Ten protokół opisuje minimalnie inwazyjną technikę osteosyntezy wykorzystującą śródszpikową do standaryzowanej stabilizacji złamań kości udowej, która może być wykorzystana do analizy endochrzęstnego gojenia kości u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Minimalnie inwazyjny model do analizy gojenia złamań śródchrzęstnych u myszy w standaryzowanych warunkach biomechanicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele gojenia kości są niezbędne do analizy złożonych mechanizmów gojenia złamań, aby poprawić kliniczne leczenie złamań. W ciągu ostatniej dekady zaobserwowano zwiększone wykorzystanie modeli mysich w badaniach ortopedycznych, najprawdopodobniej dlatego, że modele mysie oferują dużą liczbę genetycznie zmodyfikowanych szczepów i specjalnych przeciwciał do analizy molekularnych mechanizmów gojenia się złamań. Aby kontrolować warunki biomechaniczne, obowiązkowe są dobrze scharakteryzowane techniki osteosyntezy, również u myszy. W tym miejscu przedstawiamy projekt i zastosowanie zamkniętego modelu gojenia kości do stabilizacji złamań kości udowej u myszy. Śruba śródszpikowa, wykonana ze stali nierdzewnej klasy medycznej, zapewnia stabilność osiową i obrotową dzięki kompresji pękania w porównaniu z najczęściej stosowanymi prostymi sworzniami śródszpikowymi, które wykazują całkowity brak stabilności osiowej i obrotowej. Stabilność osiągnięta przez śródszpikową pozwala na analizę gojenia się chrzęstna. Duża ilość tkanki kalusa, otrzymana po stabilizacji ślimakiem, stwarza idealne warunki do pobrania tkanki do analiz biochemicznych i molekularnych. Kolejną zaletą stosowania jest fakt, że można wprowadzić do kości udowej za pomocą minimalnie inwazyjnej techniki bez wywoływania uszkodzenia tkanek miękkich. Podsumowując, śruba jest unikalnym implantem, który idealnie nadaje się do stosowania w zamkniętych modelach gojenia złamań oferujących ustandaryzowane warunki biomechaniczne.
Wprowadzenie
Badania nad leczeniem kości u myszy cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na szerokie spektrum przeciwciał i genetycznie modyfikowanych zwierząt. Fakty te pozwalają na badanie molekularnych mechanizmów gojenia się kości1. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano różne modele gojenia kości u myszy2. Modele te można podzielić na modele otwarte, w których kość jest osteotomizowana przy użyciu otwartego bocznego dostępu chirurgicznego oraz modele zamknięte, w których kość jest złamana na podstawie modelu złamania wprowadzonego przez Bonnaresa i Einhorna3. Korzystając z tej techniki, standaryzowane złamanie poprzeczne można wytworzyć za pomocą 3-punktowego urządzenia do zginania, a implanty śródszpikowe można wprowadzić przez małe przyśrodkowe nacięcie przyrzepkowe w minimalnie inwazyjnej technice, unikając poważnego urazu tkanek miękkich.
Śruba śródszpikowa może być stosowana do stabilizacji zamkniętego złamania u myszy. Śruba zapewnia stabilność obrotową i osiową. Osiąga się to poprzez kompresję złamania przez proksymalny gwint i dystalną głowę4. Kolejnymi zaletami są prosta technika chirurgiczna, niski stopień inwazyjności, niska waga implantu, a przede wszystkim wyższa stabilność zapewniająca standaryzowane i kontrolowane warunki biomechaniczne w porównaniu z innymi implantami śródszpikowymi5. W rzeczywistości w większości zamkniętych modeli pęknięć fragmenty są stabilizowane tylko za pomocą prostych sworzni, co wiąże się z całkowitym brakiem stabilności obrotowej i osiowej oraz dużym ryzykiem przemieszczenia sworznia, a także pęknięcia. Może to znacząco wpłynąć na proces gojenia, co może skutkować opóźnionym gojeniem lub brakiem zrostu.
Powszechnie wiadomo, że stabilność zespolenia złamania ma ogromny wpływ na proces gojenia6,7. Wysokie sztywne utrwalenie powoduje gojenie śródbłoniaste, podczas gdy mniej sztywne mocowanie, które może umożliwiać mikroruchy w szczelinie złamania, powoduje gojenie śródchrzęstne. Stabilizacja złamania za pomocą śródszpikowej wskazuje przede wszystkim na gojenie śródchrzęstne z dużą ilością tkanki modzelowej, szczególnie po 2 tygodniach gojenia się złamania. Możliwość pobrania dużej ilości tkanki kalusa umożliwia analizę wielu parametrów różnymi technikami.
Tutaj informujemy o budowie i zastosowaniu śródszpikowej u myszy, a także o jej zaletach i wadach w eksperymentalnych badaniach nad prawidłowym gojeniem kości śródchrzęstnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych i były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, Niemcy).
1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i implantów
- Wybierz ostrze skalpela (rozmiar 15), mały wacik, cienkie kleszcze, igłę 27 G, niewchłanialny szew 5-0, nożyczki i uchwyt na igłę z pudełka z narzędziami mikrochirurgicznymi.
- Rozpakuj śródszpikową, drut doprowadzający (średnica 0,3/0,2 mm, długość 10 cm), wiertło centrujące (średnica 0,5 mm) i wiertarkę ręczną (Rysunek 1; patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Śruba śródszpikowa (średnica 0,5 mm, długość 17,2 mm) jest wykonana ze stali nierdzewnej klasy medycznej do implantacji wstecznej do kości udowej. Śruba ma gwint proksymalny (średnica 0,5 mm, długość 4 mm) z końcówką (średnica 0,2 mm, długość 0,4 mm) na końcówce i dystalną główkę w kształcie stożka (średnica 0,8 mm, długość 0,9 mm), aby uzyskać kompresję pęknięcia oraz stabilność osiową i obrotową. - Wystawić implanty i wszystkie narzędzia chirurgiczne na działanie roztworu dezynfekującego (96% alkoholu) przez 5 minut lub wysterylizować (sterylizacja parowa, 130 °C, 25 min). Po dezynfekcji lub sterylizacji umieść narzędzia na ściereczce operacyjnej. Umieść tkaninę operacyjną bezpośrednio obok stołu operacyjnego dla małych zwierząt.
2. Zwierzęta, znieczulenie i analgezja
- Wybierz szczep, wiek i płeć myszy zgodnie z pytaniem badawczym, które jest adresowane.
UWAGA: W tym badaniu wykorzystano 12- do 14-tygodniowych samców myszy CD-1. Masa ciała odpowiednia do użycia śródszpikowej wynosi od 25 do 35 g. - Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym 15 mg/kg ksylazyny i 75 mg/kg ketaminy. Potwierdź znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi. Nałóż smar do oczu, aby chronić oczy zwierząt przed wysuszeniem podczas znieczulenia. Po indukcji znieczulenia umieść mysz pod grzejnikiem, aby utrzymać stałą temperaturę ciała. Podczas zabiegu zwierzęta były monitorowane z wielokrotnym szczypaniem palców u stóp, aby zapewnić odpowiednią płaszczyznę znieczulenia.
- Chlorowodorek tramadolu należy stosować w wodzie do picia (1,0 mg/ml) w celu znieczulenia od 1. dnia przed zabiegiem do 3. dnia po zabiegu.
UWAGA: Analgezja i zapobieganie zakażeniom powinny być zgodne z odpowiednimi wytycznymi kraju i instytucji, w której mają być przeprowadzane eksperymenty.
3. Zabieg chirurgiczny i implantacja śródszpikowej
- Przed zabiegiem należy ogolić całą prawą tylną nogę i nałożyć krem do depilacji. Po 5 minutach usuń krem i umyj nogę wodą. Następnie należy zastosować roztwór dezynfekujący z 96% alkoholem. Do alkoholu można dodać betadynę lub chlorheksydynę, aby zapewnić całkowitą aseptykę.
- W warunkach aseptycznych umieść mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym dla małych zwierząt. Zegnij prawe kolano, aby umożliwić dostęp do przodu do kłykci kolana. Wykonaj 5-milimetrowe przyśrodkowe nacięcie przyrzepkowe w prawym kolanie za pomocą ostrza skalpela.
- Ostrożnie zmobilizuj więzadło rzepki za pomocą ostrza skalpela i wacika. Następnie przesuń rzepkę na boki za pomocą cienkich kleszczyków, aby odsłonić wcięcie międzykłykciowe kości udowej.
- Otwórz wcięcie międzykłykciowe dokładnie pośrodku kości udowej między obydwoma kłykciami. Upewnij się, że głębokość wierconego otworu nie przekracza 1.0 mm.
- Rozpocznij wiercenie ręczne z małą prędkością i przesunięciem brzusznym o 45 ° do osi kości udowej za pomocą wiertła centrującego 0,5 mm i wiertarki ręcznej (Rysunek 1C i D, Rysunek 2). Podczas wiercenia należy stale zmniejszać kąt do przesunięcia 0 ° (równolegle do osi kości udowej). Przerwij wiercenie po osiągnięciu głębokości 1,0 mm.
- Po otwarciu kości w miejscu wcięcia międzykłykciowego wprowadzić igłę 27 G do jamy śródszpikowej na całej długości kości udowej. Rozwiercić jamę śródszpikową kości udowej ręcznie za pomocą ruchów obrotowych igły 27 G. Popchnij igłę do przodu, aby przebić kość korową na krętarzu większym proksymalnie.
- Wyjąć igłę 27 G i przeciągnąć prowadnik przez dystalną część kości udowej.
- Wykonaj nacięcie skóry ostrzem skalpela (rozmiar 15) proksymalnie nad drutem doprowadzającym i popchnij drut doprowadzający do przodu, aż oba końce drutu doprowadzającego znajdą się na zewnątrz. Upewnij się, że przewód doprowadzający jest na miejscu.
- Utwórz zdefiniowane zamknięte pęknięcie za pomocą gilotyny.
- Umieść mysz w pozycji bocznej z prawą nogą pod gilotyną. Upewnij się, że część kłosowa kości udowej znajduje się na środku gilotyny.
- Upuść ciężar (200 g) z określonej odległości 25,5 cm.
- Kontroluj konfigurację pęknięć i położenie pęknięcia, a także położenie drutu prowadzącego (Rysunek 3) za pomocą urządzenia rentgenowskiego (patrz Tabela materiałów).
- Połącz śródszpikową z noskiem na dystalnym końcu do drutu prowadzącego 0,2 mm i włóż ją do kości udowej pod ciągłym naciskiem i obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
- Ścinanie wału napędowego po osiągnięciu wystarczającego momentu obrotowego.
- Usuń przewód doprowadzający proksymalnie.
- Zmień położenie rzepki i przymocuj ścięgno rzepki do mięśni za pomocą jednego szwu za pomocą syntetycznego, monofilamentowego, niewchłanialnego szwu polipropylenowego 5-0. Użyj pojedynczych szwów z tego samego materiału i rozmiaru, aby zamknąć ranę. Kontrolować rozdrobnienie odłamków i położenie radiologicznie za pomocą urządzenia rentgenowskiego (patrz Tabela materiałów).
- Trzymaj zwierzęta pod grzejnikiem, aż dojdą do siebie po znieczuleniu. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą brzusznie. Umieść zwierzęta z powrotem w pojedynczych klatkach w obiekcie dla zwierząt. Nie należy zwracać zwierząt do towarzystwa innych zwierząt w ciągu pierwszych 24 godzin, nawet jeśli w pełni wyzdrowiały po znieczuleniu.
- Uważnie monitoruj zwierzęta każdego dnia. Utrzymuj analgezję pooperacyjną za pomocą chlorowodorku tramadolu w wodzie do picia w dawce 1,0 mg/ml przez pierwsze trzy dni. Kontynuuj analgezję, jeśli w 4 dniu po operacji zwierzęta nadal wykazują oznaki bólu, na co wskazuje wokalizacja, niepokój, brak mobilności, brak pielęgnacji, nieprawidłowa postawa i brak normalnego zainteresowania otoczeniem. Zakończ analgezję, gdy zwierzęta są wolne od bólu.
- Pod koniec eksperymentu poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie barbituranu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Czas operacji od nacięcia skóry do zamknięcia rany wynosił 20 min. Zabieg można przeprowadzić bez użycia stereomikroskopu. Po operacji zwierzęta były monitorowane codziennie. Analgezję pooperacyjną przerwano po 2 dniach, ponieważ po tym okresie u żadnego ze zwierząt nie stwierdzono oznak bólu. W ciągu 2 dni po operacji u zwierząt zaobserwowano również prawidłowe obciążanie kończyn. W całym okresie obserwacji nie odnotowano infekcji ran.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Krytycznymi etapami zabiegu chirurgicznego jest znalezienie prawidłowego punktu wejścia do implantacji śrubowej w środku kłykci kości udowej w wcięciu międzykłykciowym, a także optymalna orientacja igły równolegle do osi kości w celu rozwiercenia jamy śródszpikowej. Aby uniknąć nieprawidłowej pozycji wejściowej, chirurg powinien przygotować wcięcie do momentu uzyskania optymalnego widoku. Aby kontrolować orientację podczas rozwiercania, kość udową myszy należy trzymać palcami w stabilnej pozycji. Kolejnym krytycznym krok...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez RISystem AG, Davos, Szwajcaria.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Śruba myszy | RISystem AG | 221,100 | |
| Drut doprowadzający | RISystem AG | 521,100 | |
| Wiertło centrujące | RISystem AG | 590,205 | |
| Wiertarka ręczna | RISystem AG | 390,130 | |
| Wacik bawełniany (150 mm, mała główka) | Fink Walter GmbH | 8822428 | |
| Szew (5-0 Prolen) | Ethicon | 8614H | |
| Kleszcze | Braun Aesculap AG & Nożyczki CoKG | BD520R | |
| Braun | Aesculap AG & CoKG | BC100R | |
| Uchwyt na igłę | Braun Aesculap AG & CoKG | BM024R | |
| 27 G igła | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| Ostrze skalpela rozmiar 15 | Braun Aesculap AG & CoKG | 16600525 | |
| Grzejnik | Sanitas | 605.25 | |
| Krem do depilacji | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| Smar do oczu | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| Ketamine | Serumwerke Bernburg | 7005294 | |
| Tramadol | Gr& UML; nenthal GmbH | 2256241 | |
| Roztwór do dezynfekcji (SoftaseptN) | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| myszy CD-1 | River | 22 | |
| Urządzenie rentgenowskie | Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation | 2321A0988 | |
| Urządzenie do pękania małe | RISystem AG | 891,100 |
Bibliografia
- Jacenko, O., Olsen, B. R. Transgenic mouse models in studies of skeletal disorders. J Rheumatol Suppl. 43, 39-41 (1995).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. J Orthop Res. 2 (1), 97-101 (1984).
- Holstein, J. H., et al. Development of a stable closed femoral fracture model in mice. J Surg Res. 153 (1), 71-75 (2009).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. J Orthop Res. 27 (9), 1152-1156 (2009).
- Claes, L., Augat, P., Suger, G., Wilke, H. J. Influence of size and stability of the osteotomy gap on the success of fracture healing. J Orthop Res. 15 (4), 577-584 (1997).
- Histing, T., et al. Characterization of the healing process in non-stabilized and stabilized femur fractures in mice. Arch Orthop Trauma Surg. 136 (2), 203-211 (2016).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Cheung, K. M., Kaluarachi, K., Andrew, G., Lu, W., Chan, D., Cheah, K. S. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. J Biomech. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. J Orthop Res. 28 (3), 397-402 (2010).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail-a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J Surg Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Histing, T., Klein, M., Stieger, A., Stenger, D., Steck, R., Matthys, R., Holstein, J. H., Garcia, P., Pohlemann, T., Menger, M. D. A new model to analyze metaphyseal bone healing in mice. J Surg Res. 178 (2), 715-721 (2012).
- Histing, T., Menger, M. D., Pohlemann, T., Matthys, R., Fritz, T., Garcia, P., Klein, M. An Intramedullary Locking Nail for Standardized Fixation of Femur Osteotomies to Analyze Normal and Defective Bone Healing in Mice. J Vis Exp. (117), (2016).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11 (2), 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18 (10), 687-695 (2004).
- Holstein, J. H., Menger, M. D., Culemann, U., Meier, C., Pohlemann, T. Development of a locking femur nail for mice. J Biomech. 40 (1), 215-219 (2007).
- Claes, L. E., et al. Effects of mechanical factors on the fracture healing process. Clin Orthop Relat Res. 355 Suppl, S132-S147 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
