Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Specjalnie zaprojektowane formy do kultur tkankowych od mistrzów trawionych laserowo

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57239

⸱

21 maja 2018

 ,  , 
1Center for Biomedical Engineering,, Brown University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szybką, łatwą i tanią metodę wytwarzania niestandardowych form polidimetylosiloksanowych, które mogą być używane do produkcji hydrożelowych tkanek inżynieryjnych o skomplikowanej geometrii. Dodatkowo opisujemy wyniki ocen mechanicznych i histologicznych przeprowadzonych na zmodyfikowanych tkankach serca wytworzonych tą techniką.

Streszczenie

Wraz z rozwojem inżynierii tkankowej, wzrosło zainteresowanie szerokim zakresem parametrów tkanki, w tym kształtem tkanki. Manipulowanie kształtem tkanki w skali od mikrometra do centymetra może kierować wyrównaniem komórek, zmieniać efektywne właściwości mechaniczne i rozwiązywać ograniczenia związane z dyfuzją składników odżywczych. Ponadto naczynie, w którym przygotowywana jest tkanka, może nakładać na tkankę mechaniczne ograniczenia, co skutkuje powstawaniem pól stresowych, które mogą dodatkowo wpływać zarówno na strukturę komórki, jak i macierzy. Kształtowane tkanki o wysoce powtarzalnych wymiarach mają również zastosowanie w testach in vitro, w których wymiary próbki mają kluczowe znaczenie, takich jak analiza mechaniczna całej tkanki.

Ten manuskrypt opisuje alternatywną metodę produkcji wykorzystującą negatywne formy wzorcowe przygotowane z laserowo trawionego akrylu: te formy dobrze radzą sobie z polidimetylosiloksanem (PDMS), pozwalają na projekty o wymiarach w skali centymetrowej i rozmiarach elementów mniejszych niż 25 μm, i mogą być szybko zaprojektowane i wyprodukowane przy niskich kosztach i przy minimalnym doświadczeniu specjalistycznym. Minimalne wymagania czasowe i kosztowe pozwalają na szybkie iterowanie form trawionych laserowo, aż do określenia optymalnego projektu, i łatwe dostosowanie do wszelkich interesujących testów, w tym tych spoza dziedziny inżynierii tkankowej.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad miękka litografia była szeroko stosowana jako technika produkcyjna wspierająca badania naukowe, szczególnie w dziedzinie mikrofluidyki, badań materiałowych i inżynierii tkankowej1,2,3. Formowanie replik, w którym obiekt o pożądanym kształcie jest tworzony z ujemnej formy wzorcowej, oferuje wygodną i tanią metodę wytwarzania dodatnich replik PDMS, które można wykorzystać do odlewania hydrożeli w kształcie. Jednak wymagane ujemne formy wzorcowe są zwykle produkowane przy użyciu technik mikrowytwarzania, które są drogie, czasochłonne, mają ograniczony rozmiar i wymagają przestrzeni w pomieszczeniu czystym oraz wyrafinowanego sprzętu. Chociaż druk 3D stanowi potencjalną alternatywę, jego użyteczność jest nieco ograniczona ze względu na ograniczenia rozdzielczości tańszych drukarek oraz interakcje chemiczne między powszechnymi polimerami drukarek 3D a PDMS, które mogą hamować utwardzanie.

Systemy wycinarek laserowych zdolne zarówno do cięcia, jak i trawienia materiałów takich jak plastik, drewno, szkło i metal, stały się ostatnio drastycznie tańsze, a tym samym bardziej dostępne do produkcji narzędzi badawczych. Komercyjne wycinarki laserowe są w stanie wytwarzać obiekty w skali centymetrowej z minimalnymi cechami mniejszymi niż 25 μm, a ponadto wymagają minimalnego szkolenia, wiedzy i czasu na użytkowanie. Podczas gdy ablacja laserowa PDMS była wcześniej stosowana w produkcji urządzeń mikroprzepływowych, o ile nam wiadomo, żaden manuskrypt nie opisał procesu, w którym formy w skali milimetrowej i centymetrowej mogą być wytwarzane z laserowo wycinanych ujemnych form wzorcowych4.

Użyliśmy tej techniki głównie do manipulowania kształtem tkanek inżynieryjnych w celu poprawy dyfuzji składników odżywczych, wyrównania komórkowego i właściwości mechanicznych5,6,7. Jednak wszechstronność tej techniki pozwala na jej wykorzystanie w każdej dziedzinie, w której interesujące są formowane hydrożele, takich jak dostarczanie leków i badania materiałoznawcze8. Dzięki dostępowi do wycinarki laserowej, repliki form PDMS mogą być wykonane dla prawie każdej geometrii bez wysięgów (co uniemożliwiłoby usunięcie bez wieloczęściowej formy, co wykracza poza zakres tego manuskryptu) i które mieszczą się w wymiarach łoża laserowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Tworzenie projektów form wzorcowych w formacie wektorowym

  1. Złóż żądaną geometrię formy w formacie wektorowym za pomocą programu do grafiki wektorowej (patrz Tabela materiałów, wyposażenia i oprogramowania). Wybierz pozycję Plik| Nowy i utwórz płótno o odpowiednich wymiarach z formatem kolorów RGB. Utwórz żądaną geometrię za pomocą narzędzi kształtu w panelu po lewej stronie: wprowadź żądane wymiary w górnej części okna (kliknij przycisk przekształć u góry, jeśli nie jest początkowo widoczny), aby precyzyjnie zdefiniować rozmiary kształtów.
    UWAGA: Geometrie formy powinny umożliwiać co najmniej 6-milimetrową granicę między krawędzią najbardziej zewnętrznych elementów a linią cięcia, aby umożliwić przycinanie menisku PDMS po odlaniu formy. Pozwoli to gotowej formie leżeć równo z dnem naczynia hodowlanego. Ponadto geometrie form powinny uwzględniać ograniczenia związane z modelem wycinarki laserowej, który będzie używany, w tym szerokość rzazu i minimalny rozmiar elementu. Laser używany do prac opisanych w niniejszym dokumencie (patrz tabela materiałów, sprzętu i oprogramowania) charakteryzował się szerokością rzazu 0,2 mm i minimalnym rozmiarem wytrawionej cechy 25 μm (maksymalna rozdzielczość DPI 1,000). Wymiary formy można dobrać tak, aby pomieścić żądane naczynie hodowlane, takie jak 10-centymetrowe naczynie lub płytki 6- lub 24-dołkowe.
  2. Otwórz próbnik kolorów w lewym górnym rogu okna i zdefiniuj nowe próbki kolorów kompatybilne z oprogramowaniem do cięcia laserowego.
    UWAGA: Do cięcia używamy koloru czerwonego (RGB 255, 0, 0) i niebieskiego (RGB 0, 0, 255) do wytrawiania. W zależności od wymagań dotyczących projektu można zdefiniować dodatkowe próbki (na przykład, jeśli pożądana jest więcej niż jedna głębokość trawienia).
    1. Przypisz te kolory próbek do ścieżek cięcia, zaznaczając ścieżkę, a następnie wybierając próbkę przekroju dla koloru ścieżki i [Brak] dla koloru wypełnienia z próbnika kolorów.
  3. Podobnie, aby przypisać kolory próbki do ścieżek trawienia, zaznaczając obiekt, a następnie wybierając ścieżkę trawienia dla koloru wypełnienia i [Brak] dla koloru ścieżki z próbnika kolorów.
  4. Zapisuj projekty jako either.ai or.pdf formaty plików, w zależności od programu do grafiki wektorowej i kompatybilności z wycinarką laserową (Rysunek 1A i plik uzupełniający).

2. Laserowe wycinanie akrylowych form wzorcowych

  1. Wybierz ujemny materiał formy wzorcowej.
    UWAGA: Akryl o grubości ćwierć cala dobrze nadaje się do tego zastosowania ze względu na jego kompatybilność z cięciem laserowym, stosunkowo niski koszt i grubość, która pozwala na uzyskanie elementów o wysokości do ~ 5,5 mm. Można jednak również stosować inne materiały, które spełniają następujące wymagania: (i) Niereaktywne z utwardzaniem PDMS; (ii) Nieporowate/silnie przylegające do utwardzonego PDMS; (iii) Czyście tnie i wytrawia za pomocą wycinarki laserowej; (iv) utrzymuje stan szklisty w temperaturze do 60 °C; (v) o grubości zgodnej z pożądaną maksymalną wysokością elementu.
  2. Przygotuj wycinarkę laserową do cięcia zgodnie ze specyfikacją producenta. Upewnij się, że stosowana jest odpowiednia wentylacja i że wysokość łoża jest odpowiednio skalibrowana do wybranej grubości ujemnego materiału formy wzorcowej.
  3. Otwórz plik projektu w programie do grafiki wektorowej na komputerze podłączonym do wycinarki laserowej i kliknij Plik| Wydrukować. Upewnij się, że wycinarka laserowa jest ustawiona jako drukarka i że w menu rozwijanym Skalowanie wybrano opcję "Nie skaluj", aby zapobiec zniekształceniu projektu, przed kliknięciem przycisku Drukuj u dołu okna dialogowego drukowania.
  4. W narzędziu do drukowania wycinarki laserowej kliknij przycisk Ustawienia w prawym dolnym rogu. Przypisz ustawienia mocy, prędkości i impulsów na cal (PPI) do każdego z wcześniej wybranych kolorów, aby ustawić parametry cięcia/wytrawiania dla wszystkich cech konstrukcyjnych.
    UWAGA: W tym przypadku wycinarka laserowa wyposażona w laser o mocy 75 W (patrz tabela materiałów, sprzętu i oprogramowania), zastosowała następujące ustawienia: 100% mocy, 1% prędkości i 1,000 PPI tnie czysto przez akryl 1/4"; 100% mocy, 8% prędkości i 500 PPI wytrawia na głębokość 2,75 mm w akrylu; i 100% mocy, 5% prędkości, 500 PPI wytrawia na głębokość 3,50 mm w akrylu. Jeśli konfiguracja lub materiał wycinarki laserowej nie są znane, parametry te można określić empirycznie metodą prób i błędów na badanym elemencie.
  5. Kliknij duży zielony przycisk w oprogramowaniu wycinarki laserowej, aby wytrawić laserowo i wyciąć ujemne formy wzorcowe.
  6. Przygotuj ujemne formy wzorcowe do odlewania PDMS, usuwając wszelkie resztki cięcia za pomocą małych szczotek i/lub sprężonego powietrza (Rysunek 1B).

3. Przygotuj formy PDMS do hodowli komórek lub tkanek

  1. Przygotuj mieszankę odlewniczą PDMS zgodnie ze specyfikacją producenta. Przygotuj 0,35 ml /cm2 formy wzorcowej; Będzie się to różnić w zależności od cech formy i wysokości.
  2. Przygotowany PDMS odgazowuje się w komorze próżniowej podłączonej do standardowej laboratoryjnej linii próżniowej (<500 mmHg) przez 1 godzinę lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków.
  3. Zaklej zewnętrzną krawędź formy taśmą winylową lub taśmą maskującą (dobrze sprawdza się kolorowa taśma etykietowa) tak, aby taśma wystawała >3 mm ponad wytrawioną powierzchnię formy wzorcowej negatywu. Mocno dociśnij taśmę do boku formy, aby zapobiec późniejszym wyciekom.
    UWAGA: Jeśli akrylowa forma główna ma otwory przelotowe, może być konieczne nałożenie taśmy również na spód formy (Rysunek 1C).
  4. Wylej odgazowany PDMS na wytrawioną powierzchnię ujemnej formy wzorcowej.
    UWAGA: Docelowa grubość PDMS będzie zależeć od zastosowania, chociaż grube dna formy PDMS mogą utrudniać obrazowanie. Minimalna grubość ~ 1,5 mm zapewnia dobrą równowagę między względami obrazowania a łatwością usuwania pleśni.
  5. Umieść ujemną formę główną pokrytą PDMS w komorze próżniowej i ponownie odgazowuj przez 1 godzinę lub do momentu, gdy wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte.
  6. Odgazowaną ujemną formę wzorcową pokrytą PDMS umieścić w piekarniku o temperaturze 60 °C, aby utwardzała się przez co najmniej 6 godzin. Upewnij się, że półka piekarnika jest wypoziomowana. Alternatywnie, pozostawić PDMS do utwardzenia w temperaturze 37 °C przez noc lub w temperaturze otoczenia przez ~ 72 godziny.
  7. Jeśli wiele form zostało odlanych na tej samej ujemnej formie wzorcowej, użyj żyletki, aby rozciąć te formy, gdy nadal znajdują się na ujemnej formie głównej. Następnie oderwij każdą formę PDMS od ujemnej formy głównej. Upewnij się, że formy PDMS są zbierane powoli i ostrożnie, aby zapobiec rozdarciu elementów pleśni podczas zbierania.
  8. Za pomocą żyletki odetnij obszary z łąkotką przed odlewaniem, co zapobiegłoby płaskiemu leżeniu formy, a także nadmiarowi materiału lub zanieczyszczeń (Rysunek 1D).
  9. W razie potrzeby przygotuj formy do odlewania komórek/tkanek w autoklawie.

4. Odlew tkanki hydrożelowe z kolagenu i fibryny

UWAGA: Stosuj odpowiednią procedurę aseptyczną, aby utrzymać sterylność.

  1. Przyklej foremki do dna żądanego naczynia. Przyklej nowe formy do dna płytki poddanej hodowli tkankowej, mocno dociskając formę do nieobrobionego tworzywa sztucznego (ze względu na hydrofobowość PDMS).
    UWAGA: Jeśli jednak ma być użyty poliwęglan poddany działaniu kultur tkankowych lub w przypadku form ponownie używanych, które mają tendencję do słabszego przylegania, można użyć naturalnego lub syntetycznego kleju (takiego jak fibryna lub uszczelniacz silikonowy utwardzany przez noc), aby zapewnić mocowanie.
  2. Przygotuj roztwory odlewów fibrynogenu, trombiny i zneutralizowanego kolagenu w taki sposób, aby pożądane stężenie każdego z nich zostało osiągnięte w odlewanej tkance. Trzymaj kolagen na lodzie aż do odlewania.
    UWAGA: Fibrynogen i trombinę nie powinny mieszać się aż do momentu bezpośrednio przed odlewaniem. W razie potrzeby roztwory fibrynogenu i trombiny można również schłodzić, aby wydłużyć czas polimeryzacji. Użyliśmy końcowego stężenia fibrynogenu w zakresie 0-8 mg / ml, końcowego stężenia trombiny w zakresie 10 - 100 U / ml i końcowego stężenia kolagenu w zakresie 0,8 - 2,0 mg / ml (Rysunek 2). W przypadku zmodyfikowanych tkanek serca często używamy kardiomiocytów o stężeniu 12 x 106 komórek/ml z 1,6 mg/mL, 4 mg/ml fibrynogenu i 20 U/ml trombiny (trombinę dodaje się bezpośrednio przed odlewaniem). Optymalne stężenia (nawet poza tymi sugerowanymi zakresami) powinny być określone empirycznie.
  3. Pobrać komórki zgodnie ze standardowymi protokołami i ponownie zawiesić w stężeniu odpowiednim do osiągnięcia pożądanej początkowej gęstości komórek w odlewanej tkance.
    UWAGA: Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych zostały zebrane zgodnie z opisem w Lian i wsp.9 Zachowaj zebrane komórki na lodzie. Objętość komórek powinna być uwzględniona podczas przygotowywania zawiesiny komórek. Użyliśmy stężeń komórek w zakresie od 9 do 18 x 106 komórek / ml, chociaż oczekuje się, że optymalne zakresy będą się różnić w zależności od populacji komórek (Rysunek 2).
  4. Połącz fibrynogen, zneutralizowany kolagen i zawiesinę komórkową (patrz krok 4.2, aby zapoznać się z przykładem), aby stworzyć mieszankę odlewniczą. Utrzymuj mieszankę odlewniczą na lodzie.
    UWAGA: Temperatury i stężenia fibrynogenu i trombiny będą determinować kinetykę polimeryzacji; Aby zapobiec polimeryzacji podczas odlewania, może być konieczne przygotowanie oddzielnych partii mieszanki odlewniczej w zależności od liczby i objętości konstrukcji, które będą odlewane.
  5. Potraktuj powierzchnie formy, które będą narażone na działanie mieszanki odlewniczej, aby złagodzić hydrofobowość PDMS (hydrofobowość PDMS zwiększy adsorpcję białek i utrudni odlewanie).
    1. Osiągnij hydrofilową modyfikację powierzchni poprzez obróbkę plazmą tlenową, na przykład za pomocą ręcznego generatora wysokiej częstotliwości (np. BD-20A firmy Litton Engineering). Wszystkie powierzchnie formy, które stykają się z mieszaniną komórek/żelu, należy poddać obróbce plazmowej przez 3 - 5 sekund, około 5 minut przed odlewem.
    2. Alternatywnie można zastosować środek powierzchniowo czynny, taki jak Pluronic F-127 (1% w/v)10. Obróbkę powierzchni należy wykonać jak najbliżej czasu odlewania, ponieważ zmiana polaryzacji będzie się pogarszać z czasem.
  6. Bezpośrednio przed odlewaniem dodać trombinę do mieszanki odlewniczej i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół bez wprowadzania pęcherzyków.
  7. Pracując szybko, odpipetuj mieszankę odlewniczą do form, ostrożnie umieszczając mieszankę we wszystkich rogach i szczelinach formy. Unikaj wyrzucania pipety poza pierwszy ogranicznik, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków wewnątrz konstrukcji.
  8. Powtórzyć kroki 4.6 i 4.7 w razie potrzeby dla wszelkich dodatkowych partii mieszanki odlewniczej.
  9. Umieścić naczynie do hodowli tkankowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 45 minut. Jeśli inkubator nie jest dobrze nawilżony, przed inkubacją umieść pożywkę komórkową wokół form, aby zapobiec odwodnieniu konstrukcji.
    UWAGA: Rodzaj pożywki komórkowej będzie zależał od typu komórki, ale w przypadku zmodyfikowanych konstrukcji tkanki serca używamy suplementu RPMI 1640 + B27.
  10. Po 45 minutach włóż konstrukty z powrotem do kaptura i przykryj pożywką komórkową przed powrotem do inkubatora.
  11. Zmieniaj nośnik ogniwa co 48 - 72 godziny w zależności od potrzeb dla komórki i typu konstrukcji.
    UWAGA: Wymiana pożywki powinna być zaplanowana zgodnie z zalecanymi instrukcjami dostarczonymi przez dostawcę, aby zapewnić maksymalne zdrowie komórek. Zachowaj ostrożność podczas wymiany nośnika, aby nie naruszyć konstrukcji. Nie doświadczyliśmy problemów z unoszącymi się konstrukcjami, ale jeśli tak się stanie, można temu zapobiec, dodając do projektu formy wysokie słupki, które wystają poza poziom mediów.
  12. Po użyciu umyj formy kolejno 10% wybielaczem, 70% etanolem i wodą destylowaną. Następnie wysuszyć na powietrzu i autoklaw do ponownego użycia do ~ 10 razy.

5. Techniki analizy: Zagęszczanie tkanek

UWAGA: Zagęszczenie wynikające z przebudowy matrycy jest wskaźnikiem żywotności i rozwoju tkanki, który można łatwo zmierzyć za pomocą mikroskopii optycznej i analizy obrazu.

  1. Zbieraj obrazy mikroskopii optycznej konstrukcji w formach w odstępach czasowych od 2 h do 96 h po odlewaniu.
    UWAGA: Ze względu na wymagany niski stopień powiększenia, mikroskop preparacyjny z mocowaniem kamery dobrze nadaje się do tego zastosowania.
  2. Śledź widoczny obszar konstrukcji w pakiecie do analizy obrazów, takim jak ImageJ (open source, imagej.nih.gov/ij/).
  3. Przeanalizuj szybkość i końcowy stopień zagęszczenia (Rysunek 2).

6. Techniki analizy: Próba rozciągania

Uwaga: Zarówno mechanika aktywna (siły lub napięcia generowane przez zmodyfikowaną tkankę w wyniku aktywności komórki), jak i mechanika pasywna (siły lub napięcia generowane w odpowiedzi na przyłożone naprężenia lub siły) są krytycznymi cechami funkcjonalnymi wielu zmodyfikowanych tkanek, a jest to szczególnie prawdziwe dla zmodyfikowanych tkanek serca. Analizator mikromechaniczny wykorzystywany do analiz jest opisany w Tabeli Materiałów. Inne mechaniczne aparaty testowe mogą być podobnie stosowane, zakładając, że pozwalają na badanie uwodnione i są zdolne do kontroli długości i pomiarów siły w zakresach i rozdzielczościach istotnych dla tkanki. W przypadku tkanek o polach przekroju poprzecznego rzędu pojedynczych milimetrów kwadratowych i sztywności rzędu dziesiątek kPa dobrze nadaje się ogniwo obciążnikowe 5 mN. Większe i sztywniejsze materiały wymagałyby większego ogniwa obciążnikowego. Przed testowaniem upewnij się, że zarówno przetwornik siły, jak i regulator długości są prawidłowo skalibrowane.

  1. Włącz regulator długości, przetwornik siły, generator impulsów i regulator temperatury.
  2. Napełnij rynnę do badań mechanicznych roztworem Tyrode'a (1,8 mM chlorku wapnia, 1,0 mM chlorku magnezu, 5,4 mM chlorku potasu, 140 mM chlorku sodu, 0,33 mM fosforanu sodu, 10 mM HEPES i 5 mM glukozy w ddH2O, pH dostosowane do 7,4) dla zmodyfikowanych tkanek serca. Wyregulować termoparę w taki sposób, aby osiągnąć temperaturę kąpieli 37 °C.
  3. Załaduj protokół testów mechanicznych w celu zbierania danych o aktywnym skurczu.
    UWAGA: Oceniliśmy aktywną mechanikę skurczu za pomocą protokołu kroku długości, w którym kroki długości w przyrostach odkształcenia o 5% do 30% są utrzymywane przez 120 sekund, aby ocenić wpływ odkształcenia na siłę skurczu (Rysunek 3A). Dodatkowo oceniliśmy pasywne właściwości mechaniczne za pomocą protokołu pull-to-break przy stałej szybkości odkształcenia wynoszącej 10% odkształcenia/min ( Rysunek 3B). Oba te protokoły mogą służyć jako dobre punkty wyjścia do aktywnej i pasywnej analizy mechanicznej.
  4. Pod lunetą do preparacji ostrożnie odłącz zmodyfikowany konstrukt tkankowy od formy PDMS, tak aby swobodnie unosił się na wodzie.
    UWAGA: Konstrukcje komórkowe, które zostały poddane zagęszczeniu tkanki, prawdopodobnie zostaną już oderwane od wewnętrznych powierzchni formy iw takich przypadkach wymagana jest minimalna manipulacja.
    1. Jeśli zagęszczenie nie spowodowało uwolnienia konstruktu, użyj kleszczy, aby delikatnie oddzielić konstrukcję od boków i dna formy, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
  5. Za pomocą kleszczy delikatnie podnieś konstrukcję i przenieś ją do kąpieli do prób mechanicznych.
  6. Oglądając konstrukcję przez mikroskop preparacyjny, zamontuj oba końce konstrukcji na hakach przymocowanych do przetwornika siły i ramienia dźwigni.
  7. Wyreguluj pozycję ramienia dźwigni za pomocą mikromanipulatora, aż konstrukcja zostanie ustawiona bez przyłożonego naprężenia. Wyzeruj kontroler długości i regulator siły.
  8. Zobrazuj konstrukcję przez lunetę sekcji, aby wymiary konstrukcji można było zmierzyć za pomocą analizy obrazu.
  9. Zainicjuj protokół aktywnej siły i zapisz zebrane dane po zakończeniu protokołu (Rysunek 3).
  10. Jeśli wymagane są również pasywne dane mechaniczne, ponownie wyreguluj ramię dźwigni, aż do zera przyłożonego naprężenia. Wyzeruj kontrolery długości i siły, a następnie zobrazuj konstrukcję po raz drugi przed załadowaniem i zainicjowaniem protokołu mechaniki pasywnej (Rysunek 3). Zapisz zebrane dane.

7. Technika analizy: histologia parafiny i immunohistochemia

Uwaga: Odnieśliśmy największy sukces w obrazowaniu wycinków tkanek zmodyfikowanych za pomocą bloków parafinowych, dzięki czemu morfologia tkanek jest jak najlepiej zachowana. Wszystkie etapy procesu muszą być starannie przemyślane i dostosowane do zmodyfikowanej tkanki, w tym przetwarzanie próbek bez próżni lub ciśnienia, empiryczne określenie odpowiednich metod pobierania antygenu i miareczkowanie stężenia przeciwciał pierwszorzędowych. Inne techniki, takie jak użycie zamrożonych bloków do przygotowania szkiełek, mogą wymagać mniej czasu i kosztów, a jednocześnie przynosić wystarczające wyniki w zależności od zamierzonego zastosowania.

  1. Pod zakresem preparacji ostrożnie odłącz zmodyfikowany konstrukt tkankowy od formy PDMS za pomocą kleszczy wsuniętych między konstrukt a PDMS, aby delikatnie oddzielić go od PDMS, tak aby swobodnie unosił się w powietrzu. Przenieś te konstrukty do probówki mikrowirówkowej w celu utrwalenia.
    UWAGA: Delikatne konstrukcje lub te, które mają być zamocowane w warunkach naprężeń statycznych zapewnianych przez samą formę, można utrwalić w formie poprzez zmianę roztworów w studzience hodowlanej i usunięcie konstrukcji z formy po utrwaleniu.
  2. Natychmiast utrwal zmodyfikowane tkanki, zanurzając je w 4% paraformaldehydzie (PF) na 10 minut w temperaturze pokojowej. Oszacować nie więcej niż 1 h na 1 mm grubości tkanki; Nie naprawiaj zbyt mocno.
  3. Przepłukać tkanki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  4. Utrzymując tkankę mokrą, umieść na niej kroplę eozyny, aby zabarwić ją na różowo przez 10 - 30 s, a następnie spłucz 70% etanolem.
    UWAGA: Różowy kolor pomaga zidentyfikować go w bloku parafiny w celu późniejszego przekroju i zostanie zmyty podczas deparafinowania.
  5. Zawiń chusteczkę w papier do soczewek i umieść w kasecie histologicznej. W razie potrzeby użyj piankowych wkładek w kasecie, aby utrzymać chusteczkę płasko.
  6. Zanurz kasetę w 70% EtOH i przechowuj w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do przetwarzania parafiny.
  7. Przetwarzaj tkankę, odwadniając ją w rosnących stężeniach etanolu (2 x 30 min po 70, 95 i 100%). Następnie wykąpać próbki w trzech sekwencyjnych kąpielach ksylenowych przez 30 minut każda.
  8. Zanurz próbki w trzech sekwencyjnych kąpielach parafinowych na 30 minut każda.
  9. Rozgrzej kasety, ostrożnie rozłóż i usuń poplamioną eozyną chusteczkę z papieru do soczewek, a następnie zanurz tkankę naciekaną parafiną w bloku parafinowym. Uważaj, aby położyć próbkę płasko na dnie formy, aby umożliwić łatwiejsze cięcie.
  10. Proszę przeciąć tkanki za pomocą mikrotomu (o grubości 5 - 8 μm) i wybarwić przy użyciu standardowych procedur zoptymalizowanych dla tkanki inżynieryjnej (Rysunek 4).
    UWAGA: Alternatywą dla skrawków parafinowych jest użycie zamrożonych bloków, chociaż morfologia próbki może być zagrożona. Utrwalone konstrukty umieścić w 30% sacharozie w PBS na 3 godziny lub do momentu, gdy próbka zostanie zrównoważona (np. przez noc). Roztwór należy wymienić na 50/50 v/v 30% sacharozy i medium zamrażającym o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) na 1 godzinę. Umieść konstrukcje w zamrożonych blokach z pożywką do zamrażania OCT, używając 70% EtOH z zawiesiną suchego lodu w celu szybkiego zamrożenia bloków na plastikowych tacach. Bloki należy pokroić kriostatem na odcinki o grubości 10 - 50 μm.

8. Technika analizy: Wyrównanie komórek

Uwaga: Manipulowanie kształtem tkanki i wewnętrznymi polami stresu może modulować wyrównanie komórek, co jest cechą charakterystyczną wielu tkanek natywnych.

  1. Przygotuj zmodyfikowane konstrukty tkankowe w formach PDMS o interesującej geometrii.
  2. Pod koniec okresu hodowli umyć konstrukty w PBS, utrwalić 4% PF (patrz krok 7.2) i zebrać konstrukty, aby przygotować się do obrazowania przez cięcie i histologię (patrz sekcja 7) lub barwienie całego wierzchowca.
    UWAGA: Barwienie całego wierzchowca przebiega podobnie jak histologia/immunohistochemia, ale wymaga dłuższych okresów inkubacji, a głębokość penetracji barwników, przeciwciał i wszelkich technik obrazowania (takich jak głębokość penetracji światła w konstruktach) będzie musiała zostać empirycznie określona dla składu konstruktu.
  3. Ustaw skrawki tkanki w płaszczyźnie poziomej (równolegle do płaszczyzny dna formy) i zabarwić marker dla interesującej Cię komórki. Użyj etykiety f-aktyny, takiej jak falloidyna, aby oznaczyć włókna stresu aktynowego większości typów komórek. Alternatywnie użyj markera specyficznego dla komórki.
    UWAGA: W przypadku zmodyfikowanych tkanek serca orientację określano za pomocą sarkomerów barwionych α-aktyniną.
  4. Oceń główną oś wszystkich komórek lub jąder w obszarze zainteresowania ręcznie lub za pomocą narzędzia analitycznego (np. ImageJ, MATLAB).
    UWAGA: Przydatne może być kategoryzowanie różnych regionów tej samej konstrukcji, w zależności od geometrii (np. regiony "węzła" i "wiązki" w geometrii przypominającej siatkę lub "rdzeń" i "krawędź" w geometrii kołowej).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Optyka wycinarki laserowej sprawi, że obszary trawione będą miały nieco mniejsze wymiary wraz ze wzrostem głębokości trawienia, co skutkuje powstaniem ścian formy z bardzo delikatnym skosem, ze względu na zwężanie się wiązki lasera. Ułatwi to usuwanie odlewów z PDMS, jednak należy to starannie rozważyć w przypadku wymaganych bardzo głęboko trawionych negatywowych form wzorcowych (>6 mm) (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niestandardowe geometrie form PDMS, które są kompatybilne z kulturą tkankową, mają ogromne zastosowanie w dostrajaniu ważnych właściwości tkanek inżynieryjnych, takich jak wyrównanie komórek, szybkość dyfuzji i efektywna sztywność. Dodatkowo formy te są bardzo przydatne do przygotowania tkanek do zastosowań analitycznych, w których ważna jest geometria, takich jak badania mechaniczne16,17. Przygotowanie tych urządzeń z wycinanych laserowo ujemnych form wzorcowych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za finansowanie z NIH R00 HL115123 i Brown University School of Engineering. Są również wdzięczni Brown Design Workshop i Chrisowi Bullowi za szkolenie i wsparcie przy wycinarce laserowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pozycja
Fibrynogen bydlęcySigmaF8630-5GBuduje
Trombinę bydlęcąSigmaT6634-250UNBuduje
bydlęcą aprotyninęSigma10820-25MGBuduje
kolagen z ogona szczura, 4 mg / mlAdvanced Biomatrix5153-100MGKonstrukcje
Chlorek soduFisherBP358-10Konstrukcje
PBSLife Technologies14190-250Konstrukcje
Cienkie kleszczeFine Science Tools11252-20Konstrukcje
Sylgard 184 elastomer silikonowyCorning4019862PDMS Formy
Taśma laboratoryjnaFisher15-901-5RPDMS Formy
Akryl, 1/4" grubyMcMaster-Carr8560K356PDMS Formy
Bufor HEPES, 1 M SigmaH3537-100MLKonstrukcje
RPMI 1640 średnie, proszekFisher31800-089Konstrukcje
Dwuwodny chlorek wapniaFisherAC423520250Konstrukty
Sześciowodny chlorek magnezuFisherM33 500Konstrukty
Chlorek potasuSigmaP9541-500GKonstrukcje
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnySigmaS9390-500GWytwarza
GlukozaSigmaG5767-25GBuduje
OCTVWR25608-930Histologia
Mrożone formy blokoweVWR25608-916Histologia
HematoksylinaFisher3530 1Histologia
Eozyna YFisherAC152880250Histologia
Szybki zielony FCFFisherAC410530250Histologia
Oprogramowanie
IllustratorAdobe SystemsGrafika wektorowa
Inkscape(Open Source)Grafika
UCP (Universal Control Panel)Uniwersalne systemyInterfejs wycinarki laserowej
Equipment
PLS6.75 Wycinarka laserowaUniwersalne systemyWycinarka laserowa
Analizator mikromechanicznyAurora Scientific1530A z ogniwem obciążnikowym 5 mNAnaliza mechaniczna
wektorowa laserowe laserowe

Bibliografia

  1. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491(2010).
  2. Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  4. Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008(2016).
  5. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
  6. Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
  7. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
  8. Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
  9. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
  10. Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
  11. Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
  12. Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
  13. Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
  14. Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
  15. Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
  16. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
  17. Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
  18. Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
  19. Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Formy trawione laserowoformy tkankowe z PDMSniestandardowe formy tkankoweformy do in ynierii tkankowejakrylowe formy matrycoweproces odlewania PDMSgeometryczna kontrola tkanekmetody wyr wnywania tkanekwytwarzanie tkanek in ynieryjnych
Specjalnie zaprojektowane formy do kultur tkankowych od mistrzów trawionych laserowo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.