Oznaczanie indeksu lipidowego metodą odzyskiwania ciekłej fluorescencji w patogenie grzybowym Ustilago maydis

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania wskaźnika kropelek lipidów (indeksu LD) w celu zbadania dynamiki triacylogliceroli w komórkach hodowanych w eksperymentach wysokoprzepustowych. Test wskaźnika LD jest łatwą i niezawodną metodą, która wykorzystuje BODIPY 493/503. Ten test nie wymaga jednorazowej ekstrakcji lipidów ani analizy mikroskopowej.

Streszczenie

Artykuł pokazuje, jak zaimplementować test indeksu LD, który jest czułym testem mikropłytki do określania akumulacji triacylogliceroli (TAGs) w kropelkach lipidów (LDs). Wskaźnik LD uzyskuje się bez ekstrakcji lipidów. Umożliwia pomiar zawartości LD w wysokoprzepustowych eksperymentach w różnych warunkach, takich jak wzrost w pożywkach bogatych lub zubożonych w azot. Chociaż metoda została opisana po raz pierwszy w celu zbadania metabolizmu kropelek lipidów u Saccharomyces cerevisiae, z powodzeniem zastosowano ją do podstawczaka Ustilago maydis. Co ciekawe, a także dlatego, że LD są organellami filogenetycznie zachowanymi w komórkach eukariotycznych, metoda ta może być stosowana do wielu różnych komórek, od drożdży po komórki ssaków. Wskaźnik LD opiera się na teście odzysku ciekłej fluorescencji (LFR) BODIPY 493/503 w warunkach hartowania, przez dodanie komórek związanych formaldehydem_. Jod potasu jest stosowany jako środek gaszący fluorescencję. Stosunek między fluorescencją a nachyleniem gęstości optycznej nazywa się indeksem LD. Nachylenia oblicza się na podstawie linii prostych uzyskanych, gdy fluorescencja BODIPY i gęstość optyczna przy 600 nm (OD₆₀₀) są wykreślane na tle dodania próbki. Optymalna jakość danych znajduje odzwierciedlenie we współczynnikach korelacji równych lub większych niż 0,9 (r ≥ 0,9). Wiele próbek może być odczytywanych jednocześnie, ponieważ można je wprowadzić do mikropłytki. Ponieważ BODIPY 493/503 jest lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym, który rozdziela się na kropelki lipidów, może być stosowany w wielu typach komórek, które gromadzą LD.

Wprowadzenie

Kropelki lipidów (LDs) to wszechobecne wewnątrzkomórkowe ciała tłuszczowe składające się z rdzenia z neutralnych lipidów, głównie TAGów i estrów steroli (SE). Rdzeń jest otoczony monowarstwą fosfolipidów, która oddziałuje z białkami, takimi jak perylipina i enzymami biorącymi udział w syntezie obojętnych lipidów, takimi jak acylotransferaza diacyloglicerolu, karboksylaza acetylo-CoA i syntaza acylo-CoA¹. Ze względu na swoje dynamiczne zachowanie, monowarstwa fosfolipidowa zawiera również lipazy triacyloglicerolu, które hydrolizują TAGs i SE². W zależności od typu komórki i organizmu, zmagazynowane obojętne lipidy mogą by....

Protokół

1. Przygotowanie buforów i roztworów

1. Aby przygotować 1 L solistrowanego buforu fosforanowego (PBS, pH 7), rozpuścić 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ oraz 0,24 g KH₂PO₄ w 800 mL wody destylowanej. Dostosować pH do 7,0 za pomocą HCl, a następnie dodać wodę do uzyskania końcowej objętości 1 L. PBS można przygotować jako 10-krotny roztwór zapasowy i przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Aby przygotować 10 mL roztworu utrwalającego, dodać 1 mL 37% formaldehydu do 9 mL PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 3,7%. Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
   Uwaga: Podczas pracy z roztworem f....

Wyniki

LFR z zastosowaniem BODIPY 493/503 jako sondy fluorescencyjnej jest niezawodną i prostą metodą badania dynamicznej akumulacji LD w U. maydis, niezależnie od warunków wzrostu. Gdy komórki hodowano w pożywce YPD, obserwowano wzrost indeksu LD podczas fazy wykładniczej, a następnie jego spadek w fazie stacjonarnej (Rycina 2A). W przeciwieństwie do tego, w komórkach hodowanych w warunkach głodzenia azotowego odnotowano stały wzrost indeksu LD zarówno w f.......

Dyskusja

LFR to nowatorska metoda, która po raz pierwszy została zastosowana do badania metabolizmu lipidów u S. cerevisiae, a następnie została z powodzeniem wdrożona w U. maydis^20,21. Chociaż indeks LD nie daje wartości bezwzględnej TAGów zgromadzonych w komórkach, daje szybkie wyobrażenie o zawartości lipidów w komórkach, a interpretacja danych jest prosta, gdy porównuje się indeks LD z dwóch lub więcej warunków eksperymentalnych. BODIPY 493/503 jest .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektrofotometr	Varioskan Lux wielomodowy odczyt mikropłytki	D5879	Filtr 493/503 lub detektor monochromatorowy
Płyta costar	Corning Inc.	3615	96-dołkowa czarnościenna/przezroczysta
płyta dolna costar	Corning Inc	3598	96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej costar
BODIPY 493/503	Invitrogen/ Thermofisher	D3922	4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen
Roztwór formaldehydu	Sigma Aldrich	252549	odczynnik ACS, 37% wag. w H2O, zawiera 10-15% metanolu, aby zapobiec polimeryzacji
Jodek potasu	Sigma Aldrich	60399	BioUltra, ≥ 99,5% (AT)
FB2 Ustilago maydis	ATCC	201384	Drożdże Basidiomycete-Chlorek
sodu	Odczynnik Sigma Aldrich	746398	ACS, sól nieorganiczna
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma Aldrich	P0662	Odczynnik ACS
Select Ekstrakt drożdżowy	Sigma Aldrich	Y100	Mieszanina kwasów amini, peptydów, rozpuszczalnych w wodzie, witamin i węglowodanów do pożywek hodowlanych
Przypadek N-Z plus	Sigma aldrich	N4642	Hydrolizat enzymatyczny kazeiny z mleka krowiego
Glukoza	Sigma Aldrich	G-8270	D (+) glukoza
Kolba Skaker	Pirex	CLS4450250-6EA	ze szkła borokrzemianowego
	SEV Mé xico	INO650V-7	Wytrząsarka orbitalna
Stół wirówkowy	Eppendorf	5415C	Wirówka
Mikroprobówki	Sigma Aldrich	Z606340	Eppendorf
Końcówki do pipet	Axygen scientific	T-200-Y	Uniwersalne końcówki do pipet ze ściętą końcówką, 200 mikrolitrów, niesterylne
pipety mLine	Biohit	725130	8 kanałów, zakres objętości 5-100 uL

Wytrząsarka