Artykuł metodologiczny

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

DOI:

10.3791/57281

⸱

28 lutego 2018

 , 
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jelitowy układ odpornościowy odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu funkcji bariery przewodu pokarmowego, generując tolerancyjne odpowiedzi na antygeny dietetyczne i bakterie komensalne, jednocześnie budując skuteczne odpowiedzi immunologiczne na mikroorganizmy enteropatogenne. Ponadto stało się jasne, że miejscowa odporność jelitowa ma głęboki wpływ na odporność odległą i ogólnoustrojową. Dlatego ważne jest, aby zbadać, w jaki sposób indukowana jest jelitowa odpowiedź immunologiczna i jaki jest wynik immunologiczny tej odpowiedzi. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych jelita cienkiego, takich jak plamy Peyera związane z tkanką limfoidalną jelita oraz drenujące węzły chłonne krezkowe i miejsca efektorowe, takie jak blaszka właściwa i nabłonek jelitowy. Technika ta zapewnia izolację dużej liczby limfocytów z tkanek jelita cienkiego o optymalnej czystości i żywotności oraz minimalnym zanieczyszczeniu międzyprzedziałowym w akceptowalnych ograniczeniach czasowych. Techniczna zdolność do izolowania limfocytów i innych komórek odpornościowych z tkanek jelitowych umożliwia zrozumienie odpowiedzi immunologicznej na infekcje żołądkowo-jelitowe, nowotwory i choroby zapalne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewód pokarmowy (GI) ma wiele fałd i wypukłości, które stanowią największy interfejs oddzielający ciało wewnętrzne od środowiska zewnętrznego. Jelitowy układ odpornościowy odgrywa istotną rolę w utrzymaniu funkcji barierowej przewodu pokarmowego. Jest stale narażony na antygeny dietetyczne, bakterie komensalne i drobnoustroje chorobotwórcze. W związku z tym musi pozostać tolerancyjny na antygeny pokarmowe i bakterie komensalne, zachowując jednocześnie zdolność do szybkiego generowania skutecznej odpowiedzi immunologicznej na drobnoustroje enteropatogenne1. Jelitowy układ odpornościowy można anatomicznie podzielić na miejsca indukcyjne, w których naiwne limfocyty są aktywowane przez komórki prezentujące antygen przenoszące antygeny z błony śluzowej jelita, oraz miejsca efektorowe, w których aktywowane limfocyty wywierają określone funkcje efektorowe2. Miejsca indukcyjne obejmują zorganizowaną strukturę limfoidalną plastrów Peyera (PP), która bada światło jelita bezpośrednio poprzez działanie wyspecjalizowanych komórek M i regionalnych drenujących węzłów chłonnych krezkowych (MLN). Miejsca efektorowe składają się z blaszki właściwej (LP), która jest tkanką łączną poniżej błony podstawnej, oraz nabłonka jelitowego, pojedynczej warstwy komórkowej znajdującej się nad błoną podstawną, która zawiera limfocyty śródnabłonkowe (IEL). Limfocyty są głównymi graczami odporności adaptacyjnej, która pośredniczy w ochronie przed infekcjami i nowotworami, a także może przyczyniać się do immunopatologii w chorobach zapalnych. Badanie limfocytów w tych odrębnych anatomicznych przedziałach błony śluzowej jest ważne i bardzo istotne, aby lepiej zrozumieć ich funkcje indukcyjne i efektorowe.

Stosunkowo prosty i ujednolicony protokół izolacji limfocytów z tych przedziałów jest potrzebny, ponieważ liczba badaczy badających zdarzenia immunologiczne zachodzące w jelicie rośnie. Kilka grup badawczych opublikowało protokoły, które dzielą kilka podobnych procesów izolowania komórek odpornościowych z przedziałów jelita cienkiego myszy 3,4,5,6,7. Istnieje jednak między nimi kilka różnic technicznych w zależności od tego, na czym skupia się poszczególne protokoły. Na przykład, koncentrując się na izolowaniu komórek odpornościowych od LP, jeden z protokołów bada wpływ różnych trawień enzymatycznych na żywotność komórek, ekspresję markerów powierzchniowych komórek i skład izolowanych komórek odpornościowych5. Inny protokół podkreśla szybką i powtarzalną metodę izolacji limfocytów bez wirowania gęstości6. Wreszcie, istnieją również specjalne protokoły w celu izolowania fagocytów jednojądrzastych z różnych warstw tkanki jelita cienkiego7. W tym miejscu przedstawiono wysoce powtarzalny protokół, który umożliwia sekwencyjną izolację populacji limfocytów z przedziału MLN, PP, LP i IEL jelita cienkiego.

Skupiamy się na izolowaniu wysoce oczyszczonych populacji z przedziałów LP i IEL, które są w dużej mierze wolne od zanieczyszczeń z innych przedziałów jelitowych. Ten szeroko stosowany protokół zapewnia wysoką wydajność maksymalnie czystych i żywotnych limfocytów w akceptowalnych ograniczeniach czasowych4,8,9,10,11,12. Protokół ten zapewnia również izolację limfocytów z przedziału LP i IEL przy minimalnym zanieczyszczeniu międzyprzedziałowym, co daje możliwość badania limfocytów w tych odrębnych przedziałach. Wyizolowane limfocyty mogą być poddawane dalszym manipulacjom, takim jak analiza cytometrii przepływowej lub analiza funkcjonalna. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do izolacji limfocytów z jelita cienkiego i okrężnicy myszy podczas infekcji bakteryjnych, takich jak Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium i Yersinia pseudotuberculosis oraz stanów zapalnych, takich jak zapalenie jelita grubego wywołane przez chemikalia i patogeny. Protokół ten może być również stosowany do izolowania wrodzonych komórek odpornościowych, takich jak komórki dendrytyczne, makrofagi, neutrofile i monocyty z jelita cienkiego i okrężnicy myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stony Brook.

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie zgody zostały udzielone przed wykonaniem procedur.

1. Przygotowanie roztworu

  1. HGPG (HEPES, L-glutamina, penicylina/streptomycyna i gentamycyna), 100×
    1. Wymieszaj 59,6 g HEPES (500 mM wersja ostateczna), 14,6 g L-glutaminy (200 mM wersja ostateczna), 1×10 6 U penicyliny (2 000 U/ml wersja ostateczna), 1 g streptomycyny (2 mg/ml wersja ostateczna) i 2,5 mg gentamycyny (5 μg/ml wersja ostateczna). Dodaj RPMI 1640 do 500 ml. Dostosuj pH do 7,5 za pomocą NaOH (przed dostosowaniem bufor jest żółto-pomarańczowy z pH około 6,0). Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,45 μm. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku lub w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  2. HEPES-bufor wodorowęglanowy, 10x
    1. Wymieszaj 23,8 g HEPES (100 mM final), 21 g NaHCO3 (250 mM final) i dodaj wodę do 1,000 ml. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą HCl. Filtr sterylizuj za pomocą filtra 0,45 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej. pH zmienia się w czasie. Okresowo dostosowuj pH.
  3. Pożywka do zbioru (~ 1 butelka/2 myszy)
    1. Do 500 ml RPMI 1640 dodaj 25 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (5% końcowej) i 5 ml 100× HGPG. Przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.
  4. Roztwór ditioerytrytolu (DTE) (40 ml/jelito cienkie)
    1. Wymieszaj 50 ml 10× Hanksa zbilansowanego roztworu soli, wolnego od Ca2+ i Mg2+, 50 ml 10× buforu wodorowęglanowego HEPES i 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (10% finału). Dodać 350 mlH2Oi 15,4 mg ditioerytrytolu/100 ml (1 mM końcowy). Przygotuj to na świeżo przed użyciem.
  5. Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (50 ml/jelito cienkie)
    1. Wymieszaj 50 ml zbilansowanego roztworu soli 10× Hanksa, wolnego od Ca2+ i Mg2+ z 5 ml 100× HGPG. Dodać 445 ml H2O. Dodać 260 μl 0,5 M EDTA/100 ml (1,3 mM final). Przygotuj to na świeżo przed użyciem.
  6. Roztwór kolagenazy (30 ml/LP)
    1. Do 500 ml RPMI dodaj 50 ml FBS (10% FBS final), 5 ml 100× HPGP, 1 ml 0,5 M MgCl2 (1 mM final) i 1 ml 0,5 M CaCl2 (1 mM final). Dodać kolagenazę typu I (100 U/ml final). Przygotuj to na świeżo przed użyciem.
  7. Rozwiązania gradientu gęstości (DG)
    1. Przygotować 1× roztwór podstawowy DG, mieszając 90 ml roztworu podstawowego DG (patrz tabela materiałów) z 10 ml 10× PBS. Przechowywać w sterylnej temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować 44% roztwór DG (8 ml/IEL, 8 mL/LP), mieszając 44 ml roztworu podstawowego 1×DG i 56 ml RPMI 1640. Przygotuj to na świeżo przed użyciem.
    3. Przygotować 67% roztwór DG (5 ml/IEL, 5 mL/LP), mieszając 67 ml 1× roztworu podstawowego DG i 33 ml RPMI 1640. Przygotuj to na świeżo przed użyciem.

2. Izolacja węzłów chłonnych krezki, jelit i plam Peyera

  1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą narkozy dwutlenkiem węgla i wtórnego zwichnięcia szyjki macicy. Połóż mysz na plecach i spryskaj ją 70% etanolem. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej i otwórz skórę i ścianę brzucha, aby odsłonić jamę otrzewnej.
  2. Zlokalizuj kątnicę i użyj kleszczy, aby delikatnie pociągnąć kątnicę w dół. Użyj kleszczy, aby ostrożnie przesunąć jelito cienkie w prawo, odsłaniając cały łańcuch MLN, który jest wyrównany z okrężnicą.
    UWAGA: Mapa łańcucha węzłów chłonnych krezki i drenażu limfatycznego jelit była wcześniej przedstawiona13.
  3. Zidentyfikuj dolny węzeł w łańcuchu, znajdujący się najbliżej jelita ślepego. Użyj jednego zestawu kleszczy, aby chwycić krezkę/tłuszcz wokół niego i delikatnie usuń łańcuch MLN od dołu do góry, wycierając tłuszcz z okolic węzła chłonnego innym zestawem kleszczy.
  4. Połóż łańcuch MLN na ręczniku papierowym zwilżonym podłożem żniwnym. Usuń krezkę/tłuszcz, zwijając łańcuch na papierowej wieży i ściągając tłuszcz za pomocą dwóch zestawów kleszczy. Umieść MLN w zimnym podłożu do zbioru w celu późniejszego etapu izolacji.
    UWAGA: (i) Bezpośrednia obsługa węzłów jest odradzana. Zamiast tego chwyć krezkę/tłuszcz wokół nich. (ii) Bardzo ważne jest usunięcie jak największej ilości krezki/tłuszczu, aby poprawić żywotność komórek.
  5. Przetnij jelito cienkie poniżej zwieracza odźwiernika i powyżej jelita ślepego za pomocą nożyczek. Powoli wyciągnij jelito od jelita krętego do dwunastnicy za pomocą jednego zestawu kleszczy, jednocześnie usuwając przyczepioną krezkę/tłuszcz za pomocą innego zestawu kleszczy.
  6. Umieść jelito na ręczniku papierowym zwilżonym pożywką do zbioru i zetrzyj pozostałą krezkę/tłuszcz za pomocą dwóch zestawów kleszczy.
    UWAGA: (i) Upewnij się, że usunąłeś jak najwięcej krezki/tłuszczu, aby uzyskać optymalną wydajność i żywotność komórek. (ii) Utrzymuj jelito w stanie wilgotnym przez cały ten i następne etapy, okresowo stosując pożywkę do zbiorów.
  7. Zbierz plastry Peyera, usuwając je z jelita zakrzywionymi nożyczkami. W razie potrzeby użyj lunety sekcyjnej lub szkła powiększającego (początkujący); większość plastrów Peyera powinna być widoczna dla wprawnego oka. Zbierz 5-11 (typowych) plastrów Peyera z jelita cienkiego. Umieść plastry Peyera w zimnym podłożu do zbiorów, aby później wykonać etapy izolacji.
    UWAGA: Łaty Peyera są małe, głównie okrągłe wybrzuszenia w zewnętrznej ścianie jelita naprzeciwko linii przyczepu krezki.
  8. Użyj płaskiej strony kleszczy i delikatnie przesuwaj się od dwunastnicy w kierunku jelita krętego, aby usunąć zawartość kału i śluz. Powtórz raz, aby usunąć większość śluzu.
    UWAGA: Niepełne usunięcie śluzu może zmniejszyć żywotność i wydajność komórek. Niemniej jednak należy pamiętać, aby delikatnie przesunąć jelito, aby uniknąć usunięcia kosmków lub uszkodzenia błony podstawnej.
  9. Użyj cienkich nożyczek z końcem w jednym punkcie, włóż koniec do jelita i rozetnij jelito wzdłuż od dwunastnicy do jelita krętego. Otwarte jelito pokroić bocznie na ~2-centymetrowe kawałki. Umieść kawałki jelita w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 25 ml zimnego podłoża do zbioru w celu późniejszego etapu izolacji.
    UWAGA: Utrzymywanie nożyczek zwilżonych podłożem pomoże im bez wysiłku przesuwać się po jelicie.

3. Izolacja limfocytów od miejsc indukcyjnych

  1. Wyizoluj limfocyty z MLN, delikatnie dysocjując przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml. Umyj sitko komórkowe 5 ml zimnego podłoża do zbiorów.
  2. Komórki MLN-granulek przez odwirowanie w stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnej pożywki do zbioru. Policz żywe komórki, używając wykluczenia błękitu trypanowego.
    UWAGA: Bufor do lizy czerwonych krwinek może być używany do usuwania czerwonych krwinek, jeśli podczas usuwania wystąpiło krwawienie.
  3. Wyizolować limfocyty z plastrów Peyera, inkubując plastry Peyera w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanego roztworu kolagenazy w temperaturze 37 °C i 220 obr./min przez 30 min.
  4. Wirować przez 15 s przy maksymalnym ustawieniu i przefiltrować strawioną tkankę i supernatant do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek o średnicy 70 μm. Delikatnie oddzielić pozostałe kawałki tkanki za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml i umyć sitko do komórek 5 ml zimnej pożywki do pożywki.
  5. Granulki Peyera rozdrabniać przez odwirowanie w stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnej pożywki do zbioru. Policz żywe komórki, używając wykluczenia błękitu trypanowego.
    UWAGA: Izolacja plastrów Peyera może zawierać pewne zanieczyszczające limfocyty blaszki właściwej i limfocyty śródnabłonkowe.

4. Izolacja śródnabłonkowych limfocytów z jelita cienkiego

  1. Umyj kawałki jelita cienkiego trzykrotnie 25 ml zimnej pożywki do zbiorów, odwracając probówkę 10 razy, pozwalając kawałkom jelita osiąść i wylewając supernatant.
    UWAGA: Kawałki tkanki powinny łatwo osiadać na dnie probówki. Jeśli tak się nie stanie, oznacza to, że zbyt dużo krezki/tłuszczu pozostaje przyczepione lub są one związane z pęcherzykiem powietrza.
  2. Dodać 20 ml wstępnie podgrzanego roztworu DTE do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej kawałki jelita i przenieść do 50 ml silikonowanej kolby Erlenmeyera zawierającej mieszadło. Mieszać w temperaturze 37 °C i 220 obr./min na mieszadle magnetycznym przez 20 minut. Użyj dużego magnesu na zewnątrz kolby, aby przytrzymać mieszadło i przenieś tkankę i roztwór z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  3. Wiruj probówkę na maksymalnym ustawieniu przez 10 s. Przenieś supernatant do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek o średnicy 70 μm, uważając, aby utrzymać kawałki tkanki w oryginalnej probówce. Nie wyrzucać supernatantu; Supernatant zawiera limfocyty śródnabłonkowe. Komórki osadu należy rozdmuchiwać przez odwirowanie w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml zimnej pożywki do zbioru i przechowywać na lodzie.
  4. Dodać 20 ml wstępnie podgrzanego roztworu DTE do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej fragmenty jelita i przenieść z powrotem do 50 ml silikonowanej kolby Erlenmeyera zawierającej mieszadło. Mieszać w temperaturze 37 °C i 220 obr./min na mieszadle magnetycznym przez 20 minut. Użyj dużego magnesu na zewnątrz kolby, aby przytrzymać mieszadło i przenieś tkankę i roztwór z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: DTE jest środkiem redukującym, który wzbogaca limfocyty śródnabłonkowe.
  5. Wirować probówkę na maksymalnym ustawieniu przez 10 s. Przenieść supernatant przez sitko do komórek o średnicy 70 μm do poprzedniej probówki zawierającej komórki z supernatantu z pierwszego zabiegu DTE (od kroku 4.3).
    UWAGA: Pozostałe fragmenty jelita służą do izolowania limfocytów z blaszki właściwej. Kontrola jakości: Kawałek tkanki można usunąć i sprawdzić histologicznie, aby upewnić się, że komórki nabłonkowe są obecne, a błona podstawna jest nienaruszona.
  6. Osad komórkowy należy zawiesić przez odwirowanie supernatantu o stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 8 ml 44% roztworu DG w temperaturze pokojowej (RT).
  7. Przenieś 8 ml 44% roztworu/zawiesiny komórek DG do 14-mililitrowej probówki z polipropylenu o okrągłym dnie 17 mm ø x 100 mm. Podkład z 5 ml roztworu RT 67% DG. Wirować przy 1600 × g przez 20 min przy wilgotności względnej bez użycia hamulca.
    UWAGA: Probówki mogą być wstępnie potraktowane surowicą bydlęcą, aby zapobiec przywieraniu komórek do ścianek probówki.
  8. Należy zauważyć, że żywe komórki tworzą pasmo (płaszcz kożuchowy) na granicy faz od 44% do 67%, martwe komórki i niektóre komórki nabłonkowe znajdują się w błonie śluzowej na szczycie gradientu, a czerwone krwinki znajdują się w granulce. Usuń górną warstwę gradientu z dokładnością do ~2 cm od granicy faz przez zasysanie próżniowe. Użyj pipety Pasteura, aby zebrać kożuchową powłokę na granicy faz i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml zimnej pożywki do zbioru.
  9. Komórki osadu należy odwirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego podłoża do zbioru. Policz żywe komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego.

5. Izolacja limfocytów Blaszki Właściwej z Jelita Cienkiego

  1. Usunąć komórki nabłonkowe z kawałków tkanki jelitowej, dodając 25 ml podgrzanego roztworu EDTA do kolby zawierającej pozostałe fragmenty jelita. Mieszać kolbę w temperaturze 37 °C i prędkości 220 obr./min na mieszadle magnetycznym przez 30 minut. Użyj dużego magnesu na zewnątrz kolby, aby przytrzymać mieszadło i ostrożnie wyrzuć supernatant, pozostawiając kawałki jelita w kolbie.
    UWAGA: (i) EDTA jest chelatatorem wapnia, który celuje w połączenia zależne od wapnia i sprzyja odwarstwianiu komórek nabłonka jelitowego. (ii) Supernatant powinien być mętny i może być użyty do wyizolowania IEC, jeżeli pożądane jest jego zebranie.
  2. Powtórz krok 5.1.
    UWAGA: Supernatant powinien być mniej mętny po tej inkubacji. Kontrola jakości: Kawałek tkanki można usunąć i sprawdzić histologicznie, aby upewnić się, że komórki nabłonka jelitowego zostały usunięte, a błona podstawna jest nienaruszona. Próbkę z supernatantu można również ocenić za pomocą cytometrii przepływowej, aby potwierdzić, że leukocyty (komórki CD45+) są nieobecne.
  3. Dodać 50 ml pożywki do zbioru RT do kolby. Krótko wymieszaj za pomocą magnesu. Pozwól, aby kawałki jelita osiadły i ostrożnie wyrzuć supernatant.
    UWAGA: Ten krok zapewnia usunięcie EDTA przed trawieniem kolagenazy, ponieważ EDTA inaktywuje kolagenazę poprzez chelatację wapnia, który jest krytyczny dla funkcji kolagenazy.
  4. Dodać 30 ml podgrzanego roztworu kolagenazy do kolby i mieszać kawałki jelit w temperaturze 37 °C i 220 obr./min na mieszadle magnetycznym przez 45 minut.
  5. Przenieś strawioną tkankę i supernatant do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, filtrując przez sitko do komórek o średnicy 70 μm. Delikatnie oddzielić pozostałe kawałki tkanki za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 3 ml w celu przetarcia przez filtr. Umyj filtr 10 ml zimnego podłoża do zbioru.
  6. Komórki komórkowe zawiesić przez odwirowanie w stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 8 ml roztworu o temperaturze otoczenia 44% DG.
  7. Przenieś 8 ml 44% roztworu/zawiesiny komórek DG do 14-mililitrowej probówki z polipropylenu o okrągłym dnie 17 mm ø x 100 mm. Podkład z 5 ml 67% roztworu DG o temperaturze otoczenia. Odwirować gradienty w temperaturze pokojowej i 1600 × g przez 20 minut bez hamowania.
  8. Usuń warstwę tłuszczu na wierzchu przez aspirację próżniową. Użyj pipety Pasteura, aby zebrać kożuszek na granicy faz i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml pożywki do zbioru na zimno.
  9. Komórki osadu należy odwirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego podłoża do zbioru. Policz żywe komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono schematyczną reprezentację protokołu (Rysunek 1). Limfocyty w błonie śluzowej jelit, miejscach indukcyjnych i efektorowych są wyraźnie zorganizowane. Łaty Peyera (PP) i krezkowe węzły chłonne (MLN) zawierają limfocyty w dobrze zorganizowanych obszarach komórek T i pęcherzykach komórek B, podczas gdy nabłonek jelitowy zawiera limfocyty, które są bardziej rozproszone. Blaszka właściwa (LP) zawiera zarówno rozproszone limfocyty, jak i limfocyty zaw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych (MLN i PP) i efektorowych (LP i IEL) błony śluzowej jelit. Protokół został opracowany w celu zrównoważenia nakładów (czasu) i wyników (żywotności i wydajności) w celu maksymalizacji produktywności i wyników. Protokół zapewnia również minimalne zanieczyszczenie międzykompartmentowe między przedziałami LP i IEL.

Opublikowano kilka protokołów izolacji komórek odpornościowych z jelita cienkiego myszy

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.S.S. jest wspierany przez grant NIH (R01 AI076457) i fundusze dostarczone przez Stony Brook University. Z.Q. jest wspierany przez grant NIH (K12 GM102778).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HEPESFisher ScientificBP310-500
L-glutamina Sigma-aldrichG3126-100G
Penicylina-StreptomycynaLife Technologies15140-122
GentamycynaLife Technologies15710-072
Wodorotlenek soduFisher ScientificS318-500
RPMI 1640Life Technologies21870-076
Wodorowęglan soduFisher ScientificS233-500
Płodowa surowica bydlęcaLife Technologies26140-079
10x Zbilansowany roztwór soli HanksaSigma-aldrichH4641-500ML
1,4-DithioerythritolSigma-aldrichD9680-5G
0,5M EDTA, pH 8,0Life Technologies15575-020
Sześciowodny chlorek kalsiumSigma-aldrich21108-500G
Sześciowodny chlorek magnezuSigma-aldrichM2670-100G
Kolagenaza, typ ILife Technologies17100-017
DG gradientowy roztwór podstawowy (Percoll) GE Healthcare17-0891-01
Bufor do lizy czerwonych krwinekBiolegend420301
70-&mikro; Filtr siatkowy M Corning352350
14 ml Polipropylenowa rurka okrągłodennaKolba Corning352059
Erlenmeyer Kimble26500R-50mL
Mieszadło magnetyczneThermo Fisher50094596
MieszadłoFisher Scientific14-512-148

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja limfocyt wjelito cienkiek pki Peyeraw z y ch onne krezkowelamina proprialimfocyty wewn trznab onkowesiter do kom rekcentryfugacja w gradiencie g sto cicytometria przep ywowapod o e do pobierania tkanek

Powiązane artykuły