Method Article

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

DOI:

10.3791/57258

⸱

January 25th, 2018

 , 
1Department of Biology, California State University, Northridge

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Soja (Glycine max (L.) Merr.) jest ważnym gatunkiem uprawnym i stała się modelem roślin strączkowych do badań nad szlakami genetycznymi i biochemicznymi. Dlatego ważne jest, aby ustanowić wydajny system przejściowej ekspresji genów w soi. W tym miejscu przedstawiamy prosty protokół przygotowania protoplastów sojowych i jego zastosowanie do przejściowych analiz funkcjonalnych. Odkryliśmy, że młode jednolistne liście z siewek soi dały duże ilości wysokiej jakości protoplastów. Optymalizując metodę transformacji za pośrednictwem PEG i wapnia, osiągnęliśmy wysoką wydajność transformacji przy użyciu jednolistnych protoplastów soi. System ten stanowi wydajny i wszechstronny model do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach soi i może pomóc w lepszym zrozumieniu różnorodnych procesów komórkowych, rozwojowych i fizjologicznych roślin strączkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protoplasty to komórki roślinne, z których usunięto ściany komórkowe. Ze względu na to, że zachowują większość cech i aktywności komórek roślinnych, protoplasty są dobrym systemem modelowym do obserwacji i oceny różnorodnych zdarzeń komórkowych oraz są cennymi narzędziami do badania hybrydyzacji somatycznej1 i regeneracji roślin2. Protoplasty są również szeroko wykorzystywane do transformacji roślin3,4,5, ponieważ w przeciwnym razie ściany komórkowe blokowałyby przenikanie DNA do komórki. Protoplasty posiadają niektóre reakcje f....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost roślin

  1. Wysiewaj 5 - 10 nasion soi (Williams 82) w doniczce o średnicy 13 cm w szklarni w warunkach długiego dnia (16 godzin światła przy 1 500 μmol m-2 s-1) w temperaturze 25 °C na niestandardowej mieszance gleby dla soi (stosunek 1:1:1 gleby, perlitu i piasku torpedowego).

2. Przygotowanie plazmidowego DNA

  1. Za pomocą sterylnej końcówki pipety lub wykałaczki wybierz pojedynczą kolonię lub mrożony bulion glicerolowy E. coli przenoszący plazmid zawierający interesujący nas gen i zaszczep go w 20 ml płynnej pożywki Luria-Bertani (LB) odpowiednimi antybiotykami w kolbie o po....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne organy 10-dniowych ziaren soi zostały przetestowane pod kątem przygotowania protoplastów (Rysunek 1) i zaobserwowano plony pod mikroskopem (Rysunek 2). Ściany komórkowe z hipokotylu i epikotylu były prawie nie trawione, a niektóre komórki pozostawały połączone ze sobą (Ryc. 2B, 2C). W liścieniu (Rysunek 2D) i korzeniu (Rycina 2A) ściany komórkowe zostały usunięte tylk.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół izolacji protoplastów soi i zastosowania do badań nad ekspresją przejściową został dokładnie przetestowany i bardzo dobrze sprawdza się w naszym laboratorium. Procedury są proste i łatwe, wymagają zwykłego sprzętu i minimalnych kosztów. Nasz protokół daje duże ilości jednorodnych, wysokiej jakości protoplastów w porównaniu z wcześniej opisanymi metodami 34,35,36,37,38.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program Badań nad Genomem Roślinnym od Narodowej Fundacji Nauki (NSF-PGRP-IOS-1339388).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
Celulaza CELFWorthington Biological CorporationLS002611
Pektoliaza Y-23BioWorld9033-35-6
CELULAZA "ONOZUKA" R-10yakult10g
MACEROZYME R-10yakult10g
MannitolICN Biomedicals152540
CaCl2FisherC79-500g
BSANEBR3535S
DTTSigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100g
PEG4000Fluka81240
siatka nylonowacarolina652222N
Płytki do hodowli tkankowychUSA ScientificCC7682-7506
Żyletki12-640
hememytometrHausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
Zestaw miniprzygotowawczy plazmidu EZNAOmegaD6942-01
Zestaw do miniprzygotowania plazmidu GeneJETWirówka Thermo ScientificK0502
58105811000827eppendorf
5424eppendorf22620401
Kontroler rur Jencons Powerpette PlusJencons14526-202
Mikroskop konfokalny Zeiss 710ZeissN/A
Nieprzywierające, wolne od RNaz probówki do mikrofugowania, 1,5 mlAmbionAM12450
15 ml ProbówkiDenvilleC1018-P
50 mlDenvilleC1060-P
Surowica dla noworodkówThermo Scientific16010159
GlebaSzkółka
perlitVigoro100521091
Piasek torpedowyJKS Ventures
LB Rosół, Lennox (proszek)FisherBP1427-500
Fisher Wirówka do wirówkowe Ingrama

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
  2. Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
  3. Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Soybean ProtoplastsProtoplast IsolationPEG TransformationTransient Gene ExpressionEnzyme DigestionW5 SolutionConfocal MicroscopyHemocytometer CountingUnifoliate LeavesSoybean Seedlings

Related Articles