Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek tucznych pochodzących z otrzewnej i ich charakterystyka funkcjonalna za pomocą Ca2+-obrazowania i testów degranulacji

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57222

⸱

4 lipca 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology, Ruprecht-Karls Heidelberg University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek tucznych otrzewnej. Opisujemy również dwa protokoły ich funkcjonalnej charakterystyki: obrazowanie fluorescencyjne wewnątrzkomórkowego stężenia wolnego Ca2 + oraz test degranulacji oparty na kolorymetrycznej ocenie ilościowej uwolnionej β-heksozaminidazy.

Streszczenie

Komórki tuczne (MC), jako część układu odpornościowego, odgrywają kluczową rolę w obronie gospodarza przed wieloma patogenami i w inicjowaniu alergicznej odpowiedzi immunologicznej. Aktywacja MC poprzez sieciowanie powierzchniowych IgE związanych z receptorem IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI), a także poprzez stymulację kilku innych receptorów, inicjuje wzrost wolnego wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2 + ([Ca2 + ]i), który sprzyja uwalnianiu mediatorów stanu zapalnego i alergicznego. Identyfikacja składników molekularnych zaangażowanych w te szlaki sygnałowe ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia regulacji funkcji MC. W tym artykule opisano protokół izolacji mysich MC typu tkanki łącznej poprzez płukanie otrzewnowe i hodowlę MC otrzewnej (PMC). Hodowle MC z różnych modeli myszy z nokautem za pomocą tej metodologii stanowią użyteczne podejście do identyfikacji białek zaangażowanych w szlaki sygnałowe MC. Ponadto opisujemy również protokół obrazowania Fura-2 pojedynczej komórki jako ważną technikę kwantyfikacji sygnalizacji Ca2 + w MC. Monitorowanie [Ca2 + ] i oparte na fluorescencji jest wiarygodnym i powszechnie stosowanym podejściem do badania zdarzeń sygnalizacyjnych Ca2 +, w tym wejścia wapnia w magazynie, które ma ogromne znaczenie dla aktywacji MC. Do analizy degranulacji MC opisujemy test uwalniania β-heksozaminidazy. Ilość β-heksozaminidazy uwolnionej do pożywki hodowlanej jest uważana za marker degranulacji dla wszystkich trzech różnych podzbiorów wydzielniczych opisanych w MCs. β-heksosaminidazę można łatwo określić ilościowo przez jej reakcję z substratem barwnikowym w teście kolorymetrycznym na płytce z mikromiareczkowaniem. Ta wysoce powtarzalna technika jest opłacalna i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Ogólnie rzecz biorąc, dostarczony protokół wykazuje wysoką wydajność MC wyrażających typowe markery powierzchniowe MC, wykazując typowe cechy morfologiczne i fenotypowe MC oraz wykazując wysoce powtarzalne odpowiedzi na sekretagogi w testach obrazowania Ca2+ i degranulacji.

Wprowadzenie

MCs odgrywają znaczącą rolę podczas wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych. W szczególności MC uczestniczą w zabijaniu patogenów, takich jak bakterie i pasożyty, a także rozkładają potencjalnie toksyczne endogenne peptydy lub składniki jadów (przegląd patrz Galli et al. 20081). Fizjologiczna rola MC w odporności wrodzonej i nabytej jest przedmiotem gorącej debaty. W związku z tym liczne rozbieżności w danych w badaniach przeprowadzonych na różnych modelach myszy z niedoborem MC wymagają systematycznej ponownej oceny funkcji immunologicznych MC poza alergią2. Dojrzałe MC są najczęściej zlokalizowane w tkankach i narządach, takich jak skóra, płuca i jelita, i zwykle występują tylko w niewielkich ilościach we krwi. MC wywodzą się z prekursorów hematopoetycznych, takich jak progenitorzy MC, i kończą swoje różnicowanie i dojrzewanie w mikrośrodowiskach prawie wszystkich unaczynionych tkanek1. Interleukina (IL)-3 pochodząca z limfocytów T selektywnie promuje żywotność, proliferację i różnicowanie pluripotencjalnej populacji mysich MC od ich hematopoetycznych przodków3. Czynnik komórek macierzystych (SCF) jest wytwarzany przez komórki strukturalne w tkankach i odgrywa kluczową rolę w rozwoju, przetrwaniu, migracji i funkcji MC4. Właściwości poszczególnych MC mogą się różnić w zależności od ich zdolności do syntezy i magazynowania różnych proteaz czy proteoglikanów. U myszy tak zwane MC typu tkanki łącznej różnią się od MC błony śluzowej na podstawie ich lokalizacji anatomicznej, morfologii oraz zawartości heparyny i proteaz5.

W MCs, wzrost wolnego cytozolu Ca2+ ([Ca2+]i) jest niezbędny do degranulacji i produkcji eikozanoidów, a także do syntezy cytokin i aktywacji czynników transkrypcyjnych w odpowiedzi na antygen i różne sekretagogi6. Głównym celem tych bodźców jest fosfolipaza C, która hydrolizuje 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu do diacyloglicerolu (DAG) i 1,4,5-trifosforanu inozytolu. DAG aktywuje kinazę białkową C, a IP3 uwalnia jonyCa2+ z retikulum endoplazmatycznego. Wyczerpywanie się tych zapasów aktywuje napływ Ca2+ przez kanały Ca2+ błony komórkowej, co prowadzi do wejścia wapnia przez magazyn (SOCE). Proces ten jest wywoływany poprzez interakcję czujnika Ca2+, cząsteczki interakcji zrębowej-1 (Stim1), w retikulum endoplazmatycznym z Orai17, a także poprzez aktywację białek kanału przejściowego potencjału receptora kanonicznego (TRPC) (przegląd patrz Freichel i wsp. 20148) w błonie plazmatycznej.

Aby zbadać fizjologiczną rolę tych kanałów, zazwyczaj stosuje się kilka podejść farmakologicznych (stosowanie blokerów kanałów) lub genetycznych. W tym drugim przypadku supresję ekspresji białka uzyskuje się poprzez celowanie w mRNA (knockdown) lub edycję genomowego DNA za pomocą globalnej lub specyficznej dla tkanki delecji klasy 9 eksonu kodującego podjednostkę tworzącą pory kanału (knockout). Dostępność blokera o wystarczającej swoistości dla tych kanałów jest ograniczona. Ponadto podejście knockdown wymaga starannej kontroli jego skuteczności za pomocą np. analizy Western blot i jest w wielu przypadkach utrudnione przez niedostępność specyficznych przeciwciał dla docelowego białka kanałowego. W związku z tym wykorzystanie modeli myszy z nokautem jest nadal uważane za złoty standard dla takiej analizy. Preferowanym modelem in vitro do badania funkcji MC jest hodowla PMC, które mogą być izolowane ex vivo jako w pełni dojrzała populacja (w przeciwieństwie do różnicowania MC in vitro od, np. komórek szpiku kostnego)10. W porównaniu z MC pochodzącymi ze szpiku kostnego (BMMC), które są również powszechnie stosowane do badania funkcji MC in vitro, stymulacja FcεRI i uwalnianie beta-heksozaminidazy jest zwiększona odpowiednio 8-krotnie i 100-krotnie w PMC. W artykule opisano metodę izolacji i hodowli mysich PMC, która pozwala na uzyskanie po 2 tygodniach hodowli dużej liczby czystych MC typu tkanki łącznej, wystarczającej do dalszej analizy.

Pomimo niedawnego postępu w rozwoju i zastosowaniu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, ich użycie jest nadal ograniczone przez trudności w dostarczaniu genów do komórek docelowych, szczególnie w wysoce wyspecjalizowanych komórkach, takich jak MC hodowane pierwotnie. Ponadto w tej grupie wskaźników fluorescencyjnych do pomiarów [Ca2+]i nadal brakuje barwników ratiometrycznych o wysokim zakresie dynamiki. Z tych powodów preferowaną metodą pomiaru ratiometrycznego [Ca2+]i jest nadal użycie barwnika fluorescencyjnego "Fura-2"11.

Obecnie, najczęściej stosowanym podejściem do oceny aktywacji i degranulacji MC jest pomiar aktywności β-heksosaminidazy. β-heksosaminidaza, mediator alergiczny, jest jednym ze składników granulek MC, który jest współuwalniany z histaminą w stałej proporcji z MCs12. β-heksosaminidaza może być łatwo i dokładnie zmierzona poprzez jej reakcję z określonym substratem, który wytwarza mierzalną ilość produktu barwnikowego, która jest łatwo wykrywalna w teście kolorymetrycznym na mikropłytce. W artykule przedstawiono zastosowanie tej techniki do analizy degranulacji PMC w odpowiedzi na różnorodne bodźce.

Agregacja plazmalemalnego receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcɛRI) aktywuje w MCs wszechstronny wewnątrzkomórkowy szlak sygnałowy, prowadząc do uwolnienia zawartości granulek wydzielniczych w otaczającej przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Oprócz specyficznego antygenu, wiele innych bodźców może aktywować MC do uwalniania różnorodnego zestawu mediatorów immunomodulujących, takich jak anafilatoksyny dopełniacza (np. C3a i C5a)13, peptyd zwężający naczynia krwionośne endothelin 1 (ET1)14, a także liczne substancje kationowe i leki wywołujące reakcje pseudoalergiczne (np. ikatybant)15 poprzez wiązanie z MRGPRX216. Wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe zaangażowane w degranulację MC indukowaną przez MRGPR są słabo scharakteryzowane w porównaniu z sygnalizacją wewnątrzkomórkową za pośrednictwem FcɛRI; Szlaki te zaczęły być intensywnie badane dopiero w ciągu ostatnich kilku lat17 po identyfikacji receptora16. W dużej mierze kanały jonowe błony komórkowej zaangażowane w wnikanie wapnia, a następnie stymulację MRGPRX2, pozostają do zrozumienia. W związku z tym w niniejszym artykule skupiono się również na wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej i degranulacji MC stymulowanych agonistami MRGPR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi niemieckiego ustawodawstwa dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (oficjalnie zatwierdzonymi przez radę regionalną Karlsruhe).

1. Izolacja i hodowla PMC poprzez płukanie otrzewnowe

1Lód
2strzykawki 10 ml
3igły 27 G
4igły 20 G
5Blok styropianowy i piny
6Probówki do pobierania (plastikowe probówki wirówkowe 50 ml)
770% etanol
8Pożywka RPMI (wstępnie schłodzona i przechowywana w lodzie)
9Pożywka PMC: pożywka RPMI + 20% FCS (płodowa surowica cielęca) + 1% roztwór penicyliny i streptomycyny (Pen-Strep)
10Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym Dulbecco – DPBS (bez Ca2+)2+ oraz Mg2+)
11Kolby hodowlane (25 cm)
12Roztwory stokowe czynników wzrostu (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2.5 μg/mL)
13Pipety serologiczne (10 ml)
14Sterylne końcówki do pipet (20–200 µL)
15Komora licznikowa (hemocytometr)
16Wirówka laboratoryjna nakładkowa
17Nożyczki i pęsety
18Tlenek węgla2 komora dla myszy
19Otwórz komorę sterylnego dygestorium
20Zamknięta komora sterylna
21Inkubator do hodowli komórek (37 °C oraz 5% CO22)
22Pipety transferowe (20–200 µL)

Tabela 1: Materiały do kroku 1.

  1. Izolacja PMC poprzez płukanie otrzewnowe
    1. Przed izolacją komórek należy przygotować materiały wymienione w Tabeli 1.
    2. Do izolacji PMC należy użyć samców myszy w wieku od 8 do 14 tygodni. Mysz należy uśmiercić poprzez inhalację CO2 i potwierdzić zgon poprzez utratę odruchów. Mysz należy spryskać 70% etanolem i przymocować do bloku piankowego za pomocą szpilek (grzbietem do dołu). Za pomocą nożyczek z tępym końcem należy usunąć skórę z brzusznej strony myszy. Należy unikać uszkodzenia jamy otrzewnej.
      UWAGA: Ten protokół stosujemy zazwyczaj dla myszy o tle genetycznym szczepu C57BL/6N.
    3. Do jamy otrzewnej należy wstrzyknąć 7 mL schłodzonego medium RPMI oraz 5 ml powietrza, używając strzykawki 10 mL wyposażonej w igłę 27 G. Igłę należy ostrożnie wprowadzić do otrzewnej, nie perforując żadnych narządów. W celu zmniejszenia ryzyka perforacji narządów należy wybrać miejsce w obrębie tkanki tłuszczowej nadjajowodowej.
    4. Po wstrzyknięciu należy wstrząsać myszą przez 1 min, aby odłączyć komórki otrzewne do medium RPMI. Nie należy wstrząsać myszą zbyt mocno, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych i zanieczyszczenia jamy otrzewnej krwią.
    5. Należy ponownie użyć strzykawki 10 mL, wyposażając ją w nową kaniulę 20 G. Przesunąć narządy wewnętrzne na jedną stronę poprzez przechylenie bloku piankowego i delikatne opukanie go o blat, aby ułatwić aspirację medium z drugiej strony. Wprowadzić igłę 20 G ściętym końcem do góry i delikatnie oraz powoli (~0,5 mL/s) aspirować płyn z jamy brzusznej, aby uniknąć zablokowania igły przez narządy wewnętrzne. Należy zebrać jak najwięcej płynu (zazwyczaj 5–6 mL).
    6. Wyjąć igłę ze strzykawki i przenieść zebraną zawiesinę komórkową do probówki zbiorczej w lodzie. Probówkę z próbką należy odrzucić, jeśli widoczne jest zanieczyszczenie krwią.
    7. Probówki z zawiesiną komórkową wirować przy ~300 x g przez 5 min. W sterylnej komorze laminarnej odessać nadsącz. Dla każdej myszy połączyć osady komórkowe w 4 mL zimnego (4–10 °C) Medium PMC i przenieść zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej 25 cm2. Dodać czynniki wzrostu IL-3 i SCF do stężeń końcowych odpowiednio 10 ng/mL i 30 ng/mL. Kolbę z komórkami umieścić w inkubatorze (37 °C i 5% CO2) i inkubować przez ~48 h do czasu kolejnej procedury.
  2. Kultura PMC
    1. Dzień 2 (~48 h po izolacji): Wymiana medium
      1. Aby usunąć nadsącz i komórki nieprzylegające (erytrocyty i martwe komórki), należy odessać medium z kolby, umieszczając końcówkę pipety Pasteura przy krawędzi kolby i trzymając kolbę prawie poziomo. Dodać 4 mL podgrzanego Medium PMC na każdą mysz. Dodać czynniki wzrostu IL-3 (10 ng/mL) i SCF (30 ng/mL). Kolbę z komórkami umieścić w inkubatorze (37 °C i 5% CO2).
    2. Dzień 9: Pasaż komórek
      1. Przenieść zawiesinę komórkową z kolby do hodowli komórek do plastikowej probówki wirówkowej 50 mL. Przepłukać kolbę trzy razy 10 mL podgrzanym (37 °C) solą fizjologiczną z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS), zbierając zawiesinę z odłączonymi komórkami do tej samej plastikowej probówki wirówkowej 50 mL. Oznaczyć stężenie komórek za pomocą hemocytometru i obliczyć całkowitą liczbę komórek.
      2. Zawiesinę komórkową wirować przy ~300 x g przez 5 min i odessać nadsącz. Resuspender osad w podgrzanym Medium PMC (37 °C), aby uzyskać stężenie komórek 1 x 106 komórek/mL. Przenieść zawiesinę komórkową do nowej kolby hodowlanej 25 cm2. Starą kolbę z przylegającymi do dna fibroblastami należy odrzucić.
      3. Dodać czynniki wzrostu IL-3 (10 ng/mL) i SCF (30 ng/mL) i umieścić kolbę z komórkami w inkubatorze (37 °C i 5% CO2).
    3. Dni 12–15: Pomiary komórkowe
      1. Jeśli planowane są eksperymenty ze stymulacją receptorów FcɛRI, komórki należy inkubować przez noc z 300 ng/mL IgE anty-DNP w standardowym medium hodowlanym. Przejść do kroku 2 lub kroku 3.

2. Fluorometryczny pomiar wewnątrzkomórkowego stężenia wolnego wapnia w PMC

  1. Przed przystąpieniem do pomiarów należy przygotować materiały wymienione w Tabeli 2. Należy również przygotować zestaw do obrazowania, w skład którego wchodzą: odwrócony mikroskop fluorescencyjny; obiektyw: 40X/1.3 Oil; zestaw filtrów do Fura 2; kamera CCD; źródło światła wzbudzenia; program do akwizycji obrazów; grawitacyjny system aplikacji roztworów.
1PMC (wiek 12–15 dni) 1 x 106 komórek/mL
2Konkanawalina A
3Fura-2 AM
4Roztwór Pluronic F-127 20%
5Szkiełka nakrywkowe okrągłe; ø 25 mm; No. 1
6Roztwór zapasowy DNP-HSA (albuminy surowicy ludzkiej z dinitrofenolem)
7Roztwór zapasowy przeciwciał anty-DNP (IgE)
8Płytka z płaskim dnem (12 dołków)
9Roztwór zapasowy związku 48/80
10Komory obrazowania z nakrywką
11Hemocytometr
12Pipety transferowe (20–200 µL)

Tabela 2: Materiały do kroku 2.

  1. Przygotowanie do obrazowania Fura-2
    1. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek do 1 x 106 komórek/mL. Rozbij kolonie komórek PMC poprzez delikatne pipetowanie (3–5 razy) zawiesiny komórkowej końcówką pipety 1 mL.
    2. Przygotuj bufor solny HEPES zawierający Ca2+ (Ca2+-HBSS) składający się z 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 10 mM HEPES i 12 mM glukozy. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 3 M NaOH.
    3. Przygotuj szkiełka pokrywowe powlekane konkanawaliną A, nanosząc 1 kroplę roztworu konkanawaliny A (0,1 mg/mL w H2O) na każde okrągłe szkiełko pokrywowe o średnicy 25 mm pod sterylnym dygestorium. Pozostaw krople na szkiełkach na co najmniej 1 min, a następnie usuń większość roztworu pipetą i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 45 min. Ostrożnie dociśnij potraktowane konkanawaliną A szkiełka pokrywowe do gumowej komory obrazującej (patrz Tabela materiałów), aż zostaną przymocowane, tworząc komory do obrazowania mikroskopowego.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować szkiełka powlekane poli-L-lizyną.
    4. Rozpuść fluorescencyjny barwnik Ca2+ Fura-2 AM (1 mM) w dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowuj ten roztwór w ciemności.
    5. Rozcieńcz roztwór stokowy Fura-2 AM w Ca2+-HBSS do końcowego stężenia 5 µM w celu przygotowania „buforu ładującego”. Uzupełnij o 5 µL/mL 20% pluroniku F-127 w DMSO.
    6. Wymieszaj 500 µL „buforu ładującego” z 500 µL zawiesiny komórek PMC. Przenieś mieszaninę pipetą do komory obrazującej i inkubuj komórki przez 20–30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    7. Przygotuj grawitacyjny system aplikacji z różnymi roztworami zgodnie z protokołem stymulacji. Napełnij strzykawkę 1 40 mL roztworu Ca2+-HBSS, strzykawkę 2 40 mL roztworu Ca2+-HBSS zawierającego 100 ng/mL DNP, strzykawkę 3 40 mL roztworu Ca2+-HBSS zawierającego 50 µg/mL Compound 48/80, strzykawkę 4 40 mL nominalnie wolnego od Ca2+ roztworu HBSS oraz strzykawkę 5 40 mL nominalnie wolnego od Ca2+ roztworu HBSS zawierającego 2 µM tapsygarginy.
    8. Przygotuj obiektyw imersyjny olejowy 40X o wysokiej aperturze, nanosząc na niego małą kroplę oleju imersyjnego.
    9. Zamontuj system aplikacji na stoliku mikroskopu odwróconego. Umieść komorę obrazującą z załadowanymi komórkami w systemie aplikacji i zabezpiecz ją, aby zapobiec przemieszczaniu podczas rejestracji. Włącz światło przechodzące i ustaw ostrość na komórki.
    10. Przepłucz komórki trzy razy buforem Ca2+-HBSS, korzystając z grawitacyjnego systemu aplikacji.
    11. Inkubuj komórki w Ca2+-HBSS przez 5 min w celu deestryfikacji Fura-2 AM.
    12. Przepłucz komórki jeszcze raz przed rozpoczęciem obrazowania, aby usunąć ewentualnie wyciekający barwnik fluorescencyjny.
  2. Obrazowanie komórek
    1. Uruchom program do akwizycji obrazów w trybie fizjologicznym. Otwórz okno konfiguracji i dostosuj ostrość oraz optymalny czas akwizycji (który powinien być taki sam dla wzbudzenia 340 nm i 380 nm i zazwyczaj mieści się w zakresie 50–150 ms).
      UWAGA: Zminimalizuj ekspozycję komórek załadowanych Fura-2 na światło, aby uniknąć fotobielenia barwnika.
    2. Wykonaj zdjęcie referencyjne i zaznacz komórki jako obszary zainteresowania (ROI). Zaznacz ostatnie ROI w obszarze, w którym nie ma komórek, i zdefiniuj je jako tło.
    3. Zakończ konfigurację i rozpocznij pomiar z częstotliwością akwizycji 5 s.
      UWAGA: Komórki będą na zmianę oświetlane światłem wzbudzenia 340 nm i 380 nm, a emitowana fluorescencja (>510 nm) będzie zbierana za pomocą kamery CCD. Obrazy sygnałów fluorescencji F340 nm i F380 nm oraz ich stosunek (F340 nm/F380 nm) będą wyświetlane w trzech oknach. Wykresy przebiegu czasowego średnich wartości intensywności fluorescencji poszczególnych ROI będą również wyświetlane w czasie rzeczywistym.
    4. Dodaj roztwory w odpowiednim numerze cyklu zgodnie z planem eksperymentu:
      1. Aby zmierzyć indukowany antygenem wzrost [Ca2+]i, jak pokazano na Rysunku 2A, 2B, podaj roztwór ze strzykawki 2 po cyklu 20 i zakończ rejestrację po cyklu 150.
      2. Aby zmierzyć indukowany Compound 48/80 wzrost [Ca2+]i, jak pokazano na Rysunku 2C, podaj roztwór ze strzykawki 3 po cyklu 20 i zakończ rejestrację po cyklu 150.
      3. Aby zmierzyć wzrost [Ca2+]i wywołany przez SOCE, jak pokazano na Rysunku 2D, podaj roztwór ze strzykawki 4 po cyklu 10, roztwór ze strzykawki 5 po cyklu 70, roztwór ze strzykawki 4 po cyklu 120, roztwór ze strzykawki 1 po cyklu 150 i zakończ rejestrację po cyklu 220.
    5. Po zakończeniu pomiaru przekształć wyniki w tabelę stosunków zawierającą zmierzone intensywności dla obu długości fal wzbudzenia z korekcją tła i bez niej, a także wartości stosunków z korekcją tła i bez niej dla każdego ROI i każdego punktu czasowego pomiaru. W programie do akwizycji naciskaj kolejno przyciski: „start cutter”, „mark all”, „convert all”, „physiology measurements”, „Ok”, „Ok”. Zapisz pliki jako tabele i stosy obrazów do analizy offline.

3. Pomiar uwalniania beta-heksosaminidazy w PMC

1PMC (12–15 dni) 1 x 106 komórek/mL
2Roztwór zapasowy przeciwciała Anti-DNP (IgE)
3Roztwór zapasowy DNP-HSA
4Roztwór zapasowy związku 48/80
5Jonomycyna
6Płytka 96-dołkowa, dno w kształcie litery V
7Płytki 96-dołkowe, dno płaskie
8Plastikowe probówki wirówkowe (15 mL)
9Pipety serologiczne
10Inkubator do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2)
11Wirówka stołowa
12Czytnik płytek mikrotitracyjnych do pomiarów gęstości optycznej
13Pipeta wielokanałowa (20–200 μL)
14Hemocytometr

Tabela 3: Materiały do kroku 3.

  1. Przed przystąpieniem do pomiarów należy przygotować materiały wymienione w Tabeli 3.
    UWAGA: β-heksosaminidaza uwalniana z komórek tucznych (MCs) po ich stymulacji hydrolizuje p-nitrofenylo-acetyl-D-glukozaminę (pNAG) do p-nitrofenolu i N-acetyl-D-glukozaminy. Ilość β-heksosaminidazy w próbce jest proporcjonalna do ilości powstałego p-nitrofenolu. W środowisku o wysokim pH, jakim jest „roztwór stopujący” (Stop Solution), p-nitrofenol występuje jako w pełni zdeprotonowany p-nitrofenolan i może być wykrywany poprzez pomiar absorbancji światła przy 405 nm.
  2. Przygotować roztwór Tyrode'a zawierający 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5,6 mM glukozy oraz 0,1% BSA. pH należy dostosować do wartości 7,4 za pomocą 3 M NaOH.
  3. Przygotować roztwór lizujący poprzez dodanie 1% objętości Triton X-100 do roztworu Tyrode'a.
  4. Przygotować roztwór stopujący składający się z 200 mM glicyny i dostosować pH do 10,7 za pomocą NaOH.
  5. Przygotować roztwór pNAG (4-nitrofenylo-2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozyd), rozpuszczając pNAG w 0,4 M kwasie cytrynowym do stężenia końcowego 4 mM.
  6. Obliczyć ilość komórek potrzebną do analizy (analizę przeprowadzić w dubletach). Należy użyć 200 000 PMCs na dołek. Dla każdego genotypu należy wyznaczyć 2 dołki jako kontrole negatywne (roztwór Tyrode'a bez sekretagogów, takich jak DNP lub związek 48/80) oraz 2 dołki jako kontrole pozytywne (roztwór Tyrode'a z 10 µM ionomycyną).
  7. Przenieść komórki do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL, uzupełnić objętość do 15 mL roztworem Tyrode'a i wirować przy 200 x g przez 4 min. Usunąć nadosad za pomocą pipety Pasteura i resuspendować komórki w roztworze Tyrode'a do stężenia 2 x 106 komórek/mL.
  8. Przenieść 100 µL zawiesiny komórkowej na dołek do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V. Do każdego dołka dodać 25 µL roztworu stymulującego lub kontrolnego (zgodnie ze schematem pipetowania przedstawionym na Rysunku 3A). Inkubować komórki przez 45 min w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  9. Zatrzymać reakcję, umieszczając płytkę 96-dołkową na lodzie na 5 min. Następnie wirować płytkę w temperaturze 4 °C przez 4 min przy 120 x g. Przenieść 120 µL nadosadu za pomocą pipety wielokanałowej do płaskodنnej płytki 96-dołkowej i umieścić ją na lodzie. Należy uważać, aby nie dotknąć osadów komórkowych, ale całkowicie odessać nadosad.
  10. Dodać 125 µL buforu lizującego do osadów komórkowych. Inkubować osady komórkowe przez 5 min w temperaturze pokojowej, a po inkubacji resuspendować je poprzez wielokrotne pipetowanie (około 5 razy).
  11. Nanieść 25 µL roztworu pNAG (4 mM) do odpowiednich dołków nowej płaskodنnej płytki 96-dołkowej. Do przygotowanego roztworu pNAG dodać 25 µL każdego nadosadu oraz 25 µL każdego lizatu komórkowego.
  12. Inkubować serie reakcyjne przez 1 h w temperaturze 37 °C. Po inkubacji dodać do każdego dołka 150 µL roztworu stopującego, aby zatrzymać reakcję.
  13. Przeanalizować płytkę za pomocą czytnika mikropłytek, korzystając z ustawienia dwudługościowego przy 405 nm z referencją 630 nm w celu automatycznego odjęcia tła. W programie akwizycji zaznaczyć pole „Reference”, a w menu elementów programu „Absorbance” wybrać z listy rozwijanej „630 nm”. Jeśli gęstość optyczna próbek jest zbyt wysoka, należy przygotować odpowiednie rozcieńczenie próby przed ponownym pomiarem.
  14. Obliczyć procent uwalniania β-heksosaminidazy zgodnie z następującym równaniem:
    Równanie uwalniania; metoda oczyszczania białek, stosunek; wzór obliczeniowy wyniku eksperymentalnego.
    gdzie Release [%] to procent specyficznego uwalniania beta-heksosaminidazy, A[supernatant] to absorbancja nadosadu po korekcie tła, a A[lysate] to absorbancja odpowiadającego mu lizatu komórkowego po korekcie tła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki PMCs wyizolowano z 3 myszy typu dzikiego (C57BL/6N) poprzez płukanie otrzewnowe, a następnie hodowano w medium RPMI uzupełnionym o 20% FCS i 1% Pen-Strep w obecności czynników wzrostu (IL-3 w stężeniu 10 ng/mL i SCF w stężeniu 30 ng/mL) w sterylnych, nawilżonych warunkach w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Medium wymieniano w 2. i 9. dniu po izolacji komórek. Morfologię komórek analizowano za pomocą obrazowania DIC w świetle przechodzącym (patrz Rysunek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Modele MC mogą być z powodzeniem wykorzystywane do badania degranulacji MC, chemotaksji, adhezji, a także do wyjaśnienia wewnątrzkomórkowych szlaków transdukcji sygnałowych zaangażowanych w aktywację MC. Niektórzy badacze używają ludzkich modeli MC, takich jak unieśmiertelnione linie (LAD2 i HMC1) lub ludzkie MC pochodzące z komórek progenitorowych krwi pępowinowej (CD133+) i komórek progenitorowych krwi obwodowej (CD34+). Inni preferują modele MC gryzoni, takie jak modele unieśmiertelnione (linia RBL-2H3 MC białaczki ba...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Julii Geminn za pomoc techniczną w przygotowaniu komórek tucznych i hodowli. Prace te były wspierane przez Transregionalne Centrum Badawcze (TR-SFB)152.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI MediumThermo Scientific21875034
DPBSSigma-Aldrich14190144
FCSThermo ScientificR92157
IL-3R& D Systems403-ML
SCFThermo ScientificPMC2115
Concanavalin ASigma-AldrichC2272
Fura-2 AM Thermo Fischer ScientificF1221
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
DNP-HSA Przeciwciało anty-DNP Sigma-AldrichA6661
 Sigma-AldrichD-8406
PenstrepThermo Scientific15140122
Compound 48/80 Sigma-AldrichC2313
4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy glikolSigma-AldrichX100
4-nitrofenylo 2-acetamido-2-deoksy-β-D-glukopiranozydSigma-AldrichN9376
Komora obrazowaniaCoverWell Sigma-AldrichGBL635051
96-dołkowa płytka, dno w kształcie litery V Corning3896
96-dołkowe płytki, płaskie dnoGreiner Bio-One655180
Czytnik płytek mikromiareczkowych z oprogramowaniem "i-control" TecanNano Quant, nieskończony M200 Pro
Płaska płyta dolna Greiner Bio-One655180
IonomycynaSigma-AldrichI9657
50 ml Plastikowe probówki wirówkoweSarstedt62.547.254 
Kolby hodowlane (25 cm)Greiner Bio-One69160
Szkiełka nakrywkowe okrągłe; ø 25 mm; Nr 1MenzelCB00250RA1
HemocytometrVWR631-0696
Mikroskop odwróconyZeissObserver Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3 OilZestaw filtrów Zeiss440260-9900
HC Fura 2 Kamera CCD AHFH76-521
ZeissAxioCam MRm 
Monochromatyczne źródło światłaSutter InstrumentsLambda DG-4
ZeissAxioVision 4.8.2 
System aplikacji roztworu zasilanego grawitacyjnieWykonane na zamówienie4-kanałowe
plastikowe probówki wirówkowe o pojemności 15 mlSarstedt62,554,502
Wirówka stołowaHeraeusMegafuge 1.0R
Program do akwizycji obrazowania

Bibliografia

  1. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
  2. Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
  3. Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
  4. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
  5. Galli, S. J., et al. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
  6. Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
  7. Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
  8. Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150(2014).
  9. Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
  10. Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
  11. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  12. Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
  13. Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
  14. Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
  15. Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
  16. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
  17. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  18. Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366(2017).
  19. Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
  20. Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
  21. Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
  22. Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja kom rek tucznychp ukanie otrzewnejobrazowanie wapnia z u yciem Fura 2test beta heksaminozydazywewn trzkom rkowe sygnalizowanie wapniowedegranulacja kom rek tucznychkom rki tuczne otrzewnejprotok obrazowania wapniakolba do hodowli kom rkowychmikroskop odwr cony
Izolacja komórek tucznych pochodzących z otrzewnej i ich charakterystyka funkcjonalna za pomocą Ca2+-obrazowania i testów degranulacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.