Method Article

Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny

DOI:

10.3791/57293

⸱

May 7th, 2018

 ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia i kwalifikacji każdego gatunku sfingomieliny za pomocą monitorowania wielu reakcji i trybu MS/MS/MS, odpowiednio.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę jakościowej i ilościowej analizy sfingomieliny (SM) za pomocą chromatografii cieczowej, elektrorozpylania, jonizacji, tandemowej spektrometrii mas (LC-ESI-MS/MS). SM jest powszechnym sfingolipidem składającym się z fosforylcholiny i ceramidu jako składnika hydrofilowego i hydrofobowego, odpowiednio. Wiele gatunków SM jest obecnych w komórkach ssaków ze względu na różnorodność zasady długiego łańcucha sfingoidu (LCB) i ugrupowanie N-acylowe w ceramidzie. W niniejszym raporcie przedstawiono metodę szacowania liczby wiązań węglowych i podwójnych w LCB i ugrupowaniu N-acylowym na podstawie odpowiadających im jonów produktowych w eksperymentach MS/MS/MS (MS 3). Ponadto przedstawiono metodę analizy ilościowej SM z wykorzystaniem dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków SM, co ułatwia określenie zakresu stosowanego w oznaczaniu ilościowym SM. Niniejsza metoda będzie przydatna w charakterystyce różnych gatunków SM w próbkach biologicznych i produktach przemysłowych, takich jak kosmetyki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sfingomielina (SM) jest powszechnym sfingolipidem w komórkach ssaków. SM jest syntetyzowany wewnątrzkomórkowo1 i występuje jako prekursor innych sfingolipidów, takich jak sfingozyno-1-fosforan i ceramid, które odgrywają kluczową rolę odpowiednio w transporcie komórek odpornościowych i homeostazie bariery skórnej2,3. Dlatego dokładna analiza metabolizmu SM jest ważna dla wyjaśnienia fizjologicznej i patologicznej roli sfingolipidów.

SM składa się z ceramidu i fosforylcholiny, która jest połączona z grupą 1-hydroksy ceramidu, która z kolei składa się z sfingozy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed użyciem zapoznaj się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS). Nosić rękawice, aby zminimalizować zanieczyszczenie próbki SM pochodzącym ze skóry. Niniejszy protokół został zastosowany do komórek HeLa wyhodowanych w minimalnej niezbędnej pożywce Eagle'a, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 1000 U/L penicyliny i 100 mg / L streptomycyny.

1. Przygotowanie próbek lipidów

UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie naczynia szklane, w tym probówki z nakrętkami wyłożonymi teflonem, były wolne od detergentów.

  1. Ekstrakcja całkowitej....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemicznie zsyntetyzowane d18:1/24:0 SM (Rysunek 1A) i d18:1/24:0 SM w próbkach lipidów wyekstrahowanych z komórek HeLa (Rysunek 1B) zostały przeanalizowane przez LC-ESI-MS3 z wykorzystaniem [M+HCOO]- i [M-CH3]- odpowiednio jako pierwszy i drugi jon prekursorowy. Należy zauważyć, że intensywność widma demetylowanej sfingozylofosforylcholiny (SPC) (m/z 449) jest wi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej metodzie jakościowej otrzymano jony pochodne MS3 SPC i ugrupowania N-acylowego. Bardzo ważne jest prawidłowe przypisanie zarówno SPC, jak i ugrupowania N-acylowego. W tym celu należy zauważyć, że inne cząsteczki zawierające fosforylcholinę mogą być również wykrywane jako jony porodowe MS3. Diacylofosfatydylocholina (PC) i plazmalogen-PC są obficie obecne w komórkach ssaków, a ich hydrofobowość jest podobna do SM. Dlatego diacyl-PC i plazmalogen-PC z izotopem (zwykle

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant badawczy z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii (KAKENHI) dla K.H. (#15K01691), Y.F. (#15K08625), K.Y. (#26461532), oraz grant na badania nad Projektem Chorób Nieuleczalnych z Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej (K.Y. #201510032A). Dziękujemy Grupie Edanz (www.edanzediting.com/ac) za redakcję szkicu tego manuskryptu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSThermoFisher10010023
100 mm naczynie do hodowli tkankowychIWAKI3020-100
Skrobak do komórekIWAKI9000-220
Silikonowana probówka 2,0 mlFisher Scientific02-681-321
ProbówkaIWAKITST SCR 16-100
Zakrętka wyłożona teflonemIWAKI9998CAP415-15
Jednorazowa szklana rurkaIWAKI9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 µ m 1,5 mm ID x 100 mmShiseido92223Nabój ochronny jest wkładany do uchwytu naboju i połączony z kolumną C18
CAPCELL C18 MGII S-3 2,0 mm x 10 mm WKŁAD OCHRONNYShiseido12197
Uchwyt na kartridżeShiseido12415
AcetonitrylWako018-19853
2-Propanol (Alkohol Izopropylowy)Wako161-09163
MetanolWako134-14523
Kwas mrówkowyWako066-00466
28% Woda amoniakcyjnaWako016-03146
Sonikator (typ kąpielowy)SHARPUT-206H
Mieszalnik wirowy do szklanej probówkiTAITECMix-EVR
1,4 ml szklana fiolkaTomsic500-1982Próbki są przechowywane w szklanej fiolce o pojemności 1,4 ml zamkniętej nakrętką i przegrodą 8 mm w temperaturze -20&g; C
Przegroda 8 mmTomsic200-3322Podczas analizy próbek nakrętki są zastępowane nakrętkami z rozciętą przegrodą
Zakrętka do szklanej fiolki 1,4 mmTomsic500-2762
Zakrętka z przegrodą szczelinowąShimadzu GLCGLCTV-803
PVDF 0,22 µ m filtrMilliporeSLGVR04NL
Potrójna kwadrupolowa i kwadrupolowa liniowa spektrometria mas pułapek jonowychSCIEXQTRAP4500
Oprogramowanie do akwizycji danych i analizy widm jonów produktuSCIEXAnalyst Oprogramowanie
do integracji danych w analizie ilościowejSCIEXMultiQuant
HPLC systemShimadzuNexera
Szklana butelkaSansyo85-0002
d18:1/24:0 sfingomielinaAvanti Polar Lipids860592P
SfingozylofosforylcholinaMerck567735
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher 
L-glutaminaThermoFisher 
Penicylina i streptomycynaSigmaP4333
Orzeł" s minimum niezbędne mediumSigmaM4655
2614007925030081

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
  2. Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
  3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sphingomyelin AnalysisLC MS MS MethodStable Isotope LabelingLipid ExtractionMobile Phase PreparationTriple Quadrupole MSProduct Ion SpectraStandard Curve ConstructionHeLa Cell SamplesCosmetic Lipid Characterization

Related Articles