Method Article

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

DOI:

10.3791/57258

⸱

January 25th, 2018

 , 
1Department of Biology, California State University, Northridge

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Soja (Glycine max (L.) Merr.) jest ważnym gatunkiem uprawnym i stała się modelem roślin strączkowych do badań nad szlakami genetycznymi i biochemicznymi. Dlatego ważne jest, aby ustanowić wydajny system przejściowej ekspresji genów w soi. W tym miejscu przedstawiamy prosty protokół przygotowania protoplastów sojowych i jego zastosowanie do przejściowych analiz funkcjonalnych. Odkryliśmy, że młode jednolistne liście z siewek soi dały duże ilości wysokiej jakości protoplastów. Optymalizując metodę transformacji za pośrednictwem PEG i wapnia, osiągnęliśmy wysoką wydajność transformacji przy użyciu jednolistnych protoplastów soi. System ten stanowi wydajny i wszechstronny model do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach soi i może pomóc w lepszym zrozumieniu różnorodnych procesów komórkowych, rozwojowych i fizjologicznych roślin strączkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protoplasty to komórki roślinne, z których usunięto ściany komórkowe. Ze względu na to, że zachowują większość cech i aktywności komórek roślinnych, protoplasty są dobrym systemem modelowym do obserwacji i oceny różnorodnych zdarzeń komórkowych oraz są cennymi narzędziami do badania hybrydyzacji somatycznej1 i regeneracji roślin2. Protoplasty są również szeroko wykorzystywane do transformacji roślin3,4,5, ponieważ w przeciwnym razie ściany komórkowe blokowałyby przenikanie DNA do komórki. Protoplasty posiadają niektóre reakcje fizjologiczne i procesy komórkowe nienaruszonych roślin, oferując tym samym fundamentalną wartość w badaniach podstawowych w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych6,7,8, interakcje białko-białko9,10, oraz aktywność promotora11,12, 13 w aktywnych komórkach.

Izolacja protoplastów roślinnych została po raz pierwszy opisana w 1960 roku14, a protokoły zarówno izolacji, jak i transformacji protoplastów zostały opracowane i zoptymalizowane. Standardowa procedura izolacji protoplastów polega na ścinaniu liści i enzymatycznym trawieniu ścian komórkowych, a następnie oddzieleniu uwolnionych protoplastów od niestrawionych szczątków tkankowych. Strategie transformacji obejmują metody elektroporation15,16, metody mikroiniekcji17,18 oraz metody oparte na glikolu polietylenowym (PEG)4,5,19. Stwierdzono, że wiele gatunków z powodzeniem izoluje protoplasty, w tym Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 i inne rodziny roślin ozdobnych23,24. Podczas gdy różne typy tkanek są używane u różnych gatunków, system przejściowej ekspresji w protoplastach mezofilu Arabidopsis (TEAMP) wyizolowanych z liści modelowej rośliny Arabidopsis thaliana został dobrze ugruntowany25 i szeroko przyjęty do różnych zastosowań.

Soja (Glycine max (L.) Merr.) jest jedną z najważniejszych roślin białkowych i oleistych26. W przeciwieństwie do rzodkiewnika i ryżu, uzyskanie transgenicznych roślin soi jest znane z tego, że jest dość trudne i mało wydajne. Naciek, w którym pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, jest powszechnie stosowany do badań nad przejściową ekspresją genów w komórkach naskórka u tytoniu27 i siewkach Arabidopsis28,29, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes jest używany do przekształcania owłosionych korzeni w soi30. Metody wyciszania genów wywołane przez wirusa zostały wykorzystane do regulacji w dół docelowych genów31,32 i ekspresja przejściowa33 w sposób systemowy. Protoplasty stanowią cenną i wszechstronną alternatywę dla tych podejść. Protoplasty można uzyskać z materiałów nadziemnych soi i umożliwiają szybką i zsynchronizowaną ekspresję transgenu. Jednak od czasu początkowej udanej izolacji protoplastów soi w 198334, pojawiły się ograniczone doniesienia na temat zastosowania protoplastów w soibean35,36,37,38, głównie ze względu na stosunkowo niską wydajność protoplastów soi.

Tutaj opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji protoplastów soi oraz jego zastosowanie do badań nad przejściową ekspresją genów. Wykorzystując młode jednolistne liście z sadzonek soi, byliśmy w stanie uzyskać duże ilości ważnych protoplastów w ciągu kilku godzin. Ponadto zoptymalizowaliśmy metodę transformacji za pośrednictwem PEG i wapnia, która jest prosta i tania, aby dostarczyć DNA do protoplastów soi z wysoką wydajnością.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost roślin

  1. Wysiewaj 5 - 10 nasion soi (Williams 82) w doniczce o średnicy 13 cm w szklarni w warunkach długiego dnia (16 godzin światła przy 1 500 μmol m-2 s-1) w temperaturze 25 °C na niestandardowej mieszance gleby dla soi (stosunek 1:1:1 gleby, perlitu i piasku torpedowego).

2. Przygotowanie plazmidowego DNA

  1. Za pomocą sterylnej końcówki pipety lub wykałaczki wybierz pojedynczą kolonię lub mrożony bulion glicerolowy E. coli przenoszący plazmid zawierający interesujący nas gen i zaszczep go w 20 ml płynnej pożywki Luria-Bertani (LB) odpowiednimi antybiotykami w kolbie o pojemności 50 ml.
  2. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez noc na wytrząsarce. Zebrać bakterie, odwirowując zawiesinę o sile 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i odrzucając supernatant. Ekstrahuj i oczyść plazmid zgodnie z procedurą producenta zestawu do przygotowania plazmidu.

3. Izolacja protoplastów

  1. Wytnij nowo ekspandowane liście jednolistne z 10-dniowych siewek soi (Rysunek 1).
    UWAGA: Selekcja liści w odpowiednim etapie rozwojowym jest kluczem do sukcesu preparatu protoplastów soi. Używaj tylko rozszerzonych liści we wczesnych stadiach rozwoju. W miarę dojrzewania liści ściany komórkowe stają się trudniejsze do strawienia.
  2. Za pomocą świeżej żyletki usuń nerw środkowy z jednolistnego liścia, a następnie pokrój resztki w paski o grubości 0,5-1 mm.
    UWAGA: Dwa jednolistkowe liście strawione w 10 ml roztworu enzymatycznego dadzą wystarczającą ilość protoplastów na więcej niż 10 przemian.
  3. Za pomocą kleszczyków natychmiast i delikatnie przenieść paski liści do 10 ml świeżo przygotowanego roztworu enzymatycznego (Tabela 1) w probówce o pojemności 15 ml. Infiltrować próżniowo paski liści przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować paski liści w roztworze enzymu, delikatnie mieszając (40 obr./min) w słabym świetle przez 4-6 godzin w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że roztwór enzymatyczny zmieni kolor na żółto-zielony, gdy protoplasty zostaną uwolnione. Sprawdzić roztwór enzymu/protoplastów pod mikroskopem (X10).
    UWAGA: Uwolnione protoplasty mają kulisty kształt, podczas gdy niestrawione komórki mają nieregularny lub owalny kształt.
  5. Przenieść 10 ml roztworu enzymu/protoplastu do probówki o pojemności 50 ml, delikatnie wlewając i dodając 10 ml roztworu W5 (Tabela 1) w temperaturze pokojowej, aby zatrzymać trawienie. Delikatnie odwróć rurkę kilka razy. Delikatnie wlej roztwór enzymu/protoplastów na czystą nylonową siatkę o grubości 75 μm umieszczoną na probówce o pojemności 50 ml, aby usunąć niestrawione tkanki liści.
  6. Odwirować przepływowy roztwór enzymu/protoplastów o sile 100 x g w probówce o pojemności 50 ml przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Delikatnie usunąć sklarowany osad za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, nie naruszając osadu protoplastu.
  7. Zawiesić protoplasty i rozcieńczyć do stężenia 2 x 105 mL-1 w schłodzonym roztworze W5 w temperaturze 4 °C, licząc liczbę protoplastów na hemytometrze pod mikroskopem (x10). Trzymaj protoplasty na lodzie przez 30 minut.
  8. Odwirować zawiesinę o sile 100 x g przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej i delikatnie usunąć roztwór W5 za pomocą pipety o pojemności 1 ml, nie naruszając osadu protoplastu. Zawiesić protoplasty w roztworze MMG (Tabela 1) w stężeniu 2 x 105 mL-1 w temperaturze pokojowej.

4. Transformacja protoplastów

  1. Przygotować 100 μl porcji protoplastów (2 x 104 protoplasty w 2 x 105 ml-1) w probówkach wirówek mikrowirówek o niskiej przyczepności o pojemności 1,5 ml za pomocą nieoszlifowanych końcówek do pipet o pojemności 200 μl. Odłożyć jedną porcję na bok, aby służyła jako kontrola ujemna. Dodać 10 μl plazmidu (10-20 μg) do każdej z pozostałych podwielokrotności protoplastów.
  2. Powoli dodać 110 μl świeżo przygotowanego roztworu PEG (Tabela 1) na wewnętrzną ściankę probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie delikatnie odwrócić i obrócić probówkę, aż roztwór stanie się jednorodny.
  3. Mieszaninę transformacyjną inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  4. Aby zatrzymać przemianę, powoli dodaj 400 μl roztworu W5 do probówki o pojemności 1,5 ml w temperaturze pokojowej i delikatnie odwróć probówkę, aż roztwór stanie się jednorodny. Odwirować probówkę o masie 100 g przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.
  5. Dodać 1 ml roztworu WI (Tabela 1) do probówki i ponownie zawiesić, delikatnie pipetując 1-2 razy. Dodaj 1 ml sterylnej surowicy cielęcej o stężeniu 5% (obj./obj.) do każdej studzienki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, aby pokryć powierzchnię i zapobiec przywieraniu protoplastów do płytki.
  6. Po kilku sekundach wyrzuć surowicę cielęcą za pomocą pipety. Przenieś zawieszone protoplasty do studzienki płytki hodowlanej. Przykryj talerz pokrywką.

5. Inkubacja i zbiór protoplastów

  1. Inkubuj protoplasty w temperaturze pokojowej przez 1-2 dni w ciemności.
    UWAGA: Odkryliśmy, że dwudniowa inkubacja daje ogólnie silniejszy sygnał białka fluorescencyjnego w porównaniu z inkubacją jednodniową, a sygnał białka fluorescencyjnego może trwać do 3-4 dni.
  2. Przenieść roztwór protoplastu do probówki mikrowirówkowej o niskiej przyczepności o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówkę o stężeniu 100 x g przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać protoplasty. Usunąć supernatant za pomocą pipety i przenieść 10 μl protoplastów na szkiełko podstawowe.
  3. Obserwuj sygnał fluorescencyjny pod mikroskopią fluorescencyjną lub konfokalną. Używaj nieprzekształconych protoplastów jako kontroli negatywnej (nie należy obserwować żadnego sygnału).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne organy 10-dniowych ziaren soi zostały przetestowane pod kątem przygotowania protoplastów (Rysunek 1) i zaobserwowano plony pod mikroskopem (Rysunek 2). Ściany komórkowe z hipokotylu i epikotylu były prawie nie trawione, a niektóre komórki pozostawały połączone ze sobą (Ryc. 2B, 2C). W liścieniu (Rysunek 2D) i korzeniu (Rycina 2A) ściany komórkowe zostały usunięte tylk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół izolacji protoplastów soi i zastosowania do badań nad ekspresją przejściową został dokładnie przetestowany i bardzo dobrze sprawdza się w naszym laboratorium. Procedury są proste i łatwe, wymagają zwykłego sprzętu i minimalnych kosztów. Nasz protokół daje duże ilości jednorodnych, wysokiej jakości protoplastów w porównaniu z wcześniej opisanymi metodami 34,35,36,37,38.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program Badań nad Genomem Roślinnym od Narodowej Fundacji Nauki (NSF-PGRP-IOS-1339388).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
Celulaza CELFWorthington Biological CorporationLS002611
Pektoliaza Y-23BioWorld9033-35-6
CELULAZA "ONOZUKA" R-10yakult10g
MACEROZYME R-10yakult10g
MannitolICN Biomedicals152540
CaCl2FisherC79-500g
BSANEBR3535S
DTTSigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100g
PEG4000Fluka81240
siatka nylonowacarolina652222N
Płytki do hodowli tkankowychUSA ScientificCC7682-7506
Żyletki12-640
hememytometrHausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
Zestaw miniprzygotowawczy plazmidu EZNAOmegaD6942-01
Zestaw do miniprzygotowania plazmidu GeneJETWirówka Thermo ScientificK0502
58105811000827eppendorf
5424eppendorf22620401
Kontroler rur Jencons Powerpette PlusJencons14526-202
Mikroskop konfokalny Zeiss 710ZeissN/A
Nieprzywierające, wolne od RNaz probówki do mikrofugowania, 1,5 mlAmbionAM12450
15 ml ProbówkiDenvilleC1018-P
50 mlDenvilleC1060-P
Surowica dla noworodkówThermo Scientific16010159
GlebaSzkółka
perlitVigoro100521091
Piasek torpedowyJKS Ventures
LB Rosół, Lennox (proszek)FisherBP1427-500
Fisher Wirówka do wirówkowe Ingrama

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
  2. Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
  3. Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
  4. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  5. Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
  6. Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
  7. Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
  8. Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
  9. Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
  10. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16(2009).
  11. Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
  12. Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
  13. Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
  14. Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  15. Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
  16. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
  17. Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
  18. Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
  19. Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
  20. Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
  21. Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
  22. Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
  23. Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
  24. Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14(2012).
  25. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565(2007).
  26. Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
  27. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
  28. Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
  29. Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19(2014).
  30. Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
  31. Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
  32. Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
  33. Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
  34. Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
  35. Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
  36. Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129(2011).
  37. Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
  38. Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).
  39. Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
  40. Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Soybean ProtoplastsProtoplast IsolationPEG TransformationTransient Gene ExpressionEnzyme DigestionW5 SolutionConfocal MicroscopyHemocytometer CountingUnifoliate LeavesSoybean Seedlings

Related Articles