Artykuł metodologiczny

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57223

⸱

14 marca 2018

 ,  , 
1Center for Synaptic Neuroscience and Technology, Istituto Italiano di Tecnologia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza przepływ pracy, jak połączyć sztuczną interferencję RNA za pośrednictwem mikroRNA z optogenetyką, aby stymulować specyficznie presynaptyczne butony ze zmniejszoną ekspresją selektywnych genów w nienaruszonych obwodach neuronalnych.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie wpływu knockdownu genu na funkcję presynaptyczną w obrębie nienaruszonych obwodów neuronalnych. Opisujemy przebieg pracy nad tym, jak połączyć interferencję RNA za pośrednictwem sztucznego mikroRNA (miR) z optogenetyką, aby osiągnąć selektywną stymulację zmanipulowanych butonów presynaptycznych w ostrych wycinkach mózgu. Podejście eksperymentalne polega na wykorzystaniu pojedynczego konstruktu wirusowego i pojedynczego promotora specyficznego dla neuronu w celu sterowania ekspresją zarówno sondy optogenetycznej, jak i sztucznych miR przeciwko genom presynaptycznym. Po stereotaktycznym wstrzyknięciu do obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania, wyrażony konstrukt umożliwia stymulację światłem wyłącznie neuronów o zmniejszonej ekspresji badanego genu (genów). Strategia ta nie wymaga rozwoju i utrzymania genetycznie zmodyfikowanych linii myszy i w zasadzie może być stosowana do innych organizmów i do dowolnego genu neuronalnego z wyboru. Niedawno zastosowaliśmy go do zbadania, w jaki sposób knockdown alternatywnych izoform splicingu presynaptycznych kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu P / Q (VGCC) reguluje krótkoterminową plastyczność synaptyczną w synapsach pobudzających CA3 do CA1 w ostrych wycinkach hipokampa. Podobne podejście można również zastosować do manipulowania i badania obwodów neuronalnych in vivo.

Wprowadzenie

Ten protokół opisuje nowe podejście do charakteryzowania wpływu knockdownu genu na funkcję presynaptyczną w obrębie nienaruszonych obwodów neuronalnych. Badanie funkcji presynaptycznych w nienaruszonych obwodach neuronalnych jest wyzwaniem, ponieważ wiele butonów presynaptycznych jest zbyt małych i daleko od somy, aby umożliwić połączone interwencje molekularne i elektrofizjologiczne. Chociaż interferencja RNA oferuje potężny i elastyczny sposób na zniszczenie białek synaptycznych1, podejście to było używane oszczędnie do badania funkcji presynaptycznych, ponieważ trudno jest wykryć efekty knockdownu za pomocą tradycyjnych stymulacji elektrycznych, które nie rozróżniają między zmanipulowanymi i naiwnymi butonami presynaptycznymi2. W tym miejscu opisujemy, jak połączyć interferencję RNA za pośrednictwem sztucznego mikroRNA (miR) z niedawno opracowaną technologią optogenetyczną w celu uzyskania selektywnej stymulacji zmanipulowanych boutonów presynaptycznych w ostrych wycinkach mózgu.

Chociaż myszy z warunkowym nokautem w połączeniu z elektrofizjologią mogą być również używane do badania funkcji białek presynaptycznych3,4, nasza strategia nie wymaga rozwoju i utrzymywania genetycznie modyfikowanych linii myszy i może być również łatwo wykorzystana do niszczenia określonych izoform genu. W porównaniu z częściej stosowanymi krótkimi RNA spinki do włosów (shRNA), sztuczne miR, które tutaj stosujemy, oferują kluczowe korzyści w zakresie knockdownu neuronów. W przeciwieństwie do shRNA, mogą one ulegać ekspresji pod kontrolą promotora polimerazy II1. W ten sposób pojedynczy promotor może być używany do sterowania ekspresją zarówno miR, jak i sondy optogenetycznej, wraz z reporterem fluorescencyjnym. W ten sposób rozmiar konstruktu może być utrzymany w granicach opakowania rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami (rAAV, Rysunek 1A). Ponadto zastosowanie pojedynczego konstruktu i pojedynczego promotora zmniejsza zmienność eksperymentalną, ponieważ pozwala na ekspresję miR, sondy optogenetycznej i reportera fluorescencyjnego w ustalonym stosunku.

Ostatnio zastosowaliśmy tę technologię do zbadania roli alternatywnie splicowanych izoform presynaptycznych kanałów wapniowych w hipokampie5. Taka strategia ma ogólne zastosowanie do badania fizjologicznego znaczenia innych białek o ekspresji presynaptycznej w dowolnym interesującym obwodzie mózgu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Radę Wspólnot Europejskich (Dyrektywa 2010/63/UE z 4 marca 2014 r.) i zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia.

1. Projektowanie mikroRNA do interferencji RNA i ocena ich skuteczności w heterologicznych systemach ekspresyjnych

UWAGA: Ten protokół wymaga znajomości następujących dobrze znanych metod: klonowanie molekularne, sekwencjonowanie DNA, utrzymanie linii komórkowych, transfekcja fosforanu wapnia, ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), przygotowanie lizatów komórkowych z linii komórkowych i Western blotting.

  1. Określ, czy gen będący przedmiotem zainteresowania podlega alternatywnemu splicingowi. W celu ogólnego knockdown genu wybierz wyłącznie egzony konstytutywne; W przypadku knockdown określonej alternatywnie splicowanej izoformy, należy wybrać odpowiedni alternatywnie splicowany ekson.
  2. Użyj dedykowanego oprogramowania (np. https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) do zaprojektowania sztucznych miR do interferencji RNA względem interesującej nas sekwencji.
    UWAGA: Ważne jest, aby użyć narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), aby sprawdzić, czy w obrębie tego samego gatunku nie ma możliwych niecelnych celów.
  3. Wybierz trzy najwyżej uszeregowane miR dla genu docelowego.
  4. Zamów górne i dolne pasmo wybranych miR w odpowiedniej firmie. Do kontroli ujemnej należy użyć zakodowanej wersji jednego z wybranych miR lub miR, co do których przewiduje się, że nie będą ukierunkowane na żaden znany gen gatunku użytego w doświadczeniu (np. w przypadku genów kręgowców miR obecny w pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg).
  5. Wyżarz odpowiednie górne i dolne nici wybranych miR i sklonuj je do plazmidu przeznaczonego do ekspresji miR (np. pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR) przy użyciu standardowych strategii klonowania.
    UWAGA: Celem jest stworzenie kasety ekspresji miR składającej się z regionu flankującego 5' miR, wybranej sekwencji miR i regionu flankującego 3' miR, który może być wyrażany z 3' UTR genu reporterowego pod kontrolą promotora polimerazy RNA typu II.
  6. Użyj sekwencjonowania DNA, aby zweryfikować poprawną insercję wybranych miR.
  7. Hoduj komórki HEK293 w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2) przy użyciu pożywki DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1 mM NaPyrugronian, 10 mM HEPES (pH 7,39) i 1x penicylina/streptomycyna (Pen/Strep).
  8. Gdy komórki HEK293 są w ~ 70% zlewne, należy je współtransfekować z każdym z wektorów ekspresyjnych miR i wektorem wyrażającym docelowy gen w stosunku DNA 1:1 przy użyciu metody fosforanu wapnia6. Obejmują następujące kontrole: (i) komórki nietransfekowane, (ii) komórki transfekowane wektorem wyrażającym docelowy gen wraz z nośnikiem DNA (np. pBluescript II SK(+)) lub (iii) miR Control.
    UWAGA: (i) Wyrażony gen docelowy musi pochodzić od tego samego gatunku, dla którego zaprojektowano miR, chyba że sekwencje, do których dążą miR, są absolutnie konserwatywne na poziomie nukleotydów między tymi dwoma gatunkami. (ii) Można stosować linie komórkowe inne niż HEK293. (iii) Można stosować alternatywne metody transfekcji, takie jak elektroporacja lub metody oparte na liposomach.
  9. 48 godzin po transfekcji przeprowadzić lizę komórek, uruchomić żel białkowy, wykonać Western blot i przeanalizować zawartość białka z przeciwciałem rozpoznającym białko docelowe. Celuj w skuteczność powalania na poziomie ≥50%.
    UWAGA: Skuteczność knockdown można alternatywnie lub dodatkowo ocenić (i) za pomocą analizy ELISA, (ii) poprzez pomiar aktywności białka docelowego, jeśli ma to zastosowanie (np. aktualne gęstości kanałów jonowych) lub (iii) za pomocą qRT-PCR na poziomie mRNA, jeśli odpowiednie przeciwciała nie są dostępne (krok 3 protokołu).
    1. Umieść szalki hodowlane na lodzie i umyj komórki lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
    2. Odessać PBS, a następnie dodać lodowaty bufor RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP40, 0,1% dodecylosiarczan sodu (SDS), zawierający inhibitory proteazy i fosfatazy; 1 ml na szalkę o średnicy Ø 100 mm, 0,5 ml na półkę o średnicy 60 mm).
    3. Zeskrob przylegające komórki z naczynia za pomocą skrobaka do komórek i delikatnie przenieś zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej.
    4. Odwirować probówkę o stężeniu 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki do mikrowirówki i wyrzucić osad.
    5. Oznaczyć stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA lub innej odpowiedniej metody (np. testu Bradforda).
      UWAGA: Próbki można zamrozić w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu późniejszego użycia lub natychmiast przetworzyć.
    6. Przenieść odpowiednią objętość lizatów do probówek mikrowirówek, tak aby wszystkie próbki miały takie samo stężenie białka i dodać odpowiedni lodowaty bufor do lizy, aby uzupełnić wszystkie lizaty do tej samej objętości.
      UWAGA: 30 do 50 μg białka ogółem powinno wystarczyć dla większości białek, ale odpowiednia ilość do obciążenia powinna być określona w zależności od obfitości białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    7. Dodać odpowiednią ilość 2x bufor Laemmli (4% SDS, 10% 2-merkaptoetanol, 20% glicerol, 0,004% błękitu bromofenolowego, 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8) i gotować próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    8. Załaduj próbki na żel akrylowy wraz z markerem masy cząsteczkowej. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 1-2 godziny < br /> UWAGA: Zawartość procentowa żelu zależy od wielkości interesującego nas białka.
    9. Złożyć kanapkę transferową i przenieść białka z żelu na membranę pod napięciem 100 V przez 2 godziny. Membrana może być nitroceluloza lub PVDF. Aktywuj PVDF metanolem na 1 minutę i przepłucz go buforem transferowym przed przygotowaniem komina.
    10. Blokować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy użyciu buforu blokującego (5% mleka w PBST (PBS + 0,1% Tween-20)), a następnie inkubować błonę przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w buforze blokującym.
    11. Przemyć błonę przez 10 minut w PBST trzy razy i inkubować ją z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    12. Umyj membranę przez 10 minut w PBS cztery razy, a następnie nałóż podłoże chemiluminescencyjne na membranę i przechwyć sygnały chemiluminescencyjne za pomocą kamery CCD.
    13. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić ilościowo skuteczność powalenia.
  10. Wybierz dwie najbardziej efektywne miR ukierunkowane na nienakładające się sekwencje do dalszych testów funkcjonalnych.
    UWAGA: Nigdy nie można całkowicie wykluczyć niecelnych efektów w przypadku żadnego miR. Jeśli jednak dwa niezależne miR mają podobny efekt, jest bardzo mało prawdopodobne, że jest to spowodowane tym samym niecelnym nokdaunem.
  11. Jeśli skuteczność knockdown wybranych miR nie jest zadowalająca (<50%), przeprowadź test pod kątem innych miR. Alternatywnie, wyrażaj najbardziej efektywne miR(s) w tandemie, tj. wyrażaj je w wielu kopiach z tej samej kasety z wyrażeniami, co może skutkować zwiększoną wydajnością knockdown7.

2. Budowa rekombinowanych wektorów związanych z adenowirusem do połączonej ekspresji sond optogenetycznych i mikroRNA

UWAGA: Ten protokół wymaga znajomości następujących dobrze znanych metod: klonowanie molekularne, sekwencjonowanie DNA i produkcja rAAV.

  1. Sklonuj każdą z najbardziej wydajnych kaset ekspresji miR do 3'UTR konstruktów przeznaczonych do produkcji rekombinowanych rAAV i ekspresji pobudzających sond optogenetycznych, takich jak w pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (Figura 1A), gdzie specyficzny dla neuronu promotor synapsyny napędza ekspresję ultraszybkiej rodopsyny kanałowej ChETA, czerwonego fluorescencyjnego reportera TdTomato i miR(s) wstawionych między miejsca NheI i EcoRI5.
    UWAGA: (i) Nie przekraczaj limitu pakowania rAAV, który wynosi około 4,7 Kb długości od ITR (odwrócone powtórzenie końcowe) do ITR (Rysunek 1A, pomarańczowy). (ii) Kaseta ekspresji miR musi być wprowadzona między kodon stop a WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element; Rysunek 1A). (iii) Włączenie białka fluorescencyjnego, takiego jak TdTomato, jest niezwykle przydatne, ponieważ pozwala na łatwe monitorowanie lokalizacji i intensywności infekcji (krok 4 protokołu).
  2. Użyj sekwencjonowania DNA, aby zweryfikować poprawną insercję kaset miR.
  3. Wyprodukuj i mianuj rAAV1/2 zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem8, po jednym rAAV1/2 dla każdego wybranego miR. Jeden typowy eksperyment mający na celu wyeliminowanie jednego genu obejmowałby dwa niezależne miR przeciwko temu samemu genowi i jedną kontrolę miR. Dążyć do miana wirusa ≥109 genomów wirusa (vg)/μL.
    UWAGA: z rAAV należy obchodzić się w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1). Szczegółowe informacje można uzyskać w Instytucjonalnym Komitecie ds. Bezpieczeństwa Biologicznego.
    UWAGA: Jeśli laboratorium nie posiada zaplecza do badania wirusów lub jeśli miana wirusów nie są zadowalające, produkcję rAAV można zlecić na zewnątrz. Na przykład odwiedź stronę https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ lub https://vcf.charite.de/en/metas/.

3. Ekstrakcja RNA z pierwotnych kultur neuronalnych w celu oceny skuteczności eliminacji genów endogennych miR za pomocą qRT-PCR

UWAGA: (i) Ten protokół wymaga znajomości następujących dobrze znanych metod: przygotowanie i utrzymanie pierwotnych kultur neuronalnych oraz qRT-PCR. (ii) Powtórzyć kwantyfikację skuteczności knockdown (etapy 3.1–3.14) co najmniej 3 razy (kontrpróby biologiczne). (iii) Oszacowanie skuteczności knockdown na poziomie mRNA za pomocą qRT-PCR jest odpowiednie, gdy analiza zawartości białka jest wykluczona, na przykład podczas obalania alternatywnie splicingowanych izoform, dla których nie są dostępne specyficzne przeciwciała5.

  1. Przygotuj pierwotne kultury neuronalne z obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Postępuj zgodnie z protokołem dla kultur korowych podanym w poprzedniej publikacji9, z następującymi modyfikacjami:
    1. Płytki neuronów w 6-dołkowych płytkach o gęstości 500 000 neuronów na dołek. Użyj 2,5 ml/studzienkę pożywki do nasadki i 3,3 ml/dołek pożywki konserwacyjnej.
    2. Jeśli obserwuje się przerost astrocytów, dodać 0,5 ml / studzienkę pożywki podtrzymującej uzupełnionej 7,5 μM cytozyny β-D-arabinofuranozydu (dla końcowego stężenia 1 μM) po 3–4 dniach in vitro (DIV).
  2. Zainfekuj trzy studzienki na miR (kontrpróby techniczne) przy 5-6 DIV. Użyj najniższej dawki zakaźnej, która zainfekuje ≥99% neuronów.
    1. Usuń 2 ml pożywki z każdej studzienki i zbierz ją do probówki sokoła o pojemności 50 ml.
    2. Dodać wirusa bezpośrednio do neuronów, delikatnie wymieszać i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    3. Zebrane podłoże należy przechowywać w inkubatorze. Poluzuj nasadkę rurki sokoła, aby umożliwić zrównoważenie gazu.
    4. Po 24 godzinach dodaj usuniętą pożywkę z powrotem do każdego dołka (1,9 ml / studzienkę).
  3. W 17–18 DIV lizuj neurony w celu ekstrakcji RNA.
    UWAGA: Odczynnik do lizy i chloroform są wysoce toksyczne. Pracuj pod kapturem chemicznym i noś odzież ochronną; Utylizować odpady zgodnie z wytycznymi krajowymi i instytucjonalnymi.
    UWAGA: W przypadku kroków 3.3–3.13 pracuj w warunkach wolnych od RNAse. Noś rękawiczki i używaj szkła bez RNAse oraz jednorazowych naczyń z tworzyw sztucznych. Aby uzyskać ogólne środki ostrożności dotyczące obchodzenia się z RNA, zapoznaj się na przykład z załącznikiem A do podręcznika RNeasy Micro Handbook dostępnego online.
    1. Szklane pipety Pasteura inkubować przez noc w piecu w temperaturze 180 °C.
    2. Przechylić płytki i całkowicie odessać pożywkę z każdej studzienki za pomocą szklanej pipety Pasteura podłączonej do pompy próżniowej.
    3. Natychmiast dodaj 700 μl odczynnika do lizy do każdej studzienki.
    4. Rozprowadzić roztwór równomiernie, ostrożnie i krótko ręcznie kołysząc i potrząsając płytką.
    5. Pipetować roztwór w górę i w dół 4-5 razy lub do uzyskania jednorodnej zawiesiny.
    6. Przenieść roztwór z każdej studzienki do oddzielnej probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Lizaty komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub natychmiast przetwarzane.
  4. W razie potrzeby rozmrozić lizaty w temperaturze pokojowej i natychmiast przejść do kroku 3.5.
  5. Dodać 140 μl chloroformu do każdej próbki lizatów komórkowych.
    UWAGA: Chloroform jest lotny i trudny do pipetowania, należy jak najszybciej zamknąć probówki Eppendorfa.
  6. Potrząsaj energicznie probówkami Eppendorfa przez 15 s lub do momentu, gdy próbki będą w pełni zemulgowane.
  7. Utrzymuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 1–2 minuty lub do momentu, gdy fazy ciekłe zaczną się rozdzielać.
  8. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Przenieś górną fazę wodną (~320 μl) zawierającą RNA do nowej probówki Eppendorfa i wyrzuć pozostałą ciecz.
    UWAGA: Nie dotykaj końcówką pipety dolnej różowej fazy organicznej ani białego pierścienia między dwiema fazami.
  10. Dodać 1,5 objętości 100% etanolu (480 μl) do fazy wodnej i powoli pipetować roztwór 3 razy w górę i w dół, aby wymieszać.
  11. Oczyść RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu przeznaczonego do oczyszczania RNA z małych próbek.
  12. Określić ilościowo stężenie RNA i czystość próbki za pomocą spektrofotometru.
    UWAGA: (i) Spodziewaj się plonów na poziomie ≥3,5 μg/studnię; Proporcje 260/280 i 260/230 dla czystości białek i związków organicznych powinny wynosić ≥1,9. (ii) Próbki RNA mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub natychmiast przetwarzane.
  13. Retrotranskrypcja 250, 500 lub 1000 ng RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu.
  14. Określ ilościowo skuteczność knockdown dla endogennego genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą qRT-PCR. Szczegółowy protokół można znaleźć na stronie reference10. Celuj w skuteczność powalania na poziomie ≥60% (Rysunek 2). Znormalizuj dane do ≥2 genów porządkowych (np. GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) Korzystanie z metody wielu genów kontroli wewnętrznej11.
    UWAGA: Jeśli pracujesz na szczurach, użyj następujących starterów PCR dla genów porządkowych: GAPDH-fwd: 5' GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3' i GAPDH-rev: 5' GATGATGACCCTTTTGGC 3'; ACTB-fwd: 5' CATCACTATCGGCAATGAGC 3' i ACTB-rev: 5' TCATGGATGCCACAGGATT 3'; TUBB3-fwd: 5' GCCTTTGGACACCTATTCAG 3' i TUBB3-rev: 5' TCACATTCTTTCCTCACGAC 3'; PPIA-fwd: 5' CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3' i PPIA-rev 5' CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3'.

4. Ocena roli białek presynaptycznych w nienaruszonych obwodach neuronalnych poprzez celowaną stymulację uszkodzonych neuronów za pomocą optogenetyki

UWAGA: Poniższy protokół wymaga wcześniejszego doświadczenia z zapisami elektrofizjologicznymi w ostrych wycinkach mózgu i dostępu do konfiguracji elektrofizjologicznej.

  1. Stereotaktycznie wstrzyknij rAAV1/2 do mózgu, postępując zgodnie ze szczegółowym protokołem w poprzedniej publikacji12. Określ współrzędne stereotaktyczne dla obszaru zainteresowania mózgu za pomocą atlasów stereotaktycznych dla mouse13 lub rat brain14.
    1. Za pomocą ściągacza do mikropipet wyciągnąć mikropipety iniekcyjne z długimi trzpieniami Ø 7–9 μm; przypiąć mikropipety iniekcyjne do trzonków nożyczkami. Za pomocą cienkiego markera i papieru milimetrowego umieść znaczniki kalibracji na mikropipetach iniekcyjnych co 2 mm.
    2. Znieczulić zwierzę izofluranem i utrwalić go w aparacie stereotaktycznym.
    3. Utrzymuj zwierzę w cieple przez cały czas trwania operacji za pomocą poduszki grzewczej ustawionej na 37 °C.
    4. Chroń oczy lubrykantem do oczu.
    5. Ogol futro na głowie elektryczną maszynką do golenia.
    6. Rozprowadź jod powidonu na ogolonej głowie za pomocą wacika.
    7. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj nacięcie w linii środkowej.
    8. Oczyść powierzchnię czaszki wacikiem, aby bregma i lambda były widoczne.
    9. Umieścić mikropipetę iniekcyjną w uchwycie. Przymocuj uchwyt do ramienia stereotaktycznego
      10. .
    10. Określić współrzędne x i y miejsca iniekcji względem bregmy i/lub lambdy.
    11. Użyj wiertła, aby przerzedzić czaszkę nad obszarem docelowym.
      UWAGA: Wykonuj delikatne ruchy okrężne i unikaj wiercenia w czaszce, ponieważ spowoduje to uszkodzenie powierzchni mózgu.
    12. Jeśli wystąpi krwawienie, wchłoń nadmiar krwi ręcznikiem papierowym.
      UWAGA: Nadmiar krwi utrudni prawidłowe określenie współrzędnej z.
    13. Załadować ≤2 μl wirusa do mikropipety iniekcyjnej metodą kapilarną.
    14. Doprowadzić mikropipetę do wstrzykiwań do współrzędnych x i y miejsca wstrzyknięcia.
    15. Oblicz współrzędną z opony twardej i powoli opuść pipetę do mózgu.
    16. Po osiągnięciu współrzędnej z odczekaj 3 minuty, aby umożliwić regulację tkanki.
    17. Zastosować niskie nadciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml połączonej elastyczną rurką z tyłu mikropipety iniekcyjnej. Monitoruj wzrokowo szybkość wyrzucania wirusa z mikropipety iniekcyjnej przez mikroskop preparacyjny i używając znaczników kalibracyjnych jako punktów odniesienia.
      UWAGA: Wirus należy wstrzykiwać z małą szybkością (<100 nL/min), aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
    18. Po zakończeniu iniekcji należy odczekać 5 minut, wycofać mikropipetę iniekcyjne o 0,2 mm, odczekać kolejne 5 minut, aby uniknąć cofania się wirusa.
    19. Powoli i całkowicie wyjąć mikropipetę do wstrzykiwań z mózgu i przelać ją do pojemnika wypełnionego wybielaczem.
    20. Zwilż czaszkę roztworem fizjologicznym i zszyj skórę 3-4 szwami.
    21. Nałóż maść gentamycyny na ranę.
      22. Zwierzę należy trzymać
    22. pojedynczo w czystej klatce z granulkami pokarmu i pod lampą grzewczą, aż w pełni wyzdrowieje.
  2. ≥15 dni po wstrzyknięciu odetnij głowy zwierzętom w głębokim znieczuleniu izofluranem.
  3. Przygotować ostre wycinki mózgu w obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania za pomocą wibratomu przy użyciu zagazowanego (95%O2, 5% CO2) lodowatego roztworu aCSF, zawierającego (w mM): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH2PO4, 1,5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 NaPirogronian i 18 glukozy (osmolarność dostosowana do 300 mOsm). Na przykład, jeśli celem jest analiza transmisji synaptycznej z neuronów piramidowych CA3 do CA1, przygotuj strzałkowe plastry formacji hipokampa (o grubości 350 μm).
    UWAGA: Od tego kroku pracuj w warunkach słabego oświetlenia, aby uniknąć aktywacji sondy optogenetycznej przez światło otoczenia.
  4. Pozostawić plastry do odzysku przez 30 minut w temperaturze 37 °C w tym samym płynie mózgowym w komorze przeznaczonej do przechowywania plastrów mózgu. Przechowuj plastry w tej samej komorze na wycinki mózgu w temperaturze pokojowej do momentu nagrania.
    UWAGA: W tych warunkach plastry mogą być utrzymywane w zdrowiu do 6–8 godzin.
  5. Przenieść jedną cząstkę do zanurzonej komory zapisowej i połączyć ją z 2 ml/min tego samego aCSF, który jest używany do odzyskiwania, uzupełnionego 1,5 mM CaCl2 (łącznie Ca2+: 2,5 mM) i bez NaPyrugronianu.
    UWAGA: Plastry są przygotowywane i utrzymywane w niskim stężeniu Ca2+ (1 mM) w celu zminimalizowania toksyczności. Nagrania są wykonywane w 2,5 mM Ca2+, aby sprzyjać uwalnianiu pęcherzyków.
  6. Sprawdzić pokrótce sygnał wyrażonego reportera fluorescencyjnego (np. TdTomato; Rysunek 3B) w celu ustalenia lokalizacji i intensywności infekcji.
  7. Napełnij elektrodę plastrową roztworem wewnątrzkomórkowym zawierającym (w mM): 110 K-glukonian, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 EGTA, 3 MgCl2, 4 Mg-ATP, 0,5 Na3-GTP, 20 K 2-fosforankreatyny, 10 HEPES-KOH (pH 7,28, 290 mΩ).
    UWAGA: Należy użyć elektrody krosowej o rezystancji pipety 5–6 mΩ.
  8. W świetle podczerwonym osiągnij szczelną konfigurację całych komórek z neuronu odbierającego sygnały synaptyczne z zainfekowanych neuronów. Na przykład, jeśli neurony piramidowe CA3 zostały zainfekowane, załataj neurony piramidowe w proksymalnym i przyśrodkowym odcinku regionu CA1 (Rysunek 3C).
    UWAGA: Rezystancja szeregowa może pozostać nieskompensowana, ale powinna być stała i niska (≤20 MΩ).
  9. Użyj farmakologii, aby wyizolować badane prądy synaptyczne. Na przykład, jeśli celem jest zbadanie pobudzającej transmisji synaptycznej, zablokuj hamującą transmisję synaptyczną za pomocą 10 μM bicukuliny.
  10. Wywołaj prądy synaptyczne, na przykład pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSC), za pomocą niebieskiego lasera o długości 473 nm sprzężonego ze światłowodem (Ø ≤250 μm) umieszczonym na somatach zakażonych neuronów (np. CA3 neurony piramidowe).
    1. Dostosuj długość stymulacji do minimum, aby zmniejszyć możliwość wywołania więcej niż jednego potencjału czynnościowego na impuls świetlny. Jeśli używasz ChETA, ustaw ją na 2 ms15.
    2. Dostosuj siłę stymulacji lasera, aby uzyskać małe, ale wyraźnie wykrywalne prądy synaptyczne (amplituda szczytowa ≤50 pA dla EPSC zarejestrowanych przy potencjale utrzymywania -70 mV między neuronami piramidowymi CA3 i CA1; Rysunek 3D). W przypadku korzystania z ChETA i światłowodu o średnicy 250 μm, siła stymulacji 1–3 mW na wyjściu światłowodu powinna być odpowiednia.
      UWAGA: jeśli nie można regulować siły lasera, użyj filtrów o neutralnej gęstości.
    3. Skieruj światło lasera o długości fali 473 nm na somaty zainfekowanych neuronów, ale nie na ich aksony. Na przykład, świec światłem na somaty CA3 i z dala od pobocznych Schaffera, aby uniknąć bezpośredniej depolaryzacji aksonów.
    4. Nałóż tetrodotoksynę (TTX; 0,5 μM), bloker kanałów sodowych, na próbkę, aby potwierdzić, że kanały są sterowane potencjałem czynnościowym.
    5. W różnych nagraniach zastosuj selektywny bloker do badanego prądu synaptycznego, aby potwierdzić, że stymulacja jest selektywna.
      UWAGA: Na przykład zastosuj NBQX (10 μM) do EPSC, w których pośredniczy receptor glutaminianu typu AMPA.
    6. Porównaj optycznie i elektrycznie wywołane prądy synaptyczne w tym samym ostrym wycinku mózgu w odpowiedzi na powtarzającą się stymulację (≥2 bodźce przy ≤20 Hz). Podobny stopień ułatwienia synaptycznego lub depresji powinien być obserwowany między stymulacją elektryczną i optyczną podczas korzystania z kontrolnego miR, co sugeruje, że podobne mechanizmy komórkowe są aktywowane przez te dwa rodzaje stymulacji.
      UWAGA: Powyższe kroki są konieczne, aby zapewnić, że stymulacja optyczna nie indukuje bezpośredniej depolaryzacji butonów presynaptycznych, omijając w ten sposób niektóre mechanizmy transmisji synaptycznej.
  11. Porównaj transmisję synaptyczną w odpowiedzi na pojedyncze i powtarzające się stymulacje (bodźce ≥2 przy ≤20 Hz) między kontrolnym miR i miR ukierunkowanym na badane białka presynaptyczne.

Wyniki

Opisane powyżej procedury stanowią niezawodną metodę oceny wpływu wyciszenia białek synaptycznych w neuronach presynaptycznych na przekaźnictwo synaptyczne. Poniżej, w ramach przykładu, przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazujące, w jaki sposób wyciszenie alternatywnych izoform splicingowych presynaptycznych kanałów VGCC Cav2.1 (typu P/Q) reguluje krótkotrwałą plastyczność synaptyczną w pobudzających synapsach między obszarami CA3 a CA1.

Kanały Cav2.1 (typu P/Q) są dominującymi presynaptycznymi VGCC w większości szybkich synaps w ośrodkowym układzie nerwowym. Alternatywny splicing wzajemnie wykluczających się eksonów 37a i 37b podjednostki α1 tworzącej por kanału Cav2.1 (α1A) prowadzi do powstania dwóch głównych wariantów: Cav2.1[EFa] oraz Cav2.1[EFb]16,17,18. Aby określić, czy Cav2.1[EFa] i Cav2.1[EFb] różnicowo regulują transmisję synaptyczną i plastyczność w piramidowych neuronach hipokampa szczura, opracowaliśmy najpierw izoformowo-specyficzne miRs w celu selektywnego wyciszenia ekspresji (knockdown) Cav2.1[EFa] lub Cav2.1[EFb]5. Pomimo niewielkiego rozmiaru (97 bp) i wysokiego podobieństwa (61,86% identyczności na poziomie nukleotydów) między eksonami 37a i 37b, udało nam się zaprojektować trzy sekwencje miR przeciwko szczuremu Cav2.1[EFa] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) i dwie przeciwko szczuremu Cav2.1[EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) z przewidywaną wysoką wydajnością wyciszenia. Jako kontrolę negatywną (miR Control) wykorzystaliśmy plazmid pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg zawierający sekwencję, która nie jest skierowana przeciwko żadnemu znanemu genowi kręgowców. Na podstawie wstępnego przesiewu w komórkach HEK 293 przeciwko kanałom heterologicznym wybrano miR EFa1, miR EFa3 oraz miR EFb2 i sklonowano ich kasety ekspresyjne do 3'UTR wektora pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, który jest przeznaczony do produkcji rAAVs, a w którym promotor synapsyny steruje ekspresją ultraszybkiej channelrhodopsyny ChETA, czerwonego białka fluorescencyjnego TdTomato oraz wstawionego miR (Rycina 1). Powieliliśmy również kasetę ekspresyjną miR EFb2, aby zwiększyć wydajność wyciszenia przez ten miR.

Następnie przygotowaliśmy rAAV1/2 dla powyższych czterech konstruktów i określiliśmy ich wydajność oraz selektywność wyciszania w pierwotnych kulturach neuronów szczura za pomocą izoformowo-specyficznego qRT-PCR. miR EFa1 oraz miR EFa3 zredukowały poziom mRNA natywnego Cav2.1[EFa] o ~70%, lecz nie wpłynęły na poziom mRNA Cav2.1[EFb], podczas gdy miR EFb zredukował poziom mRNA natywnego Cav2.1[EFb] o ~60%, nie wpływając na mRNA Cav2.1[EFa] (Rycina 2).

Następnie każdy z czterech rAAV1/2 wstrzyknęliśmy stereotaktycznie do obszaru CA3 hipokampa szczurów P18 (Rysunek 3A-C), stosując współrzędne (A-P/M-L/D-V od Bregmy) −2,6/± 2,9/−2,9. Od piętnastu do dwudziestu czterech dni po iniekcji przygotowaliśmy ostre skrawki hipokampa od szczurów, którym wstrzyknięto rAAV1/2, i wykorzystaliśmy fluorescencję TdTomato do potwierdzenia ekspresji i lokalizacji rAAVs (Rysunek 3B). Aby zbadać, czy presynaptyczne wyciszenie (knockdown) Cav2.1[EFa] lub Cav2.1[EFb] wpłynęło na krótkotrwałą plastyczność synaptyczną w synapsach między obszarem CA3 a CA1, stymulowaliśmy selektywnie zainfekowane neurony CA3 krótkimi impulsami światła laserowego o długości fali 473 nm (czas trwania 2 ms; Rysunek 3C) i rejestrowaliśmy powstałe EPSCs, stosując metodę patch-clamp w neuronach piramidowych w części proksymalnej względem drogi przyśrodkowej regionu CA1 (Rysunek 3C). Stwierdziliśmy, że wyciszenie izoform splicingowych Cav2.1 wpłynęło na odpowiedzi na stymulację podwójnym impulsem w przeciwnych kierunkach: wyciszenie Cav2.1[EFa] (miR EFa1 lub miR EFa3) zwiększyło ułatwienie po podwójnym impulsie (PPF), podczas gdy wyciszenie Cav2.1[EFb] (miR EFb2) zniosło ten efekt (Rysunek 3D, E).

Schemat plazmidu pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR X do ekspresji genów; zawiera sekwencje miRNA.
Rysunek 1: Schemat konstruktów do połączonej ekspresji ultraszybkiej sondy optogenetycznej ChETA oraz izoformowo-specyficznych miR przeciwko Cav2.1[EFa] i Cav2.1[EFb]. (A) Mapa konstruktu rAAV pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, zawierającego promotor synapsyny (Syn), ultraszybką kanałorodopsynę ChETA połączoną z TdTomato oraz, w proksymalnym regionie 3'UTR, miR specyficzny dla izoformy splicingu Cav2.1. Przedstawione enzymy restrykcyjne są enzymami tnącymi w jednym miejscu. (B) Góra, schemat kasety ekspresyjnej. Promotor synapsyny steruje ekspresją zarówno ChETA-TdTomato, jak i izoformowo-specyficznego miR. Dół, odwrotna komplementarność 21-nukleotydowych sekwencji docelowych, które stanowią część kasety miR. Dla miR EFb2 dwie identyczne kasety miR były eksprimowane tandemowo, jedna po drugiej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy przedstawiający ekspresję mRNA Cav2.1 EF, czerwony/niebieski, warunki miR, istotność statystyczna.
Rycina 2. Ocena wydajności i selektywności wyciszania izoformowych miR dla Cav2.1[EFa] i Cav2.1[EFb]. Analiza qRT-PCR specyficzna dla izoform przeprowadzona na RNA wyizolowanym z pierwotnych kultur w 17-18 DIV, zainfekowanych w 6 DIV wektorami rAAV wykazującymi ekspresję miR celujących w Cav2.1[EFa] (miR EFa1 i miR EFa3) lub Cav2.1[EFb] (miR EFb2). Dane znormalizowano względem kontroli negatywnej (miR Control). miR EFa1 i miR EFa3 znacząco i selektywnie redukują mRNA Cav2.1[EFa] (odpowiednio n = 8 i 7 kultur), podczas gdy miR EFb znacząco i selektywnie redukuje mRNA Cav2.1[EFb] (n = 4 kultur; ***p<0.001; jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA, a następnie test post-hoc Tukeya-Kramera). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Rycina została zaadaptowana z Thalhammer, A. et al.5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ do stymulacji optogenetycznej; analiza odpowiedzi synaptycznej; ChETA, optyczna, ekspresja miR, elektrofizjologia.
Rysunek 3. Ocena roli Cav2.1[EFa] i Cav2.1[EFb] w natywnym hipokampie poprzez ukierunkowaną stymulację optogenetyczną neuronów z wyciszonymi genami. (A) Schemat kasety ekspresyjnej konstruktów rAAV użytych do infekcji in vivo. (B) Przekrój hipokampa wykazujący, że fluorescencja TdTomato jest ograniczona do obszaru CA3 i jego projekcji. (C) Konfiguracja eksperymentalna: wiązka lasera była skierowana na somata CA3, a rejestracje metodą patch-clamp przeprowadzono z neuronów piramidowych CA1. (D) Impulsy niebieskiego (473 nm) światła laserowego o długości 2 ms emitowane z częstotliwością 20 Hz wywołują EPSCs, których PPF jest zwiększony przez miRs nakierowane na Cav2.1[EFa] i zniesiony przez miR dla Cav2.1[EFb]. (E) Podsumowanie stosunku podwójnego impulsu dla eksperymentów jak w (D), wykazujące wzrost PPF dla miR EFa1 i miR EFa3 oraz spadek dla miR EFb2 w stosunku do miR Control (n = 9 - 11 rejestracji; *p=0.02; **p=0.01; ***p<0.0004; analiza kowariancji). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Rysunek został zaadaptowany z Thalhammer, A. et al.5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Jednoczesna ekspresja sondy optogenetycznej i miR przeciwko genowi presynaptycznemu będącemu przedmiotem zainteresowania oferuje potężne podejście do scharakteryzowania wpływu knockdownu genu na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych. Dla tego eksperymentalnego podejścia ważne jest zidentyfikowanie i scharakteryzowanie miR, które są wysoce wydajne i selektywne w powalaniu genu będącego przedmiotem zainteresowania w systemach natywnych. Jeśli to możliwe, należy użyć dwóch lub więcej niezależnych miR przeciwko temu samemu mRNA będącemu przedmiotem zainteresowania, aby kontrolować ewentualne efekty poza celem. Eksperymenty ratunkowe, w których gen oporny na miR jest ponownie wprowadzany do systemu, mogą być stosowane jako kontrola swoistości.

Użycie tego samego konstruktu do ekspresji sondy optogenetycznej i miR pozwala na optyczną stymulację tylko tych neuronów presynaptycznych, które zostały zmanipulowane. Nie jest to możliwe w przypadku stymulacji elektrycznej, ponieważ nie rozróżniają one neuronów zainfekowanych i niezainfekowanych, dając w ten sposób mieszane i rozcieńczone wyniki. Ponieważ stymulacje optyczne mogą indukować wiele potencjałów czynnościowych15, ważne jest, aby wybierać tylko najszybsze sondy optogenetyczne z rozszerzającej się palety 15,19,20,21. Ponadto konieczne jest upewnienie się, że stymulacja optyczna nie indukuje bezpośredniej depolaryzacji napadów presynaptycznych, aby uniknąć pominięcia niektórych etapów transmisji synaptycznej, które chce się zbadać22.

Opisane przez nas podejście eksperymentalne umożliwia równoległą ocenę fizjologicznego znaczenia wielu genów presynaptycznych będących przedmiotem zainteresowania w ograniczonym okresie czasu (4-6 miesięcy). Należy jednak pamiętać, że nokdauny rzadko sięgają 100%. Co więcej, rAAV muszą być eksprymowane przez co najmniej dwa tygodnie, aby umożliwić maksymalne wyłączenie i pełną ekspresję sondy optogenetycznej, co może stanowić ograniczenie czasowe podczas badania wczesnych procesów rozwojowych. Chociaż jest to bardziej czasochłonne, myszy z warunkowym nokautem ograniczone do neuronów presynaptycznych, zazwyczaj skutkują całkowitym usunięciem genu będącego przedmiotem zainteresowania i dlatego oferują ważne podejście uzupełniające.

Szczególną zaletą technologii miR jest to, że umożliwia ona ekspresję wielu miR z tego samego promotora. Ta właściwość została wykorzystana głównie do zwiększenia wydajności knockdown poprzez wstawienie wielu kopii tego samego miR lub różnych miR przeciwko temu samemu genowi docelowemu. Może być jednak również używany do niszczenia wielu genów poprzez ekspresję miR przeciwko różnym genom docelowym 7,23. Ta właściwość może być wykorzystana do wyciszenia wielu białek presynaptycznych w celu przeanalizowania presynaptycznych szlaków sygnałowych.

Tutaj połączyliśmy optogenetykę ze sztucznymi miR, aby scharakteryzować wpływ knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w ostrych wycinkach hipokampa. Podobne podejście można również zastosować do manipulowania i badania obwodów neuronalnych in vivo. Ponadto połączenie sztucznych miR z metodami chemogenetycznymi umożliwiłoby badanie obwodów neuronalnych w dłuższych skalach czasowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) za wsparcie i Carmela Vitale za pomoc w demonstracji. Praca ta została sfinansowana przez IIT i Compagnia San Paolo (grant nr 9734 dla LAC).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AkrylamidSigmaAkrylamid/Bis-akrylamid, roztwór 30%Regulator temperatury toksycznych
zwierząt z poduszką termicznąWPIATC2000
Zestaw do oznaczania białek BCAThermoFisher Scientific23225
BLOCK-iT Pol II miR RNAiThermoFisher ScientificK4936-00
Plastry mózgu Komora wstępnaHarvard ApparatusBSC-PC
CCD kamera termowizyjnaBio-RadChemiDoc™
hodowli komórkowychTechnologie życia Podłoże
chemiluminescencyjneGE HelthcareECL Western Blotting Odczynniki, RPN2106
ChloroformSigmaC2432Cytozyna
toksyczna β-D-arabinofuranozydSigmaC6645
WiertłoForedomK.1030
EGTASigmaE4378
Maść gentamycyna Aptekalokalna
GlukozaSigmaG7021
HepesSigma54459
Mikropipety iniekcyjneNarishigeGD1
Sole nieorganiczne i detergentySigma
K2- fosforan kreatynyCalbiochem237911
KGlukonianFluka60245
LaserLaserglow TechnologiesLRS-0473-GFM-00100-03
MembranaAmershamProtran™ 0,2 µ m NC
MgATPSigmaA9187
Uchwyt do mikropipetNarishigeIM-H1
Ściągacz do mikropipetNarishigePC-100
Na3GTPSigmaG8877
NaPyrgronianSigmaP5280
Smar do oczuLokalna aptekaLacrigel
Inhibitory fosforanoweSigmaP0044, P5726
Inhibitory proteazySigmacOmplete™, Inhibitor proteazy bez EDTA Koktajl
białkowy Żel białkowy urządzenia do elektroforezy i blottinguBio-RadMini-Protean III Cell
Providone JodApteka lokalnaBetadine
Qiazol Odczynnik do lizyQiagen79306Toxic
QuantiTect Reverse
Zestaw do transkrypcji		Qiagen205311
RNeasy Micro KitQiagen74004
SpektrofotometrThermoFisher ScientificNanodrop 2000
Aparat stereotaktycznyWPI
TetrodotoksynaTocris1069Toksyczna
VibratomeLeicaVT1200S
Zestaw wektorów ekspresji Odczynniki do MP

Bibliografia

  1. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252(2015).
  2. Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
  3. Maejima, T., et al. Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice. J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).
  4. Mark, M. D., et al. Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations. J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).
  5. Thalhammer, A., et al. Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity. Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).
  6. Sambrook, J., Russell, D. W. Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  7. Chung, K. H., et al. Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155. Nucleic Acids Res. 34 (7), e53(2006).
  8. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348(2011).
  9. Cingolani, L. A., et al. Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins. Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).
  10. Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition. J Vis Exp. (92), e51845(2014).
  11. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), (2002).
  12. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  13. Paxinos, G., Franklin, K. B. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  15. Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
  16. Bourinet, E., et al. Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels. Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).
  17. Chaudhuri, D., et al. Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels. J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).
  18. Soong, T. W., et al. Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation. J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).
  19. Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).
  20. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  21. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  22. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
  23. Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi. Nucleic Acids Res. 44 (5), e48(2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sztuczne mikroRNAkonstrukt wirusowyostre skrawki m zguinterferencja RNAkr tko trwa a plastyczno synaptycznakana y VGCC typu P Q
Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.