Artykuł metodologiczny

Strategie pobierania próbek i przetwarzanie próbek tkanek z biobanku z modeli biomedycznych świń

DOI:

10.3791/57276

⸱

6 marca 2018

 , 
1Institute of Veterinary Pathology at the Centre for Clinical Veterinary Medicine, LMU Munich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazano praktyczne zastosowanie i wydajność metod generowania reprezentatywnych próbek tkanek modeli zwierzęcych świń dla szerokiego spektrum dalszych analiz w projektach biobanków, w tym wolumetrii, systematycznego losowego pobierania próbek i różnicowego przetwarzania próbek tkanek dla jakościowych i ilościowych analiz morfologicznych i molekularnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W translacyjnych badaniach medycznych, modele świń stają się coraz bardziej popularne. Biorąc pod uwagę wysoką wartość pojedynczych zwierząt, w szczególności genetycznie zmodyfikowanych modeli świń, oraz często ograniczoną liczbę dostępnych zwierząt w tych modelach, ustanowienie (biobankowych) kolekcji odpowiednio przetworzonych próbek tkanek nadających się do szerokiego spektrum późniejszych metod analiz, w tym analiz nieokreślonych w momencie pobierania próbek, stanowi sensowne podejście do pełnego wykorzystania wartości translacyjnej modelu. Jeśli chodzi o specyfikę anatomii świń, niedawno ustanowiono kompleksowe wytyczne dotyczące standaryzowanego generowania reprezentatywnych, wysokiej jakości próbek z różnych narządów i tkanek świń. Wytyczne te są niezbędnymi warunkami wstępnymi odtwarzalności wyników i ich porównywalności między różnymi badaniami i badaczami. Rejestrowanie podstawowych danych, takich jak masa i objętość narządów, określenie miejsc pobierania próbek i liczby próbek tkanek, które mają zostać wygenerowane, a także ich orientacja, rozmiar, kierunki przetwarzania i przycinania, są istotnymi czynnikami decydującymi o możliwości uogólnienia i użyteczności próbki do molekularnych, jakościowych i ilościowych analiz morfologicznych. W tym miejscu przedstawiono poglądową, praktyczną, krok po kroku demonstrację najważniejszych technik generowania reprezentatywnego, wielofunkcyjnego próbki biobanku z tkanek świń. Opisane tu metody obejmują oznaczanie objętości i gęstości narządów/tkanek, stosowanie procedury systematycznego losowego pobierania próbek ważonych objętościowo dla narządów miąższowych poprzez liczenie punktowe, oznaczanie stopnia kurczenia się tkanek związanego z histologicznym zatapianiem próbek oraz generowanie losowo zorientowanych próbek do ilościowych analiz stereologicznych, takich jak izotropowe jednorodne losowe skrawki (IUR) generowane metodami "orientatora" i "Isektora", i pionowe jednorodne przekroje losowe (VUR).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W medycynie translacyjnej świnie są coraz częściej używane jako duże modele zwierzęce1,2,3,4,5, ze względu na kilka korzystnych podobieństw między anatomią i fizjologią świni a człowiekiem, a także dostępność uznanych metod biologii molekularnej pozwalających na tworzenie dostosowanych, Genetycznie zmodyfikowane modele świń dla szerokiego zakresu stanów chorobowych1,4.

Jednak w porównaniu do modeli gryzoni, liczba zwierząt z danego modelu świni, które mogą być dostarczone do eksperymentów w dowolnym momencie, jest ograniczona. Wynika to z okresu między pokoleniami świń wynoszącego około jednego roku oraz nakładów finansowych i czasochłonnych niezbędnych do stworzenia modeli świń i hodowli zwierząt. Dlatego też pojedyncze zwierzęta w modelu świniowym, jak również próbki, które można uzyskać od tych świń, są bardzo cenne, szczególnie jeśli bada się genetycznie zmodyfikowane modele świń i/lub długoterminowe problemy eksperymentalne (np. późne powikłania chorób przewlekłych) u osób w podeszłym wieku2,6,7.

W trakcie jakiegokolwiek badania, wykonanie dodatkowych analiz, które nie zostały zaplanowane w początkowym projekcie eksperymentalnym badania, może później okazać się istotne, np. w celu rozwiązania różnych pytań wynikających z wcześniej odkrytych nieoczekiwanych wyników. Jeżeli odpowiednie próbki do takich dodatkowych doświadczeń nie są dostępne, konieczne mogą być nieproporcjonalnie wysokie koszty i czasochłonne wydatki w celu wygenerowania dodatkowych próbek świń i tkanek. Aby być przygotowanym na takie ewentualności, za ważne podejście uważa się generowanie kolekcji biobanków z zachowanymi próbkami zapasowymi różnych narządów, tkanek lub biopłynów, ilościowo i jakościowo nadających się do szerokiego zakresu późniejszych analiz2,6,7. Uzyskując optymalne korzyści z modelu świnionego, dostępność odpowiednich próbek z biobanku oferuje również unikalną możliwość przeprowadzenia szerokiego spektrum różnych metod analizy identycznych materiałów próbek na poziomie wielonarządowym u tych samych pojedynczych zwierząt, np. poprzez dystrybucję próbek do naukowców z różnych grup roboczych zorganizowanych w sieć badawczą2, 6,7. Ponadto "perspektywiczna" strategia pobierania próbek w biobankach również przyczynia się do zmniejszenia liczby zwierząt potrzebnych w badaniu. Korzyści płynące z biobankowania modelu świń zostały niedawno zademonstrowane w wielonarządowym, multiomicznym badaniu, w którym analizowano krzyżowość narządów w genetycznie zmodyfikowanym modelu długotrwałej cukrzycy świń, przy użyciu próbek z monachijskiego MIDY Pig Biobank2.

Istnieją pewne obowiązkowe wymagania, które próbki z biobanków muszą zazwyczaj spełniać, aby ustalić wiarygodność i interpretowalność wyników następnie przeprowadzonych analiz. Próbki muszą być generowane w sposób powtarzalny i muszą być reprezentatywne, tj. odpowiednio odzwierciedlać interesujące cechy morfologiczne i molekularne tkanki/narządu, z którego pobrano próbki7. Aby próbki nadawały się do szerokiego zakresu dalszych analiz, muszą być pobierane w wystarczających ilościach i przetwarzane zgodnie z wymaganiami (w tym warunkami czasowymi i temperaturowymi) różnych metod analitycznych, w tym opisowych analiz histopatologicznych, takich jak kriohistologia, histologia parafiny i tworzyw sztucznych, immunohistochemia, in situ hybrydyzacja, ultrastrukturalne analizy mikroskopu elektronowego i kliniczne laboratoryjne analizy diagnostyczne, a także analizy molekularne DNA, RNA, białek i metabolitów.

Aby umożliwić ocenę szerokiego zakresu różnych ilościowych parametrów morfologicznych, takich jak liczby, objętości, długości lub powierzchnie różnych struktur tkankowych za pomocą ilościowych analiz stereologicznych, należy przygotować losowe płaszczyzny przekroju próbek histologicznych odpowiednich narządów/tkanek7,8,9,10,11. W ilościowych badaniach morfologicznych niezwykle ważne jest precyzyjne określenie całkowitej objętości tkanki, narządu lub przedziału narządowego, z którego pobrano próbki (tj. przestrzeń odniesienia)7,9,12 do obliczenia bezwzględnych ilości interesujących parametrów w danym organie, tkance lub organizmie. Ostatecznie należy określić i uwzględnić efekt obkurczania tkanek związanego z osadzaniem podczas przygotowywania skrawków histologicznych13. W związku z tym, ilościowe analizy stereologiczne, zwłaszcza próbek archiwalnych (utrwalone próbki tkanek, osadzone bloki tkankowe, skrawki histologiczne itp.) z poprzednich badań są czasami poważnie ograniczone lub nawet niemożliwe12, szczególnie jeśli nie przeprowadzono wolumetrii odpowiednich narządów/tkanek, jeśli nie zastosowano odpowiednich projektów pobierania próbek, aby zagwarantować reprezentatywne próbki, jeśli liczba i ilość dostępnych pojedynczych próbek jest niewystarczająca, lub jeżeli przetwarzanie próbek jest niezgodne z oszacowaniem ilościowego(-ych) parametru(-ów) morfologicznego(-ych) będącego(-ych) przedmiotem zainteresowania. Ze względu na wieloraki możliwych czynników wpływających, nie można jednoznacznie stwierdzić, czy materiały archiwalne są wykorzystywane do analiz różnych ilościowych parametrów morfologicznych, ale zależy to od starannej oceny każdego indywidualnego przypadku.

Tak więc, ponieważ lokalizacja, rozmiar, liczba, przetwarzanie, kierunek przycinania i orientacja próbek mogą potencjalnie wpływać na wyniki kolejnych analiz, czynniki te mają ogromne znaczenie i muszą być brane pod uwagę w eksperymentalnym projekcie każdego badania. W odniesieniu do tych aspektów i szczególnych cech anatomii świń, niedawno ustanowiono kompleksowe, szczegółowe, wielkoskalowe wytyczne dotyczące pobierania próbek dostosowane do modeli świń, stanowiące solidne odniesienie do znormalizowanego, powtarzalnego i wydajnego generowania nadmiarowych, odpowiednio przetworzonych, wysokiej jakości próbek z ponad 50 różnych narządów i tkanek świń6,7.

Opisy metodologiczne i film instruktażowy pokazany w tym artykule dostarczają szczegółowych, ilustracyjnych, zrozumiałych, krok po kroku instrukcji do praktycznego wykonywania różnych technik wolumetrii, pobierania próbek tkanek i organów świń oraz przetwarzania próbek tkanek dla różnych metod dalszej analizy. Przedstawione techniki obejmują metody określania objętości i gęstości narządów/tkanek w oparciu o zasady Archimedesa i Cavalieri9, w tym określanie wymiarów trójwymiarowego skurczu tkanki związanego z zatopieniem w różnych podłożach do zatapiania14 podczas przetwarzania do badania histologicznego, zastosowanie praktycznych metod systematycznego losowego pobierania próbek ważonych objętością, przetwarzanie pobranej tkanki Próbki do różnych kolejnych analiz7,8,9,15, oraz generowanie odpowiednio zorientowanych i przetworzonych próbek do potencjalnych ilościowych analiz stereologicznych7,8,9,10,11. Przedstawione metody, oprócz ich zastosowania w projektach biobanków trzody chlewnej, są zasadniczo odpowiednie dla wszystkich badań oceniających ilościowe właściwości histomorfologiczne narządów/tkanek. Co więcej, systematyczne projekty losowego pobierania próbek są szczególnie korzystne dla generowania reprezentatywnych próbek w eksperymentach wykorzystujących metody analizy molekularnej do wykrywania zmian obfitości, np. RNA, białek lub metabolitów w różnych narządach i tkankach.

Następne akapity zawierają krótkie wprowadzenie do tych metod, podczas gdy ich praktyczne działanie jest opisane w sekcji protokołu.

Oznaczanie objętości narządów/tkanek
Określenie masy i objętości narządów jest ważne w kilku warunkach eksperymentalnych, ponieważ czynniki te mogą wskazywać na zmiany, potencjalnie związane z eksperymentalnie badanymi czynnikami będącymi przedmiotem zainteresowania. Całkowita objętość narządu/tkanki jest również powszechnie wymagana do obliczenia bezwzględnych parametrów ilościowych (np. całkowitej liczby komórek) na podstawie stereologicznie oszacowanych liczbowych gęstości objętości (tj. liczby komórek na jednostkę objętości tkanki)7,12. Oprócz technik wykorzystujących skomplikowany sprzęt techniczny, takich jak tomografia komputerowa, istnieją zasadniczo trzy praktyczne metody powszechnie stosowane do określania bezwzględnej objętości narządu lub tkanki. Objętość narządu można określić za pomocą "bezpośredniego pomiaru objętościowego" zgodnie z zasadą Archimedesa, tj. pomiaru objętości wody lub soli fizjologicznej przemieszczonej przez konstrukcję po całkowitym zanurzeniu. Jednak w przypadku porównywalnie dużych narządów świń podejścia te są niepraktyczne i podatne na nieprecyzyjność, ponieważ wymagają bardzo dużych kolb miarowych. Wygodniej, objętość narządu/tkanki można obliczyć na podstawie jej masy i gęstości7,12,16, które można efektywnie określić za pomocą "metody zanurzenia"7,12,16 (Krok 1.1 Protokołu). Objętość narządów/tkanek można również oszacować za pomocą metod wolumetrycznych opartych na "zasadzie Cavalieriego" (1598–1647). Najprościej rzecz ujmując, zasada Cavalieriego mówi, że jeśli dwa obiekty są przecięte w płaszczyznach równoległych do płaszczyzny podłoża, a profile przekrojów przecięte przez dwa obiekty w odpowiednich odległościach od płaszczyzny podłoża mają te same powierzchnie, to oba obiekty mają taką samą objętość. W ten sposób objętość obiektów o dowolnym kształcie można oszacować jako iloczyn ich równoległych obszarów profilu przekroju, jednakowo odległych płaszczyzn przekroju i odległości między płaszczyznami przekroju. Jest to zrozumiałe przy następującej analogii: rozważmy dwa stosy składające się z tej samej liczby identycznych monet umieszczonych obok siebie, jeden stos z monetami ułożonymi w porządku jedna na drugiej, co daje cylindryczny kształt stosu monet, a drugi stos monet z monetami umieszczonymi poza środkiem (Rysunek 3A). Chociaż kształty obu stosów monet są różne, ich objętości są takie same, ponieważ obszary monet na odpowiednich poziomach obu stosów (tj. obszary profili równoległych sekcji przecinających oba stosy monet w równych odległościach od ziemi) są identyczne. Szacowanie objętości narządów i tkanek świń przy użyciu zasady Cavalieriego7,12,15 jest opisane w kroku 1.2.

Określenie stopnia kurczenia się tkanek związanych z zagnieżdżeniem histologicznym
W analizach kilku ilościowych parametrów morfologicznych mierzonych w histologicznych skrawkach tkanek należy określić i uwzględnić wpływ obkurczania się tkanki związanej z zatopieniem, występujący podczas przetwarzania tkanki do badania histologicznego. Stopień skurczu tkanki związanej z zatopieniem może być zmienny i zależy zarówno od tkanki, jej przetwarzania, jak i podłoża do zatapiania8,13,17,18,19. Ogólnie rzecz biorąc, zmiany objętości próbki tkanki związane z osadzaniem (tj. głównie kurczenie się) zachodzą we wszystkich trzech wymiarach przestrzeni, a zatem wpływają na wszystkie parametry wymiarowe oszacowane za pomocą ilościowych analiz stereologicznych8. Zasadniczo zakres kurczenia się tkanki związany z osadzaniem, wyrażony jako liniowy współczynnik kurczenia się tkanki (f S), można oszacować, jak pokazano w kroku 1.3. i służy do korekcji (wrażliwych na skurcz) ilościowych parametrów morfologicznych14.

Systematyczne losowe pobieranie narządów/tkanek ważone objętością
W celu ustanowienia biobanku próbek narządów/tkanek świń, metody systematycznego losowego pobierania próbek ważone objętościowo, takie jak opisane w kroku 2, okazały się praktycznymi, oszczędzającymi czas i skutecznymi technikami generowania reprezentatywnych, wielofunkcyjnych próbek tkanek7,8,9,15.

Generowanie izotropowych jednolitych sekcji losowych i pionowych jednolitych sekcji losowych dla ilościowych analiz stereologicznych
Próbki tkanek z biobanku muszą być odpowiednie do zastosowania w szerokim zakresie różnych metod ilościowej analizy stereologicznej w celu oszacowania maksymalnej liczby parametrów, których nie można określić bez odpowiednio przygotowanej próbki. Prawie wszystkie ilościowe parametry stereologiczne można określić za pomocą "izotropowych (niezależnych) jednorodnych sekcji losowych (IUR)"8,9. W przekrojach IUR trójwymiarowa orientacja płaszczyzny przekroju próbki tkanki jest losowa. Można to osiągnąć poprzez randomizację położenia próbki tkanki względem położenia płaszczyzny przekroju, zgodnie z metodą "Isector"11 (krok 3.1 protokołu), lub przez randomizację orientacji płaszczyzny przekroju względem próbki tkanki, jak w metodzie "Orientator"10 (Krok 3.2 protokołu). W próbkach tkanek, takich jak próbki skóry lub błony śluzowej, wykazujące naturalnie występującą lub zdefiniowaną i prawidłowo identyfikowalną oś pionową, korzystne jest przygotowanie "pionowych jednolitych odcinków losowych (VUR)" (krok 3.3 protokołu) ściśle przeciętych w płaszczyźnie ich osi pionowej8,20. W celu pełnego omówienia teoretycznych podstaw próbkowania IUR/VUR oraz obszernego omówienia potencjalnych dalszych ilościowych analiz stereologicznych, zainteresowanego czytelnika odsyłamy do podręczników stereologii ilościowej w naukach przyrodniczych8,9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody wykorzystują próbki tkanek pochodzące od martwych zwierząt i są w pełni zgodne z niemieckimi przepisami prawnymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt.

1. Wolumetria

  1. Technika zanurzenia do określania gęstości tkanek/narządów (Rysunek 1 i Rysunek 2)7,12,16
    1. Przygotuj materiały: ostrza skalpela, ręczniki papierowe, cienkie kleszcze, standardowe wagi laboratoryjne, szklane lub plastikowe zlewki, 0,9% soli fizjologicznej i samodzielnie skonstruowane uchwyty na próbki (Rysunek 2A).
    2. Wyciąć fragment tkanki (maksymalny rozmiar: 2 x 2 x 2 cm3) z narządu/tkanki, a konkretnie z przedziału narządu będącego przedmiotem zainteresowania. Małe narządy, takie jak przysadka mózgowa lub szyszynka, są mierzone w toto.
      UWAGA: Upewnij się, że rozmiar próbki jest znacznie mniejszy niż wewnętrzna średnica zlewki (krok 1.1.5 i nast.) oraz jej poziom napełnienia, aby umożliwić całkowite zanurzenie próbki bez kontaktu z wewnętrznymi ściankami zlewki w kroku 1.1.7.
    3. Ostrożnie przetrzyj próbkę ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar krwi/płynu tkankowego.
    4. Zważyć próbkę na wadze precyzyjnej i zanotować masę próbki (mS). Określ masę małych próbek tkanek z dokładnością do mg (Rysunek 1A).
    5. Umieść na wadze zlewkę wypełnioną 0.9% solą fizjologiczną o temperaturze pokojowej. Nie napełniać całkowicie zlewki, aby umożliwić zanurzenie próbki tkanki w kolejnym etapie bez przepełnienia.
      UWAGA: Użyć rozmiaru zlewki odpowiedniej do wielkości i masy mierzonej próbki tkanki oraz efektywnego zakresu pomiarowego wagi. W przypadku większych próbek o wymiarach do 2 x 2 x 2 cm3 odpowiednia jest wielkość zlewki 50–100 ml w połączeniu ze skalą o masie od około 100 mg do 500 g, natomiast w przypadku małych próbek należy stosować zlewki o objętości 5–10 ml w połączeniu z precyzyjnymi skalami o zakresach pomiarowych od około 0,1 mg do 20 g.
    6. Zanurz uchwyt na próbkę (tj. wystarczająco sztywną pętlę z cienkiego drutu lub coś podobnego, Rysunek 2A) w soli fizjologicznej w zaznaczonym miejscu (strzałki w Rysunek 1B, Rysunek 2B, oraz Rysunek 2C). Następnie zresetuj (wytaruj) wyświetlacz skali do zera.
    7. Ostrożnie przymocuj próbkę tkanki do uchwytu na próbkę i całkowicie zanurz próbkę w soli fizjologicznej, aż zostanie osiągnięta zaznaczona pozycja na uchwycie próbki (strzałki w Rysunek 1B, Rysunek 2B i Rysunek 2C).
      UWAGA: Zanurzona próbka i uchwyt próbki nie mogą stykać się ze ściankami wewnętrznymi lub dnem zlewki lub powierzchnią soli fizjologicznej.
    8. Trzymając uchwyt na próbkę i zanurzoną próbkę w tej pozycji, zapisz masę wyświetlaną na wadze (mL), odnosząc się do masy soli fizjologicznej przemieszczonej przez próbkę tkanki (Rysunek 1C, Rysunek 2B i Rysunek 2C).
    9. Obliczyć objętość próbki (VS) z mL i gęstość soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej (20 °C) (ρsól fizjologiczna = 1,0048 g/cm³) jako VS = mL/ρsól fizjologiczna [g/g/cm³] (Rysunek 1).
    10. Obliczyć gęstość próbki tkanki (ρ próbki) na podstawie masy (tj. masy) próbki (mS) i jej objętości (VS): ρpróbka = mS/VS [g/cm³] (Rysunek 1).
    11. W przypadku narządów mierzonych in toto powtórz pomiar trzy razy i oblicz średnią gęstość narządów na podstawie pojedynczych wartości pomiaru. W przypadku dużych narządów/tkanek należy wykonać powtarzające się pomiary na różnych próbkach tego samego narządu/tkanki/przedziału narządu i odpowiednio obliczyć średnią gęstość na podstawie pojedynczych pomiarów.
    12. Oblicz całkowitą objętość narządu/tkanki/przedziału narządu na podstawie jego masy i gęstości (Rysunek 1).
  2. Zastosowanie metody Cavalieri do oznaczania objętości narządów u świń7
    1. Przygotuj materiały: linijkę, suwmiarkę, nóż, nożyczki, kleszcze, wodoodporny długopis, folie plastikowe, skaner, aparat fotograficzny i siatki krzyżowe wydrukowane na foliach plastikowych.
    2. Umieść cały narząd/tkankę na gładkiej powierzchni (podstawa tnąca) i zmierz długość (l) narządu wzdłuż jego osi podłużnej (Rysunek 3B, Rysunek 5A).
    3. Pokrój cały narząd/tkankę na równoodległe równoległe plasterki prostopadłe do osi podłużnej narządu (Rysunek 3C, Rysunek 5B). Należy wybrać odległość d między dwoma sekcjami (tj. odstęp między sekcjami/grubość przekroju, zwykle około 1 cm) wystarczająco małą, aby pomieścić wystarczającą liczbę płyt tkankowych/narządowych. Losowo umieść pierwszą sekcję w odległości od 0 do interwału sekcji od marginesu narządu. Podczas krojenia należy wizualnie ocenić położenie i orientację każdej płaszczyzny przekroju, aby uzyskać w przybliżeniu równoległe płyty narządów/tkanek o mniej więcej jednolitej grubości.
      UWAGA: Niezbędna liczba pobranych tkanek/narządów zależy od kształtu i wielkości badanego narządu/tkanki. Jeżeli małe organy lub próbki muszą być podzielone na cienkie kawałki o grubości ≤5 mm, przed podziałem na sekcje należy zanurzyć próbki w agarze (patrz krok 1.3.3) i użyć urządzenia technicznego do krojenia próbki zatopionej w agarze na kawałki. Empirycznie zalecane odstępy między sekcjami dla większości narządów i tkanek świń, a także przykłady urządzeń do krojenia, są wskazane w Materiale Uzupełniającym "Przewodniki po próbkowaniu tkanek dla modeli biomedycznych świń"7.
    4. Umieść wszystkie płyty narządów/tkanek na tej samej powierzchni skierowaną w dół na podstawie cięcia (tj. konsekwentnie na prawej lub lewej płaszczyźnie sekcji każdej płyty narządu, Rysunek 3D, Rysunek 5C) i policz płyty (n).
    5. Profile przekrojów płyt tkankowych należy uzyskać za pomocą jednej z następujących metod:
      1. Ostrożnie umieść fragmenty tkanek na odpowiednio oznakowanych foliach z tworzywa sztucznego, zachowując orientację ich górnej i dolnej powierzchni. Obrysuj kontury warstw tkanek na plastikowych foliach za pomocą wodoodpornego pisaka (Rysunek 3E1-2).
      2. Zrób zdjęcia płyt tkankowych, trzymając aparat pionowo nad powierzchniami przekroju (Rysunek 3F). W celu kalibracji umieść linijkę rozmiaru obok płyt tkankowych.
      3. Zeskanuj fragmenty tkanek za pomocą skanera płaskiego, zachowując orientację ich górnej i dolnej powierzchni części (Rysunek 3G). W celu kalibracji umieść linijkę rozmiaru obok płyt tkankowych.
    6. Zmierz obszary (śledzonych, sfotografowanych lub zeskanowanych) profili przekrojów wszystkich płyt tkankowych za pomocą jednego z następujących podejść:
      1. Nałóż lub nałóż na siebie narysowane profile płyty organowej odpowiednio zwymiarowaną, skalibrowaną siatką równo rozmieszczonych krzyżyków wydrukowanych na plastikowej przezroczystości i policz wszystkie krzyżyki uderzające w obszar profilu (Rysunek 3E3-4; porównaj do Rysunek 5D). Oblicz powierzchnię profilu przekroju każdej płyty organowej, mnożąc liczbę krzyżyków uderzających w obszar profilu przez powierzchnię odpowiadającą jednemu krzyżowi.
        UWAGA: Aby uzyskać wystarczająco precyzyjne oszacowania objętości, należy wybrać siatkę krzyżową z wystarczająco małą odległością między sąsiednimi krzyżami, tak aby średnio co najmniej 100 krzyżyków uderzyło w powierzchnie przekrojów płyt jednego narządu w każdym badanym przypadku badania. Empirycznie zalecane rozmiary siatek krzyżowych dla większości narządów i tkanek świń są wskazane w Materiale Uzupełniającym "Przewodniki po próbkowaniu tkanek dla modeli biomedycznych świń"7.
      2. Zmierz obszary warstw tkanek na cyfrowych obrazach zdjęć/skanów za pomocą odpowiednich dostępnych na rynku lub bezpłatnych aplikacji programowych i sprzętowych do morfometrii (Rysunek 3H), takich jak komercyjny system analizy obrazu21, lub ImageJ22.
        UWAGA: Należy pamiętać, że jedna płyta tkanki (pierwsza lub ostatnia) jest umieszczana na skanerze spoczywając na jego naturalnej powierzchni, odpowiednio zwrócona w stronę aparatu swoją naturalną powierzchnią. W związku z tym zeskanowany obraz, obraz fotograficzny tej płyty, nie będzie pokazywał powierzchni przekroju. W związku z tym na zeskanowanym obrazie/obrazie fotograficznym tej płyty tkankowej nie jest mierzony profil obszaru przekroju (Rysunek 3I). Należy również zwrócić uwagę na nadmierną projekcję obecną na zeskanowanych obrazach i zdjęciach płyt narządowych/tkankowych, tj. mierzy się tylko obszary rzeczywistych profili przekrojów, ale nie tkankę na obrazie leżącą za powierzchnią przekroju płyty (Rysunek 12G-H).
    7. Obliczyć szacowaną objętość narządu jako iloczyn sumy wszystkich odpowiednich powierzchni profilu przekroju wszystkich płyt tkankowych w każdym przypadku (tj. konsekwentnie odpowiednio prawej lub lewej powierzchni każdej płyty narządowej górnej lub dolnej części każdej płyty narządowej oraz średniej grubości płyt (tj. ilorazu zmierzonej długości pionowej osi narządu (l) i liczby płyt)15.
  3. Oznaczanie stopnia trójwymiarowego obkurczania tkanek związanych z zatopieniem podczas przetwarzania próbek tkanek do badań histologicznych
    1. Przygotuj materiały: ostrza mikrotomu, kleszcze, agar, formy do odlewów metalowych, skaner cyfrowy i linijkę rozmiaru (np. papier milimetrowy).
    2. Wyciąć świeżą, płaską powierzchnię przekroju z utrwalonej próbki tkanki.
      UWAGA: W przypadku korzystania z próbek łatwo odkształcalnych (miękkich) tkanek (tkanka tłuszczowa, tkanki galaretowate), przed cięciem należy zanurzyć utrwaloną próbkę tkanki w agarze (Rysunek 4A).
    3. Aby zatopić próbkę w agarze należy:
      1. Standardowy proszek agarowy używany do hodowli mikrobiologicznej należy zmieszać z odpowiednią objętością wody (około 0,5–1 g agaru/10 ml wody) w szklanej zlewce. Wymieszaj mieszaninę i podgrzej ją w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W, aż będzie gotować przez 3–5 sekund. Wymieszaj mieszaninę i ponownie doprowadź do wrzenia przez 3–5 sekund.
      2. Opcjonalnie, aby zwiększyć kontrast agaru z próbką tkanki, należy zabarwić płynny agar np. czarnym tuszem (dodać 1 ml tuszu do 10 ml gorącego płynnego agaru i energicznie wymieszać).
      3. Wlej gorący agar do formy odlewniczej (np. metalowej formy używanej do zatapiania parafiny, Rysunek 10A-D) i zanurz utrwaloną próbkę tkanki w ciepłym agarze. Pozwól agarowi ostygnąć aż do zestalenia, usuń pleśń i przetnij blok agaru z osadzoną tkanką za pomocą mikrotomu lub żyletki.
        UWAGA: Podczas obchodzenia się z gorącym płynnym agarem należy nosić okulary i rękawice ochronne. Próbki tkanek utrwalone w roztworze formaldehydu należy przetwarzać pod okapem wyciągowym i nosić okulary ochronne oraz rękawice laboratoryjne.
    4. Umieść próbkę powierzchnią przekroju skierowaną w dół na skanerze płaskim wraz z linijką rozmiaru i zeskanuj powierzchnię przekroju (Rysunek 4A,B).
    5. Określ obszar powierzchni przekroju utrwalonej próbki tkanki (AF) na skanie cyfrowym, stosując jedną z technik opisanych w kroku 1.2.6 (Rysunek 4B).
    6. Osadź próbkę w podłożu do zatapiania z tworzywa sztucznego, takim jak żywica epoksydowa (np. Epon) lub glikolmetakrylan/metakrylan metylu (GMA/MMA)23, zgodnie ze standardowymi protokołami23,24,25 (Rysunek 4C). Upewnij się, że powierzchnia przekroju nieruchomej próbki zeskanowanej w poprzednim kroku (1.3.4) jest zachowana w próbce z tworzywa sztucznego.
      UWAGA: Aby zachować orientację powierzchni przekroju próbki podczas przetwarzania próbki, należy konsekwentnie umieszczać próbkę zamierzoną powierzchnią przekroju skierowaną w dół w kasecie do zatapiania lub formie odlewniczej lub oznaczyć zamierzoną powierzchnię przekroju (lub przeciwną stronę próbki) tuszem.
    7. Wyciąć wycinek histologiczny z plastikowego bloku odpowiadającego oryginalnej powierzchni przekroju utrwalonej próbki tkanki (krok 1.3.2) za pomocą mikrotomu (Rysunek 4D), zamontować wycinek na szkiełku podstawowym (Rysunek 4D) i rutynowo go wybarwić (np. Barwienie hematoksyliną i eozyną, H&E)24,25.
      UWAGA: Aby otrzymać przekrój histologiczny w przybliżeniu w tej samej płaszczyźnie, co oryginalna powierzchnia przekroju utrwalonej próbki tkanki, przed cięciem należy ostrożnie wyregulować położenie plastikowego bloku w mocowaniu mikrotomu.
    8. Umieść szkiełko z poplamioną sekcją skierowaną w dół na skanerze płaskim razem z linijką rozmiaru i zeskanuj sekcję (Rysunek 4E).
    9. Określ obszar przekroju próbki tkanki osadzonej w plastiku (Ae) na skanie cyfrowym, korzystając z jednej z technik opisanych w kroku 1.2.6 (Rysunek 4F).
    10. Obliczyć średni skurcz tkanek związany z zatopianiem (dla odpowiedniej tkanki i podłoża do zatapiania) na podstawie zmierzonych powierzchni odpowiednich profili przekrojów próbek tkanek przed i po zatopieniu w podłożu do zatapiania z tworzywa sztucznego. Współczynnik skurczu liniowego fs oblicza się jako pierwiastek kwadratowy z ilorazu powierzchni profili przekrojów n próbek tkanek po zatopieniu w podłożu do zatapiania z tworzywa sztucznego (Ae) i powierzchni odpowiadających profili przekrojów tych samych próbek tkanek przed zatopieniem w podłożu do zatapiania z tworzywa sztucznego (Af) (Rysunek 4G)14.

2. Systematyczne losowe pobieranie próbek ważone objętościowo poprzez punktowe liczenie i przetwarzanie podpróbek tkanek dla różnych dalszych analiz - typy7

  1. Przygotuj materiały: linijkę, suwmiarkę, nóż, nożyczki, kleszcze, wodoodporne pisaki, siatki punktowe/krzyżowe wydrukowane na foliach z tworzywa sztucznego oraz tabele liczb losowych.
    UWAGA: Szablony kopii dla siatek krzyżowych (5–60 mm) znajdują się w materiale uzupełniającym "Przewodniki po próbkowaniu tkanek dla modeli biomedycznych świń"7.
  2. Umieść narząd/tkankę na gładkiej powierzchni (podstawa do cięcia) i zmierz długość (l) narządu wzdłuż jego osi podłużnej (Rysunek 5A, Rysunek 6A).
  3. Pokrój cały narząd/tkankę na równoodległe równoległe plasterki prostopadłe do jego osi podłużnej (Rysunek 5B). Należy wybrać odległość d między dwiema sekcjami (tj. odstęp między sekcjami/grubość przekroju, zwykle około 1 cm) wystarczająco małą, aby uzyskać wystarczającą liczbę wycinków tkanki/narządu. Losowo umieść pierwszą sekcję w odległości od 0 do interwału sekcji od marginesu narządu. Podczas krojenia należy wizualnie ocenić położenie i orientację każdej płaszczyzny sekcji, aby uzyskać w przybliżeniu równoległe płyty narządów/tkanek o mniej więcej jednolitej grubości.
    UWAGA: Niezbędna liczba pobranych tkanek/narządów zależy od wielkości badanego narządu/tkanki oraz liczby pobranych lokalizacji tkanek. Jeżeli małe organy lub próbki muszą być podzielone na cienkie kawałki o grubości ≤5 mm, przed podziałem na sekcje należy zanurzyć próbki w agarze (patrz krok 1.3.3) i użyć urządzeń technicznych do krojenia próbki osadzonej w agarze na kawałki. Empirycznie zalecane odstępy między sekcjami dla większości narządów i tkanek świń, a także przykłady urządzeń do krojenia są wskazane w Materiale Uzupełniającym "Przewodniki po próbkowaniu tkanek dla modeli biomedycznych świń"7.
  4. Umieść wszystkie płyty narządów/tkanek na tej samej powierzchni twarzą do dołu na podstawie tnącej (Rysunek 6B).
  5. Nałóż płyty tkankowe na siatkę krzyżową o odpowiednim rozmiarze wydrukowaną na plastikowej przezroczystości, umieszczając najbardziej zewnętrzny lewy górny krzyż siatki nad losowym punktem poza tkanką (Rysunek 5C-D, Rysunek 6B).
    UWAGA: Należy wybrać siatkę krzyżową z wystarczająco małą odległością między sąsiednimi krzyżami, tak aby w każdym badanym przypadku badania co najmniej dwa razy więcej krzyżyków uderzy w powierzchnię (powierzchnie) przekroju przedziału tkankowego, od którego ma być pobrana próbka, niż liczba próbek, które muszą zostać pobrane z tego przedziału tkankowego. Empirycznie zalecane rozmiary siatek krzyżowych dla większości narządów i tkanek świń są wskazane w Materiale Uzupełniającym "Przewodniki po próbkowaniu tkanek dla modeli biomedycznych świń"7.
  6. Zaznacz i policz wszystkie krzyżyki uderzające w tkankę (odpowiednio podprzedział tkankowy, z którego ma zostać pobrana próbka). Konsekwentnie stosować jednolity sposób liczenia i numerowania krzyżyków uderzających w przedział tkankowy, z którego mają być pobrane próbki, we wszystkich warstwach tkanki, np. poprzez kolejne numerowanie odpowiednich krzyżówek w każdej linii po linii, od lewej do prawej i od góry do dołu, lub, np. poprzez numerowanie krzyżyków w jednej warstwie tkanki po drugiej w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, zaczynając od krzyża znajdującego się najbliżej pozycji godziny dwunastej, jak to zostało zilustrowane na rysunku Rysunek 5E.
  7. Podzielić liczbę krzyżyków uderzających w tkankę/przedział tkankowy, z którego ma zostać pobrane (n) przez liczbę próbek, które mają zostać wygenerowane w celu uzyskania systematycznego odstępu między próbkami (i).
  8. Określ pierwszą pozycję próbkowania, wybierając losową liczbę x w przedziale od 1 do i. W tym celu użyj tabeli liczb losowych. Zaznacz pierwszą pozycję pobierania próbek (x) i każde następne x + i, x + 2i, x + 3i itd., uderzając krzyżowo w tkankę/przedział tkankowy, który ma być pobrany, na plastikowej przezroczystości za pomocą wodoodpornego pisaka (Rysunek 5F).
    UWAGA: Tabele liczb losowych można wygodnie i szybko generować za pomocą internetowego generatora liczb losowych.
  9. Oznacz miejsca tkanek odpowiadające zaznaczonym krzyżykom, lekko podnosząc plastikową przezroczystość i umieszczając mały kawałek czystego, czystego papieru konfetti na powierzchni płyty bibułki za pomocą pęsety (Rysunek 5G, Rysunek 6E).
  10. Pobrać próbkę tkanki z miejsc, w których pobrano próbki (Rysunek 5H, Rysunek 6F, Rysunek 7A) i dalej podzielić je na różne typy kolejnych analiz (Rysunek 6G, Rysunek 7A-B), jak określono w Tabeli 1.
  11. Po pobraniu próbek wyczyść folie plastikowe ciepłą wodą z mydłem, wysusz je i użyj ponownie.

3. Generowanie izotropowych jednolitych sekcji losowych (IUR) i pionowych jednolitych losowych (VUR) dla ilościowych analiz stereologicznych

  1. Technika "Isektor"
    1. Przygotuj materiały: żyletki lub mikrotomy, agar, kuliste formy odlewnicze (np. formy odlewnicze do pralin, które można uzyskać od dostawców cukierniczych), zaciski składane, kleszcze.
    2. Umieść odpowiedniej wielkości kawałek (1 x 1 x 1 cm3) stałej, systematycznie losowo pobieranej tkanki w sferycznej formie odlewniczej, trzymaj razem za pomocą składanych zacisków i napełnij formę ciepłym płynnym agarem (Rysunek 8A-E).
    3. Wyjmij kulę agarową (Rysunek 8F) z formy odlewniczej po zestaleniu agaru.
    4. Przetocz kulę agarową z osadzoną próbką tkanki po stole, zatrzymaj się i pokrój ją w losowe miejsce.
      UWAGA: Wynikowa płaszczyzna przekroju to przekrój IUR (Rysunek 8F-G).
    5. Przystąpić do zatopienia próbki tkanki w żywicy z tworzywa sztucznego, takiej jak GMA/MMA, zachowując orientację płaszczyzny przekroju IUR (patrz 1.3.5).
  2. Technika "orientatora"
    1. Przygotuj materiały: żyletki lub mikrotomy, agar, kleszcze, tabele liczb losowych, odciski okręgów równokątnych i cosinusoidalnych.
      UWAGA: Szablony kopii okręgów znajdują się w poprzednich publikacjach8,26.
    2. Umieść próbkę utrwalonej tkanki (lub utrwalonej tkanki osadzonej w agarze) na wydruku równokątnego koła z jedną krawędzią równoległą do kierunku 0–180° (Rysunek 9A, Rysunek 10E).
    3. Określ kąt losowy przy użyciu tabeli liczb losowych. Znajdź odpowiednie znaki w skali koła równokątnego, na którym spoczywa próbka. Korzystając z tych znaków, przeciąć przekrój przez próbkę (lub przez agar otaczający osadzoną próbkę tkanki), przy czym płaszczyzna przekroju jest zorientowana równolegle do kierunku losowego kąta wskazanego na skali koła równokątnego i pionowo do powierzchni spoczynkowej próbki (Rysunek 9B-C, Rysunek 10F).
    4. Umieść blok tkanki tak, aby powierzchnia przekroju wygenerowana w poprzednim kroku była skierowana w dół na okręgu ważonym cosinusem z krawędzią powierzchni spoczynkowej umieszczoną równolegle do kierunku 1-1 (Rysunek 9D, Rysunek 10H).
    5. Powtórz krok 3.2.3 i przetnij nowy odcinek przez próbkę pod kątem losowym określonym za pomocą tabeli liczb losowych (Rysunek 9E-F, Rysunek 10I-J).
      UWAGA: Wynikowa płaszczyzna przekroju jest przekrojem IUR.
    6. W razie potrzeby określ obszar profilu przekroju IUR utrwalonej próbki tkanki w celu określenia skurczu tkanki związanego z zatopieniem (Rysunek 9G-J), jak opisano w kroku 1.3, i przystąp do zatopienia próbki tkanki w żywicy z tworzywa sztucznego, takiej jak GMA/MMA.
  3. Generowanie pionowych jednolitych przekrojów losowych (VUR)
    1. Przygotuj materiały: żyletki lub mikrotomy, agar, kleszcze, tabele liczb losowych i odciski równokątnych kół.
      UWAGA: Szablony kopii okręgów znajdują się w poprzednich publikacjach8,26.
    2. Zdefiniuj oś pionową w nieruchomej próbce tkanki, która jest zawsze rozpoznawalna w próbce/skrawkach podczas kolejnych etapów.
      UWAGA: Zazwyczaj jako oś pionową wybiera się oś pionową do naturalnej powierzchni próbki tkanki.
    3. W razie potrzeby zanurz próbkę w agarze (Rysunek 11B).
      UWAGA: Osadzanie agaru przed przekrojem VUR lub IUR utrwalonej próbki jest ogólnie zalecane w przypadku małych, cienkich, delikatnych lub miękkich próbek. Stosuje się również zatapianie próbek w agarze, aby ułatwić pozycjonowanie próbki podzielonej na sekcje VUR podczas późniejszego zatapiania próbki w podłożu z żywicy z tworzywa sztucznego.
    4. Umieść próbkę na wydruku równokątnego koła, z osią pionową zorientowaną prostopadle do płaszczyzny stołu/stołu papierowego (Rysunek 11C).
    5. Przeciąć próbkę pod losowym kątem (określonym za pomocą tabeli liczb losowych) z płaszczyzną przekroju prostopadłą do tabeli i równoległą do osi pionowej, aby otrzymać płaszczyznę przekroju VUR (Rysunek 11D).
    6. W razie potrzeby należy określić obszar profilu przekroju IUR utrwalonej próbki tkanki w celu określenia skurczu tkanki związanego z zatopieniem, jak opisano w kroku 1.3 (porównaj z Rysunek 9G-J) i przystąp do zatopienia próbki tkanki w żywicy z tworzywa sztucznego, takiej jak GMA/MMA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika zanurzenia do określania gęstości tkanek/narządów

Rysunek 12A-B pokazuje reprezentatywne określenie gęstości i objętości nerki świni przy użyciu techniki zanurzenia opisanej w kroku 1.1 (Rysunek 1, Rysunek 2). Bardziej reprezentatywne wyniki pomiarów zagęszczenia dodatkowych narządów i tkanek świń przedstawiono w tabeli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie zbiorów próbek z biobanków z modeli świń wymaga solidnych technik i protokołów do określania objętości narządów/tkanek, powtarzalnego generowania reprezentatywnych, nadmiarowych próbek tkanek odpowiednich dla szerokiego zakresu różnych metod analizy oraz do randomizacji orientacji skrawków próbki do ilościowych analiz stereologicznych. Metody opisane w niniejszym artykule są dostosowane do wielkości narządów i tkanek świń i zostały opracowane tak, aby skutecznie sprostać tym wymaganiom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Lisie Pichl za doskonałą pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarCarl Roth GmbH, NiemcyAgar (proszek), Kat.: 5210.3Rozpuścić około 1 g agaru w 10 ml zimnej wody w szklanej lub plastikowej zlewce, podgrzać w kuchence mikrofalowej o mocy 700 W, dwukrotnie zagotować roztwór, dokładnie mieszając. Odleć do formy, gdy jest jeszcze ciepły i pozwól stwardnieć. Uwaga: Podczas obchodzenia się z gorącym agarem z płynem należy nosić okulary ochronne i rękawice.
SuwmiarkaHornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, NiemcySchieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Kat.: 3664902Każdy rodzaj suwmiarki (mechanicznej lub elektronicznej) również się nada.
Formy odlewnicze (metalowe)Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü nde, NiemcyEinbettschä lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Kat.: 14302bKażdy inny rodzaj metalowej formy odlewniczej używanej do zatapiania parafiny również się sprawdzi.
Szablony kopiowania siatek krzyżowych (5mm - 6 cm)n.a.n.a.Szablonykopiowania siatek krzyżowych (5mm - 6 cm) znajdują się w pliku danych uzupełniających Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Kopiuj szablony okręgów równokątnych i cosinusoidalnychn.a.n.a.Kopiujszablony okręgów równokątnych i cosinusoidalnych są dostępne w Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) oraz w Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. W: Haschek i Rousseaux´ s Podręcznik Patologii Toksykologicznej. Wydanie 3, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Zaciski składane (klipsy do segregatorów YIHAI, 15 mm i 19 mm)Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., ChinyY10006 i Y10005Każdy inny rodzaj standardowych zacisków biurowych również się sprawdzi.
Kleszcze (anatomiczne)NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, NiemcyneoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Kat.: 1-1811Każdy rodzaj kleszczy anatomicznych się sprawdzi.
Roztwór formaldehydu 4%SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, NiemcyFormaldehyd 37/40 %, Kat.: 1000411525005Rozcieńczyć do 4% ze stężonego roztworu. Bufor do neutralnego pH. Nosić odpowiednią ochronę oczu, rąk i dróg oddechowych. Próbki tkanek utrwalone w roztworze formaldehydu należy przetwarzać pod okapem wyciągowym i nosić okulary ochronne oraz rękawice laboratoryjne.
Papier milimetrowy (do kalibracji)Bü romarkt Bö ttcher AG, Jena, Niemcy. www.bueromarkt-ag.dePenig Millimeterpapier A4, Kat.: 2514Każdy rodzaj papieru milimetrowego (wyskalowany w milimetrach) będzie odpowiedni.
Zlewki laboratoryjne (5 ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, NiemcyBecherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Kat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036Wystarczy każdy rodzaj szklanych lub plastikowych zlewek o pojemności 5 – 100 ml.
Waga laboratoryjna(e)Mettler Toledo GmbH, Gieß en, NiemcyPM6000Wszelkie standardowe wagi laboratoryjne o zakresach pomiarowych od 0,1 mg do około 20 g, odpowiednio od 100 mg do około 500 g będą odpowiednie
Sartorius AG, Gö ttingen, NiemcyBP61S
Ostrza mikrotomuEngelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermü nde, NiemcyFEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700Każdy rodzaj jednorazowych ostrzy do mikrotomów będzie dobry.
Oprogramowanie/system morfometrii/planimetriiNarodowy Instytut Zdrowia (NIH)ImageJPobierz z https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, NiemcySystem analizy obrazu VideoplanTMBrak w magazynie
Aparat fotograficznyNikonD40Wystarczy każdy rodzaj cyfrowego aparatu fotograficznego, który można zamontować na statywie.
Folie plastikoweAvery Zweckform GmbH, Oberlaindern, NiemcyLaser Overhead-Folie DINA4 Kat.:  3562Wystarczy każda przezroczystość z tworzywa sztucznego do druku (laserowego).
Tabele liczb losowychn.a.n.a.Tabeleliczb losowych można wygodnie generować (ze zdefiniowaną liczbą liczb losowych i w określonych odstępach czasu) za pomocą generatorów liczb losowych, takich jak: https://www.random.org/
ŻyletkiPlano GmbH, Wetzlar, NiemcyT5016Każdy rodzaj żyletek się nada.
LinijkaBü romarkt Bö ttcher AG, Jena, Niemcy. www.bueromarkt-ag.deOffice-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, przezroczysty, Nr kat.: ln30Sprawdzi się również każdy rodzaj linijki w skali cm-mm.
Sól fizjologiczna (0,9%)Carl Roth GmbH, NiemcyNatriumchlorid, >99% Kat.: 0601.1Aby przygotować 0,9% sól fizjologiczną, rozpuść 9 g NaCl w 1000 ml wody destylowanej o temperaturze 20 stopni C.
Ostrza do skalpeliAesculap AG & Co KG, Tuttlingen, NiemcyBRAUN Ostrza chirurgiczne N° 22Wszelki rodzaj ostrzy skalpela się nada.
SkanerHewlett-Packardhp scanjet 7400cSprawdzi się każdy typ standardowego skanera biurowego zdolnego do skanowania z rozdzielczością od 150-600 dpi.
Przykładyskonstruowanych urządzeń do krojenia można znaleźć w Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) oraz w pliku danych uzupełniających Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Formy odlewnicze sferyczne (np. o średnicy 25,5 mm)Pralinen-Zutaten.de, Windach, NiemcyPralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25,5 mmFormy odlewnicze sferyczne mogą być równie dobrze skonstruowane samodzielnie lub uzyskane od innych dostawców słodyczy (do pralin). Wskazane tutaj formy odlewnicze są w rzeczywistości pakowaniem/owijaniem pustych korpusów pralin (najpierw zjedz praliny, a następnie użyj opakowania do wygenerowania sekcji i-sektorowych)
Cienki drutBasteln & Hobby Schobes, Straß förth, Niemcy. www,bastel-welt.deMessingdraht (0,3 mm) Nr kat.: 216464742Każdy inny rodzaj cienkiego drutu również się nada.
BibułkaNeoLab Migge GmbH, Heidelberg, NiemcyDeclcate Task Wipes-White, Kat.: 1-5305Każdy inny rodzaj bibuły laboratoryjnej również się nada.
Wodoodporny długopisStaedler Mars GmbH & Co KG, Nü rnberg, GrmanyLumocolor permanent 313, 0,4 mm, S,, Kat.: 313-2Każdy inny rodzaj wodoodpornego pisaka również się sprawdzi.
samodzielnie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).
  2. Blutke, A., et al. The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes. Mol Metab. 6, 931-940 (2017).
  3. Klymiuk, N., et al. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle. Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).
  4. Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies. Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).
  5. Renner, S., et al. Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs. Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).
  6. Abbott, A. Inside the first pig biobank. Nature. 519, 397-398 (2015).
  7. Albl, B., et al. Tissue sampling guides for porcine biomedical models. Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).
  8. Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W. Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. Haschek, W. , 3rd ed, Academic Press. London. 215-286 (2013).
  9. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , 2nd ed, Garland science/Bios Scientific Publishers. Oxford. 1-277 (2005).
  10. Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. Estimation of surface area and length with the orientator. J Microsc. 159, 301-317 (1990).
  11. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens. J Microsc. 165, 427-431 (1992).
  12. Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study. Ann Anat. 196, 3-11 (2014).
  13. Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J Microsc. 204, 232-246 (2001).
  14. Mattfeldt, T. Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology]. Normale und pathologische Anatomie. Doerr, W., Leonhardt, H. , Georg Thieme Verlag. Stuttgart-New York. (1990).
  15. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147, 229-263 (1987).
  16. Scherle, W. A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology. Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).
  17. Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector. J Urol. 154, 2170-2173 (1995).
  18. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).
  19. von Bartheld, C. S. Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods. NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).
  20. Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. Estimation of surface area from vertical sections. J microsc. 142, 259-276 (1986).
  21. Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth. Physiol Rep. 4, e12709(2016).
  22. Rasband, W. S. ImageJ. , U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij (1997).
  23. Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints. Histochemistry. 73, 439-446 (1981).
  24. Böck, P. Romeis Mikroskopische Technik. , Urban und Schwarzenberg. München, Wien, Baltimore. 17. Auflage 1-697 (1989).
  25. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's theory and practice of histological techniques. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone. 1-654 (2013).
  26. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).
  27. Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Sampling for stereology in lungs. Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).
  28. Junatas, K. L., et al. Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver. J Anat. 230, 575-588 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pobieranie pr bek tkanek wi skichprocesowanie preparat w do biobankutechnika zanurzeniowametoda orientatoraizotropowe jednorodne przekroje losowewyznaczanie g sto ci tkankipr bkowanie wa one obj to ciowoanaliza stereologicznapomiar obj to ci narz dugenerowanie losowych przekroj w

Powiązane artykuły