowe czynników wzrostu (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/ml) 13 Pipety serologiczne (10 ml) 14 Końcówki do pipet sterylne (20–200 μl) 15 Hemocytometr 16 Wirówka stołowa 17 Nożyczki i kleszcze Rozdział 18 Komora CO₂ dla myszy Rozdział 19 Otwarty sterylny kaptur 20 Zamknięty sterylny kaptur 21 Inkubator komórkowy (37 °C i 5% CO_{2 )} 22 Rozdział 22 Pipety transferowe (20–200 μl)

Tabela 1: Materiały do Kroku 1.

1. Izolacja PMC przez płukanie dootrzewnowe
   1. Przed izolacją komórek należy przygotować materiały wymienione w tabeli 1.
   2. Użyj 8 do 14 tygodniowych samców myszy do izolacji PMC. Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO₂ i potwierdź śmierć przez utratę odruchów. Spryskaj mysz 70% etanolem i przymocuj ją do bloku piankowego za pomocą szpilek (grzbietem do dołu). Usuń brzuszną skórę myszy za pomocą nożyczek o krawędziach. Unikać uszkodzenia jamy otrzewnej.
      UWAGA: Zazwyczaj używamy tego protokołu dla myszy z tłem genetycznym szczepu C57BL/6N.
   3. Wstrzyknąć 7 ml lodowatego podłoża RPMI i 5 ml powietrza do jamy otrzewnej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę 27 G. Ostrożnie wbić igłę w otrzewną i nie przebijać żadnych narządów. Użyj miejsca w okolicy tłuszczu najądrza, aby zmniejszyć ryzyko perforacji narządu.
   4. Po wstrzyknięciu należy potrząsać myszą przez 1 minutę, aby odłączyć komórki otrzewnej od podłoża RPMI. Nie potrząsaj myszą zbyt mocno, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych i zanieczyszczenia jamy otrzewnej krwią.
   5. Ponownie użyj strzykawki o pojemności 10 ml, wyposażając ją w nową kaniulę 20 G. Przesuń narządy wewnętrzne na jedną stronę, przechylając blok piankowy i delikatnie stukając nim o ławkę, aby ułatwić aspirację podłoża z drugiej strony. Włóż igłę 20 G, delikatnie i powoli odessaj płyn z jamy brzusznej (~0,5 ml/s), aby uniknąć zatkania przez narządy wewnętrzne. Zbierz jak najwięcej płynu (zwykle 5–6 ml).
   6. Wyjąć igłę ze strzykawki i przenieść zawiesinę pobranych komórek do probówki zbiorczej na lodzie. Wyrzuć probówkę z próbką, jeśli widoczne jest zanieczyszczenie krwi.
   7. Odwirować probówki z zawiesiną komórek o sile ~300 x g przez 5 min. Pod sterylnym kapturem odessać supernatant. Dla każdej myszy połączyć osadki próbki w 4 ml zimnego (4–10 °C) podłoża PMC i przenieść zawiesinę komórek do kolby hodowlanej o średnicy 25 cm². Dodać czynniki wzrostu IL-3 i SCF do końcowych stężeń odpowiednio 10 ng/ml i 30 ng/ml. Umieścić kolbę zawierającą komórki w inkubatorze (37 °C i 5% CO₂ ) i inkubować przez ~48 godzin do następnego zabiegu.
2. Kultura PMC
   1. Dzień 2 (~48 h po izolacji): Zmiana podłoża
      1. Aby usunąć komórki sklarowane nad osadem i nieprzylegające (erytrocyty i martwe komórki), należy odessać pożywkę z kolby, umieszczając końcówkę pipety Pasteura na krawędzi kolby i trzymając kolbę prawie poziomo. Dodaj 4 ml wstępnie podgrzanego podłoża PMC Medium na mysz. Dodać czynniki wzrostu IL-3 (10 ng/ml) i SCF (30 ng/ml). Umieścić kolbę zawierającą komórki w inkubatorze (37 °C i 5% CO₂ ).
   2. Dzień 9: Podział komórek
      1. Przenieść zawiesinę komórkową z kolby do hodowli komórkowej do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przemyć kolbę trzykrotnie 10 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco, zbierając zawiesinę komórkową wraz z odłączonymi komórkami do tej samej probówki wirówkowej z tworzywa sztucznego o pojemności 50 ml. Policz stężenie komórek za pomocą hemocytometru i oblicz całkowitą liczbę komórek.
      2. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu ~300 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Odzyskać osad we wstępnie podgrzanym podłożu PMC (37 °C), aby uzyskać stężenie komórek 1 x 10⁶ komórek/ml. Przenieść zawiesinę komórek do nowej kolby hodowlanej o średnicy 25^cm2. Wyrzuć starą kolbę z fibroblastami przylegającymi do dna.
      3. Dodać czynniki wzrostu IL-3 (10 ng/ml) i SCF (30 ng/ml) i umieścić kolbę zawierającą komórki w inkubatorze (37 °C i 5%_CO2).
   3. Dni 12–15: Pomiary komórek
      1. Jeśli planowane są jakiekolwiek eksperymenty ze stymulacją receptorów FcɛRI, należy wstępnie potraktować komórki przez noc 300 ng / ml IgE anty-DNP w standardowej pożywce hodowlanej. Przejdź do kroku 2 lub kroku 3.

2. Fluorometryczny wewnątrzkomórkowy pomiar stężenia wolnego wapnia w PMC

1. Przed przystąpieniem do pomiarów należy przygotować materiały wymienione w tabeli 2. Przygotuj również zestaw do obrazowania składający się z: odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego; Obiektyw: 40x/1,3 oleju; Fura 2 Zestaw filtrów; Kamera CCD; źródło światła wzbudzenia; Program akwizycji obrazowania; System aplikacji roztworu zasilanego grawitacyjnie.

1 PMC (12–15 dni) 1 x 10⁶ komórek/ml cyfra arabska Konkanawalina A 3 Fura-2 w nocy 4 Pluronic F-127 20% roztwór 5 Szkiełka nakrywkowe okrągłe; ø 25 mm; Nr 1 6 DNP-HSA (dinitrophenol-albumina surowicy ludzkiej) roztwór podstawowy 7 Roztwór podstawowy przeciwciała anty-DNP (IgE) 8 Płaska płyta denna (12 dołków) 9 Związek 48/80 roztwór podstawowy 10 Przykryj studzienki obrazowania 11 Hemocytometr 12 Pipety transferowe (20–200 μl)

Tabela 2: Materiały do Kroku 2.

2. Preparat do obrazowania Fura-2
   1. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek do 1 x 10⁶ komórek/ml. Podzielić kolonie PMC, delikatnie pipetując (3-5 razy) zawiesinę komórek za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
   2. Przygotować buforowany roztwór soli HEPES zawierający Ca²⁺ (Ca²⁺-HBSS) składający się ze 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES i 12 mM glukozy. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 3 M NaOH.
   3. Przygotować szkiełka powleczone konkanawaliną A, odpipetowując 1 kroplę roztworu konkanawaliny A (0,1 mg/ml w_H2O) na każde okrągłe szkło nakrywkowe o średnicy 25 mm pod sterylnym kapturem. Pozostaw krople na szkiełkach nakrywkowych na co najmniej 1 minutę, a następnie usuń większość roztworu za pomocą pipety i pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu przez 45 minut. Ostrożnie dociśnij szkiełka nakrywkowe nasączone konkanawaliną A do gumowej komory obrazowania (patrz Tabela materiałów), aż się zamocują, aby uzyskać komory do obrazowania mikroskopowego.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować prowadnice pokryte poli-L-lizyną.
   4. Rozpuść fluorescencyjny barwnik Ca²⁺ Fura-2 AM (1 mM) w dimetylosulfotlenku (DMSO). Roztwór należy przechowywać w bezpiecznym miejscu.
   5. Rozcieńczyć roztwór podstawowy Fura-2 AM w Ca²⁺-HBSS do końcowego stężenia 5 μM w celu przygotowania "buforu ładującego". Uzupełnij 5 μL/ml 20% pluronu F-127 w DMSO.
   6. Zmieszać 500 μl "buforu ładującego" z 500 μl zawiesiny komórek PMC. Odpipetować mieszaninę do komory obrazowania i inkubować komórki przez 20–30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
   7. Skonfiguruj system aplikacji zasilany grawitacyjnie z różnymi roztworami zgodnie z protokołem stymulacji. Strzykawka uzupełniająca 1 z 40 ml roztworu Ca²⁺-HBSS, strzykawka 2 z 40 ml roztworu Ca²⁺-HBSS zawierającego 100 ng/ml DNP, strzykawka 3 z 40 ml roztworu Ca²⁺-HBSS zawierającego 50 μg/ml związku 48/80, strzykawka 4 z 40 ml nominalnie wolnego od Ca²⁺-roztworu HBSS i strzykawka 5 z 40 ml nominalnie Ca²+-wolnego roztworu HBSS zawierającego 2 μM Thapsigargin.
   8. Przygotuj 40-krotny obiektyw immersyjny z olejkiem o dużej aperturze, umieszczając na nim małą kroplę olejku immersyjnego.
   9. Zamontuj system aplikacji na stoliku mikroskopu odwróconego. Umieść komorę obrazowania z załadowanymi komórkami w systemie aplikacyjnym i zabezpiecz ją, aby zapobiec przesuwaniu się podczas nagrywania. Włącz przechodzące światło i skup komórki.
   10. Przepłukać komórki trzykrotnie buforem Ca^{2 +} -HBSS za pomocą grawitacyjnego systemu aplikacyjnego.
   11. Inkubować komórki w Ca²⁺-HBSS przez 5 minut w celu deestryfikacji Fura-2 AM.
   12. Przed rozpoczęciem obrazowania przepłucz komórki jeszcze raz, aby usunąć ewentualny wyciek barwnika fluorescencyjnego.
3. Obrazowanie komórek
   1. Uruchom program akwizycji obrazowania w trybie akwizycji fizjologicznej. Otwórz okno ustawień i dostosuj ostrość i optymalny czas akwizycji (który powinien być taki sam dla wzbudzenia przy 340 nm i 380 nm i zwykle mieści się w zakresie 50–150 ms).
      UWAGA: Zminimalizuj ekspozycję ogniwa załadowanego Fura-2 na jakiekolwiek światło, aby uniknąć fotowybielania barwnika.
   2. Zobrazuj obraz referencyjny i oznacz komórki jako obszary zainteresowania (ROI). Zaznacz ostatni zwrot akcji w obszarze, w którym nie ma żadnych komórek, i zdefiniuj go jako tło.
   3. Zakończ konfigurację i rozpocznij pomiar z szybkością akwizycji 5 s.
      UWAGA: Ogniwa będą naprzemiennie oświetlane światłem wzbudzającym o długości fali 340 nm i 380 nm, a wyemitowana fluorescencja (>510 nm) zostanie zebrana za pomocą kamery CCD. Obrazy sygnałów fluorescencyjnych F340 nm i F380 nm oraz stosunek (F340 nm/F380 nm) zostaną wyświetlone w trzech oknach. Wykresy przebiegu w czasie poszczególnych średnich wartości intensywności fluorescencji ROI będą również wyświetlane w sposób ciągły.
   4. Dodaj roztwory o odpowiednim numerze cyklu zgodnie z projektem eksperymentu:
      1. Aby zmierzyć wywołane antygenem zwiększenie [Ca^{2 +}] _i, jak pokazano na Rysunek 2A, 2B, nałóż roztwór strzykawki 2 po cyklu 20 i przestań rejestrować po cyklu 150.
      2. Aby zmierzyć indukowane związkiem 48/80 podwyższenie [Ca^{2 +}] _i, jak pokazano na Rysunek 2C, nałóż roztwór strzykawki 3 po cyklu 20 i przestań rejestrować po cyklu 150.
      3. Aby zmierzyć uniesienie [Ca^{2 +}] _i wywołane przez SOCE, jak pokazano na Rysunek 2D, nałóż roztwór strzykawki 4 po 10 cyklu, nałóż roztwór strzykawki 5 po cyklu 70, nałóż roztwór strzykawki 4 po cyklu 120, nałóż roztwór strzykawki 1 po cyklu 150 i przestań nagrywać po cyklu 220.
   5. Po zakończeniu pomiaru przekształć wyniki w tabelę wskaźników zawierającą zmierzone intensywności dla obu długości fal wzbudzenia z korekcją tła i bez niej, a także wartości współczynników z korekcją tła i bez niej dla każdego ROI i każdego punktu czasowego pomiaru. W programie akwizycyjnym naciskaj kolejno przyciski: "rozpocznij frez", "zaznacz wszystko", "przelicz wszystko", "pomiary fizjologiczne", "Ok, "Ok". Zapisz pliki jako tabele i stosy obrazów do analizy off-line.

3. Pomiar uwalniania beta-heksosaminidazy w PMC

1 PMC (12–15 dni) 1 x 10⁶ komórek/ml cyfra arabska Roztwór podstawowy przeciwciała anty-DNP (IgE) 3 Roztwór podstawowy DNP-HSA 4 Związek 48/80 roztwór podstawowy 5 Jonomycyna 6 Płytka 96-dołkowa, dno w kształcie litery V 7 Płytki 96-dołkowe, płaskie dno 8 Probówki wirówkowe z tworzywa sztucznego (15 ml) 9 Pipety serologiczne 10 Inkubator komórkowy (37 °C i 5% CO_{2 )} 11 Wirówka stołowa 12 Czytnik płytek mikromiareczkowych do pomiarów gęstości optycznej 13 Pipeta wielokanałowa (20–200 μl) 14 Hemocytometr

Tabela 3: Materiały do Kroku 3.

1. Przed pomiarami należy przygotować materiały wymienione w tabeli 3.
   UWAGA: β-heksozaminidaza uwalniana z MC po ich stymulacji hydrolizuje p-nitrofenylo-acetylo-D-glukozaminę (pNAG) do p-nitrofenolu i N-acetylo-D-glukozaminy. Ilość β-heksozaminidazy w próbce jest proporcjonalna do ilości p-nitrofenolu, który zostanie utworzony. W środowisku o wysokim pH "Stop Solution" p-nitrofenol występuje jako całkowicie zdeprotonowany p-nitrofenolat i można go wykryć na podstawie absorbancji światła przy 405 nm.
2. Przygotuj roztwór Tyrode'a zawierający 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 5,6 mM glukozy i BSA 0,1%. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 3 M NaOH.
3. Przygotuj roztwór do lizy, dodając 1% objętości Triton X-100 do roztworu Tyrode.
4. Przygotować roztwór zatrzymujący składający się z 200 mM glicyny i dostosować pH do 10,7 za pomocą NaOH.
5. Przygotować roztwór pNAG (4-nitrofenylo 2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozyd), rozpuszczając pNAG w 0,4 M kwasie cytrynowym do końcowego stężenia 4 mM.
6. Oblicz ilość komórek potrzebnych do testu (wykonaj test w dwóch egzemplarzach). Użyj 200 000 PMC na dołek. Użyj 2 studzienek jako kontroli ujemnych (roztwór Tyrode'a bez żadnych substancji wydzielających, takich jak DNP lub związek 48/80) i 2 studzienek jako kontroli dodatnich (roztwór Tyrode'a z 10 μM jonomycyną) dla każdego genotypu.
7. Przenieść komórki do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, dostosować objętość do 15 ml roztworem Tyrode'a i odwirować przy 200 x g przez 4 minuty. Usunąć supernatant za pomocą pipety Pasteura i ponownie zawiesić komórki w roztworze Tyrode'a do 2 x 10 6 komórek/ml.
8. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Dodać 25 μl roztworu stymulującego lub kontrolnego do każdej studzienki (zgodnie ze schematem pipetowania zilustrowanym na Rysunek 3A). Inkubować komórki przez 45 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
9. Zatrzymaj reakcję, umieszczając 96-dołkową płytkę na lodzie na 5 minut. Następnie odwirować płytkę w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 120 x g. Przenieść 120 μl supernatantu za pomocą pipety wielokanałowej na płaskodenną 96-dołkową płytkę i umieścić ją na lodzie. Ostrożnie unikaj dotykania osadów komórkowych, ale całkowicie zasysaj supernatant.
10. Dodać 125 μl buforu do lizy do granulek komórek. Inkubować granulki komórkowe przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić je po inkubacji przez wielokrotne pipetowanie (około 5 razy).
11. Odpipetować 25 μl roztworu pNAG (4 mM) do wymaganych studzienek nowej płaskodennej 96-dołkowej płytki. Dodać 25 μl z każdego supernatantu do przygotowanego roztworu pNAG, a także 25 μl każdego lizatu komórkowego.
12. Inkubować partie reakcyjne przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Po inkubacji odpipetować 150 μl roztworu zatrzymującego do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję.
13. Przeanalizuj płytkę za pomocą czytnika mikropłytek, używając ustawienia podwójnej długości fali na 405 nm z odniesieniem 630 nm w celu automatycznego odejmowania tła. W programie akwizycji należy zaznaczyć pole "Odniesienie" i w menu elementu programu "Absorbancja" wybrać z listy rozwijanej "630 nm". Jeżeli gęstość optyczna próbek jest zbyt wysoka, należy przygotować odpowiednie rozcieńczenie sondy przed ponownym pomiarem.
14. Obliczyć procentowe uwalnianie β-heksozaminidazy zgodnie z następującym równaniem:
    
    gdzie Uwalnianie [%] jest procentem swoistego uwalniania beta-heksozaminidazy, A[supernatant] jest absorpcją supernatantu skorygowaną w tle, a A[lizat] jest skorygowaną absorpcją odpowiedniego lizatu komórkowego.

Wyniki

PMC zostały wyizolowane od 3 myszy typu dzikiego (C57BL/6N) przez płukanie dootrzewnowe i dalej hodowane w pożywce RPMI uzupełnionej 20% FCS i 1% Pen-Strep w obecności czynników wzrostu (IL-3 w stężeniu 10 ng/ml i SCF w stężeniu 30 ng/ml) w sterylnych, wilgotnych warunkach w temperaturze 37 °C i 5% CO₂. Pożywka została zmieniona w 2 i 9 dniu po izolacji komórek. Morfologię komórki analizowano za pomocą obrazowania DIC w świetle transmisyjnym (patrz Rysunek 1...

Dyskusja

Modele MC mogą być z powodzeniem wykorzystywane do badania degranulacji MC, chemotaksji, adhezji, a także do wyjaśnienia wewnątrzkomórkowych szlaków transdukcji sygnałowych zaangażowanych w aktywację MC. Niektórzy badacze używają ludzkich modeli MC, takich jak unieśmiertelnione linie (LAD2 i HMC1) lub ludzkie MC pochodzące z komórek progenitorowych krwi pępowinowej (CD133+) i komórek progenitorowych krwi obwodowej (CD34+). Inni preferują modele MC gryzoni, takie jak modele unieśmiertelnione (linia RBL-2H3 MC białaczki ba...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI Medium	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R& D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Przeciwciało anty-DNP Sigma-Aldrich	A6661
	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
Compound 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy glikol	Sigma-Aldrich	X100
4-nitrofenylo 2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozyd	Sigma-Aldrich	N9376
Komora obrazowania	CoverWell Sigma-Aldrich	GBL635051
96-dołkowa płytka, dno w kształcie litery V	Corning	3896
96-dołkowe płytki, płaskie dno	Greiner Bio-One	655180
Czytnik płytek mikromiareczkowych z oprogramowaniem "i-control"	Tecan	Nano Quant, nieskończony M200 Pro
Płaska płyta dolna	Greiner Bio-One	655180
Ionomycyna	Sigma-Aldrich	I9657
50 ml Plastikowe probówki wirówkowe	Sarstedt	62.547.254
Kolby hodowlane (25 cm)	Greiner Bio-One	69160
Szkiełka nakrywkowe okrągłe; ø 25 mm; Nr 1	Menzel	CB00250RA1
Hemocytometr	VWR	631-0696
Mikroskop odwrócony	Zeiss	Observer Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil	Zestaw filtrów Zeiss	440260-9900
HC Fura 2	Kamera CCD AHF	H76-521
	Zeiss	AxioCam MRm
Monochromatyczne źródło światła	Sutter Instruments	Lambda DG-4
	Zeiss	AxioVision 4.8.2
System aplikacji roztworu zasilanego grawitacyjnie	Wykonane na zamówienie	4-kanałowe
plastikowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml	Sarstedt	62,554,502
Wirówka stołowa	Heraeus	Megafuge 1.0R