Rekonfigurowalny kanał mikroprzepływowy z dyskretnymi ściankami bocznymi

Podsumowanie

Kanał mikroprzepływowy z odkształcalnymi ściankami bocznymi oferuje kontrolę przepływu, obsługę cząstek, dostosowywanie wymiarów kanału i inne rekonfiguracje podczas użytkowania. Opisujemy metodę wytwarzania kanału mikroprzepływowego ze ściankami bocznymi wykonanymi z układu pinów, który umożliwia zmianę ich kształtu.

Streszczenie

Komponenty mikroprzepływowe muszą mieć różne kształty, aby realizować różne kluczowe funkcje mikroprzepływowe, takie jak mieszanie, separacja, zatrzymywanie cząstek lub reakcje. Kanał mikroprzepływowy, który odkształca się nawet po wyprodukowaniu, zachowując jednocześnie kształt kanału, umożliwia wysoką rekonfigurowalność czasoprzestrzenną. Ta rekonfigurowalność jest wymagana w takich kluczowych funkcjach mikroprzepływowych, które są trudne do osiągnięcia w istniejących "rekonfigurowalnych" lub "zintegrowanych" układach mikroprzepływowych. Opisujemy metodę wytwarzania kanału mikroprzepływowego z odkształcalną ścianą boczną składającą się z bocznie ustawionego układu końców prostokątnych kołków. Uruchamianie kołków w kierunkach wzdłużnych zmienia położenie końcowe kołków, a co za tym idzie, kształt dyskretnych ścianek bocznych kanału. Szczeliny między kołkami mogą powodować niepożądane przecieki lub przyleganie do sąsiednich kołków spowodowane siłami łąkotki. Aby wypełnić luki w sworzniach, wprowadziliśmy wypełniacz szczelin na bazie zawiesiny węglowodorowo-fluoropolimerowej, któremu towarzyszy bariera elastomerowa. To rekonfigurowalne urządzenie mikroprzepływowe może generować silny czasowy przepływ przemieszczenia w kanale lub może zatrzymać przepływ w dowolnym obszarze kanału. Ta funkcja ułatwi, na żądanie, obsługę ogniw, lepkich cieczy, pęcherzyków gazu i niepłynów, nawet jeśli ich istnienie lub zachowanie jest nieznane w momencie wytwarzania.

Wprowadzenie

Urządzenia mikroprzepływowe - mikrourządzenia, które kontrolują małe ilości cieczy i ich przepływy - oferują miniaturyzację procedur biomedycznych do formatu "chip" z większą przenośnością i, często, przystępnością cenową. Jak opisano w niedawnym przeglądzie¹, różne komponenty mikroprzepływowe składające się z przestrzeni i pozytywnych cech zostały opracowane w celu realizacji podstawowych i kluczowych funkcji płynów, takich jak mieszanie, separacja, zatrzymywanie cząstek lub reakcje.

Podczas gdy zachowanie wielu urządzeń mikroprzepływowych jest określane na etapie projektowania, niektóre rodzaje urządzeń mikroprzepływowych pozwalają na zmiany ich struktury lub zachowania po produkcji. Tutaj odnosimy się do tej funkcji jako "rekonfigurowalności". Rekonfigurowalność systemów mikroprzepływowych zazwyczaj skraca czas i koszty wymagane do zaprojektowania urządzenia i/lub umożliwia dostosowanie układu lub funkcji mikroprzepływowych w czasie.

Poprzednio opisane rekonfigurowalne urządzenia mikroprzepływowe dzielą się na następujące trzy kategorie. W pierwszym przypadku odkształcenie kanałów elastomerowych pozwala na zmianę natężenia przepływu i kierunków przepływu podczas użytkowania. Aby uzyskać rekonfigurowalność, kanały elastomerowe są odkształcane przez różne zewnętrzne i kontrolowane siły, takie jak pneumatyczne źródła ciśnienia², siłowniki Braille'a³, lub kompresyjne uszczelnienie⁴. W drugim przypadku rekonfigurowalne urządzenia opierają się na konstrukcjach modułowych, takich jak wielowarstwowe obwody płynowe, modułowe kanały z połączeniami magnetycznymi oraz mikrofluidyka oparta na rurkach⁵. W trzecim przypadku samo urządzenie nie jest rekonfigurowalne, ale transport mikrokropel na matrycach elektrod (często określanych jako mikrofluidyka cyfrowa)^6,7 i wiszące urządzenia mikroprzepływowe oparte na kroplach⁸ umożliwiają przełączanie przepływu lub trasy płynu na żądanie.

Niemniej jednak, wiele z tych rekonfiguracji jest ograniczonych na poziomie topologicznym i makroskopowym. Na przykład wiele zintegrowanych urządzeń mikroprzepływowych zatrzymuje przepływ lub zmienia kierunek przepływu poprzez zapadanie mikrokanałów w predefiniowanych obszarach. Jednak położenie i liczba regionów, które mają zostać zwinięte, nie są ponownie konfigurowalne. Chociaż cyfrowa mikrofluidyka ma różne możliwości obsługi płynów, możliwe przepływy powinny być w dużej mierze ograniczone objętością każdej kropli. Ponadto, gdy komórki są hodowane w takich kropelkach pożywki do hodowli komórkowych, potrzebny jest dodatkowy wysiłek, aby zapobiec parowaniu i rozpraszaniu gazu z kropelek oraz uniknąć szoku osmolalności i nagłej zmiany pH.

Aby zapewnić możliwość rekonfiguracji na poziomie funkcji kanału, zaproponowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe z ruchomymi ściankami bocznymi, które składało się z tablic elementów maszyny do dynamicznej rekonfiguracji podczas użytkowania⁹. Aby utworzyć odkształcalną ścianę boczną, małe prostokątne kołki zostały ustawione tak, aby każdy koniec kołków definiował segment ściany bocznej. Przesunięcie kołków pozwoliło na odkształcenie ściany bocznej, co umożliwiło transport lub tworzenie wzoru komórek, pęcherzyków i cząstek wewnątrz kanału. Aby zminimalizować objętość martwą i zmaksymalizować możliwości rekonfiguracji, odległość między sąsiednimi pinami musiała zostać zminimalizowana. Jednak silne działanie kapilarne działające na małe szczeliny między pinami łączącymi wnętrze i zewnętrzną stronę mikrokanalika powoduje wyciek jakiejkolwiek cieczy dostającej się do szczeliny w bolcu, powodując parowanie mediów, zanieczyszczenie bakteryjne lub cytotoksyczne, a ostatecznie śmierć komórki. Dlatego opracowaliśmy szczelne, dyskretne, rekonfigurowalne kanały mikroprzepływowe typu ścianka boczna, które wytrzymują cykliczne działania pinów i długoterminową hodowlę komórek¹⁰.

W tym artykule przedstawiamy protokół budowy mikroprzepływowego urządzenia do hodowli komórek z dyskretną ścianką boczną, które może być rekonfigurowane po stopniowym zwiększaniu obszaru hodowli komórkowej. Szczelność ścianek bocznych kanału dyskretnego jest badana za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Kompatybilność kultur komórkowych i zdolność do modelowania komórek są oceniane przy użyciu hodowli komórkowej na chipie.

Ten system mikroprzepływowy jest odpowiedni wszędzie tam, gdzie nie można z góry określić odpowiedniego projektu kanału i musi on zostać zmieniony na żądanie. Na przykład, system ten może być używany do regulacji szerokości kanału i natężenia przepływu w oparciu o wzrost lub migrację komórek, do przepływu lub wyłapywania aktywnych nicieni lub innych małych obiektów, które zachowują się nieoczekiwanie w kanale, lub do przyjmowania różnych surowych próbek lub bioproduktów, które nie zostały jeszcze poczęte w momencie projektowania.

Protokół

1. Trawienie szpilek (Rysunek 2A)

1. Odtłuścić prostokątne kołki przez zanurzenie w acetonie.
2. Pasywować szpilki, zanurzając je w 4 ml 10% kwasu azotowego, a następnie podgrzewać roztwór w temperaturze 65 °C przez 30 minut w piekarniku.
3. Sonikuj szpilki w wodzie dejonizowanej przez 5 minut, aby usunąć resztki kwasu i osusz ręcznikiem papierowym. Zanurz szpilki w 0,5 ml środka antyadhezyjnego na 2 godziny. Sonikuj szpilki w wodzie dejonizowanej na 5 minut.
4. Zbuduj naczynie do trawienia (Rysunek 2C).
   1. Narysuj lub napisz dwie równoległe linie z odstępem 4 mm na szklanym szkiełku za pomocą linijki.
   2. Nałóż odporny na chemikalia klej o niskiej lepkości na jedną powierzchnię dwóch prostokątnie wyciętych szkieł nakrywkowych.
   3. Przymocuj dwie wycięte szkła nakrywkowe do szkiełka podstawowego w odstępie 4 mm. Użyj linii równoległej jako prowadnicy.
5. Nałóż dwie linie kleju silikonowego na naczynie do trawienia (patrz Rysunek 2C, aby zapoznać się z położeniem i rozmiarem konturu).
   UWAGA: Szablon wydrukowany w 3D (plik modelu STL jest dołączony jako materiał dodatkowy) pomoże łatwo i dokładnie narysować linie.
6. Umieść szpilki na naczyniu do trawienia tak, aby końcówki o długości 2 mm na ich prostych końcach były zanurzone we wzorze linii kleju. Ponownie dozuj klej, aby upewnić się, że kołki są całkowicie zakryte i narysować kontur. Przenieść naczynie do trawienia do nawilżonego fermentora podgrzanego do temperatury 38 °C. Odczekać noc, aby klej utwardził.
7. Powoli dodawać 0,2 ml 0,5 M kwasu azotowego do 0,2 ml 5,0 M kwasu solnego w szklanej fiolce.
   UWAGA: Mieszanina, znana również jako Aqua regia, jest bardzo i potencjalnie wybuchowa. Nosić rękawice z gumy kwasoodpornej i okulary ochronne oraz zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z kwasami. Nigdy nie przechowuj roztworu. Zmniejsz ilość kwasu azotowego, jak to możliwe, aby zmniejszyć jego agresywność.
8. Umieść naczynie do trawienia na płycie grzejnej podgrzanej do 65 °C. Wlej 0,4 ml mieszaniny kwasów na odsłonięty obszar szpilek. Odczekaj 10 minut i przenieś kwas do zlewki.
9. Zneutralizować cały pozostały kwas, w tym wytrawiony obszar szpilek, za pomocą 5 ml 0,8 M roztworu wodorowęglanu sodu w wodzie dejonizowanej.
10. Usuń szpilki z naczynia do trawienia, pociągając je wzdłuż pęsetą. Sonikować szpilki w wodzie dejonizowanej przez 5 minut, a następnie sonikować w acetonie przez 5 minut.
11. Pasywować wytrawiony obszar kołków, jak w kroku 1.2.
12. Sprawdź szerokość wytrawionych szpilek za pomocą mikroskopu sklepowego z siatką. Dostosuj czas trawienia opisany w ppkt 1.7 tak, aby szerokość wytrawionego obszaru wynosiła 0,2 ± 0,02 mm.
13. Przenieść szpilki do szklanej fiolki zawierającej 5 ml 70% etanolu. Doprowadzić fiolkę do okapu laminarnego. Podnieść szpilki z fiolki i pozostawić do wyschnięcia.

2. Wykonanie płyty silikonowej ze zbiornikami i miejscem na szpilki.

1. Wykonaj formę na miejsce na kołki i stałą ścianę boczną za pomocą typowych procesów litograficznych.
   1. Pokryj odtłuszczone szkiełko 1 ml ujemnego fotorezystu epoksydowego za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 1,000 obr./min. Suszyć fotorezystor na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 15 minut. Powtórz ten krok raz.
   2. Trzecią warstwę tego samego fotorezystu należy obrócić z prędkością 2,000 obr./min na szkiełku z powłoką fotorezystu. Suszyć fotorezystor na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 30 minut.
   3. Naświetlić warstwę fotorezystu na działanie 450 mJ/^cm2 światła ultrafioletowego 365 nm ze źródła światła punktowego UV przez folię fotoplotowaną. Piecz naświetlony fotorezystor na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 15 minut. Wywołaj fotorezyst, rozpylając rozpuszczalnik (octan 2-metoksy-1-metyloetylu) za pomocą opryskiwacza ręcznego i wysusz suszarką z gazowym azotem.
   4. Umieść szklane szkiełko z wzorzystym fotorezystem na dnie plastikowego naczynia.
2. Wlać prepolimer polidimetylosiloksanu (PDMS) na formę do grubości 3 mm. Usunąć pęcherzyki prepolimeru PDMS w eksykatorze próżniowym przy ciśnieniu -800 kPa przez 10 minut.
3. Prepolimer PDMS utwardzić w piecu w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę. Częściowo utwardzoną płytę PDMS wyjąć z formy za pomocą skalpela. Całkowicie utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 120°C przez 1 godzinę.
4. Wzdłuż wzoru prowadnic odetnij nieregularne krawędzie płyty PDMS tym samym skalpelem. Wykonaj tak precyzyjne i czyste cięcie, jak to tylko możliwe, szczególnie na powierzchni, która definiuje szczelinę do wkłuwania (patrz Rysunek 1A) dla kołków.
5. Wykonać otwory o średnicy 2 mm na wlot/wylot w końcach głównego kanału płyty PDMS za pomocą stempli biopsyjnych. Podobnie perforuj otwory o średnicy 1 mm na końcach kanału wentylacyjnego. Zobacz Rysunek 1A dla układu kanałów i położenia tych otworów.

3. Montaż urządzenia z wykonaniem na miejscu wypełniacza szczeliny i bariery.

1. Wykonaj zespół mikrokanałów.
   1. Zanurzyć szkło nakrywkowe nr 4 o średnicy 10 × 20 mm w roztworze czyszczącym podgrzanym do temperatury 60 °C na 10 minut.
   2. Dwukrotnie spłukać okulary dejonizowaną wodą i suszyć w temperaturze 120 °C przez 10 minut.
   3. Plazmowo przymocuj płytę PDMS do szkła nakrywkowego:
      1. Umieść płytę PDMS (kanałem do góry) i oczyszczoną szklaną pokrywę 10 × 20 mm nr 4 w komorze próżniowej napylarki.
      2. Rozpocznij pompowanie w dół komory do 60 Pa. Generuj plazmę próżniową (20 mA) przez 30 s.
      3. Natychmiast odpowietrzyć komorę. Przymocuj stronę elementu kanału płyty PDMS do szkła nakrywkowego tak, aby ich krawędzie były wyrównane.
      4. Warstwy klejone umieszczać w piekarniku o temperaturze 65 °C na 10 minut.
   4. Przynieś połączone warstwy do okapu laminarnego za pomocą sterylnego pojemnika. Sterylizuj je światłem UV przez 30 min.
   5. W osłonie laminarnej włóż kołki do szczeliny tak, aby ich końce tworzyły drugą ścianę boczną mikrokanału. Sąsiednie kołki powinny mieć różną długość, aby uniknąć kontaktu obu pionowych końców (patrz Rysunek 1B). Preferowane są duże odstępy między pionowymi końcami. Odstęp (N-1) × (szerokość pinu) jest możliwy, gdy przygotowanych jest N rodzajów pinów o różnych długościach pinów (L w Rysunek 2A).
2. Wyprodukuj bazę ( Rysunek 2B).
   1. Utwórz lub odczytaj plik części bazy i utwórz dwa pliki sterowania numerycznego (NC) (zawierające ścieżki narzędzia; dołączone jako materiał uzupełniający) za pomocą oprogramowania CAD/CAM. Pierwszy dodatkowy pilnik NC wykorzystuje frez palcowy o średnicy 4 mm, a drugi frez palcowy o średnicy 1 mm.
   2. Zamocuj przezroczystą płytę z polimetakrylanu metylu (PMMA) o grubości 3 mm na frezarce CNC.
   3. Otwórz pierwszy plik NC w sterowniku komputerowej frezarki NC (CNC). Zamontuj frez palcowy 4 mm do frezarki CNC i zlokalizuj część zero, dotykając frezu palcowego do płyty PMMA. Uruchom kod NC, aby przeciąć deskę.
      UWAGA: Od czasu do czasu przedmuchaj końcówkę frezu palcowego sprężonym powietrzem w celu schłodzenia i usunięcia wiórów.
   4. Powtórzyć czynności opisane w pkt 3.2.3 przy użyciu drugiego pilnika NC i frezu palcowego o średnicy 1 mm.
   5. Obrabiane części odtłuścić detergentem i osuszyć ręcznikiem papierowym. Spryskaj części 70% etanolem i umieść je w okapie laminarnym.
3. Wykonaj wypełniacz szczelin szpilkowych i barierę elastomerową:
   UWAGA: Kroki 3.3.1 - 3.3.7 należy wykonywać aseptycznie w okapie laminarnym.
   1. Przygotować wypełniacz luk, mieszając białą wazelinę i proszek politetrafluoroetylenu w stosunku wagowym 2:1. Homogenizować mieszaninę za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego.
   2. Wlej wypełniacz szczelin do strzykawki z dozownikiem. Wprowadzić tłok i nacisnąć go, aby napełnić końcówkę strzykawki. Zamocować igłę i ponownie wcisnąć tłok, aż końcówka igły zostanie wypełniona. Podobnie przygotuj strzykawkę dozującą z tłokiem i igłą i wypełnij klejem silikonowym.
   3. Podłączyć każdą strzykawkę do dozownika pneumatycznego za pomocą rurki adaptera. Dostosuj ciśnienie dozowania kleju silikonowego i wypełniacza na 250 kPa i 280 kPa.
   4. Dozuj klej silikonowy do krawędzi kieszeni podstawy. Umieść szkiełko nakrywkowe nr 4 o średnicy 10 × 20 mm na kieszeni i mocno dociśnij, aby je związać.
   5. Dozuj klej silikonowy na głębokość około 1 mm, aby narysować dwa segmenty wzdłuż dwóch zewnętrznych szczelin podstawy. Dozować wypełniacz szczeliny na głębokość około 1 mm, aby narysować segmenty wzdłuż drugiej szczeliny.
   6. Dozuj klej silikonowy do krawędzi innej kieszeni. Umieść zespół mikrokanalików (3.1) na kieszeni i mocno dociśnij, aby się połączył.
   7. Powtórz 3.3.5, aby upewnić się, że zarówno wypełniacz szczelin, jak i klej silikonowy całkowicie osadzają kołki i że nie ma otworu w szczelinach.
   8. Umieść urządzenie w sterylnym pojemniku, takim jak pudełko ze stali nierdzewnej z pokrywką. Przenieść pojemnik do nawilżonego zbiornika fermentacyjnego podgrzanego do temperatury 38 °C. W okapie laminarnym utwardź barierę elastomerową przez jeden dzień.
   9. Przesuń każdy kołek do 1 mm wzdłuż sąsiednich kołków, aby zwolnić kołki z utwardzonej bariery elastomerowej.
   10. Sterylizuj urządzenie światłem UV przez 30 min.

4. Ocena urządzenia mikroprzepływowego

1. Wykrywanie wycieków za pomocą fluorescencji
   1. Otwórz mikrokanał za pomocą precyzyjnego narzędzia lub robota biurkowego. Zadbaj o to, aby szerokość kanału była jak najbardziej spójna w całym kanale.
   2. Rozcieńczyć zielony barwnik fluorescencyjny wodą dejonizowaną o stężeniu 10 μM, aby otrzymać roztwór fluorescencyjny.
   3. Dodaj roztwór fluorescencyjny do jednego z portów końcowych mikrokanału za pomocą mikropipetatora. Ten krok wypełni kanał roztworem.
   4. Umieść urządzenie mikroprzepływowe i dwa kawałki chłonnego papieru zwilżonego wodą dejonizowaną w dużym plastikowym naczyniu. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez co najmniej 24 godziny.
   5. Rejestruj obrazy zielonej fluorescencji mikrokanału za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z kamerą mikroskopową.
   6. Otwórz obrazy fluorescencyjne za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu i upewnij się, że nie ma wycieków (zielona fluorescencja) na styku wypełniacza szczelin i kołków.
2. Komórki nasienne do mikrokanału.
   1. Przygotuj naczynie do hodowli komórkowej zawierające 70 - 80% zlewających się komórek (w zależności od typu komórek). Odłącz i zawieś komórki w pożywce wzrostowej.
   2. Odwirować komórki (prędkość i czas zależą od typu komórek) i odessać pożywkę.
   3. Ponownie zawiesić komórki niewielką ilością pożywki. Policz komórki za pomocą licznika komórek i dostosuj gęstość komórek od 1,5 × 10⁶ do 1,5 × 10⁷ komórek/ml.
   4. Otwórz mikrokanał za pomocą precyzyjnego narzędzia lub robota biurkowego (Rysunek 1B), aby utworzyć prosty kanał o szerokości 400 μm. Dostosuj pozycje sworzni, aby ściana boczna była jak najbardziej płaska w całym kanale. Dodaj zawiesinę komórek do jednego z portów końcowych mikrokanału i napełnij kanał.
   5. Zlokalizuj jeden z pinów, który definiuje ścianę boczną regionu, aby rozpocząć kulturę. Pod odwróconym mikroskopem zamknij dwa sąsiednie szpilki, aby zamknąć komórki w regionie hodowli komórkowej.
   6. Zamknij wszystkie piny w kolejności od wewnętrznej do zewnętrznej, aby usunąć wszystkie komórki z kanału. Delikatnie zassać zawiesinę z portów końcowych i dodać do nich pożywkę.
   7. Inkubować urządzenie zgodnie z opisem w ppkt 4.1.4. Gdy komórki są w około 70-80% zlewne, powoli otwórz szpilkę, aby poszerzyć obszar hodowli.

Wyniki

Budowa rekonfigurowalnego mikrokanału jest pokazana w Rysunek 1. Wiele prostokątnych kołków umieszczono na szklanym podłożu i ustawiono w taki sposób, aby dłuższy bok kołków stykał się ze sobą. Arkusz PDMS z wykrawanymi otworami i wgłębieniem o tej samej głębokości co wysokość kołka zakrywał końce kołków, tworząc zbiorniki wlotowe/wylotowe kanału, sufit kanału i kolejną ścianę boczną przeciwną do ściany kanału, która składała się z kołków. Obszar otoczony szpilkami, ściana (jedna ze ścian arkusza PDMS) i szklane podłoże tworzą jeden kanał mikroprzepływowy.

Jak wcześniej opisano, rekonfigurowalność proponowanego systemu mikroprzepływowego osiąga się dzięki wielu małym pinom umieszczonym równolegle z bardzo małymi, ale niezerowymi odstępami. Problemem w poprzednich raportach był silny przepływ generowany przez szczeliny przez efekt kapilarny. Aby przezwyciężyć ten problem, szczeliny zostały najpierw wypełnione wypełniaczem szczelin. W tym protokole jako wypełniacz szczelin zastosowano dyspersyjną mieszaninę lepkiego węglowodoru i proszku fluoropolimerowego. Jednak sam wypełniacz szczelin również podlega efektowi kapilarnemu. Dlatego, jak pokazano na Rysunek 1, powstały rekonfigurowalny mikrokanał ma zarówno wypełniacz szczelin węglowodorowo-fluoropolimerowych, jak i elastomerową barierę utworzoną wokół zewnętrznego obwodu wypełniacza szczeliny. Pocienienie środka kołków jest konieczne, aby pomieścić wystarczającą ilość wypełniacza szczeliny, aby zapewnić grubość i wytrzymałość bariery elastomerowej między dwoma kołkami.

Rysunek 2A przedstawia rysunek szpilki, która tworzy segment ściany bocznej. Jako materiał wybrano stal nierdzewną 316L ze względu na jej odporność na korozję i niskie właściwości wymywania. Wymagany był jednak dodatkowy proces pasywacji, aby hodowla komórek szpilkowych była kompatybilna. Kołek musi mieć precyzyjnie prostokątną końcówkę bez zadziorów, aby z powodzeniem utworzyć segment ściany bocznej. Dodatkowo kołek musi mieć "uchwyt", aby kołek można było łatwo przesuwać, popychając uchwyt. Ponieważ każdy kołek ma wąski środek, grubość elastomeru między kołkami była wystarczająca, aby wytrzymać ścinanie spowodowane ruchem sworznia. W przeciwieństwie do innych części składających się na urządzenie, wykonanie kołków, poza cienkim średnim, powinno być zamawiane w firmie specjalizującej się w obróbce elektroerozyjnej (EDM), ponieważ jest to jedna z najbardziej precyzyjnych i opłacalnych metod obróbki małych części wykonanych z twardych metali. Wykonanie środkowego przerzedzania poprzez samodzielne wytrawianie zmniejsza koszty obróbki oraz ryzyko wygięcia lub złamania podczas obróbki.

Aby potwierdzić, że wypełniacz luk, bariera elastomerowa i ostatecznie wodoszczelność rekonfigurowalnego mikrokanału działają prawidłowo, zastosowano wykrywanie nieszczelności za pomocą fluorescencji. Rysunek 3 pokazuje obraz fluorescencyjny obszaru w pobliżu krawędzi bariery elastomerowej 3 dni po napełnieniu mikrokanału wodą zawierającą fluorescencyjny barwnik znacznikowy. Na obrazie fluorescencyjnym widać, że ciecz wypełniająca kanał osiągnęła głębokość około 200 μm od widocznej krawędzi bariery elastomerowej. Jednak ciecz nie dotarła do wypełniacza szczeliny. Dodatkowo nie zaobserwowano przeciekania wypełniacza szczeliny przez barierę elastomerową. Obserwacja ta wskazuje, że ciasne pasowanie między wąskim środkiem kołków a barierą elastomerową zapobiegało migracji cieczy przez szczeliny.

Na koniec, przeprowadziliśmy długoterminową hodowlę komórkową z obszarem hodowli dostosowanym poprzez stopniowe rozszerzanie ściany bocznej rekonfigurowalnego urządzenia mikroprzepływowego, jak pokazano na Rysunek 4A. Przy 0 d niewielka liczba komórek została zamknięta w przestrzeni równej szerokości jednego szpilki, a pozostałe komórki zostały zassane. Po 2 dniach komórki zostały przyczepione do dolnej powierzchni i zaczęły się namnażać. Dwie szpilki zostały cofnięte tak, że wszystkie komórki były wyraźnie widoczne, chociaż zbieg był nadal niski. Po 5 dniach komórki nadal się namnażały, a konfluencja wzrastała. W 6 i 9 d dwie inne szpilki zostały cofnięte, aby utrzymać niedostateczne zlewanie się komórek. Efekt stopniowego rozszerzania obszaru hodowli jest pokazany w Rysunek 4B. Nastąpiły nagłe zmiany w gęstości komórek w dniu, w którym szpilki zostały wsunięte. Jednak tempo wzrostu liczby komórek było utrzymywane na stałym poziomie, podczas gdy tempo obserwowane w typowej hodowli komórkowej jest wykładnicze.

Rysunek 1: Rekonfigurowalne urządzenie mikroprzepływowe z jedną dyskretną ścianką boczną. (A) Części i budowa rekonfigurowalnego urządzenia mikroprzepływowego. Urządzenie posiada jeden prosty kanał z jedną ścianą boczną utworzoną przez końce 10 kołków ze stali nierdzewnej włożonych w elementy mikrokanału PDMS / szkła. Wypełniacz szczelin i bariera elastomerowa zapobiegają przeciekaniu cieczy przez szczeliny w sworzniach. Szkła nakrywkowe, wypełniacz szczelin i bariera elastomerowa są przymocowane do podłoża z polimetakrylanu metylu (PMMA). (B) Automatyczny manipulator pinów. Efektor końcowy wykonany z blachy jest przymocowany do 3-osiowego robota biurkowego. Aby przesunąć jeden pin, efektor końcowy popycha jego pionowy koniec. Kołki o różnych długościach są umieszczane w odstępie trzykrotnie większym niż szerokość sworznia. Interwał zapewnia, że efektor końcowy łączy jeden sworzeń za jednym razem z wystarczającym luzem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Rysunek mechaniczny części obrabianych w protokole. Jednostki podane są w milimetrach; R oznacza wymiar promienia; Symbol kwadratu (□) oznacza kwadratowe obiekty; t oznacza grubość. (A) Sworzeń ze stali nierdzewnej 316L jako część ściany bocznej. Kołki można zamawiać i obrabiać zgodnie z opisem. Przerzedzenie środka szpilki w celu uzyskania kształtów przypominających kość psa nie jest odzwierciedlone na tym rysunku, ponieważ nie zostało to zlecone w ramach obróbki, ale zostało wykonane w ramach protokołu. (B) Podstawa z polimetakrylanu metylu (PMMA), która utrzymuje szkła nakrywkowe, wypełniacz szczelin i elastomerową barierę przed ruchem sworznia. (C) Naczynie trawiące używane do wytrawiania środka szpilek. Aby zbudować naczynie do trawienia, cztery kawałki szkła są łączone za pomocą kleju silikonowego. Na naczyniu rysowany jest konturowy wzór kleju silikonowego, a następnie umieszcza się kołki na naczyniu, jak pokazano na rysunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Fluorescencyjna detekcja wycieku z rekonfigurowalnego mikrokanału przez szczeliny w pinach. Obraz fluorescencyjny zielonego barwnika fluorescencyjnego wypełniającego rekonfigurowalny mikrokanał nakładany jest na obraz z kontrastem fazowym struktury uszczelnienia, która składa się z wypełniacza szczeliny (nieprzezroczystego) i bariery elastomerowej (półprzezroczystej). Krawędź bariery elastomerowej jest widoczna jako elementy podobne do łąkotki i jest oznaczona górną linią przerywaną; Interfejs między barierą elastomerową a wypełniaczem szczeliny jest pokazany jako elementy podobne do łąkotki, które stykają się z czarnym obszarem i jest oznaczony dolną linią przerywaną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Progresywny i ciągły wzrost komórek ze zmiennym obszarem hodowli komórek w rekonfigurowalnym mikrokanale. (A) Wzrost komórek COS-7 w obszarze hodowli komórkowej ograniczonym ruchomymi ścianami bocznymi. (B) Krzywa wzrostu i ewolucja w czasie gęstości komórek COS-7 zamkniętych w obszarach hodowli o zmiennej wielkości w rekonfigurowalnym mikrokanale pokazanym w A). Trzy pionowe strzałki oznaczają rozszerzenie obszaru hodowli komórkowej odpowiednio na 2, 5 i 6 d. Oprócz liczby komórek, gęstości komórek są pokazane dla tych samych obszarów hodowli, dopasowane indywidualnie do każdej wykładniczej krzywej wzrostu i wykorzystane do oszacowania lokalnego czasu podwojenia (t_d [h]) pokazanego w ramkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Mikrokanał dyskretny pinowo jest w pełni funkcjonalnym kanałem mikroprzepływowym i uważamy, że ma oczywiście wysoką rekonfigurowalność kształtu kanału w porównaniu z jakimikolwiek istniejącymi kanałami mikroprzepływowymi. Dostarczony przez nas protokół umożliwi urządzeniom mikroprzepływowym zdolnym do hodowli komórkowej ze stopniowo zwiększającą się powierzchnią hodowli komórkowej utrzymanie kultur w stanie zbiegu przez długi czas. Urządzenie zapewni również modelowanie komórek w kanale bez wcześniejszego modelowania białek na podłożu lub jakichkolwiek innych czynników w momencie projektowania lub produkcji. Ponadto to rekonfigurowalne urządzenie mikroprzepływowe z łatwością generuje silny przepływ przemieszczeniowy w kanale, co pomogłoby w realizacji obsługi tak trudnych do przepływu materiałów, z którymi może sobie poradzić bardzo niewiele istniejących urządzeń mikroprzepływowych. Oznacza to, że interakcja między komórkami a innymi mikroorganizmami, gazami i innymi niepłynami może być oceniana za pomocą tego urządzenia bez dużych modyfikacji konstrukcji urządzenia.

Rozważaliśmy zastosowanie ciśnienia Laplace'a lub ciśnienia hydrostatycznego do jednego wlotu kanału jako metod zewnętrznej kontroli przepływu. Nie zalecamy wpychania cieczy w ślepy zaułek, ponieważ spowoduje to wytworzenie przepływu w kierunku kanału wentylacyjnego przez szczeliny między kołkami a sufitem/podłogą kanału. Wiele operacji związanych z płynami nie wymaga takich operacji na sworzniach. Na przykład mieszanie można osiągnąć poprzez rozcieranie cieczy za pomocą jednego kołka (tj. kilkakrotne przesuwanie tylko jednego kołka w przód iw tył).

Najbardziej krytycznymi częściami urządzenia są kołki. Precyzja długości, równoległości, prostopadłości i jakości powierzchni są wymagane dla kołków, ponieważ muszą one tworzyć mikrokanał, muszą poruszać się płynnie i muszą kierować ruchem sąsiednich kołków. Dlatego zalecamy, aby kołki zamawiać w firmie specjalizującej się w precyzyjnej obróbce skrawaniem poprzez przedłożenie rysunku podobnego do rysunku 2A. Mogą istnieć firmy, które wymagają dodatkowego wymiarowania geometrycznego i wyraźnych kierunków chropowatości powierzchni. Jednak szpilki nadają się do wielokrotnego użytku, jeśli obchodzi się z nimi ostrożnie i od czasu do czasu pasywuje kwasem azotowym.

Bariera elastomerowa to kolejna krytyczna cecha, a jej powstanie jest najbardziej krytycznym krokiem w procesach wytwarzania urządzenia. Do uzyskania powtarzalnych i wiarygodnych wyników potrzebna będzie precyzyjnie obrobiona podstawa. Umieszczenie kołków na nieutwardzonej barierze jest również krytycznym krokiem. Kołki powinny być dobrze wyrównane i osadzone w wypełniaczu szczeliny i barierze bez pęcherzyków powietrza. Te kroki zapobiegają wyciekom przez piny, co jest częstym problemem w przypadku tego urządzenia mikroprzepływowego.

Inne typowe problemy związane z korzystaniem z tego urządzenia to a) szpilki krępowane tarciem oraz b) śmierć komórki i niskie tempo wzrostu. Możliwe przyczyny tego stanu rzeczy w a) to nierównomierne (stożkowe lub faliste) wytrawienie środka szpilki, słaba jakość wytrawionej powierzchni oraz niedopasowanie wymiarowe między wysokością końcówki szpilki a wysokością warstwy fotorezystu na formie do płyt silikonowych. Dostosowanie formuły wytrawiacza, temperatury i mieszania może pomóc w poprawie ruchu sworznia. Ponadto próbny montaż bez użycia wosku lub kleju dostarczy wskazówek, jak rozwiązać problem. Możliwe czynniki w b) to niedostateczna pasywacja kołków, błędy w doborze klejów do barier elastomerowych oraz niepełne utwardzenie klejów. Niektóre komórki mogą wymagać pokrycia wewnątrz mikrokanalika fibronektyną lub innymi białkami lub polimerami, które sprzyjają adhezji komórek. Ponadto optymalizacja w praktyce hodowli komórkowych, taka jak trypsyna i wirowanie, zmniejszy liczbę martwych komórek w mikrokanale.

Jednym z ograniczeń przedstawionego protokołu produkcyjnego jest to, że tylko jedna ze ścian bocznych jest dyskretna. Rekonfigurowalność kanału ulegnie dalszej poprawie, jeśli obie ściany boczne będą zbudowane za pomocą układów pinów. Chociaż wymaga to podwójnej liczby kołków i dłuższych etapów produkcji, jest to technicznie opłacalna opcja.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Piekarnik	Yonezawa	MI-100
10% Kwas azotowy	Wako Chemicals	149-06845
Kołki ze stali nierdzewnej	Micro Giken	N/A	o przekroju 0,3 mm, klasa 316L stal nierdzewna, drut EDM
Środek antyadhezyjny	Fluoro Technology	FG-5093SH
Polidimetylosiloksan (PDMS)	Shin-Etsu Chemicals	KE-106
Fotorezystor epoksydowy ujemny	Nippon Kayaku	SU-8 3050
Okulary nakrywkowe (prostokątne)	Szkło Matsunami	26 x 60mm Nr 4
Aceton	Kanto Chemicals	01060-79
Szkiełka szklane (duże)	Szkło Matsunami	76 x 52mm No.1
Klej silikonowy	Shin-Etsu Chemicals	KE-41
Biała wazelina	Nikko Rica	Sun White P-1
Politetrafluoroetylen (PTFE) w proszku	Power House Accele	Microfluon II
Przezroczysta płyta akrylowa (o grubości 3 mm)	Różne	Nie dotyczy
Dozownik pneumatyczny	Musashi Engineering	ML-5000XII
Kwas solny	Kanto Chemicals	180768-00
Frezarek sterowany numerycznie (CNC)	Pro Spec Tools	PSF240-CNC
Frez palcowy (średnica 4 mm)	Mitsubishi Materials	MS2MSD0400
Frez palcowy (średnica 1 mm)	Mitsubishi Materials	MS2MSD0100
Klej (odporny chemicznie i o niskiej lepkości)	Fiolki ze szkła borykrzemianowego Cotronics	Duralco 4460
	Różne		Przygotowanie roztworu HNO3+HCl (Aqua regia). Zawsze wybieraj szkło borokrzemianowe.
Wodorowęglan sodu	Kanto Chemicals	37116-00
Myjka ultradźwiękowa	AS ONE AS12GTU
Wiertarka	ultradźwiękowa Shinoda Tools	SOM-121	Stosowany jako homogenizator ultradźwiękowy.
Powlekarka wirowa	Active	ACT-220DII
Płyta grzejna	AS ONE	ND-1
Film fotoplotowany (12 700 dpi)	Bez Giken	N/A	Nanoszono negatywy obrazu wgłębienia na dnie płyty PDMS.
Octan 2-metoksy-1-metyloetylu	Wako Chemicals	130-10505
Punktowe źródło światła UV	Hamamatsu	L8327	Źródło ultrafioletu
Azot	Różne	N/A
Eksykator próżniowy i pompa	JAK JEDEN	MVD-100, GM-20S Skalpele
		nr 11
(1,0 mm i 2,0 mm)	Kai Medical	BP-10F(1,0 m), BP-20F(2,0 mm)
Długopis do grawerowania szkła	Różne	Nie dotyczy
Roztwór czyszczący	Tama Chemicals	TMSC	Rozcieńczony w stosunku 1:100 wodą dejonizowaną
Napylarka	San-yu Electron	SC-708	Do klejenia plazmowego.
Strzykawka dozująca (5 ml)	Musashi Engineering	PSY-5E
Tłok	Musashi Engineering	FLP-5E
igła (21G)	Musashi Engineering	PN-21G-B
Rurka adaptera	Musashi Engineering	AT-5E
Fermentor	Japan Kneader	PF100
Zielony barwnik fluorescencyjny (Alexa Fluor 488 kwas karboksylowy)	Thermo Fisher	A33077
Duże plastikowe naczynie	Greiner bio-one	688161
Papier chłonny	Asahi Kasei	BEMCOT M-1
Mikroskop odwrócony	Leica	DMi8
Kamera mikroskopowa	Qimaging	Retiga 2000R
Dulbecco modyfikowany Eagle medium (DMEM)	GE Health Care	SH30021.01
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy	Thermo Fisher	15240-062
Roztwór trypsyny/EDTA	Thermo Fisher	25200-056
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	GE Health Care	SH30256.01
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Biowest	S1820
Licznik komórek	FPI	OC-C-S02
Naczynie do hodowli komórkowych	VIOLAMO	VTC-D100
15 ml rurka stożkowa	Corning	352095
Mikroskop sklepowy	PEAK	2034-20
Opryskiwacz ręczny	FURUPLA	No.3530
Okulary nakrywkowe (prostokątne)	Matsunami Szkło	10 x 20mm No.4
Oprogramowanie CAD/CAM	Autodesk	Inventor HSM
Regulator ciśnienia azotu	gazowego AS ONE	GF1-2506-RN-V	Ustawiony na 0,1 MPa