Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa identyfikacja synergicznych kombinacji leków metodą Overlap2

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57241

⸱

21 maja 2018

 , 
1Microbiology and Immunology Division, Department of Pathology, University of Utah

W tym artykule

Podsumowanie

Synergiczne kombinacje leków są trudne i czasochłonne do empirycznego zidentyfikowania. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i walidacji synergicznych małych cząsteczek.

Streszczenie

Chociaż leki przeciwbakteryjne znacznie zwiększyły długość i jakość życia wXX wieku, oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe zagraża zdolności całego naszego społeczeństwa do leczenia infekcji ogólnoustrojowych. W samych Stanach Zjednoczonych infekcje oporne na antybiotyki zabijają około 23 000 osób rocznie i kosztują około 20 miliardów dolarów dodatkowej opieki zdrowotnej. Jednym ze sposobów zwalczania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest terapia skojarzona, która jest szczególnie przydatna w krytycznym wczesnym stadium zakażenia, zanim zostanie zidentyfikowany organizm infekujący i jego profil oporności na leki. Wiele terapii przeciwbakteryjnych wykorzystuje terapie skojarzone. Jednak większość z tych kombinacji ma charakter addytywny, co oznacza, że łączna skuteczność jest taka sama, jak suma skuteczności poszczególnych antybiotyków. Niektóre terapie skojarzone są synergiczne: łączna skuteczność jest znacznie większa niż addytywna. Synergiczne kombinacje są szczególnie przydatne, ponieważ mogą hamować wzrost szczepów opornych na leki przeciwdrobnoustrojowe. Jednak te kombinacje są rzadkie i trudne do zidentyfikowania. Wynika to z samej liczby cząsteczek, które musiały zostać przetestowane w sposób parami: biblioteka 1000 cząsteczek ma 1 milion potencjalnych kombinacji. W związku z tym podjęto wysiłki w celu przewidzenia cząsteczek pod kątem synergii. W tym artykule opisano naszą wysokoprzepustową metodę przewidywania synergicznych par małych cząsteczek, znaną jako metoda Overlap2 (O2M). O2M wykorzystuje wzorce z zestawów danych chemiczno-genetycznych do identyfikacji mutantów, które są nadwrażliwe na każdą cząsteczkę w synergistycznej parze, ale nie na inne cząsteczki. Laboratorium Browna wykorzystuje tę różnicę wzrostu, przeprowadzając wysokoprzepustowe badanie przesiewowe dla cząsteczek, które hamują wzrost zmutowanych, ale nie dzikich komórek. Prace laboratorium wcześniej zidentyfikowały cząsteczki, które działają synergistycznie z antybiotykiem trimetoprimem i lekiem przeciwgrzybiczym flukonazolem przy użyciu tej strategii. W tym miejscu autorzy przedstawiają metodę badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych synergicznych kombinacji, które można zmienić dla wielu mikroorganizmów.

Wprowadzenie

Bakterie oporne na antybiotyki powodują ponad 2 miliony infekcji i 23 000 zgonów rocznie w Stanach Zjednoczonych według CDC1. Aby przezwyciężyć te infekcje, potrzebne są nowe metody leczenia. Strategie identyfikacji tych nowych metod leczenia obejmują opracowywanie nowych leków przeciwdrobnoustrojowych lub zmianę przeznaczenia małych cząsteczek zatwierdzonych do leczenia innych schorzeń w leczeniu infekcji mikrobiologicznych2,3,4. Jednak odkrywanie nowych leków jest bardzo kosztowne i czasochłonne. Zmiana przeznaczenia leków może nie identyfikować nowych leków lub celów leków5,6. Nasze laboratorium koncentruje się na trzeciej strategii znanej jako synergiczne terapie skojarzone. Synergiczne kombinacje występują, gdy dwie małe cząsteczki razem mają skuteczność większą niż efekt addytywny ich indywidualnych skuteczności7. Dodatkowo, synergiczne kombinacje mogą być skuteczne przeciwko patogenowi opornemu na jedną z małych cząsteczek w parze, a także mają mniej niepożądanych efektów poza celem, co czyni je bardzo potencjalnymi8,9,10.

Synergiczne pary są rzadkie, występują w około 4-10% kombinacji leków11,12,13. W związku z tym tradycyjne techniki, takie jak badania przesiewowe parami, są trudne i czasochłonne, z tysiącami potencjalnych kombinacji z małej biblioteki stu cząsteczek. Co więcej, oddziaływań synergicznych zwykle nie można przewidzieć na podstawie aktywności związków14. Autorzy opracowali jednak wysokoprzepustowe podejście do badań przesiewowych pod kątem par synergicznych, zwane Overlap2 Method (O2M)12. Ta metoda, opisana tutaj, pozwala na szybszą i skuteczniejszą identyfikację tych synergicznych par. O2M wymaga użycia znanej pary synergicznej i zestawu danych chemiczno-genetycznych. Zestawy danych chemiczno-genetycznych są generowane, gdy biblioteka mutantów nokautujących jest hodowana w obecności wielu różnych małych cząsteczek. Jeśli jedna cząsteczka w znanej parze synergistycznej indukuje ten sam fenotyp z określonego mutanta nokautującego, co druga cząsteczka synergistyczna, każda inna mała cząsteczka, która wywołuje fenotyp z tego samego mutanta, powinna również synergizować z każdym członkiem znanej pary synergicznej. To uzasadnienie zostało wykorzystane w laboratorium Browna do zidentyfikowania synergicznych par antybiotyków aktywnych przeciwko Escherichia coli (E. coli) i synergistycznych par leków przeciwgrzybiczych aktywnych przeciwko patogennemu grzybowi Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M nie tylko dostosowuje się do różnych patogenów, ale pozwala na badania przesiewowe dużych bibliotek cząsteczek w celu łatwej i szybkiej identyfikacji synergicznych par. Badania przesiewowe z użyciem mutanta genetycznego zidentyfikowanego przez O2M pozwalają nam zweryfikować tylko te małe cząsteczki, co do których przewiduje się synergię. Tak więc testowanie biblioteki 2000 cząsteczek parami zajęłoby miesiące, podczas gdy gdyby w tej bibliotece było tylko 20 cząsteczek, które miałyby synergię, testowanie synergii zajmuje teraz kilka dni. O2M nie wymaga umiejętności programowania, a wymagany sprzęt jest dostępny w większości laboratoriów lub podstawowych obiektów. Oprócz badaczy zainteresowanych kombinacjami leków, analiza O2M jest interesująca dla każdego, kto ukończył badanie przesiewowe narkotyków i chce rozszerzyć swoje trafienia poprzez identyfikację ważnych interakcji lek-lek. Poniżej znajduje się protokół identyfikacji synergicznych małych cząsteczek u bakterii, a także walidacji przewidywanych interakcji synergicznych w dobrze znanych testach15,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Identyfikacja mutantów do przewidywania synergii z zestawu danych chemogenetycznych za pomocą metody nakładania 2 (O2M)

UWAGA: Jest to metoda identyfikacji mutantów do przewidywania synergii z wykorzystaniem opublikowanego zbioru danych Nichols et al.17 w E. coli. Można ją jednak zastosować do dowolnego zbioru danych z zakresu chemii genetycznej i dowolnego mikroorganizmu. Zbiory danych te zawierają bibliotekę mutantów z wyłączonymi genami (knockout), hodowanych w obecności ponad 100 małych cząsteczek, co pozwala na uzyskanie ilościowej oceny wzrostu dla każdego mutanta w obecności każdej małej cząsteczki. Należy znać jedną parę synergistyczną, a zbiór danych musi zawierać oceny wzrostu dla obu małych cząsteczek.

  1. Oblicz średni wskaźnik wzrostu oraz odchylenie standardowe dla wszystkich mutantów hodowanych w obecności pojedynczego stężenia każdej małej cząsteczki.
    UWAGA: Można to zrobić za pomocą dowolnego oprogramowania arkuszowego. Laboratorium Brown używa programu Excel oraz funkcji =AVERAGE(B3:B3981) i =STDEV(B3:B3981) do obliczeń dla każdej kolumny małej cząsteczki.
    1. Oblicz średnie i odchylenia standardowe z każdej kolumny małej cząsteczki, choć orientacja ta może być inna w przypadku korzystania z innego zestawu danych.
  2. Oblicz wyniki Z (Z-scores) dla każdego stężenia małej cząsteczki, korzystając z tego samego zestawu danych od Nichols et al.17 w programie arkusza kalkulacyjnego. W tym przypadku ujemne wyniki Z będą wynosić Z(2,5) = średnia - 2,5 * odchylenie standardowe, a dodatnie wyniki Z będą wynosić Z(2,5) = średnia + 2,5 * odchylenie standardowe.
  3. Ustal, które mutanty genów wykazują istotne wyniki Z w przypadku małych cząsteczek tworzących znaną parę synergistyczną, pamiętając o sprawdzeniu wszystkich stężeń tych cząsteczek. Jeśli wskaźnik wzrostu mutanta jest mniejszy niż ujemny wynik Z (2,5) lub większy niż dodatni wynik Z (2,5) dla danej małej cząsteczki, uznaje się go za istotny.
  4. Ustal, czy którykolwiek z istotnych mutantów genów należy do operonu.
    UWAGA: W przypadku E. coli autorzy zalecają sprawdzenie „Ecoli wiki” w celu uzyskania informacji, czy geny są transkrybowane jako część policistronicznego RNA.
  5. Zidentyfikuj mutanty genów/operonów, które są wspólne dla większości interesujących małych cząsteczek w różnych stężeniach (np. szukając cząsteczek, które działają synergistycznie z antybiotykiem trimetoprimem, zidentyfikuj mutanty wykazujące istotny wynik Z podczas hodowli w obecności trimetoprimu i jego znanych partnerów synergistycznych, takich jak sulfametizol lub sulfametoksazol). Są to domniemane mutanty do przewidywania synergii.

2. Przewidywanie synergizerów w zbiorze danych chemogenetycznych za pomocą O2M

  1. Wracając do zbioru danych17, należy zidentyfikować każde stężenie małej cząsteczki, które wywołuje istotny wynik wzrostu w mutancie do predykcji synergii. Odbywa się to poprzez analizę wartości Z obliczonych dla każdego stężenia małych cząsteczek. Ponownie, istotny wynik wzrostu to taki, który jest mniejszy niż ujemna wartość Z lub większy niż dodatnia wartość Z dla danego stężenia małej cząsteczki.
    UWAGA: Jeśli cząsteczka pojawi się choćby przy jednym ze swoich stężeń, uznaje się ją za przewidywany synergizator. Każda cząsteczka, która nie wywołuje istotnego wyniku wzrostu, jest przewidywanym niesynergizatorem.

3. Walidacja przewidywanych interakcji synergistycznych

  1. Wyznaczanie minimalnego stężenia hamującego (MIC) przewidywanych synergistów.
    1. Hodować kulturę nocną z E. coli w minimalnym medium M9 w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Wszelkie hodowle nocne można prowadzić w odpowiednio zdefiniowanym pożywce dla danego organizmu. Laboratorium Brown nie zaleca stosowania pożywek bogatych, takich jak LB lub YPD. Minimalna pożywka M9 składa się z 10,5 g/L bulionu M9, 0,2% kwasów kasamino oraz 0,1 M CaCl2.2, 0,4% glukozy, 1 M MgSO44, 0,25% kwasu nikotynowego oraz 0,3% tiaminy w H2O.
    2. Jeśli po otrzymaniu małych cząsteczek w literaturze nie zostaną znalezione dane dotyczące MIC dla analizowanego patogenu, należy rozpuścić je w dimetylosulfotlenku (DMSO) w wysokim stężeniu (>10 mg/ml).
    3. Do płytki 96-dołkowej należy dodać 100 µL pożywki M9 do każdej studzienki. Dodać dodatkową 100 µL pożywki M9 w kolumnie 1, aby uzyskać całkowitą objętość wynoszącą 200 µL.
    4. Dodaj dowolną ilość (~10 µL) skoncentrowanego roztworu małej cząsteczki w kolumnie 1. Jedna mała cząsteczka na studzienkę w kolumnie 1 (8 małych cząsteczek na płytkę).
      UWAGA: Są to interesujące małe cząsteczki, których oczekuje się, że będą działać synergistycznie. Laboratorium Brown zazwyczaj dodaje 10 µL wysoko skoncentrowanego roztworu małych cząsteczek, którego ilość jest niższa od ilości 10% DMSO mogącej wywołać inhibicję E. coli.
    5. Po dodaniu małych cząsteczek należy je rozcieńczyć wzdłuż osi x płytki. Pobrać 100 µL roztworu z kolumny 1, przenieś do kolumny 2 i wymieszaj. Pobierz 100 µL z kolumny 2 przenieś do kolumny 3 i wymieszaj. Kontynuuj ten proces, aż 100 µL umieszcza się w kolumnie 1. Wymieszaj zawartość kolumny 1, a następnie pobierz 100 µL z tej kolumny i odrzuć. Pozostaw kolumnę 12 zawierającą wyłącznie medium w celu normalizacji danych.
    6. Zaszczepić płytkę. Wyznaczyć gęstość optyczną (OD600) z kultury nocnej. Przygotować roztwór kultury i medium M9 o gęstości optycznej (OD)600 wynoszącej 0,02 (lub odpowiedniego stężenia odpowiadającego 50 komórkom/µL (dla pożądanego organizmu). Pipetować 2 µL roztworu hodowlanego do każdej studzienki płytki w taki sposób, aby w każdej studzience znalazło się 10 komórek.
    7. Delikatnie wstrząśnij płytką i zmierz wartość OD600 do odczytu w 0 h. Pozostawić płytkę do wzrostu w 37 °C przez 24 h. Odczytać wartość OD600 do odczytu po 24 h.
      UWAGA: W przypadku innych interesujących organizmów należy zastosować odpowiednie warunki hodowli.
    8. Oblicz przyrost netto dla każdej studzienki, korzystając z programu arkusza kalkulacyjnego.
    9. Oblicz średnią wartość przyrostu netto dla kolumny 12, aby uzyskać średni przyrost bez leku. Znormalizuj pozostałe studzienki do średniego przyrostu bez leku, korzystając z oprogramowania arkusza kalkulacyjnego. Zidentyfikuj studzienki z przyrostem poniżej 10%, aby określić MIC90. Każda studzienka z przyrostem poniżej 50% wskazuje MIC50. Oblicz stężenie małej cząsteczki w tych studzienkach.
  2. Testy szachownicowe w celu oceny synergicznych interakcji
    1. Przygotować hodowlę nocną z E. coli w minimalnym medium M9, jak wcześniej.
      UWAGA: W przypadku innych organizmów należy zastosować odpowiednie warunki hodowli.
    2. Dodać 100 µL pożywki M9 do każdej studni płytki 96-dołkowej oraz dodatkowej 100 µL w kolumnie 1.
    3. Do każdej studzienki w kolumnie 1 dodać badaną małą cząsteczkę (w stężeniu ok. 8-krotności MIC), a do studzienki A1 dodać podwójne stężenie (ok. 16-krotności MIC) (jedna badana mała cząsteczka na płytkę).
      UWAGA: Wartość ta jest określana na podstawie wcześniej przeprowadzonego testu MIC i różni się dla każdego potencjalnego synergisty.
    4. Przygotuj rozcieńczenie gradientowe na osi x, pobierając 100 µL z kolumny 1 i przenoszenie do kolumny 2. Kontynuuj ten proces, aż 100 µL dodaje się do kolumny 1. Pomieszać, a następnie pobrać 100 µL z kolumny 1 i zutylizować. Do kolumny 12 nie dodawać żadnego leku (Rysunek 1A).
    5. Ustaw drugi gradient leku wzdłuż osi y dla leku wejściowego. Dodaj 100 µL pożywki zawierającej 2-krotność MIC cząsteczki wejściowej w rzędzie A. Wymieszać i rozcieńczyć w sposób opisany wcześniej, pobierając 100 µL z rzędu A i umieszczając w B. Kontynuować do momentu, aż 100 µL umieszcza się w rzędzie G. Wymieszać, pobrać 100 µL i zutylizować, dbając o to, aby w rzędzie H nie dodawać żadnego leku wejściowego. Dzięki temu w rzędzie H i kolumnie 12 znajdą się indywidualne wartości MIC dla testowanej pary leków (Rycina 1B).
    6. Zaszczep płytkę. Dodaj 2 µL z E. coli hodowla OD600 0,02 do każdej studzienki (10 komórek na studzienkę).
    7. Zmierz OD600 każdej studzienki na płytce do pomiaru w czasie 0 h.
    8. Inkubować płytkę przez 24 h w temperaturze 37 °C.
    9. Zmierz OD600 każdej studzienki po 24 h.
  3. Obliczanie indeksu frakcyjnej stężenia hamującego (FICI) z testów szachownicowych
    1. Oblicz przyrost netto dla każdej studzienki płytki, odejmując wartość OD600 w 0 h od pomiaru OD600 po 24 h w programie arkusza kalkulacyjnego.
    2. Znormalizuj przyrost w oprogramowaniu, dzieląc wartość dla każdej studzienki przez wartość dla studzienki H12, która nie zawiera małej cząsteczki.
    3. Wyznacz MIC90 dla cząsteczki wejściowej w kolumnie 12 oraz MIC90 dla potencjalnego synergisty wierszu H.
    4. Znajdź wszystkie studzienki, w których zahamowanie wzrostu wynosi 90%.
    5. Oblicz wartość FICI90 dla studzienki, która znajduje się albo najniżej poniżej (synergia) lub najwyżej powyżej (antagonizm) obu wartości MIC90, korzystając z równania:
      równanie indeksu FIC, formuła analizy synergii leków, szczegółowy zapis matematyczny dla badania synergii.
    6. Przyjmij każdą wartość FICI ≤ 0,5 jako synergistyczną, a FICI ≥ 4 jako antagonistyczną (Rysunek 2).
      UWAGA: Można to również przeprowadzić z wykorzystaniem MIC50 (50% hamowania wzrostu), aby uzyskać FICI50 na podstawie tych wartości MIC.
  4. Analiza niezależności Blissa
    UWAGA: Analizę niezależności Bliss przeprowadzono dla każdego potencjalnego synergisty, który nie wykazał własnego MIC.
    1. Przygotować kulturę nocną z E. coli w pożywce M9 w temperaturze 37 °Ctak jak wcześniej.
      UWAGA: W tym kroku można ponownie zastosować odpowiednie warunki hodowli dla innych organizmów będących przedmiotem zainteresowania.
    2. Przygotować płytki 96-dołkowe do testowania potencjalnej cząsteczki synergistycznej, cząsteczki wejściowej, kombinacji oraz kontroli nieleczonej.
    3. Przygotować płytkę z potencjalnymi synergistami poprzez dodanie 50 µL pożywki M9 do każdej studni. Dodać 50 µL pożywki zawierającej określone stężenie (10 µM lub 100 µM) potencjalnego synergisty do każdej studzienki w rzędzie. Testuj 8 cząsteczek na płytkę.
    4. Przygotuj płytkę z cząsteczkami wejściowymi poprzez dodanie 50 µL pożywki do każdej studzienki. Dodać 50 µL zawierające 4-krotność MIC badanego leku w każdej studzience w kolumnie 1. Należy przygotować rozcieńczenie gradientowe wzdłuż osi x, analogicznie do płytek MIC, przyjmując 50 µL z kolumny 1, dyspersja i mieszanie w kolumnie 2. Kontynuuj ten proces aż do kolumny 12, utylizacja 50 µL z kolumny 12. Dodać dodatkowy 50 µL podłoża do każdej studzienki, tak aby końcowa całkowita objętość w każdej studni wynosiła 100 µL.
    5. Tworzenie płytki kombinacyjnej przy użyciu płytki 96-dołkowej, dodać 50 µL pożywki do każdej studzienki. Dodać 50 µL zawierający 4-krotność MIC badanego leku w każdej studzience w kolumnie 1. Rozcieńczać wzdłuż osi x analogicznie do płytek MIC, pobierając 50 µL z kolumny 1, dyspersja i mieszanie w kolumnie 2. Kontynuuj w ten sposób aż do kolumny 12, utylizacja 50 µL z kolumny 12. Dodać 50 µL pożywki zawierającej potencjalny synergistę w stężeniu 10 µM lub 100 µM do każdej studzienki w rzędzie. Ponownie, w każdym rzędzie powinno znajdować się jedno stężenie lub jeden lek.
    6. Przygotować kontrolę nietraktowaną poprzez dodanie 100 µL pożywki M9 do wszystkich dołków płytki.
    7. Zaszczep wszystkie płytki, dodając 2 µL hodowli bakteryjnej o gęstości optycznej (OD)600 0,02 lub 10 komórek do każdej studzienki, analogicznie jak poprzednio.
    8. Zmierz OD600 z każdej studzienki w 0. i 24. godzinie.
  5. Obliczanie wskaźnika niezależności Blissa
    1. Oblicz przyrost netto dla każdej studni płytki, odejmując wartość OD600 w czasie 0 h w stosunku do wzrostu po 24 h przy użyciu programu arkusza kalkulacyjnego.
    2. W programie arkuszy kalkulacyjnych znormalizuj wartości w dołkach do średniego wzrostu z płytki bez leku.
    3. Przy użyciu programu do tworzenia arkuszy kalkulacyjnych oblicz inhibicję, odejmując wzrost netto od 1.
    4. W programie arkusza kalkulacyjnego oblicz średnią z kolumn na płytce kontrolnej zawierającej wyłącznie gradient wejściowy.
    5. Obliczyć wynik bliss (bliss score) dla każdej dołki, korzystając z równania:
      Wskaźnik Bliss (Bliss Score) = (dołek X + kolumna wejściowa X) – Połączona studzienka X
    6. Należy wyszukać wyniki negatywne w studzienkach poniżej wartości MIC90 próbki wejściowej.
      UWAGA: Wartości ujemne uzyskane dla wielu stężeń wskazywałyby na oddziaływanie synergistyczne.

4. Przesiew wysokoprzepustowy z użyciem mutantów z przewidywaną synergią w celu identyfikacji nowych par synergistycznych

  1. Identyfikacja mutantów do przewidywania synergii
    UWAGA: W kroku 1.5 zidentyfikowano domniemane mutanty do przewidywania synergii. W niniejszym etapie określamy, które z tych mutantów będą najlepiej funkcjonować w wysokoprzepustowym przesiewie leków synergistycznych. Przeprowadzono ten test w urządzeniu Bioscreen, jednak czytniki płytek 96-dołkowych również powinny być odpowiednie.
    1. Hodować każdą z komórek mutantów z przewidywaną synergią oraz komórki typu dzikiego w minimalnym medium M9.
    2. Przygotować płytkę typu honeycomb z 100 studzienkami (lub płytkę 96-dołkową), wypełniając ją odpowiednio: pożywką wzrostową, pożywką wzrostową z dodatkiem badanego leku, pożywką wzrostową z dodatkiem znanego synergicznego partnera badanego leku oraz pożywką wzrostową z dodatkiem znanego leku niesynergicznego. Należy pamiętać o uwzględnieniu kontroli nośnika.
      UWAGA: Zalecamy wykonanie czterech powtórzeń w dołkach dla każdego szczepu/leku/stężenia.
    3. Zaszczepić 10 komórek na studzienkę, w tym w studzienkach kontrolnych (blank).
    4. Inkubować przez 48 h w temperaturze 37 °Cz wstrząsaniem, a następnie odczytać wartość OD600 co 20 min.
    5. Wyznaczyć stężenie leku oraz punkt czasowy, w którym występuje największa różnica w przyroście między komórkami typu dzikiego a komórkami mutantami z przewidywaną synergią w obecności badanego leku i jego znanych partnerów synergistycznych. W optymalnym punkcie czasowym i przy optymalnym stężeniu nie powinno być znaczącej różnicy w przyroście między komórkami typu dzikiego a komórkami mutantami z przewidywaną synergią podczas hodowli w obecności leków, o których wiadomo, że nie działają synergistycznie z badanym lekiem (Rysunek 3).
  2. Przesiew wysokoprzepustowy w poszukiwaniu leków o działaniu synergistycznym
    1. Hodować komórki typu dzikiego oraz komórki mutantów do predykcji synergii w minimalnym medium M9.
      UWAGA: Należy zastosować odpowiednią pożywkę wzrostową dla badanego organizmu.
    2. Dodaj leki z biblioteki do pożywki, tak aby każda studzienka zawierająca 100 µL pożywkę z małymi cząsteczkami o określonym stężeniu, wyznaczonym w poprzednim kroku. Należy uwzględnić studzienki kontrolne (bez komórek) oraz studzienki z kontrolą nośnika (vehi....g., DMSO), aby uwzględnić ewentualne hamowanie wzrostu przez rozpuszczalnik leku.
      1. Przygotuj co najmniej cztery studzienki kontrolne z nośnikiem na płytkę, najlepiej rozmieszczone w różnych częściach płytki, aby uwzględnić efekt położenia studzienek. W przypadku zmienności wyników analiz należy uwzględnić co najmniej jedną studzienkę kontrolną z nośnikiem w każdym rzędzie/kolumnie i wykorzystać każdą z tych studzienek jako kontrolę do obliczania wyników Z dla każdego rzędu/kolumny zamiast dla całej płytki (krok 4.2.5).
    3. Dodaj 2 µL kultury do każdej studni, tak jak poprzednio. (Jedna płytka dla bakterii typu dzikiego i jedna płytka dla bakterii z mutacją wykazującą przewidywaną synergię).
    4. Oceń OD600 w 0. i 18. godzinie dla E. coli lub przez 48 h dla C. neoformans.
    5. Za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych oblicz przyrost netto, odejmując wartość OD600 od pustych studzienek od studzienek kontrolnych z nośnikiem. Należy zidentyfikować studzienki z wynikiem Z rzędu -2,5 (Z score = średnia - 2,5*odchylenie standardowe). Studzienki te zawierają potencjalną małocząsteczkową substancję synergistyczną.
    6. Zweryfikuj wyniki przesiewowe, stosując metody opisane w kroku 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Testy szachownicowe (checkerboard assays) są półilościową metodą pomiaru interakcji synergistycznych. Końcowy wynik, wskaźnik FICI, określa, czy kombinacja leków jest uznana za synergistyczną (FICI ≤0,5), nieoddziałującą (0,5 Rysunek 1 ilustruje sposób przygotowania gradientów leków w teście szachownicowym. Rysunek 2 przedstawia typowe wyniki. Przyjmijmy, że wzrost (dołki zaznaczon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Synergistyczne pary małych cząsteczek mogą być potężnym narzędziem w leczeniu infekcji mikrobiologicznych, ale nie osiągnęły pełnego potencjału klinicznego, ponieważ pary synergistyczne są trudne do zidentyfikowania. W artykule opisano metodę identyfikacji par synergicznych znacznie szybciej niż proste kombinacje parami. Korzystając ze zbiorów danych z zakresu genetyki chemicznej, O2M identyfikuje mutanty z nokautami genów, które można następnie wykorzystać jako odczyt do badań przesiewowych dużych bibliotek małych cząst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem dla startupów z Wydziału Patologii Uniwersytetu Utah dla J.C.S.B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instrument Bioscreen CKrzywe wzrostu USA
Synergy H1instrumentBioTek
odczynnikdo bulionuAmrescoJ863-500G
OdczynnikCasamino AcidsFisher ScientificBP1424-500
Odczynnik glukozySigmaG7021-10KG
Odczynnikkwasu nikotynowegoOdczynnik tiaminowy AlfaA12683
Acros Organics148991000
CaCl2 Odczynnik DihydrateFisherC79-500
MgSO4 heptahydratFisherM63-500
obejmują Nichols i in., Komórka, 2011, Brown i in., Komórka, 2014 i inne cytowane w tekście.
trimetoprim (przykładowy lek wejściowy; można użyć dowolnego)odczynnikFisher ScientificICN19552701
sulfametoksazol (przykładowy lek testowy; można użyć dowolnego)odczynnikFisher ScientificICN15671125
M9 Przykłady zestawów danych genetyki chemicznej

Bibliografia

  1. Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145(2014).
  2. Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870(2012).
  3. Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703(2014).
  4. Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
  5. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
  6. Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282(2015).
  7. Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796(2010).
  8. Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
  9. Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819(2011).
  10. Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
  11. Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644(2017).
  12. Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
  13. Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
  14. Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
  15. Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181(2015).
  16. Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
  17. Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
  18. Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
  19. Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930(2015).
  20. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
  21. Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562(2012).
  22. Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
  23. Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
  24. Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiewy wysokoprzepustowetest szachownicowywynik FICIoporno na rodki przeciwdrobnoustrojowezbiory danych chemiczno genetycznychkom rki typu dzikiegomutanty do predykcji synergiipomiar g sto ci optycznej
Wysokoprzepustowa identyfikacja synergicznych kombinacji leków metodą Overlap2
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.