Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

15.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57270

⸱

10 lipca 2018

 ,  , 
1Institute of Neuroscience, National Yang-Ming University, 2Brain Research Center, National Yang-Ming University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół chirurgii stereotaktycznej za pomocą domowego urządzenia do mikrowstrzykiwania odczynników do prążkowia mózgów noworodków myszy. Technika ta pozwala na manipulację genetyczną w komórkach neuronalnych określonych regionów mózgów noworodków myszy.

Streszczenie

Wiele genów ulega ekspresji w embrionalnych mózgach, a niektóre z nich są ciągle wyrażane w mózgu po urodzeniu. W przypadku takich trwale wyrażanych genów mogą one funkcjonować w celu regulacji procesu rozwojowego i/lub funkcji fizjologicznych w mózgach noworodków. Aby zbadać neurobiologiczne funkcje określonych genów w mózgu, niezbędna jest dezaktywacja genów w mózgu. Tutaj opisujemy prostą metodę stereotaktyczną do inaktywacji ekspresji genów w prążkowiu myszy transgenicznych w oknach noworodkowych. Wirusy AAV-eGFP-Cre zostały mikrowstrzyknięte do prążkowia myszy z genem reporterowym Ai14 w dniu pourodzeniowym (P) 2 za pomocą stereotaktycznej operacji mózgu. Ekspresję genu reporterowego tdTomato wykryto w prążkowiu P14, co sugeruje udaną rekombinację DNA za pośrednictwem Cre-loxP w komórkach prążkowia transdukowanych przez AAV. Następnie zweryfikowaliśmy tę technikę, mikroiniekując wirusy AAV-eGFP-Cre myszom P2Foxp2 fl / fl. Podwójne znakowanie GFP i Foxp2 wykazało, że komórkom GFP-dodatnim brakowało immunoreaktywności Foxp2 w prążkowiu P9, co sugeruje utratę białka Foxp2 w komórkach prążkowia transdukowanych przez AAV-eGFP-Cre. Podsumowując, wyniki te wskazują na skuteczną delecję genetyczną przez stereotaktycznie mikrowstrzykiwane wirusy AAV-eGFP-Cre w określonych populacjach neuronów w mózgach noworodków myszy transgenicznych. Podsumowując, nasza technika stereotaktyczna zapewnia łatwą i prostą platformę do manipulacji genetycznej w mózgach noworodków myszy. Technika ta może być nie tylko wykorzystywana do usuwania genów w określonych regionach mózgu noworodków, ale może być również stosowana do wstrzykiwania leków farmakologicznych, znaczników neuronalnych, genetycznie zmodyfikowanych białek optogenetycznych i chemogenetycznych, wskaźników aktywności neuronalnej i innych odczynników do prążkowia mózgów noworodków myszy.

Wprowadzenie

Nowoczesne badania nad strukturą i funkcją mózgu zazwyczaj wymagają genetycznej manipulacji specyficznymi genami w komórkach neuronalnych. Aby zbadać funkcje różnych genów, rutynowo generowano transgeniczne myszy przenoszące zmutowane allele, w tym allele knockout i knock-in. Stereotaktyczna chirurgia mózgu u dorosłych gryzoni jest standardową metodą miejscowego dostarczania leków, wirusów, znaczników i innych odczynników do określonych obszarów mózgu gryzoni1,2. Zastosowanie stereotaktycznej chirurgii mózgu u myszy transgenicznych pozwala na genetyczne manipulowanie funkcją genu i aktywnością neuronalną w określonych populacjach neuronów mózgu myszy. Manipulacja specyficzna dla typu komórki zapewnia potężne podejście do rozszyfrowywania funkcji neuronalnych w złożonych obwodach neuronowych mózgu3,4,5.

Rozwój neuronalny układu nerwowego rozpoczyna się we wczesnych stadiach embrionalnych, a procesy rozwojowe trwają po urodzeniu aż do okresu młodzieńczego. Pourodzeniowe dojrzewanie układu nerwowego obejmuje precyzyjne okablowanie synaptyczne obwodów nerwowych, co jest niezbędne dla fizjologicznych i poznawczych funkcji mózgu6. Dlatego badanie zdarzeń rozwojowych, które występują w oknach czasowych noworodków, jest ważne nie tylko dla zrozumienia prawidłowego rozwoju neuronów, ale może również dostarczyć wglądu w patogenezę zaburzeń neurorozwojowych i neuropsychiatrycznych7,8. Chociaż metody stereotaktycznej chirurgii mózgu u dorosłych gryzoni są łatwo dostępne2,9, w Internecie dostępnych jest niewiele protokołów stereotaktycznej chirurgii mózgu u noworodków myszy10,11. W rzeczywistości stereotaktyczne mikrowstrzyknięcia odczynników do mózgów nowonarodzonych młodych myszy są trudne, ponieważ głowa nowonarodzonego szczeniaka jest zbyt delikatna, aby można ją było zamocować w standardowym aparacie stereotaktycznym. Niemniej jednak, zastosowanie stereotaktycznej chirurgii mózgu u myszy transgenicznych jest wykonalne dla noworodków myszy12. Tutaj opisujemy prostą metodę z domowym zestawem do wykonywania stereotaktycznej operacji mózgu u nowonarodzonych szczeniąt myszy. Pokazujemy, że ta technika pozwala na warunkowe usunięcie floksowanych genów poprzez mikrowstrzyknięcie rekombinazy Cre DNA z ekspresją AAV do prążkowia myszy z genem reporterowym i myszy transgenicznych z warunkowym floksowaniem. Technika ta ma również zastosowanie do dostarczania odczynników do prążkowia noworodka myszy typu dzikiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane tutaj protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Uniwersytetu Yang-Ming.

1. Przygotowanie uchwytu dla noworodków w aparacie stereotaktycznym

  1. Przygotuj tackę na głowę: odetnij spód probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml (o długości 15 mm) do kształtu pasującego do głowy nowonarodzonych młodych, usuwając 1/5 ścianki probówki.
  2. Weź pudełko z końcówkami do pipet o odpowiednim rozmiarze, które pasuje do cokołu aparatu stereotaktycznego, i zdejmij górną pokrywę. Przymocuj tackę na głowę przygotowaną w kroku 1.1 i kasetę z wkładem do zatapiania chusteczek na podstawie tacki na końcówki za pomocą kleju topliwego. Wysokość kasety do zatapiania tkanek wynosi 7 mm, która służy do podparcia szyi i ciała szczeniaka w pozycji unieruchomionej przez głowę.
  3. Umieść cały zestaw w standardowym aparacie stereotaktycznym.

2. Przygotowanie igieł do iniekcji 30G ze stali nierdzewnej

  1. Wstępnie wyczyść igły strzykawki 30G, mocząc je w chloroformie przez 3 dni.
  2. Użyj kleszczyków, aby ostrożnie i powoli wyciągnąć igłę z polipropylenowej piasty w kapturze chemicznym.
  3. Myj igły absolutnym etanolem przez 20 minut, a następnie płucz 70% etanolem przez 3 × 10 minut na wytrząsarce z prędkością 50 obr./min. Pozostaw igły do wyschnięcia na powietrzu i przechowuj oczyszczone igły w czystym pudełku w temperaturze pokojowej (RT) do czasu użycia.

3. Przygotuj adapter do wężyka do mikroiniekcji

  1. Podłączyć strzykawkę o pojemności mikrolitrów do igły iniekcyjnej 30G z rurką polietylenową PE10 (tubka PE10). Przygotować adapter rurki polietylenowej PE20 (rurka PE20) do mostkowania igły iniekcyjnej i strzykawki o pojemności mikrolitrów. Użycie adaptera jest konieczne, ponieważ średnica rurki PE10 jest znacznie mniejsza niż igły strzykawki mikrolitrowej 26G.
  2. Przygotuj rurkę do strzykawki z mikrolitrami: połącz wstępnie oczyszczoną igłę iniekcyjną 30G z 5 cm rurką PE20 i uszczelnij złącze klejem błyskawicznym. Ten adapter do węży jest wielokrotnego użytku.
    UWAGA: Jeśli igła strzykawki do mikroiniekcji ma 30 G, przygotowanie (krok 3.1) i użycie (krok 3.3) tego adaptera nie jest konieczne.
  3. Połączyć adapter rurki (przygotowany w kroku 3.1) ze strzykawką o pojemności mikrolitrów (10 μl).
  4. Podłącz jeden koniec rurki PE10 (nie dłuższej niż 60 cm) do igły 30G adaptera rurki PE20. Zamontuj nową igłę iniekcyjną 30G na drugim końcu rurki PE10.

4. Załaduj rurkę do mikroiniekcji autoklawowaną wodą destylowaną, barwnikiem i wirusami

  1. Zdjąć tłok strzykawki z mikrolitrami. Użyj strzykawki 25G, aby załadować strzykawkę mikrolitrową i połączoną z nią rurkę PE autoklawowaną wodą destylowaną, aby usunąć powietrze z rurki.
  2. Umieścić tłok z powrotem w strzykawce o pojemności mikrolitrów i naciskać tłok, aż w cylindrze pozostaną 2 μl wody destylowanej. Nie pozwól, aby objętość wody destylowanej spadła poniżej 2 μl.
  3. Ostrożnie zamontuj strzykawkę o mikrolitrach na pompie strzykawkowej o mikroprzepływie.
  4. Pipetą odpipetować niewielkie ilości 0,1% szybko zielonego barwnika (przygotowanego w 0,9% soli fizjologicznej i przefiltrowanego filtrem 0,22 μm) i wirusa płynić do kawałka parafilmu.
  5. Pobrać niewielką ilość powietrza, aby na styku igły iniekcyjnej 30G i rurki PE10 był widoczny pęcherzyk powietrza, a następnie załadować 0,7 μl przefiltrowanego, szybko zielonego środka do probówki, aby przetestować przepływ płynów w rurce do mikroiniekcji.
  6. Pobrać kolejną niewielką ilość powietrza, aby wytworzyć drugi pęcherzyk powietrza, a następnie załadować płyny wirusowe do rurki do mikroiniekcji.
  7. Przymocuj i przymocuj igłę do mikroiniekcji 30G do ramienia aparatu stereotaktycznego.

5. Znieczulenie nowonarodzonych myszy przez hipotermię

  1. Umieść szczeniaka w lateksowym rękawie rękawicznym i zanurz go w kruszonym lodzie po szyję na 5 minut.
  2. Uszczypnij stopy szczeniaka kleszczami, aby upewnić się, że jego stopy nie reagują na wycofanie.
  3. Umieść szczeniaka z lateksowym rękawem na rękawiczki w tacy na głowę i umieść trochę pokruszonego lodu wokół lateksowego rękawa, aby był zimny do znieczulenia hipotermią.
  4. Nałóż maść weterynaryjną na oczy szczeniaka, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia, jeśli to możliwe.

6. Mikroiniekcja

  1. Przygotuj sterylną operację, dokładnie wycierając instrument stereotaktyczny 70% etanolem. Wysterylizuj narzędzie chirurgiczne, zanurzając je w 70% etanolu.
  2. Wyszoruj głowę szczeniaka 70% etanolem. Zlokalizuj punkt orientacyjny lambda na czaszce i zaznacz lambdę markerem. Skieruj końcówkę igły do lambdy i ustaw współrzędne przednio-tylne (AP) i przyśrodkowo-boczne (ML) na zero.
  3. Przesunąć ramię iniekcyjne do miejsca docelowego zgodnie ze współrzędnymi X i Y miejsca docelowego. Dla prążkowia dnia pourodzeniowego (P) 2 młode współrzędne to: AP, +2,4 mm przed lambdą; ML, ±1,0 mm bocznie od linii środkowej; grzbietowo-brzuszna (DV), −1,7 mm od czaszki. Zaznacz długopisem pozycję szybkiego zielonego barwnika w tubie PE10.
  4. Powoli opuść igłę do wstrzykiwań 30G, aby przeniknęła przez skórę i czaszkę, a następnie podnieś końcówkę igły, aż zatrzyma się na powierzchni czaszki. Ustaw współrzędną DV na zero.
  5. Powoli opuszczać igłę do wstrzykiwań 30G, aż osiągnie współrzędną DV miejsca docelowego. Odczekaj 1 minutę, aby miąższ powrócił do normalnego kształtu. Uruchomić program mikroiniekcji (100 nL/min).
  6. Upewnij się, że ślad szybkiego zielonego barwnika porusza się w probówce PE, aby upewnić się, że płyn wirusowy został wstrzyknięty do mózgu.
  7. Odczekać 1 minutę po zakończeniu mikroiniekcji, a następnie powoli i stopniowo podnosić igłę do 1/2 wysokości DV w ciągu 30 sekund. Po 30 s powoli wyjmij igłę z głowy szczeniaka.
  8. Powtarzaj kroki od 6.2 do 6.7, aż do zakończenia mikroiniekcji we wszystkich docelowych miejscach.

7. Rekonwalescencja pooperacyjna szczeniaka

  1. Rozgrzej szczenię przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 33 °C. Sprawdzaj powrót szczeniaka do zdrowia po znieczuleniu hipotermicznym co 5 minut, aż szczenię odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać leżący mostek.
  2. Zwróć szczenię z powrotem do tamy po tym, jak szczenię w pełni wyzdrowieje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W pierwszej serii eksperymentów mikroiniekcyjnie podano 200 nL wirusów AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (AAV-eGFP-Cre, rozcieńczenie 1/10 w soli fizjologicznej Dulbecco), które wykazują ekspresję rekombinazy DNA Cre połączonej z GFP, do prążkowia myszy Ai14 w dniu P2. Myszy Ai14 wykazują ekspresję genu reporterowego tdTomato po Cre-pośrednim usunięciu kasety STOP flankowanej przez sekwencje loxP (floxed) (Rysunek 2F). Mózgi pobrano w dniu P14 w celu przep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu demonstrujemy prostą i niezawodną stereotaktyczną metodę wstrzykiwania wirusów AAV do prążkowia mózgów noworodków myszy. Mikrowstrzyknęliśmy wirusy AAV-eGFP-Cre do prążkowia myszy reporterowych Ai14 w P2, a następnie przeanalizowaliśmy ekspresję genu reporterowego w P14. Odkryliśmy, że komórki transdukowane przez AAV GFP w całym prążkowiu na poziomie rostrocaudalnym. Co więcej, prawie wszystkie komórki GFP-dodatnie wykazywały koekspresję genu reporterowego tdTomato w komórkach prążkowia, co sugeruje ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Nauki i Technologii przyznaje granty MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, National Health Research Institutes grant NHRI-EX106-10429NI, oraz grant z Programu Centrum Badań nad Obszarami z Ministerstwa Edukacji za pośrednictwem Centrum Badań nad Mózgiem, Narodowy Uniwersytet Yang-Ming na Tajwanie,oraz stypendia podoktorskie MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 i MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła 30G PrecisionGlideBecton DickinsonREF 305106
ChloroformJT Baker9180-03
Strzykawka Hamilton MICROLITRHamilton Igła 8030030G pasująca do rurki PE10; Igła 26G wymaga adaptera PE20
Rurka polietylenowa PE20Rurka polietylenowa Becton Dickinson427406
PE10Becton Dickinson427401
Pompa strzykawkowa z mikroprzepływemDłuższa pompa precyzyjna Co.TJ-2A (kontroler) i L0107-2A (jednostka napędowa)
25GBecton DickinsonREF 302105
Fast greenSigma-AldrichF-72520.1%
Standard Stereotaxic InstrumentsRWD Life Science68037Bez użycia 68030 Adapter myszy/noworodka Szczur
Przeciwciało anty-FOXP2Abcamab16046Królik poliklonalny do FOXP2, 1:4,000
Przeciwciało anty-RFPAbcamab65856Mysz monoklonalna do RFP, 1:1,000
Mikroskop BX63OlympusBX63
LSM 880 mikroskop konfokalnyZeissLSM 880
Koza anty-królik sprzężony z Alexa fluor594Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40Penn Vector CoreAV-9-PV1848Lot # CS0987, 5.506x1013 (GC/mL)
AAV9.chicken aktyna-eGFPAAV core, Instytut Nauk Biomedycznych, Academia Sinica, TajwanN/A1x1014 (GC/ml)
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JLaboratorium Jacksona 007914Ai14
B6(Cg)-Foxp2TM1.1Sfis/CfreJLaboratorium Jacksona 026259Foxp2fl/fl
Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanamiCorning  cellgro21-030-CVR
Strzykawka

Bibliografia

  1. Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
  2. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
  4. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  5. Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
  6. Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
  7. Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
  8. Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
  9. Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).
  10. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
  11. Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
  12. Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
  13. Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  15. Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wirus AAV eGFP Crerekombinacja Cre loxPtechnika mikrowstrzykiwaniachirurgia noworodkowych myszywsp rz dne atlasu m zgufluorescencyjne geny reporterowe
Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.