Kanał mikroprzepływowy z odkształcalnymi ściankami bocznymi oferuje kontrolę przepływu, obsługę cząstek, dostosowywanie wymiarów kanału i inne rekonfiguracje podczas użytkowania. Opisujemy metodę wytwarzania kanału mikroprzepływowego ze ściankami bocznymi wykonanymi z układu pinów, który umożliwia zmianę ich kształtu.
Artykuł metodologiczny
Rekonfigurowalny kanał mikroprzepływowy z dyskretnymi ściankami bocznymi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komponenty mikroprzepływowe muszą mieć różne kształty, aby realizować różne kluczowe funkcje mikroprzepływowe, takie jak mieszanie, separacja, zatrzymywanie cząstek lub reakcje. Kanał mikroprzepływowy, który odkształca się nawet po wyprodukowaniu, zachowując jednocześnie kształt kanału, umożliwia wysoką rekonfigurowalność czasoprzestrzenną. Ta rekonfigurowalność jest wymagana w takich kluczowych funkcjach mikroprzepływowych, które są trudne do osiągnięcia w istniejących "rekonfigurowalnych" lub "zintegrowanych" układach mikroprzepływowych. Opisujemy metodę wytwarzania kanału mikroprzepływowego z odkształcalną ścianą boczną składającą się z bocznie ustawionego układu końców prostokątnych kołków. Uruchamianie kołków w kierunkach wzdłużnych zmienia położenie końcowe kołków, a co za tym idzie, kształt dyskretnych ścianek bocznych kanału. Szczeliny między kołkami mogą powodować niepożądane przecieki lub przyleganie do sąsiednich kołków spowodowane siłami łąkotki. Aby wypełnić luki w sworzniach, wprowadziliśmy wypełniacz szczelin na bazie zawiesiny węglowodorowo-fluoropolimerowej, któremu towarzyszy bariera elastomerowa. To rekonfigurowalne urządzenie mikroprzepływowe może generować silny czasowy przepływ przemieszczenia w kanale lub może zatrzymać przepływ w dowolnym obszarze kanału. Ta funkcja ułatwi, na żądanie, obsługę ogniw, lepkich cieczy, pęcherzyków gazu i niepłynów, nawet jeśli ich istnienie lub zachowanie jest nieznane w momencie wytwarzania.
Wprowadzenie
Urządzenia mikroprzepływowe - mikrourządzenia, które kontrolują małe ilości cieczy i ich przepływy - oferują miniaturyzację procedur biomedycznych do formatu "chip" z większą przenośnością i, często, przystępnością cenową. Jak opisano w niedawnym przeglądzie1, różne komponenty mikroprzepływowe składające się z przestrzeni i pozytywnych cech zostały opracowane w celu realizacji podstawowych i kluczowych funkcji płynów, takich jak mieszanie, separacja, zatrzymywanie cząstek lub reakcje.
Podczas gdy zachowanie wielu urządzeń mikroprzepływowych jest określane na etapie projektowania, niektóre rodzaje urządzeń mikroprzepływowych pozwalają na zmiany ich struktury lub zachowania po produkcji. Tutaj odnosimy się do tej funkcji jako "rekonfigurowalności". Rekonfigurowalność systemów mikroprzepływowych zazwyczaj skraca czas i koszty wymagane do zaprojektowania urządzenia i/lub umożliwia dostosowanie układu lub funkcji mikroprzepływowych w czasie.
Poprzednio opisane rekonfigurowalne urządzenia mikroprzepływowe dzielą się na następujące trzy kategorie. W pierwszym przypadku odkształcenie kanałów elastomerowych pozwala na zmianę natężenia przepływu i kierunków przepływu podczas użytkowania. Aby uzyskać rekonfigurowalność, kanały elastomerowe są odkształcane przez różne zewnętrzne i kontrolowane siły, takie jak pneumatyczne źródła ciśnienia2, siłowniki Braille'a3, lub kompresyjne uszczelnienie4. W drugim przypadku rekonfigurowalne urządzenia opierają się na konstrukcjach modułowych, takich jak wielowarstwowe obwody płynowe, modułowe kanały z połączeniami magnetycznymi oraz mikrofluidyka oparta na rurkach5. W trzecim przypadku samo urządzenie nie jest rekonfigurowalne, ale transport mikrokropel na matrycach elektrod (często określanych jako mikrofluidyka cyfrowa)6,7 i wiszące urządzenia mikroprzepływowe oparte na kroplach8 umożliwiają przełączanie przepływu lub trasy płynu na żądanie.
Niemniej jednak, wiele z tych rekonfiguracji jest ograniczonych na poziomie topologicznym i makroskopowym. Na przykład wiele zintegrowanych urządzeń mikroprzepływowych zatrzymuje przepływ lub zmienia kierunek przepływu poprzez zapadanie mikrokanałów w predefiniowanych obszarach. Jednak położenie i liczba regionów, które mają zostać zwinięte, nie są ponownie konfigurowalne. Chociaż cyfrowa mikrofluidyka ma różne możliwości obsługi płynów, możliwe przepływy powinny być w dużej mierze ograniczone objętością każdej kropli. Ponadto, gdy komórki są hodowane w takich kropelkach pożywki do hodowli komórkowych, potrzebny jest dodatkowy wysiłek, aby zapobiec parowaniu i rozpraszaniu gazu z kropelek oraz uniknąć szoku osmolalności i nagłej zmiany pH.
Aby zapewnić możliwość rekonfiguracji na poziomie funkcji kanału, zaproponowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe z ruchomymi ściankami bocznymi, które składało się z tablic elementów maszyny do dynamicznej rekonfiguracji podczas użytkowania9. Aby utworzyć odkształcalną ścianę boczną, małe prostokątne kołki zostały ustawione tak, aby każdy koniec kołków definiował segment ściany bocznej. Przesunięcie kołków pozwoliło na odkształcenie ściany bocznej, co umożliwiło transport lub tworzenie wzoru komórek, pęcherzyków i cząstek wewnątrz kanału. Aby zminimalizować objętość martwą i zmaksymalizować możliwości rekonfiguracji, odległość między sąsiednimi pinami musiała zostać zminimalizowana. Jednak silne działanie kapilarne działające na małe szczeliny między pinami łączącymi wnętrze i zewnętrzną stronę mikrokanalika powoduje wyciek jakiejkolwiek cieczy dostającej się do szczeliny w bolcu, powodując parowanie mediów, zanieczyszczenie bakteryjne lub cytotoksyczne, a ostatecznie śmierć komórki. Dlatego opracowaliśmy szczelne, dyskretne, rekonfigurowalne kanały mikroprzepływowe typu ścianka boczna, które wytrzymują cykliczne działania pinów i długoterminową hodowlę komórek10.
W tym artykule przedstawiamy protokół budowy mikroprzepływowego urządzenia do hodowli komórek z dyskretną ścianką boczną, które może być rekonfigurowane po stopniowym zwiększaniu obszaru hodowli komórkowej. Szczelność ścianek bocznych kanału dyskretnego jest badana za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Kompatybilność kultur komórkowych i zdolność do modelowania komórek są oceniane przy użyciu hodowli komórkowej na chipie.
Ten system mikroprzepływowy jest odpowiedni wszędzie tam, gdzie nie można z góry określić odpowiedniego projektu kanału i musi on zostać zmieniony na żądanie. Na przykład, system ten może być używany do regulacji szerokości kanału i natężenia przepływu w oparciu o wzrost lub migrację komórek, do przepływu lub wyłapywania aktywnych nicieni lub innych małych obiektów, które zachowują się nieoczekiwanie w kanale, lub do przyjmowania różnych surowych próbek lub bioproduktów, które nie zostały jeszcze poczęte w momencie projektowania.
Protokół
1. Trawienie szpilek (Rysunek 2A)
- Odtłuścić prostokątne kołki przez zanurzenie w acetonie.
- Pasywować szpilki, zanurzając je w 4 ml 10% kwasu azotowego, a następnie podgrzewać roztwór w temperaturze 65 °C przez 30 minut w piekarniku.
- Sonikuj szpilki w wodzie dejonizowanej przez 5 minut, aby usunąć resztki kwasu i osusz ręcznikiem papierowym. Zanurz szpilki w 0,5 ml środka antyadhezyjnego na 2 godziny. Sonikuj szpilki w wodzie dejonizowanej na 5 minut.
- Zbuduj naczynie do trawienia (Rysunek 2C).
- Narysuj lub napisz dwie równoległe linie z odstępem 4 mm na szklanym szkiełku za pomocą linijki.
- Nałóż odporny na chemikalia klej o niskiej lepkości na jedną powierzchnię dwóch prostokątnie wyciętych szkieł nakrywkowych.
- Przymocuj dwie wycięte szkła nakrywkowe do szkiełka podstawowego w odstępie 4 mm. Użyj linii równoległej jako prowadnicy.
- Nałóż dwie linie kleju silikonowego na naczynie do trawienia (patrz Rysunek 2C, aby zapoznać się z położeniem i rozmiarem konturu).
UWAGA: Szablon wydrukowany w 3D (plik modelu STL jest dołączony jako materiał dodatkowy) pomoże łatwo i dokładnie narysować linie. - Umieść szpilki na naczyniu do trawienia tak, aby końcówki o długości 2 mm na ich prostych końcach były zanurzone we wzorze linii kleju. Ponownie dozuj klej, aby upewnić się, że kołki są całkowicie zakryte i narysować kontur. Przenieść naczynie do trawienia do nawilżonego fermentora podgrzanego do temperatury 38 °C. Odczekać noc, aby klej utwardził.
- Powoli dodawać 0,2 ml 0,5 M kwasu azotowego do 0,2 ml 5,0 M kwasu solnego w szklanej fiolce.
UWAGA: Mieszanina, znana również jako Aqua regia, jest bardzo i potencjalnie wybuchowa. Nosić rękawice z gumy kwasoodpornej i okulary ochronne oraz zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z kwasami. Nigdy nie przechowuj roztworu. Zmniejsz ilość kwasu azotowego, jak to możliwe, aby zmniejszyć jego agresywność. - Umieść naczynie do trawienia na płycie grzejnej podgrzanej do 65 °C. Wlej 0,4 ml mieszaniny kwasów na odsłonięty obszar szpilek. Odczekaj 10 minut i przenieś kwas do zlewki.
- Zneutralizować cały pozostały kwas, w tym wytrawiony obszar szpilek, za pomocą 5 ml 0,8 M roztworu wodorowęglanu sodu w wodzie dejonizowanej.
- Usuń szpilki z naczynia do trawienia, pociągając je wzdłuż pęsetą. Sonikować szpilki w wodzie dejonizowanej przez 5 minut, a następnie sonikować w acetonie przez 5 minut.
- Pasywować wytrawiony obszar kołków, jak w kroku 1.2.
- Sprawdź szerokość wytrawionych szpilek za pomocą mikroskopu sklepowego z siatką. Dostosuj czas trawienia opisany w ppkt 1.7 tak, aby szerokość wytrawionego obszaru wynosiła 0,2 ± 0,02 mm.
- Przenieść szpilki do szklanej fiolki zawierającej 5 ml 70% etanolu. Doprowadzić fiolkę do okapu laminarnego. Podnieść szpilki z fiolki i pozostawić do wyschnięcia.
2. Wykonanie płyty silikonowej ze zbiornikami i miejscem na szpilki.
- Wykonaj formę na miejsce na kołki i stałą ścianę boczną za pomocą typowych procesów litograficznych.
- Pokryj odtłuszczone szkiełko 1 ml ujemnego fotorezystu epoksydowego za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 1,000 obr./min. Suszyć fotorezystor na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 15 minut. Powtórz ten krok raz.
- Trzecią warstwę tego samego fotorezystu należy obrócić z prędkością 2,000 obr./min na szkiełku z powłoką fotorezystu. Suszyć fotorezystor na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 30 minut.
- Naświetlić warstwę fotorezystu na działanie 450 mJ/cm2 światła ultrafioletowego 365 nm ze źródła światła punktowego UV przez folię fotoplotowaną. Piecz naświetlony fotorezystor na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C przez 15 minut. Wywołaj fotorezyst, rozpylając rozpuszczalnik (octan 2-metoksy-1-metyloetylu) za pomocą opryskiwacza ręcznego i wysusz suszarką z gazowym azotem.
- Umieść szklane szkiełko z wzorzystym fotorezystem na dnie plastikowego naczynia.
- Wlać prepolimer polidimetylosiloksanu (PDMS) na formę do grubości 3 mm. Usunąć pęcherzyki prepolimeru PDMS w eksykatorze próżniowym przy ciśnieniu -800 kPa przez 10 minut.
- Prepolimer PDMS utwardzić w piecu w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę. Częściowo utwardzoną płytę PDMS wyjąć z formy za pomocą skalpela. Całkowicie utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 120°C przez 1 godzinę.
- Wzdłuż wzoru prowadnic odetnij nieregularne krawędzie płyty PDMS tym samym skalpelem. Wykonaj tak precyzyjne i czyste cięcie, jak to tylko możliwe, szczególnie na powierzchni, która definiuje szczelinę do wkłuwania (patrz Rysunek 1A) dla kołków.
- Wykonać otwory o średnicy 2 mm na wlot/wylot w końcach głównego kanału płyty PDMS za pomocą stempli biopsyjnych. Podobnie perforuj otwory o średnicy 1 mm na końcach kanału wentylacyjnego. Zobacz Rysunek 1A dla układu kanałów i położenia tych otworów.
3. Montaż urządzenia z wykonaniem na miejscu wypełniacza szczeliny i bariery.
- Wykonaj zespół mikrokanałów.
- Zanurzyć szkło nakrywkowe nr 4 o średnicy 10 × 20 mm w roztworze czyszczącym podgrzanym do temperatury 60 °C na 10 minut.
- Dwukrotnie spłukać okulary dejonizowaną wodą i suszyć w temperaturze 120 °C przez 10 minut.
- Plazmowo przymocuj płytę PDMS do szkła nakrywkowego:
- Umieść płytę PDMS (kanałem do góry) i oczyszczoną szklaną pokrywę 10 × 20 mm nr 4 w komorze próżniowej napylarki.
- Rozpocznij pompowanie w dół komory do 60 Pa. Generuj plazmę próżniową (20 mA) przez 30 s.
- Natychmiast odpowietrzyć komorę. Przymocuj stronę elementu kanału płyty PDMS do szkła nakrywkowego tak, aby ich krawędzie były wyrównane.
- Warstwy klejone umieszczać w piekarniku o temperaturze 65 °C na 10 minut.
- Przynieś połączone warstwy do okapu laminarnego za pomocą sterylnego pojemnika. Sterylizuj je światłem UV przez 30 min.
- W osłonie laminarnej włóż kołki do szczeliny tak, aby ich końce tworzyły drugą ścianę boczną mikrokanału. Sąsiednie kołki powinny mieć różną długość, aby uniknąć kontaktu obu pionowych końców (patrz Rysunek 1B). Preferowane są duże odstępy między pionowymi końcami. Odstęp (N-1) × (szerokość pinu) jest możliwy, gdy przygotowanych jest N rodzajów pinów o różnych długościach pinów (L w Rysunek 2A).
- Wyprodukuj bazę ( Rysunek 2B).
- Utwórz lub odczytaj plik części bazy i utwórz dwa pliki sterowania numerycznego (NC) (zawierające ścieżki narzędzia; dołączone jako materiał uzupełniający) za pomocą oprogramowania CAD/CAM. Pierwszy dodatkowy pilnik NC wykorzystuje frez palcowy o średnicy 4 mm, a drugi frez palcowy o średnicy 1 mm.
- Zamocuj przezroczystą płytę z polimetakrylanu metylu (PMMA) o grubości 3 mm na frezarce CNC.
- Otwórz pierwszy plik NC w sterowniku komputerowej frezarki NC (CNC). Zamontuj frez palcowy 4 mm do frezarki CNC i zlokalizuj część zero, dotykając frezu palcowego do płyty PMMA. Uruchom kod NC, aby przeciąć deskę.
UWAGA: Od czasu do czasu przedmuchaj końcówkę frezu palcowego sprężonym powietrzem w celu schłodzenia i usunięcia wiórów. - Powtórzyć czynności opisane w pkt 3.2.3 przy użyciu drugiego pilnika NC i frezu palcowego o średnicy 1 mm.
- Obrabiane części odtłuścić detergentem i osuszyć ręcznikiem papierowym. Spryskaj części 70% etanolem i umieść je w okapie laminarnym.
- Wykonaj wypełniacz szczelin szpilkowych i barierę elastomerową:
UWAGA: Kroki 3.3.1 - 3.3.7 należy wykonywać aseptycznie w okapie laminarnym.- Przygotować wypełniacz luk, mieszając białą wazelinę i proszek politetrafluoroetylenu w stosunku wagowym 2:1. Homogenizować mieszaninę za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego.
- Wlej wypełniacz szczelin do strzykawki z dozownikiem. Wprowadzić tłok i nacisnąć go, aby napełnić końcówkę strzykawki. Zamocować igłę i ponownie wcisnąć tłok, aż końcówka igły zostanie wypełniona. Podobnie przygotuj strzykawkę dozującą z tłokiem i igłą i wypełnij klejem silikonowym.
- Podłączyć każdą strzykawkę do dozownika pneumatycznego za pomocą rurki adaptera. Dostosuj ciśnienie dozowania kleju silikonowego i wypełniacza na 250 kPa i 280 kPa.
- Dozuj klej silikonowy do krawędzi kieszeni podstawy. Umieść szkiełko nakrywkowe nr 4 o średnicy 10 × 20 mm na kieszeni i mocno dociśnij, aby je związać.
- Dozuj klej silikonowy na głębokość około 1 mm, aby narysować dwa segmenty wzdłuż dwóch zewnętrznych szczelin podstawy. Dozować wypełniacz szczeliny na głębokość około 1 mm, aby narysować segmenty wzdłuż drugiej szczeliny.
- Dozuj klej silikonowy do krawędzi innej kieszeni. Umieść zespół mikrokanalików (3.1) na kieszeni i mocno dociśnij, aby się połączył.
- Powtórz 3.3.5, aby upewnić się, że zarówno wypełniacz szczelin, jak i klej silikonowy całkowicie osadzają kołki i że nie ma otworu w szczelinach.
- Umieść urządzenie w sterylnym pojemniku, takim jak pudełko ze stali nierdzewnej z pokrywką. Przenieść pojemnik do nawilżonego zbiornika fermentacyjnego podgrzanego do temperatury 38 °C. W okapie laminarnym utwardź barierę elastomerową przez jeden dzień.
- Przesuń każdy kołek do 1 mm wzdłuż sąsiednich kołków, aby zwolnić kołki z utwardzonej bariery elastomerowej.
- Sterylizuj urządzenie światłem UV przez 30 min.
4. Ocena urządzenia mikroprzepływowego
- Wykrywanie wycieków za pomocą fluorescencji
- Otwórz mikrokanał za pomocą precyzyjnego narzędzia lub robota biurkowego. Zadbaj o to, aby szerokość kanału była jak najbardziej spójna w całym kanale.
- Rozcieńczyć zielony barwnik fluorescencyjny wodą dejonizowaną o stężeniu 10 μM, aby otrzymać roztwór fluorescencyjny.
- Dodaj roztwór fluorescencyjny do jednego z portów końcowych mikrokanału za pomocą mikropipetatora. Ten krok wypełni kanał roztworem.
- Umieść urządzenie mikroprzepływowe i dwa kawałki chłonnego papieru zwilżonego wodą dejonizowaną w dużym plastikowym naczyniu. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 24 godziny.
- Rejestruj obrazy zielonej fluorescencji mikrokanału za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z kamerą mikroskopową.
- Otwórz obrazy fluorescencyjne za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu i upewnij się, że nie ma wycieków (zielona fluorescencja) na styku wypełniacza szczelin i kołków.
- Komórki nasienne do mikrokanału.
- Przygotuj naczynie do hodowli komórkowej zawierające 70 - 80% zlewających się komórek (w zależności od typu komórek). Odłącz i zawieś komórki w pożywce wzrostowej.
- Odwirować komórki (prędkość i czas zależą od typu komórek) i odessać pożywkę.
- Ponownie zawiesić komórki niewielką ilością pożywki. Policz komórki za pomocą licznika komórek i dostosuj gęstość komórek od 1,5 × 106 do 1,5 × 107 komórek/ml.
- Otwórz mikrokanał za pomocą precyzyjnego narzędzia lub robota biurkowego (Rysunek 1B), aby utworzyć prosty kanał o szerokości 400 μm. Dostosuj pozycje sworzni, aby ściana boczna była jak najbardziej płaska w całym kanale. Dodaj zawiesinę komórek do jednego z portów końcowych mikrokanału i napełnij kanał.
- Zlokalizuj jeden z pinów, który definiuje ścianę boczną regionu, aby rozpocząć kulturę. Pod odwróconym mikroskopem zamknij dwa sąsiednie szpilki, aby zamknąć komórki w regionie hodowli komórkowej.
- Zamknij wszystkie piny w kolejności od wewnętrznej do zewnętrznej, aby usunąć wszystkie komórki z kanału. Delikatnie zassać zawiesinę z portów końcowych i dodać do nich pożywkę.
- Inkubować urządzenie zgodnie z opisem w ppkt 4.1.4. Gdy komórki są w około 70-80% zlewne, powoli otwórz szpilkę, aby poszerzyć obszar hodowli.
Wyniki
Konstrukcja rekonfigurowalnego mikrokanału została przedstawiona na Ryc. 1. Na szklanym podłożu umieszczono wiele prostokątnych pinów, ustawiając je w taki sposób, aby ich długie boki stykały się ze sobą. Arkusz PDMS z wyciętymi otworami oraz wnęką o głębokości odpowiadającej wysokości pinów pokrył końce pinów, tworząc zbiorniki wlotowe i wylotowe kanału, sufit kanału oraz drugą ścianę boczną naprzeciwko ściany kanału utworzonej z pinów. Obszar otoczony przez piny, ścianę (jedną z powierzchni arkusza PDMS) oraz szklane podłoże tworzy jeden kanał mikroprzepływowy.
Jak opisano wcześniej, rekonfigurowalność proponowanego systemu mikroprzepływowego uzyskuje się dzięki wielu małym pinom rozmieszczonym równolegle z bardzo niewielkimi, ale niezerowymi odstępami. Problemem w poprzednich raportach był silny przepływ generowany w szczelinach przez efekt kapilarny. Aby rozwiązać ten problem, szczeliny wypełniono najpierw wypełniaczem. W niniejszym protokole jako wypełniacz zastosowano dyspersyjną mieszaninę lepkiego węglowodoru i proszku fluoropolimerowego. Jednak sam wypełniacz również ulega efektowi kapilarnemu. Dlatego, jak pokazano na Rysunku 1, powstały rekonfigurowalny mikrokanał posiada zarówno wypełniacz węglowodorowo-fluoropolimerowy, jak i barierę elastomerową utworzoną wokół zewnętrznego obwodu wypełniacza. Zwężenie środkowej części pinów jest konieczne, aby pomieścić wystarczającą ilość wypełniacza, co zapewnia odpowiednią grubość i wytrzymałość bariery elastomerowej pomiędzy dwoma pinami.
Rysunek 2A przedstawia rysunek pinu, który tworzy segment ścianki bocznej. Jako materiał wybrano stal nierdzewną klasy 316L ze względu na jej odporność na korozję i niską tendencję do wymywania składników. Niemniej jednak, aby piny były kompatybilne z hodowlą komórkową, wymagany był dodatkowy proces pasywacji. Aby pomyślnie uformować segment ścianki bocznej, pin musi posiadać precyzyjnie prostokątną końcówkę bez zadziorów. Ponadto pin musi posiadać „uchwyt”, aby można go było łatwo przesuwać poprzez pchanie go za ten uchwyt. Ponieważ każdy pin ma zwężenie w części środkowej, grubość elastomeru między pinami była wystarczająca, aby wytrzymać naprężenia ścinające spowodowane ruchem pinów. W przeciwieństwie do innych części urządzenia, wykonanie pinów (z wyjątkiem zwężenia środkowego) należy zlecić firmie specjalizującej się w obróbce elektroiskrowej (EDM), ponieważ jest to jedna z najdokładniejszych i najbardziej opłacalnych metod obróbki małych elementów wykonanych z twardych metali. Samodzielne wykonanie zwężenia środkowego poprzez trawienie obniża koszty obróbki oraz ryzyko wygięcia lub złamania elementu podczas procesu produkcji.
Aby potwierdzić, że wypełniacz szczelin, bariera elastomerowa, a w konsekwencji szczelność rekonfigurowalnego mikrokanału działają prawidłowo, zastosowano detekcję wycieków za pomocą fluorescencji. Rysunek 3 przedstawia obraz fluorescencyjny obszaru w pobliżu krawędzi bariery elastomerowej 3 dni po wypełnieniu mikrokanału wodą zawierającą fluorescencyjny barwnik znacznikowy. Obraz fluorescencyjny pokazuje, że ciecz wypełniająca kanał dotarła do głębokości około 200 µm od widocznej krawędzi bariery elastomerowej. Jednak ciecz nie dotarła do wypełniacza szczelin. Dodatkowo nie zaobserwowano wycieku wypełniacza szczelin przez barierę elastomerową. Obserwacja ta wskazuje, że ścisłe dopasowanie między wąską częścią środkową pinów a barierą elastomerową zapobiegło migracji cieczy przez szczeliny.
Na koniec przeprowadzono długoterminową hodowlę komórkową z obszarem hodowli dostosowywanym poprzez stopniowe rozszerzanie ścianki bocznej rekonfigurowalnego urządzenia mikrofluidycznego, jak pokazano na Rysunku 4A. W dniu 0 d niewielka liczba komórek została ograniczona do przestrzeni równej szerokości jednego pinu, a pozostałe komórki odessano. W dniu 2 d komórki przytwierdziły się do dolnej powierzchni i rozpoczęły proliferację. Cofnięto dwa piny, tak aby wszystkie komórki były wyraźnie widoczne, mimo że stopień konfluencji był nadal niski. W dniu 5 d komórki nadal proliferowały, a konfluencja wzrosła. W dniach 6 i 9 d cofnięto dwa kolejne piny, aby utrzymać komórki w stanie podkonfluencyjnym. Efekt stopniowego rozszerzania obszaru hodowli przedstawiono na Rysunku 4B. W dniach cofania pinów zaobserwowano gwałtowne zmiany gęstości komórek. Jednak tempo przyrostu liczby komórek utrzymywało się na stałym poziomie, podczas gdy w typowej hodowli komórkowej ma ono charakter wykładniczy.
Rycina 1: Rekonfigurowalne urządzenie mikroprzepływowe z jedną ścianą boczną dyskretyzowaną pinami. (A) Części i konstrukcja rekonfigurowalnego urządzenia mikroprzepływowego. Urządzenie posiada jeden prosty kanał z jedną ścianą boczną utworzoną przez końce 10 stalowych pinów wstawionych w elementy mikrokanału z PDMS/szkła. Wypełniacz szczelin i bariera elastomerowa zapobiegają wyciekom cieczy przez szczeliny między pinami. Szkiełka nakrywkowe, wypełniacz szczelin i bariera elastomerowa są przymocowane do podstawy z polimetakrylanu metylu (PMMA). (B) Zautomatyzowany manipulator pinów. Efektor końcowy wykonany z blachy metalowej jest przymocowany do 3-osiowego robota biurkowego. Aby przesunąć jeden pin, efektor końcowy naciska jego pionowy koniec. Piny o różnych długościach są rozmieszczone w odstępach trzykrotnie większych niż szerokość pinu. Odstęp ten zapewnia, że efektor końcowy sprzęga się z jednym pinem na raz, zachowując wystarczający prześwit. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Rysunek techniczny obrabianych części wykorzystywanych w protokole. Jednostki podano w milimetrach; R oznacza wymiar promienia; symbol kwadratu (□) oznacza elementy kwadratowe; t oznacza grubość. (A) Sworzeń ze stali nierdzewnej 316L stanowiący element ścianki bocznej. Sworznie mogą być zamawiane i obrabiane zgodnie z opisem. Zwężenie środkowej części sworznia w celu uzyskania kształtu przypominającego kostkę do badań rozciągania nie jest uwzględnione na tym rysunku, ponieważ nie było ono częścią zamówienia na obróbkę, lecz zostało wykonane w ramach protokołu. (B) Podstawa z polimetakrylanu metylu (PMMA), która stabilizuje szkiełka nakrywkowe, wypełniacz szczelin i barierę elastomeryczną, zapobiegając przemieszczaniu się sworzni. (C) Pojemnik do trawienia wykorzystywany do trawienia środkowej części sworzni. Aby zbudować pojemnik do trawienia, cztery kawałki szkła skleja się za pomocą kleju silikonowego. Na dnie pojemnika nanosi się konturowy wzór z kleju silikonowego, a następnie umieszcza się na nim sworznie, jak pokazano na rysunku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Detekcja fluorescencyjna wycieku z rekonfigurowalnego mikrokanału przez szczeliny między pinami. Obraz fluorescencyjny zielonego barwnika fluorescencyjnego wypełniającego rekonfigurowalny mikrokanał został nałożony na obraz w kontraście fazowym struktury uszczelniającej, która składa się z wypełniacza szczelin (nieprzezroczysty) i bariery elastomerowej (półprzezroczysta). Krawędź bariery elastomerowej jest widoczna jako struktury przypominające menisk i jest oznaczona górną linią przerywaną; granica między barierą elastomerową a wypełniaczem szczelin jest przedstawiona jako struktury przypominające menisk stykające się z czarnym obszarem i jest wskazana dolną linią przerywaną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Progresywny i ciągły wzrost komórek przy zmiennej powierzchni hodowli komórkowej w rekonfigurowalnym mikrokanale. (A) Wzrost komórek COS-7 w obszarze hodowli ograniczonego przez ruchome ścianki boczne. (B) Krzywa wzrostu i ewolucja czasowa gęstości komórek COS-7 ograniczonych w obszarach hodowli o zmiennej wielkości w rekonfigurowalnym mikrokanale przedstawionym w A). Trzy pionowe strzałki oznaczają rozszerzenie obszaru hodowli komórkowej odpowiednio w 2, 5 i 6 d. Oprócz liczby komórek przedstawiono gęstości komórek dla tych samych obszarów hodowli, dopasowane indywidualnie do każdej krzywej wzrostu wykładniczego i wykorzystane do oszacowania lokalnego czasu podwojenia (td [h]) pokazanego w ramkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Mikrokanał dyskretny pinowo jest w pełni funkcjonalnym kanałem mikroprzepływowym i uważamy, że ma oczywiście wysoką rekonfigurowalność kształtu kanału w porównaniu z jakimikolwiek istniejącymi kanałami mikroprzepływowymi. Dostarczony przez nas protokół umożliwi urządzeniom mikroprzepływowym zdolnym do hodowli komórkowej ze stopniowo zwiększającą się powierzchnią hodowli komórkowej utrzymanie kultur w stanie zbiegu przez długi czas. Urządzenie zapewni również modelowanie komórek w kanale bez wcześniejszego modelowania białek na podłożu lub jakichkolwiek innych czynników w momencie projektowania lub produkcji. Ponadto to rekonfigurowalne urządzenie mikroprzepływowe z łatwością generuje silny przepływ przemieszczeniowy w kanale, co pomogłoby w realizacji obsługi tak trudnych do przepływu materiałów, z którymi może sobie poradzić bardzo niewiele istniejących urządzeń mikroprzepływowych. Oznacza to, że interakcja między komórkami a innymi mikroorganizmami, gazami i innymi niepłynami może być oceniana za pomocą tego urządzenia bez dużych modyfikacji konstrukcji urządzenia.
Rozważaliśmy zastosowanie ciśnienia Laplace'a lub ciśnienia hydrostatycznego do jednego wlotu kanału jako metod zewnętrznej kontroli przepływu. Nie zalecamy wpychania cieczy w ślepy zaułek, ponieważ spowoduje to wytworzenie przepływu w kierunku kanału wentylacyjnego przez szczeliny między kołkami a sufitem/podłogą kanału. Wiele operacji związanych z płynami nie wymaga takich operacji na sworzniach. Na przykład mieszanie można osiągnąć poprzez rozcieranie cieczy za pomocą jednego kołka (tj. kilkakrotne przesuwanie tylko jednego kołka w przód iw tył).
Najbardziej krytycznymi częściami urządzenia są kołki. Precyzja długości, równoległości, prostopadłości i jakości powierzchni są wymagane dla kołków, ponieważ muszą one tworzyć mikrokanał, muszą poruszać się płynnie i muszą kierować ruchem sąsiednich kołków. Dlatego zalecamy, aby kołki zamawiać w firmie specjalizującej się w precyzyjnej obróbce skrawaniem poprzez przedłożenie rysunku podobnego do rysunku 2A. Mogą istnieć firmy, które wymagają dodatkowego wymiarowania geometrycznego i wyraźnych kierunków chropowatości powierzchni. Jednak szpilki nadają się do wielokrotnego użytku, jeśli obchodzi się z nimi ostrożnie i od czasu do czasu pasywuje kwasem azotowym.
Bariera elastomerowa to kolejna krytyczna cecha, a jej powstanie jest najbardziej krytycznym krokiem w procesach wytwarzania urządzenia. Do uzyskania powtarzalnych i wiarygodnych wyników potrzebna będzie precyzyjnie obrobiona podstawa. Umieszczenie kołków na nieutwardzonej barierze jest również krytycznym krokiem. Kołki powinny być dobrze wyrównane i osadzone w wypełniaczu szczeliny i barierze bez pęcherzyków powietrza. Te kroki zapobiegają wyciekom przez piny, co jest częstym problemem w przypadku tego urządzenia mikroprzepływowego.
Inne typowe problemy związane z korzystaniem z tego urządzenia to a) szpilki krępowane tarciem oraz b) śmierć komórki i niskie tempo wzrostu. Możliwe przyczyny tego stanu rzeczy w a) to nierównomierne (stożkowe lub faliste) wytrawienie środka szpilki, słaba jakość wytrawionej powierzchni oraz niedopasowanie wymiarowe między wysokością końcówki szpilki a wysokością warstwy fotorezystu na formie do płyt silikonowych. Dostosowanie formuły wytrawiacza, temperatury i mieszania może pomóc w poprawie ruchu sworznia. Ponadto próbny montaż bez użycia wosku lub kleju dostarczy wskazówek, jak rozwiązać problem. Możliwe czynniki w b) to niedostateczna pasywacja kołków, błędy w doborze klejów do barier elastomerowych oraz niepełne utwardzenie klejów. Niektóre komórki mogą wymagać pokrycia wewnątrz mikrokanalika fibronektyną lub innymi białkami lub polimerami, które sprzyjają adhezji komórek. Ponadto optymalizacja w praktyce hodowli komórkowych, taka jak trypsyna i wirowanie, zmniejszy liczbę martwych komórek w mikrokanale.
Jednym z ograniczeń przedstawionego protokołu produkcyjnego jest to, że tylko jedna ze ścian bocznych jest dyskretna. Rekonfigurowalność kanału ulegnie dalszej poprawie, jeśli obie ściany boczne będą zbudowane za pomocą układów pinów. Chociaż wymaga to podwójnej liczby kołków i dłuższych etapów produkcji, jest to technicznie opłacalna opcja.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
To badanie zostało wsparte przez KAKENHI (20800048, 23700543).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Piekarnik | Yonezawa | MI-100 | |
| 10% Kwas azotowy | Wako Chemicals | 149-06845 | |
| Kołki ze stali nierdzewnej | Micro Giken | N/A | o przekroju 0,3 mm, klasa 316L stal nierdzewna, drut EDM |
| Środek antyadhezyjny | Fluoro Technology | FG-5093SH | |
| Polidimetylosiloksan (PDMS) | Shin-Etsu Chemicals | KE-106 | |
| Fotorezystor epoksydowy ujemny | Nippon Kayaku | SU-8 3050 | |
| Okulary nakrywkowe (prostokątne) | Szkło Matsunami | 26 x 60mm Nr 4 | |
| Aceton | Kanto Chemicals | 01060-79 | |
| Szkiełka szklane (duże) | Szkło Matsunami | 76 x 52mm No.1 | |
| Klej silikonowy | Shin-Etsu Chemicals | KE-41 | |
| Biała wazelina | Nikko Rica | Sun White P-1 | |
| Politetrafluoroetylen (PTFE) w proszku | Power House Accele | Microfluon II | |
| Przezroczysta płyta akrylowa (o grubości 3 mm) | Różne | Nie dotyczy | |
| Dozownik pneumatyczny | Musashi Engineering | ML-5000XII | |
| Kwas solny | Kanto Chemicals | 180768-00 | |
| Frezarek sterowany numerycznie (CNC) | Pro Spec Tools | PSF240-CNC | |
| Frez palcowy (średnica 4 mm) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0400 | |
| Frez palcowy (średnica 1 mm) | Mitsubishi Materials | MS2MSD0100 | |
| Klej (odporny chemicznie i o niskiej lepkości) | Fiolki ze szkła borykrzemianowego Cotronics | Duralco 4460 | |
| Różne | Przygotowanie roztworu HNO3+HCl (Aqua regia). Zawsze wybieraj szkło borokrzemianowe. | ||
| Wodorowęglan sodu | Kanto Chemicals | 37116-00 | |
| Myjka ultradźwiękowa | AS ONE AS12GTU | ||
| Wiertarka | ultradźwiękowa Shinoda Tools | SOM-121 | Stosowany jako homogenizator ultradźwiękowy. |
| Powlekarka wirowa | Active | ACT-220DII | |
| Płyta grzejna | AS ONE | ND-1 | |
| Film fotoplotowany (12 700 dpi) | Bez Giken | N/A | Nanoszono negatywy obrazu wgłębienia na dnie płyty PDMS. |
| Octan 2-metoksy-1-metyloetylu | Wako Chemicals | 130-10505 | |
| Punktowe źródło światła UV | Hamamatsu | L8327 | Źródło ultrafioletu |
| Azot | Różne | N/A | |
| Eksykator próżniowy i pompa | JAK JEDEN | MVD-100, GM-20S Skalpele | |
| nr 11 | |||
| (1,0 mm i 2,0 mm) | Kai Medical | BP-10F(1,0 m), BP-20F(2,0 mm) | |
| Długopis do grawerowania szkła | Różne | Nie dotyczy | |
| Roztwór czyszczący | Tama Chemicals | TMSC | Rozcieńczony w stosunku 1:100 wodą dejonizowaną |
| Napylarka | San-yu Electron | SC-708 | Do klejenia plazmowego. |
| Strzykawka dozująca (5 ml) | Musashi Engineering | PSY-5E | |
| Tłok | Musashi Engineering | FLP-5E | |
| igła (21G) | Musashi Engineering | PN-21G-B | |
| Rurka adaptera | Musashi Engineering | AT-5E | |
| Fermentor | Japan Kneader | PF100 | |
| Zielony barwnik fluorescencyjny (Alexa Fluor 488 kwas karboksylowy) | Thermo Fisher | A33077 | |
| Duże plastikowe naczynie | Greiner bio-one | 688161 | |
| Papier chłonny | Asahi Kasei | BEMCOT M-1 | |
| Mikroskop odwrócony | Leica | DMi8 | |
| Kamera mikroskopowa | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Dulbecco modyfikowany Eagle medium (DMEM) | GE Health Care | SH30021.01 | |
| Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy | Thermo Fisher | 15240-062 | |
| Roztwór trypsyny/EDTA | Thermo Fisher | 25200-056 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | GE Health Care | SH30256.01 | |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Biowest | S1820 | |
| Licznik komórek | FPI | OC-C-S02 | |
| Naczynie do hodowli komórkowych | VIOLAMO | VTC-D100 | |
| 15 ml rurka stożkowa | Corning | 352095 | |
| Mikroskop sklepowy | PEAK | 2034-20 | |
| Opryskiwacz ręczny | FURUPLA | No.3530 | |
| Okulary nakrywkowe (prostokątne) | Matsunami Szkło | 10 x 20mm No.4 | |
| Oprogramowanie CAD/CAM | Autodesk | Inventor HSM | |
| Regulator ciśnienia azotu | gazowego AS ONE | GF1-2506-RN-V | Ustawiony na 0,1 MPa |
Bibliografia
- Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
- Araci, I. E., Brisk, P. Recent developments in microfluidic large scale integration. Curr Opin Biotechnol. 25, 60-68 (2014).
- Gu, W., Chen, H., Tung, Y. -C., Meiners, J. -C., Takayama, S. Multiplexed hydraulic valve actuation using ionic liquid filled soft channels and Braille displays. Appl Phys Lett. 90 (3), 033505(2007).
- Konda, A., Taylor, J. M., Stoller, M. A., Morin, S. A. Reconfigurable microfluidic systems with reversible seals compatible with 2D and 3D surfaces of arbitrary chemical composition. Lab Chip. 15 (9), 2009-2017 (2015).
- Hahn, Y., Hong, D., Kang, J., Choi, S. A Reconfigurable microfluidics platform for microparticle separation and fluid mixing. Micromachines. 7 (8), 139(2016).
- Kintses, B., van Vliet, L. D., Devenish, S. R. A., Hollfelder, F. Microfluidic droplets: new integrated workflows for biological experiments. Curr Opin Chem Biol. 14 (5), 548-555 (2010).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology and medicine. Lab Chip. 12 (14), 2452-2463 (2012).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat Commun. 5, 4250(2014).
- Futai, N. Reconfigurable microchannels with discretized moving sidewalls. Chem Micro-Nano Syst. 10 (1), 24-25 (2011).
- Oono, M., et al. Reconfigurable microfluidic device with discretized sidewall. Biomicrofluidics. 11 (3), 034103(2017).
Przedruki i uprawnienia
