Tutaj przedstawiliśmy metody wykrywania autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych za pomocą testów elektrochemiluminescencyjnych (ECL). Protokół, stosowany do przewidywania cukrzycy typu 1, może być rozszerzony o wykrywanie autoprzeciwciał przeciwko innym chorobom autoimmunologicznym.
Artykuł metodologiczny
Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wskazanie autoprzeciwciał wysp trzustkowych związanych z cukrzycą typu 1 (T1D) prowadzi do rozprzestrzeniania i powstrzymywania tej choroby w populacji ogólnej. Nowy test ECL to nieradioaktywny test fazy płynnej dla autoprzeciwciał wysp trzustkowych o wyższej czułości i swoistości niż obecny "złoty" standardowy test wiązania promieniotwórczego (RBA). Testy ECL mogą bardziej precyzyjnie określić początek przedobjawowej cukrzycy typu 1 poprzez odróżnienie autoprzeciwciał wysokiego ryzyka i wysokiego powinowactwa od autoprzeciwciał niskiego ryzyka i niskiego powinowactwa generowanych w RBA i konwencjonalnych testach immunoenzymatycznych (ELISA). Białko antygenowe użyte w tym teście ECL jest znakowane odpowiednio znacznikiem sulfo i biotyną. Każdy test autoprzeciwciał ECL, który wykorzystuje określone białko antygenowe, wymaga etapu optymalizacji, zanim będzie mógł zostać wykorzystany do zastosowań laboratoryjnych. Ten krok jest szczególnie istotny przy określaniu wymagań dotyczących leczenia kwasami w surowicy, stężeń i proporcji dwóch różnych antygenów znakowanych sulfoznacznikiem i biotyną. Aby wykonać test, próbki surowicy miesza się z białkiem antygenu wychwytującego sprzężonym z sulfo-znacznikiem i biotynylowanym w roztworze buforowanym fosforanem (PBS), zawierającym 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Następnie próbki są inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C. Tego samego dnia przygotowuje się płytkę pokrytą streptawidyną z buforem blokującym i inkubuje przez noc w temperaturze 4 °C. Drugiego dnia umyj płytkę streptawidyny i przenieś mieszaninę surowicy i antygenu na płytkę. Umieścić płytkę na wytrząsarce do płytek, ustawić ją na niskich obrotach i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie płyta jest ponownie myta i dodawany jest bufor czytnika. Tabliczka jest następnie zliczana na czytniku płytek. Wyniki są przenoszone przez indeks, który jest generowany z próbek surowicy kontrolnej dodatniej i ujemnej wzorca wewnętrznego.
Wprowadzenie
Niedawno stworzono system klasyfikacji stopnia zaawansowania, aby pomóc w diagnozowaniu początkowych stadiów T1D u pacjentów. Dokładne wykrycie ludzkich autoprzeciwciał wysp trzustkowych odgrywa ważną rolę w identyfikacji i ocenie stopnia zaawansowania przedobjawowej cukrzycy typu 1, ponieważ obecność autoprzeciwciał wysp trzustkowych wskazuje na obecność autoimmunizacji komórek β. Szybkość, z jaką cukrzyca dotyka pacjentów od początkowego wystąpienia autoimmunizacji komórek β do objawowej choroby, związanej z liczbą i typem autoprzeciwciał wysp trzustkowych, jest zmienna2,3.
Wiek serokonwersji autoprzeciwciał, miano i powinowactwo autoprzeciwciał wysp trzustkowych mogą wpływać na tempo progresji do objawowej cukrzycy typu 14,5,6,7,8,9,10. Ostatnio opracowane testy ECL zostały szeroko zwalidowane, wykazały zwiększoną czułość i są bardziej specyficzne dla choroby10,11,12,13. Testy te poprawiają przewidywanie i ocenę stopnia zaawansowania cukrzycy poprzez wcześniejsze wykrywanie autoprzeciwciał wysp trzustkowych. Dokładniej oznaczają one inicjację autoimmunizacji wysp trzustkowych i ignorują sygnały o niskim powinowactwie i niskim ryzyku, które nie mają związku z cukrzycą.
W teście ECL, autoprzeciwciała w surowicy, jeśli są obecne, łączą antygen sprzężony z Sulfo-tag z biotynylowanym antygenem wychwytywania w fazie płynnej. Po zmostkowaniu łącznik biotyny jest wychwytywany w fazie stałej i wykrywany przez ECL przez znacznik sulfo na płytce pokrytej streptawidyną (ryc. 1).
W tym przeglądzie, testy ECL pojedynczego przeciwciała z autoprzeciwciałami ludzkich wysp trzustkowych są głównie wykorzystywane. Pokrótce omówione zostaną multipleksowane testy przeciwciał oparte na pojedynczych testach ECL. Test multipleksowy można wykorzystać do identyfikacji wielu, do 10 autoprzeciwciał w jednym dołku, przy użyciu 15 μl surowicy. Ten prosty, wysokoprzepustowy test może być stosowany do jednoczesnych badań przesiewowych wielu autoprzeciwciał pod kątem wielu istotnych chorób autoimmunologicznych w populacji ogólnej.
Protokół
1. Przygotowanie bufora
- Bufor do znakowania (2x PBS, pH 7,9): W 400 ml destylowanej wody dejonizowanej (DD) dodaj 100 ml 10x PBS, dostosuj pH do 7,9 za pomocą NaOH.
- 3 mM biotyny: Rozpuść 1 mg biotyny w 588 μl buforu znakującego.
- 3 mM znacznika Sulfo: Rozpuść 150 nmol znacznika Sulfo w 50 μl buforu do znakowania.
- Bufor antygenowy (5% BSA): W 500 ml 1x PBS dodaj 25 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
- Przygotować 0,5 M roztwór kwasu octowego.
- 1,0 M buforu Tris-HCl pH 9,0: Przygotuj 1 M bufor Tris-HCl i dostosuj pH do 9,0 za pomocą HCl.
- Bufor powlekający (3% Bloker A): W 500 ml 1x PBS dodać 15 g Blockera A.
- Bufor do płukania (0,05 % Tween 20, PBST): W 5000 ml 1x PBS dodaj 2,5 ml Tween 20.
- Bufor odczytu (2x bufor do odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym): W 500 ml wody DD dodać 500 ml 4x buforu do odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym (tabela materiałów).
- Przechowuj biotynę i sulfo-tag w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Zarówno roztwory Biotyny, jak i Sulfo-znacznika powinny być zawsze świeżo przygotowane tuż przed procedurą etykietowania.
2. Oznacz autoantygen ludzkich wysp trzustkowych za pomocą biotyny i znacznika Sulfo
Uwaga: Wysokie stężenie antygenu, ≥0,5 mg/ml, jest zalecane dla bardziej efektywnej reakcji znakowania.
- Określ stosunek molowy ludzkiego autoantygenu wysp trzustkowych dla biotyny i znacznika sulfo.
- Liczbę molową antygenu należy uzyskać, dzieląc masę antygenu przez masę cząsteczkową.
- Dla antygenu o mniejszej masie cząsteczkowej (≤10 kd) należy zastosować stosunek molowy 1:5, a dla antygenu o większej masie cząsteczkowej (>50 kd) stosunek molowy 1:20.
- Oblicz objętość biotyny lub sulfo-znacznika, dzieląc liczbę molową przez jej stężenie.
- Wymieszaj ludzki autoantygen wysp trzustkowych z biotyną lub znacznikiem sulfo o stosunku molowym 1:5,
UWAGA: Białko w systemach buforowych tris lub glicyny należy wymienić na bufor 2x PBS o pH 7,9 za pomocą kolumny wirowania według wielkości. - Ponieważ Biotyna i Sulfo-tag są wrażliwe na światło, przykryj probówki reakcyjne folią aluminiową. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.
- Podczas inkubacji należy zalać kolumnę wirową, trzykrotnie dozując 2x bufor PBS do kolumny. Odwirować roztwór o stężeniu 1000 x g przez 2 minuty za każdym razem.
UWAGA: Obecnie reakcja etykietowania, polegająca na mostkowaniu, nadal występuje i musi zostać zatrzymana. - Zatrzymaj reakcję znakowania, oczyszczając znakowany autoantygen ludzkich wysp trzustkowych. Aby oczyścić, przepuścić autoantygen przez kolumnę wirową i odwirować kolumnę przy 1000 x g przez 2 minuty.
- Oznaczyć znakowane stężenie antygenu (μg/μl) za pomocą ilości białka antygenu i objętości końcowej.
UWAGA: W przybliżeniu po każdym przejściu kolumny wirowania nastąpi 90 - 95% retencji znakowanego antygenu. - Podwielokrotnić znakowany antygen i przechowywać znakowany antygen w temperaturze -80 °C.
3. Zdefiniuj najlepsze stężenia i proporcje dla dwóch znakowanych antygenów do testu (test Checker Board)
- Przygotować dwie próbki surowicy, jedną wysoce dodatnią i jedną ujemną, o całkowitej objętości 200 μl dla każdej.
- Podaniec 4 μl surowicy i dodawać 1x PBS, aż ostateczna objętość wyniesie 20 μl na basenik dla 96-dołkowej płytki PCR. Użyj połowy płytki dla próbki o wysokim dodatnim wyniku, a drugiej połowy dla próbki ujemnej, jak pokazano na Rysunek 2A.
- Dodać 10 μl biotyny i 10 μl antygenu znakowanego sulfoznacznikiem i przeprowadzić seryjne rozcieńczenia dla dwóch różnie znakowanych antygenów, jak pokazano na Rysunek 2A. Uruchomić poziome rozcieńczenie szeregowe dla jednego znakowanego antygenu i pionowe rozcieńczenie szeregowe dla drugiego znakowanego antygenu.
- Kontynuować pozostałe etapy oznaczania opisane w ppkt 5.3–9.1.
- Oblicz stosunek sygnałów z próbki o wysokim poziomie dodatnim do każdego z odpowiadających im sygnałów z próbki ujemnej pokazanej na rysunku Rysunek 2B.
- Zidentyfikuj najlepsze stężenia antygenów znakowanych biotyną i sulfo, wybierając punkt o najwyższym lub prawie najwyższym stosunku dodatnim do ujemnego. Weź pod uwagę niski sygnał tła z próbki ujemnej, aby określić stosunek.
Uwaga: Dzień testu 1 obejmuje etapy od 4 do 6.
4. Przygotuj bufor antygenowy, używając odpowiedniego stężenia antygenu znakowanego biotyną/sulfoznacznikiem
- Wybierz racjonalne stężenie każdego antygenu na podstawie testu szachownicy.
- Przygotować 3 ml roztworu antygenu na płytkę, stosując racjonalne stężenie antygenu znakowanego biotyną/sulfoznacznikiem dla buforu antygenowego.
5. Inkubuj próbki surowicy z oznakowanym antygenem
Uwaga: W tej sekcji są dwa protokoły, jeden bez leczenia kwasem w surowicy, a drugi z leczeniem kwasem w surowicy. Wszystkie testy autoprzeciwciał na wyspach trzustkowych, z wyjątkiem testu IAA, wykorzystują zwykły protokół bez leczenia kwasem w surowicy od kroków 5.1 do 5.5, podczas gdy test IAA pomija te kroki i stosuje protokół z leczeniem kwasem surowicy od kroków 5.6 do 5.9.
- Podaniec 4 μl surowicy i dodawać 1x PBS, aż ostateczna objętość wyniesie 20 μl na basenik dla 96-dołkowej płytki PCR.
- Dodać 20 μl znakowanego roztworu antygenu do dołka.
- Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.
- Umieść płytkę na wytrząsarce (niska prędkość) przy RT na 2 godziny.
- Umieścić płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C i inkubować przez noc (18 - 24 h).
Uwaga: Poniższy protokół kroków od 5.6 do 5.9 jest przeznaczony tylko dla testów IAA i innych testów autoprzeciwciał, pomiń te kroki. - Zmieszać 15 μl surowicy z 18 μl 0,5 M kwasu octowego dla każdej próbki surowicy. Inkubować tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
- Przygotować roztwór antygenu o racjonalnym stężeniu antygenu znakowanego biotyną i sulfoznacznikiem, w oparciu o test szachownicy, używając buforu antygenowego. W każdym dołku podwielokrotność 35 μl buforu antygenowego, zawierającego biotynę i antygen znakowany sulfoznacznikiem, na nową płytkę PCR.
- Przed zakończeniem 45-minutowej inkubacji (etap 5.6) dodać 8,3 μl 1 M buforu Tris pH 9,0 z boku każdej studzienki na płytce antygenowej (krok 5.6). Ważne jest, aby ograniczyć mieszanie się buforu Tris z antygenem. Natychmiast przenieść 25 μl surowicy, którą w kroku 5.6 potraktowano kwasem, do każdej studzienki i wymieszać roztwór. Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.
- Umieść płytkę na wytrząsarce (niskie obroty) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Umieść płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C i pozostaw płytkę do inkubacji przez noc (18 - 24 godziny).
6. Przygotuj płytkę ze streptawidyną
- Wziąć płytkę ze streptawidyną z lodówki o temperaturze 4 °C i pozostawić ją do zamontowania w temperaturze RT.
- Gdy płytka streptawidyny znajdzie się w temperaturze pokojowej, dodaj 150 μl 3% blokera A do każdej studzienki.
- Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą.
- Inkubować płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.
nuta: Dzień testu 2 obejmuje etapy od 7 do 9.
7. Surowica/antygen transferowy inkubuje się na płytkę streptawidyny
- Następnego dnia wyjmij płytkę ze streptawidyną z lodówki i wyrzuć bufor z płytki. Rozłóż na stole suche ręczniki papierowe i postukaj talerzem do góry nogami, aż w studzienkach nie będzie już bufora.
- Napełnij pustą płytkę streptawidyny 150 μl PBST na studzienkę i wyrzuć PBST z płytki, co daje łącznie trzy prania.
- Przenieść 30 μl inkubacji surowicy/antygenu na dołek do płytki streptawidyny.
- Przykryj talerz folią, aby uniknąć światła. Potrząsaj płytką na niskim poziomie w temperaturze RT przez 1 godzinę.
8. Umyj płytkę i dodaj bufor do odczytu
- Wyrzuć inkubatory z płytki. Dodać 150 μl PBST do dołka i wyrzucić PBST z płytki, w sumie trzy prania.
- Po umyciu dodać 150 μl do studzienki buforu odczytowego.
UWAGA: Ważne jest, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza w roztworze, ponieważ wpłynie to na sposób odczytywania tabliczki na czytniku płytek.
9. Odczyt tabliczki i analiza danych
- Policz tabliczkę na czytniku płyt. Wartości przeciwciał są wyświetlane jako liczby na sekundę (CPS).
- Przekaż poziomy przeciwciał otrzymane z czytnika płytek jako wskaźnik względny. Oblicz indeks z następującego równania:
Wartość indeksu = [CPS (próbka) - CPS (kontrola ujemna)] / [CPS (kontrola dodatnia) - CPS (kontrola ujemna)]. - Zidentyfikuj pozytywne i ujemne wyniki przeciwciał za pomocą wartości odcięcia dla dodatniości, zdefiniowanej na podstawie 99. percentyla 100 zdrowych osób kontrolnych (osoby bez cukrzycy bez znanych chorób autoimmunologicznych i które nie mają historii cukrzycy w rodzinie).
Wyniki
Rycina 2 przedstawia analizę szachownicową (checker board). Wykazano, że stężenia 250 ng/mL biotyny oraz 250 ng/mL antygenu znakowanego Sulfo-tag są najbardziej optymalnymi stężeniami do zastosowania w teście, biorąc pod uwagę sygnały z próbki silnie dodatniej kontroli, próbki kontroli ujemnej jako tła testu oraz stosunek sygnałów dodatnich do ujemnych. Przy zoptymalizowanych stężeniach tych dwóch znakowanych antygenów test przeprowadzono z próbkami surowicy od 100 nowo zdiagnozowanych pacjentów z T1D oraz 100 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Wartość wskaźnika 0,023 zdefiniowano jako punkt odcięcia (cut-off) testu dla wyników dodatnich. Reprezentuje to 85% czułości u pacjentów i 99% swoistości w grupie kontrolnej, co określono na podstawie krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) przedstawionej na Rycini 3A. Analiza nieznanych próbek została przeprowadzona z wykorzystaniem wewnętrznych standardów: silnie dodatnich, słabo dodatnich oraz próbek kontroli ujemnej. Wyniki zliczeń CPS przedstawiono w Tabeli 2A. Średnie wartości CPS dla kontroli silnie i słabo dodatnich wyróżniono na czerwono: 17903 [(19940+15866)/2] oraz 839 [(857+820)/2], natomiast kontrole ujemne wyróżniono na zielono: 168 [(170+165)/2]. Wskaźnik dla nieznanych próbek oblicza się według wzoru „(CPSpróbki-168)/(17903-168)”. Tabela 2B przedstawia obliczone wartości wskaźnika dla wszystkich próbek. Wartości wskaźnika większe od 0,023 zapisano na czerwono, co odpowiada wartościom CPS również zaznaczonym na czerwono w Tabeli 2A. Wartości te definiuje się jako wyniki dodatnie, które przekraczają 99-ty percentyl populacji zdrowej grupy kontrolnej. W przypadku zastosowania nieoptymalnego stężenia antygenu test będzie charakteryzował się wysokim tłem, co pokazano w Tabeli 2C. Niskie poziomy przeciwciał dodatnich zostaną pominięte, tak jak wartości A2, A5, D1 i H4 wyróżnione na szaro w Tabeli 2D.
Rycina 1: Ilustracja bivalentnego wychwytywania na płytce w pojedynczym teście ECL-IAA. Autoprzeciwciało przeciwko wysepkom trzustkowym w surowicy tworzy mostek między antygenem sprzężonym z Sulfo-tag a biotynilowanym antygenem wychwytującym, który jest wiązany w fazie stałej na płytce pokrytej streptawidyną. Detekcja wychwyconego na płytce antygenu sprzężonego z Sulfo-tag odbywa się za pomocą ECL. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Yu, et al.11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Krzywa ROC służąca do wyznaczenia punktu odcięcia dla dodatniego wyniku testu. Wybrano 99ty percentyl swoistości odpowiadający czułości 85%, który został przedstawiony jako wartość wskaźnika 0,023. Ta górna granica testu została wyznaczona na podstawie 100 zdrowych kontroli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Ilustracja blokowania sygnałów ECL-IAA przez prawidłową ludzką surowicę. A: Sygnały z testów ECL-IAA z przeciwciałem monoklonalnym (MoAb) przeciw insulinie zostały drastycznie zablokowane po dodaniu prawidłowej ludzkiej surowicy. W porównaniu z MoAb w PBS, sygnał został częściowo przywrócony po poddaniu ludzkiej surowicy działaniu kwasu. B: Sygnały z testu ECL-IAA z 4 surowicami pacjentów uległy znacznemu wzmocnieniu po obróbce kwasem. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Yu, et al.11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Ilustracja multipleksowego testu ECL. Kompleksy przeciwciało-antygen tworzą się w fazie ciekłej z zastosowaniem specyficznych łączników. Specyficzne kompleksy przeciwciało-antygen-łącznik są unieruchamiane na poszczególnych miejscach dla konkretnych łączników w tej samej studzience. Czytnik płytek jest w stanie rozróżnić sygnały pochodzące z różnych punktów i podaje wartości CPS w 10 różnych kanałach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Tabela 1: Test szachownicy (checker board assay) do wyznaczenia stężeń i stosunków antygenów znakowanych biotyną i Sulfo-tagiem. A: Surowe wartości zliczeń CPS dla płytki szachownicy z wysokopozytywnym surowicą na połowie płytki i surowicą negatywną na drugiej połowie. Stężenie antygenu biotynylowanego rozcieńczano szeregowo w poziomie, a stężenie antygenu znakowanego Sulfo-tagiem rozcieńczano szeregowo w pionie. B: Wartości stosunku zliczeń CPS z wysokopozytywnej surowicy do odpowiadających im zliczeń CPS z surowicy negatywnej. Podświetlone na żółto studzienki reprezentują najlepszy stosunek wyników pozytywnych do negatywnych w panelu B. Stosunek ten odpowiada stężeniom 250 ng/mL antygenu znakowanego biotyną oraz 250 ng/mL antygenu znakowanego Sulfo-tagiem w panelu A, przy akceptowalnie niskim zliczeniu CPS dla surowicy negatywnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.
Tabela 2: Analiza wyników testu. A: Surowe wartości zliczeń CPS z płytki testowej, w której standardowe wysokie i niskie kontrole pozytywne zaznaczono na czerwono, a standardowe kontrole negatywne na zielono. Każda próbka została wykonana w dublecie. B: Obliczone wartości indeksu zgodnie z opisem w protokole testu. Każda wartość indeksu większa niż 0,023 została zdefiniowana jako wynik pozytywny i zaznaczona na czerwono. C: Surowe wartości zliczeń CPS z płytki testowej dla tego samego zestawu próbek przy zastosowaniu nieracjonalnego stężenia antygenu. Skutkowało to wysokim tłem, a niektóre niskie wyniki pozytywne, wykryte normalnie (jak pokazano w panelu B), zmieniły się w wyniki negatywne, zaznaczone na szaro w panelu D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.
Dyskusja
Autoprzeciwciała wysp trzustkowych są obecnie najbardziej wiarygodnymi biomarkerami autoimmunizacji cukrzycy typu 1. Wskazują one początek autoimmunizacji specyficznej dla wysp trzustkowych i określają jawne ryzyko choroby. Test ECL dla autoprzeciwciał wysp trzustkowych został szeroko zwalidowany w wielu krajowych i międzynarodowych badaniach klinicznych dotyczących cukrzycy typu 1. Test wykazał zwiększoną czułość i swoistość w porównaniu z obecnymi "złotymi" standardami RBA. Test ECL wykazał swoją nadrzędną przewagę w zakresie wyższej swoistości choroby poprzez odróżnienie autoprzeciwciał wysp trzustkowych o wysokim powinowactwie i wysokim ryzyku od sygnałów niskiego ryzyka i niskiego powinowactwa generowanych przez RBA. Jest to szczególnie zauważalne u osób, które są tylko dodatnimi autoprzeciwciałami przeciwko pojedynczym wyspom trzustkowym i nigdy nie rozwinęły się do cukrzycy typu 1. Stwierdzono, że większość z tych autoprzeciwciał o niskim powinowactwie została utracona podczas badań kontrolnych przeprowadzonych w ciągu kilku miesięcy lub lat, zachowując się jako "przejściowo dodatnie". Jak wcześniej przypuszczano, te "pojedyncze" autoprzeciwciała o niskim powinowactwie prawdopodobnie powstały w wyniku immunizacji cząsteczką reagującą krzyżowo. Podczas gdy wyższe powinowactwo, autoprzeciwciała wysp trzustkowych wyższego ryzyka wynikały z immunizacji samymi antygenami wysp trzustkowych. Ponadto testy ECL wykazały zdolność do wyprzedzania czasu "serokonwersji" z obecnych standardowych testów wiązania promieniotwórczego (RBA) o lata u dzieci ze stanem przedcukrzycowym, u których od urodzenia obserwowano cukrzycę kliniczną. Trwające międzynarodowe badanie kliniczne "The Environmental Determinants of Diabetes in the Young" (TEDDY) opiera się na dokładnym wykrywaniu, aby określić czas i pojawienie się "serokonwersji" pierwszego autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym, aby wyznaczyć sam początek autoimmunizacji wysp trzustkowych i zidentyfikować czynniki środowiskowe. Możliwym powodem zwiększonej czułości w teście ECL jest to, że test obejmuje wszystkie klasy immunoglobulin: IgG, IgM, IgA lub IgE, a nie tradycyjne RBA lub ELISA, które opierają się tylko na wykryciu IgG.
W testach ECL, dla niektórych szczególnych autoprzeciwciał, takich jak IAA, wiązanie autoprzeciwciał z antygenem wydaje się być hamowane przez jakiś składnik obecny w normalnej ludzkiej surowicy. Aby usunąć lub uwolnić to hamowanie, konieczne było poddanie próbek surowicy działaniu kwasu przed inkubacją surowicy z antygenem. Jak pokazano w [Figura 5], test ECL-IAA, aktywność wiązania zarówno mysiego przeciwciała monoklonalnego insuliny, jak i autoprzeciwciał w surowicy pacjentów z antygenem została znacznie zwiększona. Zakwaszenie próbek surowicy, stosowane w testach przeciwciał, jest zwykle stosowane w celu odłączenia wcześniej istniejących związanych kompleksów. Mechanizm hamowania sygnałów IAA w próbkach surowicy ludzkiej i uwalniania przez zakwaszenie surowicy nie jest znany, ale metoda ta została zastosowana w innych testach opartych na ECL14,15.
W kilku przypadkach, podczas znakowania cząsteczek, zarówno biotyny, jak i znacznika sulfo, pozycje znakowania wewnątrz cząsteczek białka antygenu znajdują się na lub bardzo blisko kluczowych epitopów wiązania przeciwciał, co może zakłócać aktywność wiązania z przeciwciałami. Zmniejszy to czułość testu i może całkowicie go zniszczyć. W przypadku rutynowej procedury znakowania pożądana jest maksymalizacja lub nasycenie dla każdej cząsteczki białka antygenowego, aby wygenerować maksymalną aktywność lub sygnał na znakowaną cząsteczkę poprzez maksymalizację zdolności znakowania każdej możliwej pozycji znakowania. Znakowanie nienasycone powinno być przeprowadzane poprzez zmniejszenie stosunku molowego cząsteczek znakujących (biotyny i znacznika sulfo) do białka antygenu, jeśli znakowanie antygenu staje się możliwą przyczyną przerwania aktywności wiązania przeciwciał. Główne epitopy mogą być lepiej zarezerwowane, a przerwanie aktywności wiązania przeciwciał może zostać uwolnione przy użyciu strategii znakowania nienasyconego w większości przypadków.
Każdy test powinien zawierać wzorzec wewnętrzny o wysokiej kontroli dodatniej i ujemnej do obliczeń indeksu nieznanych próbek. Niski poziom kontroli dodatniej w pobliżu górnej granicy normalnych kontroli testu jest ważny, aby uwzględnić go przy monitorowaniu czułości testu. Laboratorium powinno przechowywać wystarczającą ilość podwielokrotności standardowych kontroli dodatnich i ujemnych do długotrwałego stosowania, a wszystkie podwielokrotności powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C. W celu zapewnienia jakości badania muszą być przeprowadzane w dwóch egzemplarzach dla każdej próbki, a każdy pozytywny wynik powinien być potwierdzony poprzez powtórzenie próbki w oddzielnym badaniu. Trzecie badanie jest konieczne, gdy drugi test potwierdzający nie zgadza się z pierwszym testem, a wyniki dwóch testów, które są zgodne (np. +,+ lub -,-), będą ostatecznym określeniem wyniku dodatniego lub ujemnego.
Dzięki platformie ustawionej do pojedynczych testów ECL, test multipleksowany może być rozszerzony na ich podstawie. Może jednocześnie oznaczać do 10 różnych autoprzeciwciał w jednym dołku przy użyciu niewielkiej ilości surowicy. Obecnie cztery autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym, w tym IAA,, IA-2A i ZnT8A, mają równe znaczenie w przewidywaniu ryzyka progresji do T1D zarówno u krewnych pacjentów z cukrzycą typu 1, jak i w populacji ogólnej. Metody stosowane do badań przesiewowych tych 4 autoprzeciwciał przy użyciu obecnych pomiarów pojedynczych autoprzeciwciał są pracochłonne i nieefektywne, szczególnie w przypadku badań przesiewowych populacji na dużą skalę. Co ważne, nawet 40% pacjentów z cukrzycą typu 1 ma dodatkową chorobę autoimmunologiczną 16,17,18. Niestety, nie ma łatwego i niedrogiego narzędzia do badania przesiewowego pod kątem tych warunków. Multipleksowy test ECL jest nie tylko w stanie połączyć 4 obecne testy autoprzeciwciał głównych wysp trzustkowych w jeden, ale także jest w stanie połączyć więcej testów autoprzeciwciał z innych istotnych chorób autoimmunologicznych. Umożliwia to skuteczne przeprowadzanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku wielu chorób autoimmunologicznych jednocześnie w dużych populacjach. W multipleksowym teście ECL, jak pokazano na [Ryc. 6], każdy kompleks przeciwciało-antygen utworzony w fazie płynnej zostanie ograniczony do określonego miejsca źródła łącznika w tej samej studzience. Odbiornik sygnału na czytniku płytek jest w stanie rozpoznać sygnały z 10 różnych źródeł plamek. Jednak plamki o bardzo wysokim sygnale mogą generować wysokie tło testu i powodować zakłócenia w sąsiednich miejscach poprzez przesłuchy. Z tego powodu górny limit sygnałów dla każdego testu autoprzeciwciał powinien być ograniczony do mniej niż 20 000 zliczeń. Z naszego doświadczenia wynika, że autoprzeciwciała o niższym tle powinny być umieszczone stosunkowo daleko od tych miejsc, w których ich liczba jest wyższa, gdy projektowana jest mapa punktowa. W przypadku badań długoterminowych z wykorzystaniem multipleksowych testów ECL zaleca się stosowanie tego samego łącznika do tego samego testu autoprzeciwciał, aby zachować spójność testu.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez DK32083 grantu NIH, JDRF Grant 2--2015-51-Q-R.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ludzkie rekombinowane białko proinsuliny (PINS) | AmideBio | Ludzka proinsulina, Rec | |
| Ludzkie rekombinowane białko GAD65 | Diamyd | rhGAD65 | |
| Ludzkie rekombinowane białko IA-2 | Creative BioMart | IA2 | |
| 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| 10x PBS, pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | SIGMA-ALORICH | A7906-500G | |
| 96-dołkowa płytka PCR | Fisher | 14230232 | |
| Talerz pokryty streptawidyną | MSD | L15SA | |
| Kolumna spinowa do wymiarowania Zeba | Thermo Fisher Scientific | 89890 | |
| Twen-20 | Fisher | BP337-500 | |
| HCl | Fisher | A144-500 | |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| EZ-Link Biotyna | Thermo Fisher Scientific | PI21329 | |
| Sulfo-tag | MSD | R91AO-1 | |
| Bloker A | MSD | R93AA-1 | |
| 4x Bufor odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym | MSD | R92TC-1 | |
| EZ-Link NHS-PEG4-Biotyna | ThermoScience | 21329 | |
| Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
| 96-dołkowa płytka do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) | Marka Fisher | 14230232 | |
| 96-dołkowa płytka streptawidyny | MSD GOLD | L 15SA-1 | |
| Zeba Spin Kolumna odsalająca | ThermoScience | PL208984 | |
| 96-dołkowa wytrząsarka do płytek | Perkin Elmer | 1296-003 | |
| Czytnik płytek | MSD | QuickPlex SQ120 | |
| Wirówka stołowa z kubełkiem obrotowym | Beckman | Allegra X-15R |
Bibliografia
- Insel, A. I., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Steck, A. K., et al. TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY). Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).
- Krischer, J. P., et al. TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study. Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).
- Achenbach, P., et al. Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics. Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).
- Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. Natural history of type 1 diabetes. Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).
- Steck, A. K., et al. Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young. Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).
- Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).
- Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Yu, L. Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).
- Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients. J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).
- Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays. J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).
- Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).
Przedruki i uprawnienia
