Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.
Artykuł metodologiczny
Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisana jest użyteczna technika hodowli komórek w samoorganizującym się trójwymiarowym (3D) rusztowaniu z nanowłókien. Ten system hodowli odtwarza środowisko, które ściśle naśladuje cechy strukturalne niespolaryzowanej tkanki. Co więcej, szczególna struktura nanowłókien rusztowania sprawia, że jest ono przezroczyste dla światła widzialnego, co pozwala na łatwą wizualizację próbki pod mikroskopem. Ta przewaga została w dużej mierze wykorzystana do badania migracji, organizacji, proliferacji i różnicowania komórek, a tym samym dowolnego rozwoju ich szczególnej funkcji komórkowej poprzez barwienie określonymi barwnikami lub sondami. Ponadto w tej pracy opisujemy dobrą wydajność tego systemu do łatwego badania redyferencjacji rozszerzonych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę chrzęstną. Komórki zamknięto w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych i hodowano w określonych warunkach w celu pobudzenia chondrogenezy. Trójwymiarowe kultury wykazały dobrą żywotność w ciągu 4 tygodni eksperymentu. Zgodnie z oczekiwaniami, próbki hodowane z induktorami chondrogennymi (w porównaniu z nieindukowanymi kontrolami) były silnie dodatnie na obecność błękitu toluidynowego (który barwi glikozaminoglikany (GAG), które są wysoce obecne w macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki) i wykazywały ekspresję specyficznych markerów molekularnych, w tym kolagenu typu I, II i X, zgodnie z analizą Western Blot. Protokół ten jest łatwy do wykonania i może być stosowany w laboratoriach badawczych, przemyśle oraz do celów edukacyjnych na kursach laboratoryjnych.
Wprowadzenie
Przez wiele dziesięcioleci hodowla komórek ssaków była przeprowadzana w warunkach eksperymentalnych przy użyciu klasycznych dwuwymiarowych (2D) systemów hodowli ze względów praktycznych i ekonomicznych, niezależnie od aspektów niefizjologicznych. Chociaż ten system hodowli pomaga badać i rozumieć większość mechanizmów molekularnych i komórkowych, dziś wiemy, że do badania bardziej złożonych systemów komórkowych potrzebne są nowe paradygmaty hodowli komórkowych. Dlatego trójwymiarowe (3D) systemy hodowli są potrzebne do odtworzenia mikrośrodowiska, które jest biofizycznie, biomechanicznie i biologicznie bardziej podobne do naturalnego środowiska. W ostatnich latach systemy hodowli 3D, ogólnie rzecz biorąc, stały się bardziej rozpowszechnione wśród naukowców i przemysłu, ponieważ reprezentują nowy model badań lub badań przesiewowych, w którym komórki mogą rosnąć w przestrzeni, tworzyć interakcje między komórkami lub komórkami-matrycą, migrować i ostatecznie różnicować się w określone linie komórkowe.
Ogólnym celem tej metodologii jest odtworzenie mikrośrodowiska komórkowego in vitro, które jest bliższe mikrośrodowisku in vivo. W szczególności syntetyczne samoorganizujące się rusztowanie peptydowe (SAPS) jest rodzajem biomateriału o unikalnych właściwościach; Tworzy sieć porów o rozmiarach nanometrowych powstałych w wyniku słabych oddziaływań między peptydami o właściwościach mechanicznych i strukturalnych podobnych do naturalnych macierzy zewnątrzkomórkowych. Innymi słowy, racjonalność stojąca za użyciem tego materiału polega na tym, że tworzy on prawdziwie trójwymiarowe środowisko, które jest idealne do uzyskiwania pseudo-trójwymiarowych tkanek lub jednostek narządowych. Jednak, co najważniejsze, kontekst 3D pozwala strukturze 3D uzyskać nowe funkcje biologiczne, które normalnie nie są obecne na platformach hodowlanych 2D, takie jak właściwości związane z architekturą tkanki, zjawiska przenoszenia masy, wzorce komórkowe i ostatecznie morfogeneza tkanek, które są kluczowymi czynnikami w przyszłych badaniach i rozwoju funkcjonalnych tkanek i narządów1,2. Co więcej, przewagą SAPS nad ich naturalnymi odpowiednikami (Collagen, Matrigel) jest to, że są bardzo stabilne w temperaturze pokojowej i nie wymagają specjalnych warunków do postprodukcji, dystrybucji czy przechowywania3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. SAPS jest łatwy w obsłudze, gdy jest to pożądane; Żele 3D można w prosty sposób uzyskać, zwiększając siłę jonową lub dostosowując pH do neutralności1,2. Wreszcie, opisana tutaj metodologia była szeroko stosowana in vitro w celu promowania utrzymania, wzrostu i różnicowania wielu typów komórek, w tym chondrocytów, hepatocytów, komórek śródbłonka, osteoblastów, komórek neuronalnych, a także embrionalnych i somatycznych komórek macierzystych3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie systemu hodowli 3D do różnicowania ludzkich rozszerzonych chondrocytów stawowych (hACh) w tkankę podobną do chrząstki, jak opisano wcześniej11.
Tutaj opisana jest metoda hodowli komórek w systemie 3D za pomocą SAPS. W tym syntetycznym biomateriale komórki są najpierw mieszane z roztworem peptydu, który jest następnie indukowany do samoorganizacji, tworząc sieć o wymiarach nanometrycznych wokół komórek, a tym samym tworząc prawdziwie trójwymiarowe środowisko (ryc. 1). Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że na zachowanie komórek mają wpływ wartości sztywności matrycy (tj. proliferacja, migracja i różnicowanie). Dlatego powszechną kontrolą metodologiczną jest hodowla komórek na rusztowaniu peptydowym o tych samych wartościach sztywności (hodowla w dwóch wymiarach).
Protokół
1. Przygotowanie rusztowania peptydowego (SAPS)
do samodzielnego montażu- Przygotować 0,5% roztwór peptydu RAD16-I w 20% (w/v) sacharozy, w probówce do mikrowirówki. Sonikować roztwór peptydu przez 20 minut w łaźni ultradźwiękowej przy maksymalnej mocy i w temperaturze pokojowej (RT), aby zapewnić jednorodne mieszanie.
UWAGA: Objętość roztworu, który ma być przygotowany, będzie zależeć od pożądanej liczby enkapsulacji. Peptydy RAD16-I nie ulegają degradacji w tych warunkach sonikacji. - Rozcieńczyć roztwór peptydu przygotowany w kroku 1.1 z niezbędną objętością 10% (w/v) sacharozy, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe.
UWAGA: Ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest dostosowanie początkowego stężenia peptydów, ponieważ ostateczna sztywność matrycy będzie zależeć od tego parametru. Roztwór peptydu RAD16-I powinien być 2x bardziej skoncentrowany niż pożądane stężenie końcowe konstruktu 3D. Zwykle końcowe stężenia peptydu RAD16-I mieszczą się w przedziale 0,15–0,5% (w/v). - Umieścić probówkę mikrowirówki zawierającą roztwór peptydu w łaźni ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej na 20 minut, aby zapewnić jednorodne mieszanie.
UWAGA: Roztwór peptydu, jeśli nie zostanie natychmiast zużyty, może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C.
2. Przygotowanie zawiesiny komórkowej
- Odwirować zawiesinę komórkową (otrzymaną po leczeniu trypsyną) przy 60 x g i RT przez 5 minut.
- Usunąć supernatant za pomocą pipety Pasteura podłączonej do przewodu próżniowego i zawiesić osad komórkowy w 3–5 ml 10% (w/v) sacharozy za pomocą mikropipety. Kontynuuj zliczanie komórek za pomocą ręcznego lub automatycznego licznika komórek.
UWAGA: 10% (w/v) roztwór sacharozy jest izotonicznym i niejonowym podłożem, które pozwala na utrzymanie komórek i unika żelowania peptydów podczas procesu mieszania. - Odwirować zawiesinę komórkową przy 60 x g i RT przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w niezbędnej objętości 10% (w/v) sacharozy, aby uzyskać podwojenie pożądanego końcowego stężenia komórek (zalecane około 4 x 106 komórek/ml).
- Umieścić żądaną liczbę wkładek do hodowli tkankowej w każdym dołku płytki 6-dołkowej (jedna wkładka na kapsułkę).
- Sonikować roztwór peptydowy przygotowany w kroku 1 przy maksymalnej mocy i RT przez 5 minut.
- Odpipetować i umieścić 40 μl zawiesiny komórek (otrzymanej w 2.3) dla każdej żądanej kapsułki plus około 10-15% dodatkowej objętości w standardowej probówce do mikrowirówki.
3. 3D Hermetyzacja komórek w SAPS
- Zmieszać równą objętość roztworu RAD16-I w 10% sacharozie (w/v) (40 μl na kapsułkę) z równą objętością zawiesiny komórkowej (40 μl na kapsułkę) przygotowaną w kroku 2, aby uzyskać zawiesinę komórek w pożądanym stężeniu peptydu (w 10% sacharozy). Mieszać, pipetując powoli w górę i w dół około 10 razy. Unikaj tworzenia się pęcherzyków podczas mieszania.
UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie i musi być wykonany bardzo ostrożnie, ponieważ komórki znajdują się w nieprzyjaznych warunkach ze względu na peptyd o niskim pH (około 3,5–4,0). - Za pomocą mikropipety ostrożnie załadować 80 μl zawiesiny do każdej wkładki.
- Dodaj 0,5 ml pożywki hodowlanej na dno studzienki, aby zwilżyć membranę wkładu, umożliwiając dyfuzję pożywki w celu pobudzenia samoorganizacji peptydów i tworzenia hydrożelu. Pozostaw żel peptydowy na około 20 minut w komorze przepływowej.
UWAGA: Manipulowanie próbkami w czasie wiązania może zakończyć się pęknięciem żelu. - Bardzo powoli dodaj 40 μl pożywki do wkładu i pozwól mu zsunąć się po wewnętrznej ściance do żelu.
UWAGA: Zwykle załadunek tej objętości powinien zająć od 20 do 30 s. - Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 , wilgotna atmosfera) na 20 minut. Ten krok i kolejne dodatki pożywki będą sprzyjać wymywaniu sacharozy i równoważeniu komórek z pożywką hodowlaną.
- Dodać 60 μl pożywki do wewnętrznej ścianki wkładu, pozwalając mu spłynąć po ściance. Odessać pożywkę studzienki, która jest bogata w sacharozę, i dodać 0,5 ml świeżego podłoża.
- Powoli dodać 60 μl pożywki do wkładu i umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, wilgotna atmosfera) na 10 minut.
- Zassać pożywkę z dołka i dodać do niego 2,5 ml świeżego podłoża. Do wkładu dodać 200 μl pożywki. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 , wilgotna atmosfera), aby utrzymać komórki w odpowiednich warunkach.
- Zmieniaj podłoże codziennie. Usuń stare podłoże z dna studzienki. Dodać 2,5 ml świeżej pożywki do dołka i 200 μl do wkładki.
UWAGA: Jeśli różnicowanie komórek będzie kontynuowane, specyficzne pożywki indukujące zostaną dodane do kultur, co spowoduje pożądane zaangażowanie typu komórki (patrz poniżej, Różnicowanie komórek).
4. Żywotność komórek w 3D-SAPS
- UWAGA: Test żywotności komórek jest również znany jako test żywe/martwe — żywotność/cytotoksyczność.
- W probówce o pojemności 15 ml przygotuj niezbędną objętość świeżego roztworu 2 μM kalceiny AM i 2 μM homodimeru etydyny-1 (EthD-1) w PBS, wirując przez 10 s. Przechowywać w ciemności.
UWAGA: Objętość, która ma być użyta dla każdej próbki, będzie zależeć od wielkości studzienki zgodnie z następującymi zasadami: 2 ml na każdą studzienkę 6-dołkowej płytki; 1 ml na każdą studzienkę na płytce 12-dołkowej i 0,5 ml na każdą studzienkę na płytce 24-dołkowej. - Za pomocą mikropipety przepłukać próbki 3D-SAPS 3 razy 2 ml PBS, a następnie przykryć je roztworem przygotowanym w kroku 4.1. Inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 40 minut w ciemności.
- Za pomocą mikropipety przepłukać konstrukty 2 ml PBS 5 razy.
- Wizualizacja próbek pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu 10-krotnego lub 20-krotnego powiększenia.
5. Różnicowanie komórek
- Hodowla komórek (37 °C, 5% CO2, wilgotna atmosfera) w pożywce podstawowej Chondrocytów (CBM) z suplementami wzrostu.
UWAGA: Przygotowanie pożywki jest opisane w instrukcji producenta (patrz tabela materiałów). - Indukuj różnicowanie komórek w dniu 2 za pomocą pożywki chondrogennej zawierającej rekombinowany ludzki transformujący czynnik wzrostu-b1 [TGFb1] (10 ng / ml), 2-fosforan kwasu L-askorbinowego [AA2P] (25 μg / ml) i deksametazon (100 nM).
- Utrzymuj kulturę przez 4 tygodnie w inkubatorze z wilgotną atmosferą o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę chondrogenną co drugi dzień.
6. Barwienie błękitem toluidynowym (TB)
- Umyj kultury 3D-SAPS dwukrotnie, dodając, a następnie usuwając 2 ml PBS za pomocą mikropipety. Napraw je, dodając 2 ml 2% (w/v) p-formaldehydu w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Umyć dwukrotnie 2 ml 0,1% Triton X-100 w PBS (PBST).
- Inkubować z 2 ml 0,05% TB w wodzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Przemyć kilka razy (co najmniej 3 razy) 2 ml PBS, aż usunięty roztwór PBS będzie klarowny.
- Analizuj próbki za pomocą oględzin pod mikroskopem stereoskopowym11,13,14.
UWAGA: Gruźlica tworzy kompleksy z anionowymi glikokoniugatami w macierzy zewnątrzkomórkowej, takimi jak proteoglikany (PG) i glikozaminoglikany (GAG), które są wydzielane głównie przez komórki podobne do chondrocytów. Próbki dodatnie są zabarwione na niebiesko.
7. Western Blot
UWAGA: Procedura używana w tym protokole została wcześniej opisana w reference11.
- Lizuje konstrukty 3D w buforze RIPA zawierającym koktajl inhibitorów proteazy przez pipetowanie.
- Przygotuj żel akrylowy zgodnie z wymaganiami dotyczącymi objętości żelu (konkretnego sprzętu do biegania z żelem) i uruchom lizaty komórkowe przez 90 minut przy 150 V16.
UWAGA: Żel akrylamidowy jest zwykle przygotowywany w stężeniu 7,5–10% (w/v), w zależności od masy cząsteczkowej białka. - Przenieść białka zawarte w żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF), stosując 40 V przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Inkubować membranę PVDF w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w buforze blokującym (4% (m/v) beztłuszczowego mleka w proszku w PBST) w oddzielnym pojemniku o objętości wystarczającej do przykrycia membrany.
- Inkubować błonę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z pierwszorzędowymi przeciwciałami o końcowym stężeniu 1 mg/ml w PBST. Zobacz tabelę materiałów.
- Dodać przeciwciała drugorzędowe w stężeniu 1 mg/ml. Zobacz tabelę materiałów.
- Przygotuj membranę do wykrywania hP za pomocą substratu chemiluminescencyjnego16. Zobacz tabelę materiałów.
- Weźmy obrazy chemiluminescencyjne16.
Wyniki
W niniejszej pracy opisano prosty i szybszy protokół hodowli komórek w 3D z wykorzystaniem SAPS w celu uzyskania wiarygodnych danych jakościowych i ilościowych. SAPS tworzy trójwymiarowe mikrośrodowisko o wyjątkowych właściwościach, które pozwalają hodowanym komórkom w pożądanych warunkach na utrzymanie żywotności, proliferację i/lub różnicowanie3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. W naszej grupie przeprowadzono kilka badań z wykorzystaniem ludzkich komórek progenitorowych pochodzących z tkanki tłuszczowej (hAPC), namnożonych ludzkich chondrocytów stawowych (hACh) oraz ludzkich normalnych fibroblastów skóry (hNDF) w celu ich hodowli, namnażania i różnicowania w tkankę przypominającą chrząstkę10,11,12. Tutaj opisujemy hodowlę 3D i ponowne różnicowanie namnożonych hACh w tkankę przypominającą chrząstkę, zgodnie z wcześniejszym opisem11. W związku z tym enkapsulujemy komórki w 3D-SAPS i hodujemy je w medium indukującym chondrogenezę, jak przedstawiono na Rysunku 1 (oraz w Protokole). Po 24 h oceniono żywotność próbek za pomocą testu żywotności/cytotoksyczności Live/Dead. Wyniki wskazują, że po 5 dniach enkapsulacji martwe były tylko kilka procent komórek (kolor czerwony), a po 4 tygodniach hodowli prawie nie zaobserwowano martwych komórek (Rysunek 2). Następnie przeprowadzono barwienie w celu wykazania odkładania glikozaminoglikanów (GAG) w macierzy zewnątrzkomórkowej przy użyciu metody barwienia błękitem toluidyny. Zgodnie z oczekiwaniami, grupa indukcyjna zareagowała prawidłowo na zastosowane leczenie, wykazując silne barwienie (Rysunek 2).
Na koniec, za pomocą metody western blot przeanalizowano molekularne markery chondrogenezy oraz markery hipertrofii, w tym kolageny typu I, II i X (Rysunek 3). Kolagen typu I (COL1) zaobserwowano w systemach 2D i 3D, jednak niższy prążek o masie ~130 kDa (reprezentujący przetworzone, dojrzałe białko COL1 przeznaczone do wbudowania w macierz zewnątrzkomórkową) wystąpił wyłącznie w 3D. Wynik ten wyraźnie wskazuje, że komórki ulegające różnicowaniu w trzech wymiarach przebiegają w sposób bardziej fizjologiczny. Co istotne, kolagen typu II (COL2) – w formie pojedynczego prążka o oczekiwanej masie cząsteczkowej obecnego w macierzy zewnątrzkomórkowej – wykryto tylko w konstruktach 3D hodowanych w warunkach chondrogennych. Ostatecznie, kolagen typu X (COL10) wykryto w konstruktach 2D i 3D hodowanych w warunkach chondrogennych, co wskazuje na pewien stopień hipertrofii po 4 tygodniach hodowli.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie enkapsulacji komórek w 3D-SAPS. Przedstawiono schemat enkapsulacji hACh w celu uzyskania komórek rozproszonych losowo w obrębie 3D-SAPS. 1. Przygotowanie samoorganizującego się rusztowania peptydowego (SAPS); 2. Przygotowanie zawiesiny komórek; oraz 3. Enkapsulacja komórek w 3D w SAPS. Należy zauważyć, że schemat przedstawia jedynie kroki od 3.1 do 3.4.
Rycina 2: Wydajność komórek i różnicowanie chondrogenne w hodowlach 3D-SAPS. Barwienie żywotności komórek wykonane w 5. dniu i 4. tygodniu hodowli, obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym (komórki żywe na zielono, komórki martwe na czerwono). Paski skali = 200 µm. Ogólna ocena zaangażowania w chondrogenezę za pomocą barwienia błękitem toluidyny (siarczanowe glikozaminoglikany na niebiesko) konstruktów 3D-SAPS hodowanych w mediach kontrolnych i chondrogennych. Paski skali = 500 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy L. Recha-Sancho et al.11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Ekspresja kolagenu I, II i X w hACh poddawanych chondrogenezie. Oceniono ekspresję kolagenu typu I (COL1), kolagenu typu II (COL2) oraz kolagenu typu X (COL10) w hACh hodowanych w monowarstwie 2D oraz w 3D-SAPS po 4 tygodniach w pożywce chondrogennej wraz z kontrolami. Ekspresję aktyny wykorzystano jako kontrolę wewnętrzną. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy L. Recha-Sancho et al.11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Wcześniej nasza grupa i inni opisywali zastosowanie trójwymiarowych (3D) platform hodowlanych z różnymi systemami komórkowymi 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . W niniejszej pracy opisujemy łatwą i niezawodną metodę uzyskiwania systemów hodowli 3D, które mają zastosowanie do każdego rodzaju komórek ssaków, w tym dowolnego rodzaju komórek funkcjonalnych, embrionalnych lub dorosłych komórek macierzystych, lub ostatecznie dysfunkcyjnych komórek wyizolowanych z biopsji lub guzów i tak dalej. Ponadto, niezależnie, jeśli komórki macierzyste są pochodzenia embrionalnego lub dorosłego, miałyby lepszą zdolność do angażowania linii w środowisku 3D niż w klasycznych szalkach hodowlanych 2D 10,11,12,13,14,15. W związku z tym hodowla komórkowa w tym systemie doprowadziłaby do różnicowania się w funkcjonalne struktury przypominające tkanki, które mogłyby być wykorzystywane w różnych zastosowaniach, od biomedycyny naprawczej lub regeneracyjnej po platformy toksykologiczne i farmakologiczne.
Wykazaliśmy wyraźny wzrost funkcji komórki, ponieważ mikrośrodowisko komórkowe jest podobne do naturalnego środowiska tkanek pod względem struktury macierzy oraz parametrów biomechanicznych, biofizycznych i biologicznych. Niemniej jednak, w miarę jak system staje się coraz bardziej złożony, rośnie również liczba parametrów, które należy regulować, co obejmuje potrzebę zewnętrznej platformy nośnej (takiej jak aktywny system perfuzyjny, aby uniknąć problemów związanych ze zjawiskiem transferu masy). Komórki hodowane w trzech wymiarach osiągają lepsze wyniki pod względem regulacji podstawowych czynności, takich jak migracja, proliferacja i różnicowanie. Mogą one tworzyć złożone sieci pozwalające na wzmocnienie przesłuchów komórkowych, co jest zdecydowanie istotną konsekwencją wzrostu i różnicowania w 3D. Fakt, że SAPS może stworzyć warunki in vitro podobne do tych białek macierzy zewnątrzkomórkowej, stanowi zaletę, ponieważ można łatwo przeprowadzić racjonalne badanie efektu wywieranego na każdy składnik dodany do rusztowania (czynnik wzrostu, polisacharyd lub peptyd sygnałowy).
Wyraźne zalety stosowania SAPS w porównaniu z innymi naturalnymi rusztowaniami, takimi jak kolagen typu I i Matrigel, są następujące: 1) SAPS jest syntetycznym biomateriałem o minimalnej zmienności z produkcji seryjnej na partię; 2) SAPS ma zdolność do funkcjonalizacji za pomocą określonych motywów peptydowych; oraz 3) SAPS charakteryzuje się niską biodegradowalnością in vitro, co pozwala na utrzymanie konstruktu 3D o tych samych właściwościach biofizycznych, biomechanicznych i strukturalnych w czasie. Jednak ograniczenie stosowania SAPS w porównaniu z innymi rusztowaniami występuje na etapie enkapsulacji, gdzie komórki znajdują się we wrogim środowisku ze względu na niskie pH. Dlatego jest to krytyczny krok w opisywanej metodologii. Ponadto ważne jest, aby ustawić stężenie SAPS dla każdego konkretnego typu komórki przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu. Jest to w rzeczywistości niezbędne, gdy komórki są hodowane na tych biomateriałach lub w tych biomateriałach, ponieważ każdy konkretny typ komórek będzie przedstawiał optymalne warunki wzrostu biomechanicznego.
Wreszcie, uważamy, że zaprojektowanie i wyprodukowanie tego typu rusztowania z biomateriału przyczyni się do rozwoju bardziej fizjologicznych i wiarygodnych modeli tkanek 3D, aby pomóc przemysłowi farmaceutycznemu w opracowaniu lepszych podejść terapeutycznych dla medycyny regeneracyjnej, raka lub jakiegokolwiek innego leczenia.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania przeprowadzone przez autorów były częściowo wspierane przez granty z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007- 2013) na podstawie Umowy o grant nr 229239, oraz od Fundacji AO, Exploratory Research Collaborative Research Program Acute Cartilage Injury/lesion/Defect (CRP ACI) w ramach projektu Bioactive and Biomimetic Scaffolds for Cartilage Regeneration (BIOCART).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ludzkie chondrocyty stawowe (Ach) | Lonza | CC-2550 | |
| Roztwór peptydowy RAD16-I (PuraMatrix) | Corning | 354250 | |
| Sacharoza (klasa hodowli tkankowej) | Sigma | S0389 | |
| Wkładki do hodowli komórkowych (0,4 i mikro; m porów, średnica 12 mm) | Milipory | PICM01250 | |
| Chondrocyty Podłoże podstawowe (CBM) | Lonza | CC-3217 | |
| SingleQuots suplementów wzrostu | Lonza | CC-4409 | |
| Żywy/martwy zestaw żywotności/cytotoksyczności | Invitrogen | L3224 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Lonza | DE14-801F | |
| Deksametazon | Sigma | D8893 | |
| 2-fosforan kwasu L-askorbinowego (AA2P) | Sigma | A8960 | |
| Ludzki transformujący czynnik wzrostu-β 1 (TGF-β 1) | Bufor Millipore | GF111 | |
| RIPA | Sigma | R0278 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy | Roche | 11836153001 | |
| Membrana z polifluorku winylidenu (PVDF) | Invitrogen | LC 2005 | |
| SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjne | Thermo Scientific | 34080 | |
| Anty-aktyna | SCBT | sc-1615 | |
| Anty-kolagen I | Abcam | ab138492 | |
| Anty-kolagen II | Abcam | ab3092 | |
| Anty-kolagen X | Abcam | ab182563 | |
| Antykoza IgG-HRP | Abcam | ab97100 | |
| Anty-mysia IgG-HRP | Abcam | ab97023 | |
| Anty-królik IgG-HRP | Abcam | ab97051 |
Bibliografia
- Aggeli, A., et al. Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric β-sheet tapes. Nature. 386, 259-262 (1997).
- Semino, C. E. Can we build artificial stem cell compartments? Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).
- Kisiday, J., et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).
- Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration. Circulation. 110, 962-968 (2004).
- Genové, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function. Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).
- Garreta, E., Genové, E., Borrós, S., Semino, C. E. Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold. Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).
- Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).
- Semino, C. E. Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration. Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).
- Hernández Vera, R., et al. Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis. Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).
- Castells-Sala, C., Martínez-Ramos, C., Vallés-Lluch, A., Monleón Pradas, M., Semino, C. In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).
- Recha-Sancho, L., Semino, C. E. Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).
- Bussmann, B. M., et al. Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).
- Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abellà, J., Guilak, F., Semino, C. E. Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (ε-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold. Materials. 9 (6), 472(2016).
- Recha-Sancho, L., Semino, C. E. Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering. PlosOne. 11 (6), e0157603(2016).
- Aloy-Reverté, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion. Tissue Engineering Part A. , (2017).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Protein blotting and detection. Methods in Molecular Biology. 536, (2009).
Przedruki i uprawnienia
