Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania zdolności wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w ekstremalnie małych przestrzeniach

Summary

Opisujemy metodę badania zdolności komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, w tym łagiewek pyłkowych, włośników i protonematy mchu, do wydłużania się przez ekstremalnie wąskie szczeliny (~1 μm) w urządzeniu mikroprzepływowym.

Abstract

In vivo, komórki roślinne rosnące na wierzchołkach muszą pokonać szereg barier fizycznych; jednak badaczom brakuje metodologii do wizualizacji zachowania komórek w tak restrykcyjnych warunkach. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy komory wzrostowe do wzrostu komórek roślinnych rosnących w końcówkach, które zawierają szereg wąskich, mikroprefabrykowanych szczelin (~1 μm) w podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS). Ten przezroczysty materiał pozwala użytkownikowi monitorować procesy wydłużania końcówek w poszczególnych komórkach podczas penetracji mikroszczelin za pomocą obrazowania poklatkowego. Korzystając z tej platformy eksperymentalnej, zaobserwowaliśmy zmiany morfologiczne w łagiewkach pyłkowych podczas penetracji mikroszczeliny. Podczas tego procesu uchwyciliśmy dynamiczne zmiany kształtu znakowanego fluorescencyjnie jądra wegetatywnego i plemników w łagiewce pyłkowej. Ponadto wykazaliśmy zdolność włośników i protonematów mchu do przenikania przez szczelinę 1 μm. Ta platforma in vitro może być wykorzystana do badania, w jaki sposób poszczególne komórki reagują na fizycznie ograniczone przestrzenie i może dostarczyć informacji na temat mechanizmów wzrostu końcówek.

Introduction

Po wykiełkowaniu ziaren pyłku na znamieniu, każde ziarno wytwarza pojedynczą łagiewkę pyłkową, która przenosi plemniki do komórki jajowej i centralnej komórki w zalążku w celu podwójnego zapłodnienia. Łagiewki pyłkowe wydłużają się przez styl i ostatecznie docierają do zalążka, wyczuwając wiele wskazówek prowadzących na swojej drodze¹. Podczas wydłużania łagiewki pyłkowe napotykają szereg barier fizycznych; tor transmisyjny jest wypełniony komórkami, a łagiewki pyłkowe muszą wejść w maleńki otwór mikropylarny zalążka, aby dotrzeć do celu ( Rysunek 1A)². Dlatego łagiewki pyłkowe muszą mieć zdolność przenikania przez przeszkody fizyczne, jednocześnie tolerując naprężenia ściskające z otoczenia. Włośniki to kolejny rodzaj komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, które muszą wytrzymać fizyczne przeszkody w środowisku, w postaci upakowanych cząstek gleby (Rysunek 1B).

Zbadano różne właściwości mechaniczne łagiewki pyłkowej, w tym ciśnienie turgoru i sztywność obszaru wierzchołkowego komórki, które można zmierzyć za pomocą metody początkowej plazmolizy^3,4 i mikroskopia sił komórkowych (CFM)^5,6odpowiednio. Jednak same te metody nie ujawniają, czy łagiewka pyłkowa jest zdolna do wydłużania się przez bariery fizyczne wzdłuż swoich ścieżek wzrostu. Alternatywną techniką, która pozwala na monitorowanie wydłużenia łagiewki pyłkowej in vivo, jest mikroskopia dwufotonowa⁷. Jednak przy tej metodzie trudno jest zaobserwować zmiany morfologiczne w poszczególnych łagiewkach pyłkowych w głębi tkanki zalążka. Dodatkowo wzrost włośników w glebie można uwidocznić za pomocą rentgenowskiej tomografii komputerowej (CT) i rezonansu magnetycznego (MRI)⁸, aczkolwiek z niską rozdzielczością. W tym miejscu przedstawiamy metodę, którą można wykorzystać do uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości procesu deformacji komórki pod konwencjonalnym mikroskopem.

Ogólnym celem opisanej tutaj metody jest wizualizacja zdolności do wydłużania komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, w tym łagiewek pyłkowych, włośników i protonematy mchu, na bardzo małych przestrzeniach. Ponieważ mikrourządzenia z polidimetylosiloksanu (PDMS) przedstawione w tym manuskrypcie są optycznie przezroczyste i przepuszczają powietrze, możemy hodować żywe komórki wewnątrz urządzenia i obserwować ich zachowanie wzrostu pod mikroskopem. Możliwe jest również tworzenie przestrzeni w skali mikro ~ nanometrowej techniką miękkiej litografii⁹ z użyciem form. Cechy te pozwalają nam badać zdolność do wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w fizycznie ograniczonym środowisku.

W tej pracy zbudowaliśmy szczeliny o szerokości 1 μm (4 μm wysokości) w urządzeniach mikroprzepływowych i zbadaliśmy zdolność łagiewek pyłkowych do przenikania przez te sztuczne przeszkody, które są znacznie mniejsze niż średnica cylindrycznej łagiewki pyłkowej (około 8 μm). Ta eksperymentalna platforma pozwala nam zwizualizować reakcję łagiewki pyłkowej na mikroszczeliny i uchwycić poklatkowe obrazy odpowiedzi, które śledzą proces deformacji komórki. Opracowaliśmy również mikrourządzenia, które można wykorzystać do zbadania zdolności penetracji włośników i protonematy mchu. Do tej pory zgłoszono kilka mikrourządzeń, które umożliwiają wizualizację wzrostu korzeni roślin^10,11,12,13 i mchu protonemata¹⁴ wzrostu w wysokiej rozdzielczości. W naszym urządzeniu szereg kanałów wzrostu włośników jest prostopadle połączonych z komorą wzrostu korzenia, a pojedyncze włośniki (o średnicy około 7 μm) są kierowane do kanałów płynowych ze szczeliną o szerokości 1 μm. Przeprowadziliśmy również hodowlę protonematów mchu (o średnicy około 20 μm) w mikrourządzeniu zawierającym mikroszczeliny, aby zbadać ich reakcje na te bariery fizyczne. Proponowane podejście oparte na mikroprzepływach pozwala nam zbadać zdolność różnych komórek roślinnych rosnących w wierzchołkach do wydłużania się w ekstremalnie małych przestrzeniach, czego nie można zbadać żadną inną obecnie dostępną metodą.

Protocol

1. Wykonanie mikrourządzenia PDMS do badania rosnących łagiewek pyłkowych i protonematów mchu

UWAGA: Użyliśmy bezmaskowego instrumentu fotolitograficznego do przygotowania form PDMS na płytkach krzemowych. Szczegóły dotyczące działania systemu zostały pominięte w niniejszym manuskrypcie. Standardowa technika fotolitografii⁹ przy użyciu fotomaski może być również użyta do stworzenia form PDMS opisanych w tym manuskrypcie.

1. Wlej 11 g mieszaniny prepolimerowej PDMS (baza elastomerowa: utwardzacz w stosunku 10:1) do każdej 4-calowej formy.
2. Formę przygotowaną w kroku 1.1 odgazować przez 20 minut w komorze próżniowej.
3. Po utwardzeniu w temperaturze 65 °C przez 90 minut w piecu bez konwekcji, oderwij warstwę PDMS od formy i przebij otwory dostępowe w kanałach płynnych za pomocą stempli do biopsji.
   UWAGA: W przypadku łagiewki pyłkowej rozmiar otworu należy dostosować tak, aby odzwierciedlał średnicę słupka. Wartość ta będzie się zatem różnić w zależności od gatunku. W tym eksperymencie wykraliśmy otwór o średnicy 1 mm na wloty słupków i otwory o średnicy 1,5 mm na zbiorniki ciekłego medium. W przypadku urządzenia protonemata z mchu użyto otworu o średnicy 4 mm na zbiornik próbki.
4. Wystaw warstwę PDMS i szklane naczynie dolne (o średnicy 3,5 - 5 cm) na działanie plazmy powietrznej przez 50 s.
5. Wciśnij warstwę PDMS do naczynia ze szklanym dnem i podgrzewaj w temperaturze 65 °C przez 30 minut w piecu niekonwekcyjnym, aby całkowicie uszczelnić sieć mikroprzepływową.

2. Produkcja mikrourządzenia PDMS do włośników

1. Powtórz kroki 1.1 - 1.3, używając foremek, aby przygotować dwie warstwy PDMS dla mikrourządzeń z korzeniami i włosami.
   UWAGA: Zastosowaliśmy otwór o średnicy 2 mm na zbiorniki płynnego podłoża w mikrourządzeniu korzeniowym.
2. Wystaw obie warstwy PDMS na działanie plazmy powietrznej przez 50 s.
3. Zmontuj dwie warstwy PDMS pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą specjalnie zaprojektowanego alignera biurkowego.
   UWAGA: Mikrokanały na tych warstwach PDMS muszą być zwrócone do siebie. Przed montażem upewnij się, że znaczniki wyrównania na obu warstwach są zgodne.
4. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 30 minut w piecu bez konwekcji, aby całkowicie uszczelnić sieć mikroprzepływową.
5. Usuń szkiełko nakrywkowe ze zbudowanego mikrourządzenia i umieść urządzenie na szklanym naczyniu o średnicy 5 cm.

3. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych in vitro dla łagiewek pyłkowych (Torenia fournieri)

1. Przygotować zmodyfikowaną pożywkę Nitscha zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁵ i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.
   UWAGA: Skład zmodyfikowanej pożywki Nitscha jest następujący: NH₄NO₃ (80 mg/L), KNO₃ (125 mg/L), Ca(NO₃)₂‧4H₂O (500 mg/L), MgSO₄‧7H₂O (125 mg/L), KH₂PO₄ (125 mg/L), MnSO₄‧4H₂O (3 mg/L), ZnSO₄‧7H₂O (0,5 mg/L), H₃BO₃ (10 mg/L), CuSO₄‧5H₂O (0,025 mg/L), Na₂MoO₄‧2H₂O (0,025 mg/L), sacharoza (50 000 mg/L) i kazeina (500 mg/L). Tak przygotowane podłoże można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 miesiące.
2. Przygotować 26% (w/v) glikolu polietylenowego przy użyciu autoklawowanej wody dejonizowanej i przefiltrować roztwór za pomocą filtra porowego 0,3 μm.
   UWAGA: Przygotowaną pożywkę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
3. Wymieszać odczynniki przygotowane w krokach 3.1 i 3.2 w stosunku 1:1 (v/v).
   UWAGA: To podłoże powinno być przygotowywane świeże do każdego użycia.

4. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych in vitro dla włośników (Arabidopsis thaliana)

1. Przygotować roztwór 0,215% (w/v) Murashige & Skoog Medium, 0,05% (w/v) MES, 1% (w/v) sacharozy i 1% (w/v) agaru w wodzie dejonizowanej. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.

5. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych in vitro dla mchu Protonemata (Physcomitrella patens)

1. Wstępnie inkubuj protonemata mchu w BCDAT medium¹⁶ na szalce Petriego.
   UWAGA: Skład pożywki BCDAT to 1 mM MgSO₄, 10 mM KNO₃, 45 μM FeSO₄, 1,8 mM KH₂PO₄ (pH dostosowane do 6,5 z KOH), roztwór pierwiastka śladowego (0,22 μM CuSO₄, 0,19 μM ZnSO₄, 10 μM H₃BO₃, 0,1 μM Na₂MoO₄, 2 μM MnCl₂, 0,23 μM CoCl₂ i 0,17 μM KI), 1 mM CaCl₂ i 5 mM winianu diamonu(+).
2. Hodowla mchu w pożywce BCDATG w mikrourządzeniu.
   UWAGA: Pożywka BCDATG to pożywka BCDAT o zawartości 0,5% (w/v) glukozy. Tak przygotowane podłoże można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.

6. Hodowla in vitro łagiewek pyłkowych T. fournieri w mikrourządzeniu

1. Umieść mikrourządzenie w komorze pyłkowej i odgazowuj przez 20 minut.
2. Wyjąć mikrourządzenie z komory próżniowej i wprowadzić pożywkę wzrostową do wlotu słupka za pomocą mikropipety z bardzo cienką końcówką. Napełnij pozostałe studzienki po ich wierzchołki tym samym podłożem. Poczekaj kilka minut, aż wszystkie mikrokanaliki zostaną wypełnione medium przez próżnię wytworzoną wewnątrz mikrokanalików.
3. Umieść mokry ręcznik papierowy w naczyniu ze szklanym dnem, aby utrzymać wilgotność w naczyniu.
4. Przenieść ziarna pyłku z dzikiego kwiatu T. fournieri "niebiesko-białego" na jego znamię za pomocą igły do preparacji.
   UWAGA: Przeprowadziliśmy również ten eksperyment z transgenicznym kwiatem T. fournieri 'Crown violet' (RPS5Ap::H2B-tdTomato line¹⁷), z łagiewkami pyłkowymi zawierającymi fluorescencyjnie znakowane plemniki i jądra wegetatywne.
5. Wytnij zapylony styl (1 cm długości) za pomocą ostrza.
6. Wstaw styl cięcia do wlotu urządzenia, jak pokazano na rysunku Rysunek 2.
7. Nałóż pokrywkę na naczynie i uszczelnij ją taśmą.
8. Umieścić urządzenie w inkubatorze w temperaturze 28 °C na 5 - 6 godzin w ciemności.

7. Hodowla in vitro włośników A. thaliana w mikrourządzeniu

UWAGA: Kroki 7.1 - 7.9 (z wyjątkiem 7.3 i 7.5) powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.

1. Nasiona A. thaliana Columbia (Col-0) i linii transgenicznej UBQ10pro::H2B-mClover (zawierającej fluorescencyjny marker jądrowy) sterylizować przez 5 min w sterylnym płynie (5% (v/v) wybielacza domowego i 0,02% (v/v) Triton X-100).
2. Dokładnie opłucz wysterylizowane nasiona wodą w autoklawie.
3. Opłukane nasiona należy przechowywać w wodzie przez 2 dni w temperaturze 4 °C w ciemności.
4. Wysterylizuj mikrourządzenie w świetle UV przez noc.
5. Umieść mikrourządzenie w komorze próżniowej i odgazowuj przez 20 minut.
6. Wprowadzić pożywkę wzrostową do studzienek w urządzeniu za pomocą mikropipety. Odczekaj kilka minut, aż próżnia wypełni wszystkie mikrokanaliki medium.
7. Umieść autoklawowany mokry ręcznik papierowy w naczyniu ze szklanym dnem, aby utrzymać wilgotność w naczyniu.
8. Przenieś wysterylizowane nasiona do wlotu urządzenia.
9. Nałóż pokrywkę na naczynie i uszczelnij ją taśmą.
10. Umieścić urządzenie pionowo w inkubatorze w temperaturze 22 °C w ciągłym białym świetle.
11. Sprawdź wzrost włosów u nasady po 4 - 10 dniach inkubacji. Uzyskaj zarówno obrazy jasnego pola, jak i obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu odwróconego.

8. Hodowla in vitro Protonemata P. patens (mech) w urządzeniu mikroprzepływowym

UWAGA: Kroki 8.2 - 8.6 (z wyjątkiem 8.3) powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym.

1. Prekultura szczepu P. patens Gransden 2004¹⁸ na podłożu BCDAT pokrytym celofanem na szalce Petriego przez tydzień w ciągłym białym świetle w temperaturze 25 °C.
2. Wysterylizuj mikrourządzenie w świetle UV przez noc w okapie z przepływem laminarnym.
3. Umieść mikrourządzenie w komorze próżniowej i odgazowuj przez 20 minut.
4. Wprowadzić pożywkę wzrostową do studzienek za pomocą mikropipety. Odczekaj kilka minut, aż próżnia wypełni wszystkie mikrokanaliki medium.
5. Dodaj autoklawowaną wodę do naczynia otaczającego mikrourządzenie, aby utrzymać wilgotność w naczyniu.
6. Przenieść mały kawałek tkanki protonematy mchu do wlotu mikrourządzenia i hodować tkankę w inkubatorze w temperaturze 25 °C w ciągłym białym świetle.
7. Sprawdź wzrost protonematy mchu po 2-3 tygodniach inkubacji. Uzyskuj obrazy w jasnym polu za pomocą mikroskopu.

9. Obrazowanie poklatkowe wzrostu łagiewki pyłkowej T. fournieri

1. Umieść mikrourządzenie na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w sprzęt do akwizycji obrazu (np. kamerę CCD) i oprogramowanie. Znajdź lokalizacje mikroluk.
   UWAGA: Do oprogramowania do akwizycji obrazu użyliśmy dostępnego na rynku produktu (Tabela materiałów). Oprogramowanie do mikroskopii typu open source, takie jak μManager, jest również dostępne online (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Zalecamy zainstalowanie kondensora mikroskopu na mikroskopie, aby uzyskać obrazy o wyższej rozdzielczości.
2. Rejestruj obrazy w jasnym polu co 10 s za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów mikroskopowych.
3. Aby zaobserwować znakowane fluorescencyjnie plemniki i jądro wegetatywne w łagiewce pyłkowej linii RPS5Ap::H2B-tdTomato, należy naświetlić próbkę laserem o długości fali 561 nm i użyć pasmowego filtra optycznego (578/105 nm).
   UWAGA: Chociaż zdjęcia poklatkowe wzrostu łagiewki pyłkowej były często wykonywane, obrazowanie nie wydawało się wpływać na wzrost. Jednak zawsze zaleca się zminimalizowanie intensywności lasera, czasu ekspozycji i interwału poklatkowego, aby zminimalizować fototoksyczność i fotowybielanie fluoroforu.
4. Dostosuj jasność i kontrast obrazów i przygotuj plik wideo za pomocą oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Results

Jak pokazano w Rysunek 1, komórki roślinne rosnące na wierzchołkach napotykają szereg fizycznych barier na swoich ścieżkach wzrostu in vivo. Mikroprzepływowe platformy do hodowli komórkowych in vitro przedstawione w tym badaniu umożliwiły zbadanie procesu wzrostu wierzchołków w trzech typach komórek roślinnych (łagiewki pyłkowe, włośniki i protonemata mchu) przez sztuczne szczeliny 1 μm (Rysunek 3, Rys...

Discussion

Aby uzyskać przedstawione powyżej wyniki, należy dokładnie wykonać kilka krytycznych kroków w protokole. Po pierwsze, zarówno warstwa PDMS, jak i powierzchnie naczynia ze szklanym dnem muszą być traktowane plazmą przez wystarczająco długi czas przed klejeniem. W przeciwnym razie warstwa PDMS może lokalnie oderwać się od powierzchni szkła, podczas gdy komórki rosnące w końcówce przechodzą przez mikroszczeliny. Kolejnym kluczowym krokiem w protonemata z włośnikami i mchem jest sterylizacja mikrourządzenia. Zwykle włośniki ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sacharoza	Wako Pure Chemical	196-00015
Naczynie ze szklanym dnem 50 mm	Matsunami Glass	D210402
35 mm naczynie ze szklanym dnem	Iwaki	3971-035
Ostrze chirurgiczne	Pióro	nr 11
stemple do biopsji	Harris		Uni-Core
Końcówki do ładowania żelu	Bio-Bik	124-R-204
Mikroskop odwrócony	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		Nr Numer katalogowy jest dostępny dla tego niestandardowego mikroskopu
Oprogramowanie do obrazowania MetaMorph	Urządzenia molekularne