Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa identyfikacja synergicznych kombinacji leków metodą Overlap2

DOI:

10.3791/57241

⸱

21 maja 2018

 , 
1Microbiology and Immunology Division, Department of Pathology, University of Utah

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synergiczne kombinacje leków są trudne i czasochłonne do empirycznego zidentyfikowania. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i walidacji synergicznych małych cząsteczek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż leki przeciwbakteryjne znacznie zwiększyły długość i jakość życia wXX wieku, oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe zagraża zdolności całego naszego społeczeństwa do leczenia infekcji ogólnoustrojowych. W samych Stanach Zjednoczonych infekcje oporne na antybiotyki zabijają około 23 000 osób rocznie i kosztują około 20 miliardów dolarów dodatkowej opieki zdrowotnej. Jednym ze sposobów zwalczania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest terapia skojarzona, która jest szczególnie przydatna w krytycznym wczesnym stadium zakażenia, zanim zostanie zidentyfikowany organizm infekujący i jego profil oporności na leki. Wiele terapii przeciwbakteryjnych wykorzystuje terapie skojarzone. Jednak większość z tych kombinacji ma charakter addytywny, co oznacza, że łączna skuteczność jest taka sama, jak suma skuteczności poszczególnych antybiotyków. Niektóre terapie skojarzone są synergiczne: łączna skuteczność jest znacznie większa niż addytywna. Synergiczne kombinacje są szczególnie przydatne, ponieważ mogą hamować wzrost szczepów opornych na leki przeciwdrobnoustrojowe. Jednak te kombinacje są rzadkie i trudne do zidentyfikowania. Wynika to z samej liczby cząsteczek, które musiały zostać przetestowane w sposób parami: biblioteka 1000 cząsteczek ma 1 milion potencjalnych kombinacji. W związku z tym podjęto wysiłki w celu przewidzenia cząsteczek pod kątem synergii. W tym artykule opisano naszą wysokoprzepustową metodę przewidywania synergicznych par małych cząsteczek, znaną jako metoda Overlap2 (O2M). O2M wykorzystuje wzorce z zestawów danych chemiczno-genetycznych do identyfikacji mutantów, które są nadwrażliwe na każdą cząsteczkę w synergistycznej parze, ale nie na inne cząsteczki. Laboratorium Browna wykorzystuje tę różnicę wzrostu, przeprowadzając wysokoprzepustowe badanie przesiewowe dla cząsteczek, które hamują wzrost zmutowanych, ale nie dzikich komórek. Prace laboratorium wcześniej zidentyfikowały cząsteczki, które działają synergistycznie z antybiotykiem trimetoprimem i lekiem przeciwgrzybiczym flukonazolem przy użyciu tej strategii. W tym miejscu autorzy przedstawiają metodę badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych synergicznych kombinacji, które można zmienić dla wielu mikroorganizmów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie oporne na antybiotyki powodują ponad 2 miliony infekcji i 23 000 zgonów rocznie w Stanach Zjednoczonych według CDC1. Aby przezwyciężyć te infekcje, potrzebne są nowe metody leczenia. Strategie identyfikacji tych nowych metod leczenia obejmują opracowywanie nowych leków przeciwdrobnoustrojowych lub zmianę przeznaczenia małych cząsteczek zatwierdzonych do leczenia innych schorzeń w leczeniu infekcji mikrobiologicznych2,3,4. Jednak odkrywanie nowych leków jest bardzo kosztowne i czasochłonne. Zmiana przeznaczenia leków może nie identyfikować nowych leków lub celów leków5,6. Nasze laboratorium koncentruje się na trzeciej strategii znanej jako synergiczne terapie skojarzone. Synergiczne kombinacje występują, gdy dwie małe cząsteczki razem mają skuteczność większą niż efekt addytywny ich indywidualnych skuteczności7. Dodatkowo, synergiczne kombinacje mogą być skuteczne przeciwko patogenowi opornemu na jedną z małych cząsteczek w parze, a także mają mniej niepożądanych efektów poza celem, co czyni je bardzo potencjalnymi8,9,10.

Synergiczne pary są rzadkie, występują w około 4-10% kombinacji leków11,12,13. W związku z tym tradycyjne techniki, takie jak badania przesiewowe parami, są trudne i czasochłonne, z tysiącami potencjalnych kombinacji z małej biblioteki stu cząsteczek. Co więcej, oddziaływań synergicznych zwykle nie można przewidzieć na podstawie aktywności związków14. Autorzy opracowali jednak wysokoprzepustowe podejście do badań przesiewowych pod kątem par synergicznych, zwane Overlap2 Method (O2M)12. Ta metoda, opisana tutaj, pozwala na szybszą i skuteczniejszą identyfikację tych synergicznych par. O2M wymaga użycia znanej pary synergicznej i zestawu danych chemiczno-genetycznych. Zestawy danych chemiczno-genetycznych są generowane, gdy biblioteka mutantów nokautujących jest hodowana w obecności wielu różnych małych cząsteczek. Jeśli jedna cząsteczka w znanej parze synergistycznej indukuje ten sam fenotyp z określonego mutanta nokautującego, co druga cząsteczka synergistyczna, każda inna mała cząsteczka, która wywołuje fenotyp z tego samego mutanta, powinna również synergizować z każdym członkiem znanej pary synergicznej. To uzasadnienie zostało wykorzystane w laboratorium Browna do zidentyfikowania synergicznych par antybiotyków aktywnych przeciwko Escherichia coli (E. coli) i synergistycznych par leków przeciwgrzybiczych aktywnych przeciwko patogennemu grzybowi Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M nie tylko dostosowuje się do różnych patogenów, ale pozwala na badania przesiewowe dużych bibliotek cząsteczek w celu łatwej i szybkiej identyfikacji synergicznych par. Badania przesiewowe z użyciem mutanta genetycznego zidentyfikowanego przez O2M pozwalają nam zweryfikować tylko te małe cząsteczki, co do których przewiduje się synergię. Tak więc testowanie biblioteki 2000 cząsteczek parami zajęłoby miesiące, podczas gdy gdyby w tej bibliotece było tylko 20 cząsteczek, które miałyby synergię, testowanie synergii zajmuje teraz kilka dni. O2M nie wymaga umiejętności programowania, a wymagany sprzęt jest dostępny w większości laboratoriów lub podstawowych obiektów. Oprócz badaczy zainteresowanych kombinacjami leków, analiza O2M jest interesująca dla każdego, kto ukończył badanie przesiewowe narkotyków i chce rozszerzyć swoje trafienia poprzez identyfikację ważnych interakcji lek-lek. Poniżej znajduje się protokół identyfikacji synergicznych małych cząsteczek u bakterii, a także walidacji przewidywanych interakcji synergicznych w dobrze znanych testach15,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Identyfikacja mutantów przewidywania synergii na podstawie zestawu danych chemiczno-genetycznych za pomocą metody Overlap2 (O2M)

UWAGA: To jest metoda identyfikacji mutantów przewidywania synergii przy użyciu opublikowanego zestawu danych od Nicholsa i wsp. 17 w E. coli. Można to jednak zrobić na dowolnym zestawie danych chemiczno-genetycznych i mikroorganizmach. Te zestawy danych zawierają bibliotekę mutantów nokautujących hodowanych w obecności ponad 100 małych cząsteczek, co daje ilościowy wynik wzrostu dla każdego mutanta w każdej małej cząsteczce. Musi być znana jedna para synergiczna, a wyniki wzrostu powinny istnieć dla obu małych cząsteczek zawartych w zbiorze danych.

  1. Obliczyć średni wynik wzrostu i odchylenie standardowe dla wszystkich mutantów hodowanych w obecności pojedynczego stężenia każdej małej cząsteczki.
    UWAGA: Można to zrobić za pomocą dowolnego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Laboratorium Browna używa Excela i funkcji =ŚREDNIA(B3:B3981) i =ODCH.STANOWE(B3:B3981) do obliczeń każdej kolumny małej cząsteczki.
    1. Oblicz średnie i odchylenia standardowe z każdej kolumny małej cząsteczki, chociaż ta orientacja może się różnić w przypadku korzystania z innego zestawu danych.
  2. Oblicz wyniki Z dla każdego stężenia małej cząsteczki, korzystając z tego samego zestawu danych z Nichols i wsp. 17 w arkuszu kalkulacyjnym. W tym celu ujemne wyniki z będą wynosić Z(2,5) = średnia -2,5 * odchylenie standardowe, a dodatnie wyniki z będą wynosić Z(2,5) = średnia + 2,5 * odchylenie standardowe.
  3. Określ, które mutanty genów zawierają znaczące wyniki Z w małych cząsteczkach tworzących znaną parę synergiczną, pamiętając o wszystkich stężeniach tych cząsteczek. Jeśli wynik wzrostu mutanta jest mniejszy niż ujemny wynik Z (2,5) lub większy niż dodatni wynik Z (2,5) dla tej małej cząsteczki, uważa się go za znaczący.
  4. Określ, czy którykolwiek z istotnych mutantów genów należy do operonu.
    UWAGA: W przypadku E. coli autorzy zalecają sprawdzenie "Ecoli wiki" w celu uzyskania informacji o tym, czy geny są transkrybowane jako część policistronicznego RNA.
  5. Zidentyfikuj mutanty genów/operonów, które są wspólne dla większości małych cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania w różnych stężeniach (np. szukając cząsteczek, które działają synergistycznie z antybiotykiem trimetoprimem, zidentyfikuj mutanty, które wykazują znaczny wynik Z, gdy są hodowane w obecności trimetoprimu i jego znanych synergicznych partnerów, takich jak sulfametizol lub sulfametoksazol). Są to przypuszczalne mutanty przewidywania synergii.

2. Przewidywanie synergizatorów w zbiorze danych genetyki chemicznej przez O2M

  1. Wracając do dataset17, zidentyfikuj każde stężenie małej cząsteczki, które wywołuje znaczący wynik wzrostu z mutanta przewidywania synergii. Odbywa się to poprzez przyjrzenie się wynikom Z obliczonym dla każdego stężenia małych cząsteczek. Ponownie, znaczący wynik wzrostu jest mniejszy niż ujemny wynik Z lub większy niż dodatni wynik Z dla tego stężenia małej cząsteczki.
    UWAGA: Jeśli cząsteczka pojawia się nawet w jednym ze stężeń, cząsteczka jest uważana za przewidywany synergezyzator. Każda cząsteczka, która nie wywołuje znaczącego wyniku wzrostu, jest przewidywanym brakiem synergetyzu.

3. Walidacja przewidywanych interakcji synergicznych

  1. Znalezienie minimalnego stężenia hamującego (MIC) przewidywanych synergizatorów.
    1. Wyhodować nocną kulturę E. coli w minimalnej pożywce M9 w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Każda kultura wyhodowana przez noc może być uprawiana w odpowiednio zdefiniowanym podłożu dla interesującego nas organizmu. Laboratorium Brown nie zaleca multimediów, takich jak LB czy YPD. Pożywka minimalna M9 składa się z 10,5 g/l bulionu M9, 0,2% kasaminokwasów, 0,1 M CaCl2, 0,4% glukozy, 1 MMgSO4, 0,25% kwasu nikotynowego i 0,33% tiaminy wH2O.
    2. Jeżeli w literaturze nie zostaną znalezione dane MIC dla patogenu będącego przedmiotem zainteresowania po otrzymaniu małych cząsteczek, należy rozpuścić w dimetylosulfotlenku (DMSO) w wysokim stężeniu (>10 mg/ml).
    3. Używając płytki 96-dołkowej, dodaj 100 μl pożywki M9 do każdego dołka. Dodać dodatkowe 100 μl pożywki M9 do kolumny 1, aby zawierała łącznie 200 μl.
    4. Dodać dowolną ilość (~10 μl) stężonego roztworu drobnocząsteczkowego w kolumnie 1. Jedna mała cząsteczka na studzienkę kolumny 1 (8 małych cząsteczek na płytkę).
      UWAGA: Są to małe cząsteczki będące przedmiotem zainteresowania, które zgodnie z przewidywaniami ulegają synergii. Laboratorium Browna zazwyczaj dodaje 10 μl wysoce stężonego roztworu małocząsteczkowego, który jest poniżej ilości 100% DMSO, która może hamować E. coli.
    5. Po dodaniu małych cząsteczek rozcieńczyć małe cząsteczki w poprzek osi x płytki. Pobrać 100 μl roztworu z kolumny 1, umieścić w kolumnie 2 i wymieszać. Weź 100 μl z kolumny 2, umieść w kolumnie 3 i wymieszaj. Kontynuować ten proces do momentu, aż 100 μl zostanie umieszczone w kolumnie 11. Wymieszać kolumnę 11, a następnie pobrać 100 μl z tej kolumny i wyrzucić. Pozostaw kolumnę 12 tylko z multimediami, aby znormalizować dane.
    6. Zaszczepić płytkę. Gęstość optyczną (OD600) należy uzyskać z hodowli przez noc. Przygotować roztwór z kulturą i pożywką M9 do OD600 0,002 (lub odpowiedniego stężenia, które reprezentuje 500 komórek/μl dla pożądanego organizmu będącego przedmiotem zainteresowania). Odpipetować 2 μl roztworu hodowlanego do każdego dołka płytki, tak aby w każdym dołku znajdowało się 1 000 komórek.
    7. Delikatnie potrząśnij płytką i uzyskaj OD600 dla odczytu 0 godzin. Pozwól płytce rosnąć w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Uzyskaj OD600 do 24-godzinnego odczytu.
      UWAGA: Stosować odpowiednie warunki wzrostu dla innych organizmów będących przedmiotem zainteresowania.
    8. Oblicz przyrost netto dla każdego dołka za pomocą programu arkusza kalkulacyjnego.
    9. Uśrednić wzrost netto w kolumnie 12, aby uzyskać średni wzrost bez leku. Znormalizuj inne studzienki do średniej braku wzrostu leku za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych. Poszukaj dowolnego dołka o wzroście mniejszym niż 10%, aby zidentyfikować MIC90. Każdy odwiert o wzroście mniejszym niż 50% wskazuje na MIC50. Oblicz stężenie małych cząsteczek w tych studzienkach.
  2. Testy szachownicowe dla interakcji synergicznych
    1. Hoduj przez noc kulturę E. coli w minimalnej pożywce M9, jak poprzednio.
      UWAGA: Stosować odpowiednie warunki wzrostu dla innych organizmów.
    2. Dodać 100 μl pożywki M9 do każdego dołka na płytce 96-dołkowej i dodatkowe 100 μl w kolumnie 1.
    3. Dodaj testowaną małą cząsteczkę (przy ~ 8x MIC) do każdej studzienki w kolumnie 1 i dodaj podwójne stężenie (~ 16x MIC) do studzienki A1 (jedna mała cząsteczka badana na płytkę).
      UWAGA: Ilość ta jest określana na podstawie przeprowadzonego wcześniej testu MIC i różni się dla każdego potencjalnego synergizatora.
    4. Utworzyć rozcieńczenie gradientu na osi x, pobierając 100 μl z kolumny 1 i przenosząc do kolumny 2. Kontynuować ten proces do momentu dodania 100 μl do kolumny 11. Wymieszać, a następnie pobrać 100 μl z kolumny 11 i wyrzucić. Nie dodawaj żadnego leku do kolumny 12 (Rysunek 1A).
    5. Ustaw drugi gradient leku w poprzek osi y dla leku wejściowego. Dodać 100 μl pożywki zawierającej 2x MIC cząsteczki wejściowej w wierszu A. Wymieszać i rozcieńczyć jak poprzednio, pobierając 100 μl z rzędu A i umieszczając w B. Kontynuuj, aż 100 μl zostanie umieszczone w rzędzie G. Wymieszaj, weź 100 μl i wyrzuć, uważając, aby nie dodawać żadnego leku wejściowego w rzędzie H. Dzięki temu wiersz H i kolumna 12 mogą zawierać poszczególne wartości MIC badanej pary leków (Rysunek 1B).
    6. Zaszczepić płytkę. Dodać 2 μl kultury E. coli o OD600 0,002 do każdej studzienki (1000 komórek na studzienkę).
    7. Zmierz OD600 każdej studzienki w płytce dla odczytu 0 godzin.
    8. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
    9. Zmierz OD600 każdej studzienki po 24 godzinach.
  3. Obliczanie wskaźnika frakcji stężenia hamującego (FICI) z szachownicy
    1. Oblicz przyrost netto dla każdego dołka płytki, odejmując OD600 po 0 h od OD600 po 24 h w programie arkusza kalkulacyjnego.
    2. Normalizuj wzrost w oprogramowaniu, dzieląc każdą studzienkę przez studzienkę H12, która nie zawiera małej cząsteczki.
    3. Znajdź MIC90 cząsteczki wejściowej w kolumnie 12 i MIC90 potencjalnego synergetyku w wierszu H.
    4. Szukaj wszystkich studni, które hamują 90% wzrostu.
    5. Obliczyć FICI90 dla studni, która ma albo najniższą poniżej (synergiczną), albo najwyższą powyżej (antagonistyczną) obie wartości MIC90, używając równania:
      Wzór na indeks FIC, równanie do analizy interakcji leków, metoda kwantyfikacji synergii.
    6. Uznaj, że każdy ≤ FICI 0,5 jest synergiczny, a FICI ≥ 4 jako antagonistyczny (Rysunek 2).
      UWAGA: Można to również zrobić za pomocą MIC50 (50% hamowanie wzrostu), aby uzyskać FICI50 w oparciu o te wartości MIC.
  4. Test niezależności błogości
    UWAGA: Bliss Independence jest uruchamiany z każdym potencjalnym synergetykiem, który sam w sobie nie posiadał mikrofonu.
    1. Wyhodować nocną kulturę E. coli w pożywce M9 w temperaturze 37 °C, jak poprzednio.
      UWAGA: Również na tym etapie można zastosować odpowiednie warunki wzrostu dla innych organizmów będących przedmiotem zainteresowania.
    2. Przygotuj 96-dołkowe płytki do testowania potencjalnej cząsteczki synergicznej, cząsteczki wejściowej, kombinacji i kontroli niepoddanej działaniu środka.
    3. Stwórz potencjalną płytkę synergistyczną, dodając 50 μl pożywki M9 do każdej studzienki. Dodać 50 μl pożywki zawierającej ustalone stężenie (10 μM lub 100 μM) potencjalnego synergetyku do każdego dołka w rzędzie. Przetestuj 8 cząsteczek na płytkę.
    4. Utwórz płytkę cząsteczki wejściowej, dodając 50 μl pożywki do każdej studzienki. Dodać 50 μl zawierających 4 x MIC leku wejściowego do każdej studzienki w kolumnie 1. Utworzyć gradientowe rozcieńczenie wzdłuż osi x podobne do płytek MIC, pobierając 50 μl z kolumny 1, dyspergując i mieszając w kolumnie 2. Kontynuować ten proces do kolumny 12, usuwając 50 μl z kolumny 12. Dodaj dodatkowe 50 μl pożywki do każdej studzienki, tak aby końcowa suma dla każdej studzienki wynosiła 100 μl.
    5. Tworząc płytkę kombinowaną za pomocą płytki 96-dołkowej, dodaj 50 μl pożywki do każdego dołka. Dodać 50 μl zawierających 4 x MIC leku wejściowego do każdej studzienki w kolumnie 1. Rozcieńczyć wzdłuż osi x, podobnie jak płytki MIC, pobierając 50 μl z kolumny 1, dyspergując i mieszając w kolumnie 2. Kontynuować przez całą drogę do kolumny 12, usuwając 50 μl z kolumny 12. Dodać 50 μl pożywki zawierającej potencjalny synergetyk w temperaturze 10 μM lub 100 μM do każdego dołka w rzędzie. Ponownie, powinno być jedno stężenie lub lek w rzędzie.
    6. Stwórz niepoddawaną działaniu substancji kontrolę, dodając 100 μl pożywki M9 do wszystkich dołków płytki.
    7. Zaszczepić wszystkie płytki, dodając 2 μl kultury bakteryjnej o OD600 0,002 lub 1,000 komórek do każdej studzienki, jak poprzednio.
    8. Zmierz OD600 każdej studzienki po 0 i 24 godzinach.
  5. Obliczanie wyniku niezależności Bliss
    1. Oblicz przyrost netto dla każdej studzienki płytki, odejmując OD600 po 0 godzinach od wzrostu po 24 godzinach za pomocą programu arkusza kalkulacyjnego.
    2. Znormalizuj studzienki do średniego wzrostu od płytki bez leku w programie arkusza kalkulacyjnego.
    3. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, oblicz zahamowanie, odejmując wzrost netto od 1.
    4. Uśrednij kolumny na tablicy kontrolnej zawierające tylko gradient wejściowy w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego.
    5. Oblicz wynik błogości dla każdej studni za pomocą równania:
      Bliss Score = (studnia X + kolumna wejściowa X) – Połączone dobrze X
    6. Szukaj ujemnych wyników w studniach poniżej MIC90 wejścia.
      UWAGA: Ujemne wyniki w wielu stężeniach wskazywałyby na interakcję synergiczną.

4. Wysokoprzepustowy ekran z mutantami predykcyjnymi synergii do identyfikacji nowych par synergicznych

  1. Identyfikacja mutantów przewidywania synergii
    UWAGA: Krok 1.5 zidentyfikował mutanty przewidywania przypuszczalnej synergii. W tym miejscu określamy, które z tych mutantów będą najlepiej funkcjonować w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym dla leków synergicznych. Przeprowadziliśmy ten test w maszynie Bioscreen, ale 96-dołkowe czytniki płytek również powinny być akceptowalne.
    1. Hoduj każde domniemane mutanty przewidywania synergii i komórki typu dzikiego w minimalnych pożywkach M9.
    2. Ustaw 100-dołkową płytkę o strukturze plastra miodu (lub 96-dołkową płytkę) z odpowiednią pożywką wzrostową, pożywką wzrostową + lekiem wejściowym, pożywką wzrostową + znanym synergicznym partnerem leku wejściowego i pożywką wzrostową + znanym lekiem niesynergicznym. Upewnij się, że dołączyłeś elementy sterujące pojazdu.
      UWAGA: Zalecamy cztery studzienki replikacyjne dla każdego szczepu/leku/stężenia.
    3. Zaszczepij 1,000 komórek na studzienkę, w tym ślepe studzienki kontrolne.
    4. Rosnąć 48 godzin w temperaturze 37 °C, z potrząsaniem i odczytywać OD600 co 20 minut.
    5. Określ stężenie leku i punkt czasowy, który pokazuje największą różnicę wzrostu między zmutowanymi komórkami typu dzikiego i zmutowanymi komórkami predykcyjnymi synergii w obecności leku wejściowego i jego znanych synergicznych partnerów. W optymalnym punkcie czasowym i stężeniu nie powinno być dużej różnicy we wzroście między zmutowanymi komórkami typu dzikiego i zmutowanymi przewidywanymi synergiami, gdy są hodowane w obecności leków, o których wiadomo, że nie działają synergistycznie z lekiem wejściowym (Rysunek 3).
  2. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe dla leków synergicznych
    1. Hoduj komórki typu dzikiego i zmutowane komórki przewidywania synergii w minimalnym pożywce M9.
      UWAGA: Użyj odpowiedniej pożywki wzrostowej dla interesującego organizmu
      2. .
    2. Dodaj leki z biblioteki do pożywki tak, aby każda studzienka, która zawiera 100 μl pożywki z małymi cząsteczkami o ustalonym stężeniu, które zostało określone w poprzednim kroku. Uwzględnij studzienki ślepe (bez komórek) i studzienki z kontrolami nośnika (np. DMSO) w celu uwzględnienia zahamowania wzrostu przez nośnik rozcieńczania leku.
      1. Przygotuj co najmniej cztery studzienki kontrolne pojazdu na płytę, najlepiej rozrzucone po płycie, aby uwzględnić efekty położenia odwiertu. Jeżeli testy są zmienne, należy uwzględnić co najmniej jedną studzienkę kontrolną nośnika na wiersz/kolumnę i wykorzystać każdą studzienkę kontrolną wiersza/kolumny jako kontrolę do obliczenia wyników Z dla każdego wiersza/kolumny, a nie dla całej płytki (etap 4.2.5).
    3. Dodaj 2 μl kultury do każdego dołka, tak jak poprzednio. (Jedna płytka dla bakterii typu dzikiego i jedna płytka dla przewidywanych zmutowanych bakterii synergicznych).
    4. Ocenić OD600 po 0 i 18 godzinie dla E. coli lub 48 h dla C. neoformans.
    5. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, oblicz wzrost netto, odejmując OD600 pustych studzienek od studzienek kontrolnych pojazdu. Zidentyfikuj studzienki ze wskaźnikiem Z wynoszącym -2,5 (wynik Z = średnia - 2,5*odchylenie standardowe). Studnie te zawierają potencjalną synergetykę małych cząsteczek.
    6. Weryfikuj działania na ekranie, korzystając z metod opisanych w kroku 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy szachownicowe są półilościową metodą pomiaru synergicznych interakcji. Ostateczny wynik, FICI, określa, czy kombinacja leków jest uważana za synergiczną (FICI ≤0,5), nieoddziałującą (0,5 Rysunek 1 ilustruje, jak ustawić gradienty leków w teście szachownicy. Rysunek 2 ilustruje typowe wyniki. Weźmy pod uwagę wzrost (fioletowe studzienki), które wykazują mniej niż 90% zahamowanie wzrostu. Po zmierzeniu OD600 każdego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synergistyczne pary małych cząsteczek mogą być potężnym narzędziem w leczeniu infekcji mikrobiologicznych, ale nie osiągnęły pełnego potencjału klinicznego, ponieważ pary synergistyczne są trudne do zidentyfikowania. W artykule opisano metodę identyfikacji par synergicznych znacznie szybciej niż proste kombinacje parami. Korzystając ze zbiorów danych z zakresu genetyki chemicznej, O2M identyfikuje mutanty z nokautami genów, które można następnie wykorzystać jako odczyt do badań przesiewowych dużych bibliotek małych cząst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem dla startupów z Wydziału Patologii Uniwersytetu Utah dla J.C.S.B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instrument Bioscreen CKrzywe wzrostu USA
Synergy H1instrumentBioTek
odczynnikdo bulionuAmrescoJ863-500G
OdczynnikCasamino AcidsFisher ScientificBP1424-500
Odczynnik glukozySigmaG7021-10KG
Odczynnikkwasu nikotynowegoOdczynnik tiaminowy AlfaA12683
Acros Organics148991000
CaCl2 Odczynnik DihydrateFisherC79-500
MgSO4 heptahydratFisherM63-500
obejmują Nichols i in., Komórka, 2011, Brown i in., Komórka, 2014 i inne cytowane w tekście.
trimetoprim (przykładowy lek wejściowy; można użyć dowolnego)odczynnikFisher ScientificICN19552701
sulfametoksazol (przykładowy lek testowy; można użyć dowolnego)odczynnikFisher ScientificICN15671125
M9 Przykłady zestawów danych genetyki chemicznej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145(2014).
  2. Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870(2012).
  3. Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703(2014).
  4. Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
  5. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
  6. Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282(2015).
  7. Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796(2010).
  8. Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
  9. Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819(2011).
  10. Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
  11. Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644(2017).
  12. Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
  13. Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
  14. Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
  15. Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181(2015).
  16. Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
  17. Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
  18. Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
  19. Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930(2015).
  20. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
  21. Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562(2012).
  22. Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
  23. Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
  24. Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewy wysokoprzepustowetest szachownicowywynik FICIoporno na rodki przeciwdrobnoustrojowezbiory danych chemiczno genetycznychkom rki typu dzikiegomutanty do predykcji synergiipomiar g sto ci optycznej

Powiązane artykuły