Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Replikacja uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów insercji transpozonów Pseudomonas aeruginosa szczepu PA14

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57298

⸱

4 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zakażenie Pseudomonas aeruginosa powoduje znaczną zachorowalność u wrażliwych gospodarzy. Nieredundantna biblioteka mutantów insercji transpozonów szczepu PA14 P. aeruginosa, oznaczona jako PA14NR Set, ułatwia analizę funkcjonalności genów w wielu procesach. Przedstawiono tutaj protokół do generowania wysokiej jakości kopii biblioteki mutantów PA14NR Set.

Streszczenie

Pseudomonas aeruginosa to fenotypowo i genotypowo zróżnicowana i zdolna do adaptacji bakteria Gram-ujemna, wszechobecna w środowisku ludzkim. P. aeruginosa jest zdolny do tworzenia biofilmów, rozwijania oporności na antybiotyki, wytwarzania czynników wirulencji i szybkiej ewolucji w przebiegu przewlekłej infekcji. Tak więc P. aeruginosa może powodować zarówno ostre, jak i przewlekłe, trudne do leczenia infekcje, powodując znaczną zachorowalność w niektórych populacjach pacjentów. Szczep PA14 P. aeruginosa jest ludzkim izolatem klinicznym o konserwatywnej strukturze genomu, który infekuje różnych gospodarzy ssaków i bezkręgowców, co czyni PA14 atrakcyjnym szczepem do badania tego patogenu. W 2006 roku stworzono nieredundantną bibliotekę mutantów do insercji transpozonów, zawierającą 5459 mutantów odpowiadających 4596 przewidywanym genom PA14. Od tego czasu dystrybucja biblioteki PA14 pozwoliła społeczności badawczej lepiej zrozumieć funkcję poszczególnych genów i złożonych szlaków P. aeruginosa. Utrzymanie integralności biblioteki poprzez proces replikacji wymaga odpowiedniej obsługi i precyzyjnych technik. W tym celu w niniejszym manuskrypcie przedstawiono protokoły, które szczegółowo opisują etapy związane z replikacją biblioteki, kontrolą jakości biblioteki i prawidłowym przechowywaniem poszczególnych mutantów.

Wprowadzenie

Pseudomonas aeruginosa to fenotypowo i genotypowo zróżnicowana i zdolna do adaptacji bakteria Gram-ujemna, obecna w glebie, wodzie i większości środowisk ludzkich, a także mikroflory skóry. W porównaniu z wieloma gatunkami bakterii, P. aeruginosa ma stosunkowo duży genom 5,5-7 Mbp przy wysokiej zawartości G+C (65-67%). Co więcej, znaczna część jego genów jest zaangażowana w zdolności adaptacyjne metaboliczne i jest częścią sieci regulacyjnych, co pozwala na dużą elastyczność w odpowiedzi na stres środowiskowy1. P. aeruginosa wykazuje ekspresję wielu czynników wirulencji, wykazuje skłonność do tworzenia biofilmów, posiada zdolność koordynowania odpowiedzi poprzez wiele ścieżek quorum sensing i wykazuje znaczącą zdolność do rozwijania oporności i tolerancji na antybiotyki2,3,4,5,6,7,8. Cechy te stanowią poważne wyzwanie w leczeniu zakażeń wywołanych przez P. aeruginosa.

Przewlekłe infekcje P. aeruginosa mogą występować w wielu stanach chorobowych. Mukowiscydoza (CF), choroba genetyczna spowodowana mutacją genu CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), powoduje zainfekowane wydzieliny w drogach oddechowych, postępujące rozstrzenie oskrzeli i ostatecznie śmierć z powodu niewydolności oddechowej9. W wieku dorosłym większość pacjentów z mukowiscydozą jest przewlekle zakażona P. aeruginosa, który odgrywa kluczową rolę w zachorowalności i śmiertelności związanej z tą chorobą10. Dodatkowo, pacjenci z ciężkimi oparzeniami 11, tracheostomia12, wymiany stawów13, lub cewniki na stałe14 są narażeni na zakażenie P. aeruginosa związane ze zdolnością bakterii do tworzenia biofilmów i ucieczki przed reakcjami zapalnymi gospodarza15. Co więcej, kolonizacja zachodzi bez konkurencji po wybraniu populacji opornej lub tolerancyjnej na wiele antybiotyków poprzez sekwencyjne leczenie przeciwdrobnoustrojowe o szerokim spektrum działania12,16,17,18. Lepsze zrozumienie patogenezy P. aeruginosa będzie miało znaczące implikacje dla wielu stanów chorobowych.

Kilka klinicznych izolatów P. aeruginosa, w tym szczepy PAO1, PA103, PA14 i PAK, zostało intensywnie przebadanych w celu zbadania różnych cech patogenezy P. aeruginosa. Szczep PA14 to izolat kliniczny, który należy do jednej z najczęstszych grup klonów na świecie19,20 i nie został intensywnie przebadany w laboratorium. PA14 jest wysoce zjadliwy w modelach infekcji kręgowców, z godnym uwagi profilem endotoksyn21, pili structure22, wyspy chorobotwórcze23, system wydzielania typu III (TTSS), cytotoksyczność w stosunku do komórek ssaków24 oraz profile w zakresie oporności i trwałości antybiotyków25. Co więcej, PA14 jest również wysoce zjadliwy w wielu systemach modelowych gospodarz-patogen, w tym w modelach infiltracji liści roślin26,27,Caenorhabditis elegans infection models28,29, modele owadów30,31, a także modele zapalenia płuc u myszy32,33 oraz modele oparzeń skóry34.

Biblioteki mutantów całego genomu to zbiory izogenicznych mutantów w nieistotnych genach, które stanowią bardzo potężne narzędzia do zrozumienia biologii organizmu, umożliwiając analizę funkcji genów w skali genomowej. Dwie biblioteki mutantów transpozonów o niemal nasyceniu, zbudowane w P. aeruginosa, są obecnie dostępne do dystrybucji. Miejsca wstawiania transpozonów zostały określone dla obu bibliotek. Te tak zwane biblioteki nieredundantne ułatwiają badania całego genomu szczepów bakteryjnych, znacznie skracając czas i koszty związane z badaniami przesiewowymi niescharakteryzowanych losowych mutantów transpozonów. Biblioteka mutantów transpozonów P. aeruginosa PAO1, skonstruowana w izolacie MPAO1 szczepu PAO1 przy użyciu transpozonów ISphoA/hah i ISlacZ/hah35, jest kuratorowana przez laboratorium Manoil na Uniwersytecie Waszyngtońskim. Biblioteka składa się ze zweryfikowanej pod kątem sekwencji kolekcji 9 437 mutantów transpozonów, która zapewnia szeroki zakres genomu i zawiera dwie mutanty dla większości genów36. Informacje na temat biblioteki mutantów transpozonów P. aeruginosa PAO1 są dostępne na publicznej, dostępnej w Internecie stronie internetowej laboratorium Manoil pod adresem http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. Biblioteka mutantów nieredundantnych transpozonów szczepu PA14 szczepu PA14 (zestaw PA14NR) skonstruowana w szczepie PA14 przy użyciu transpozonów MAR2xT7 i TnphoA37 jest obecnie dystrybuowana przez Oddział Pediatrii w Massachusetts General Hospital. Zestaw PA14NR składa się z kolekcji ponad 5 800 mutantów z pojedynczymi insercjami transpozonów w nieistotnych genach37. Szczegóły dotyczące budowy zestawu PA14NR są opisane na ogólnodostępnej, dostępnej w Internecie stronie internetowej http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, która zawiera również różne narzędzia wyszukiwania online ułatwiające korzystanie z zestawu PA14NR.

Oryginalny zestaw PA14NR składał się z 5 459 mutantów, wybranych z obszernej biblioteki około 34 000 losowych mutantów insercji transpozonów, które odpowiadają 4 596 przewidywanym genom PA14 reprezentującym 77% wszystkich przewidywanych genów PA1437. Od czasu budowy biblioteki w 2006 roku dodawano nowe mutanty, a obecnie zestaw PA14NR zawiera ponad 5800 mutantów38, które reprezentują około 4600 genów PA14. Większość mutantów transpozonów PA14 została wygenerowana w wildtype background37. Szczegółowe informacje na temat każdego członka biblioteki mutantów, w tym tło genetyczne, są dostępne poprzez przeszukiwanie internetowej bazy danych lub poprzez pobranie arkusza kalkulacyjnego Nonredundant Library, obie funkcje są dostępne na stronie internetowej PA14 (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi). Większość mutantów została stworzona przy użyciu transpozonu MAR2xT7 (MrT7), z małym zestawem stworzonym za pomocą transpozonu TnPhoA (phoA) class37. Każdy transpozon posiada kasetę oporności na antybiotyki, która pozwala na selekcję mutantów za pomocą gentamycyny (MrT7) lub kanamycyny (phoA). Zestaw mutantów PA14NR jest przechowywany w sześćdziesięciu trzech 96-dołkowych płytkach i zawiera dwie dodatkowe 96-dołkowe płytki kontrolne, które składają się z dzikich dołków inokulowanych i nieinokulowanych PA14 interkalowanych w ustalony wzór. Format 96-dołkowej płytki w połączeniu z narzędziami wyszukiwania online znacznie ułatwia niestandardowe opracowywanie testów przesiewowych, które pozwalają użytkownikom łatwo zidentyfikować geny związane ze zmutowanymi fenotypami. Wyszukiwarki internetowe ułatwiają również wyszukiwanie i selekcję dodatkowych istotnych mutantów wymaganych do dalszych badań.

Biblioteki mutantów transpozonów PA14 i PAO1 są bardzo ważnymi globalnymi zasobami dla społeczności naukowej i uzupełniają się nawzajem w walidacji funkcji nieznanych genów i szlaków tego bakteryjnego patogenu. Przypadkowo, od czasu skonstruowania bibliotek mutacji transpozonów PAO1 i PA14, analiza sekwencjonowania pełnego genomu DNA wielu izolatów P. aeruginosa wykazała, że PAO1 i PA14 należą do różnych głównych podkladów filogenezy P. aeruginosa7,39,40,41. Ponieważ kliniczne izolaty P. aeruginosa są rozmieszczone w całej filogenezie, fakt, że PAO1 i PA14 należą do różnych podgrup P. aeruginosa, zwiększa wartość dwóch bibliotek mutacji transpozonów dla badań porównawczych.

Publikacje opisujące budowę i badania przesiewowe bibliotek mutantów bakteryjnych, w tym biblioteki P. aeruginosa35,37,42, są łatwo dostępne w literaturze. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie są dostępne żadne opublikowane protokoły opisujące szczegółowe procedury i techniki stosowane do replikacji, konserwacji i walidacji bibliotek mutantów bakteryjnych.

Metodologia opisana w tej publikacji opisuje zestaw trzech protokołów, które ułatwiają korzystanie i utrzymanie zestawu PA14NR. Pierwszy protokół opisuje replikację biblioteki zgodnie z zaleceniami dla odbiorców zestawu PA14NR. Drugi protokół zawiera wytyczne dotyczące smugowania, hodowli i przechowywania poszczególnych mutantów zidentyfikowanych za pomocą zestawu PA14NR. Trzeci protokół opisuje techniki kontroli jakości, w tym amplifikację PCR fragmentów mutantów transpozonów, a następnie sekwencjonowanie w celu potwierdzenia tożsamości mutanta. Ten zestaw protokołów może być również dostosowany do replikacji i utrzymania innych bibliotek lub kolekcji mutantów bakteryjnych. Zdecydowanie zaleca się replikację bibliotek lub kolekcji zmutowanych bakterii w celu zachowania integralności "kopii wzorcowej" (otrzymanej oryginalnej kopii). Replikacja kilku kopii zestawu PA14NR do rutynowego użytku laboratoryjnego minimalizuje prawdopodobieństwo zanieczyszczenia kopii głównej przez odwiert

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

OSTROŻNIE: Podczas pracy należy stosować standardowe środki bezpieczeństwa dla poziomu BSL-2 P. aeruginosa, patogen ludzki. Osoby z niedoborem odporności lub z jakimikolwiek schorzeniami zwiększającymi podatność na zakażenia bakteryjne powinny zachować szczególną ostrożność podczas pracy z P. aeruginosa. Przed rozpoczęciem pracy z zestawem PA14 NR lub bibliotekami mutantów patogenów bakteryjnych należy skonsultować się z biurem ds. bezpieczeństwa biologicznego w swojej instytucji oraz uzyskać zgodę lekarza.

Schemat przygotowania hodowli mikrobowych; sterylizacja replikatora igłowego, wysiew na agar LB, inkubacja.
Rysunek 1: Przegląd protokołu I: replikacja zestawu PA14NR. Dzień 1: Przeszczepienie zamrożonych kultur mutantów z „kopii wzorcowej” zestawu PA14NR na podłoże agar LB i inkubacja mutantów przez noc w temperaturze 37 °CDzień 2: Przenieść wzrost mutantów z podłoża LB Agar do bloków z głębokimi dołkami zawierających płynną pożywkę LB, inkubować przez noc w 37 °C z wytrząsaniem przy 950 obr./min. Dzień 3: Wymieszać nocne hodowle w podłożu LB z glicerolem, a następnie przenieść do docelowych płytek 96-dołkowych w celu długotrwałego przechowywania. Płytki 96-dołkowe umieścić płasko w -80 °C zamrażarka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Schemat bezpieczeństwa w laboratorium: środki ochrony indywidualnej, strefa sterylna, stosowanie etanolu, przygotowywanie roztworów.
Rycina 2: Zalecana konfiguracja. Należy zachować sterylność i zapewnić płynny przebieg pracy poprzez stosowanie odpowiednich środków ostrożności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Protokół I: Replikacja zestawu PA14NR

UWAGA: Replikację biblioteki można przeprowadzić, dzieląc zestaw PA14NR na cztery podzbiory po szesnaście płytek każdy, które można przetwarzać w ciągu czterech kolejnych tygodni. Generowanie od 1 do 6 kopii odbywa się zgodnie z tygodniowym harmonogramem przedstawionym w Tabeli 1, natomiast generowanie więcej niż 6 kopii przebiega zgodnie z tygodniowym harmonogramem przedstawionym w Tabeli 2. Aby wygenerować 12 kopii zestawu PA14NR, należy zaszczepić ten sam podzbiór PA14NR do płynnej pożywki LB w Dniu 2 i ponownie w Dniu 3 (z tego samego zestawu płytek agarowych zreplikowanych w Dniu 1), a następnie przenieść nocne kultury mutantów na płytki kopii odpowiednio w Dniu 3 i Dniu 4.

Dzień 0Dzień 1Dzień 2Dzień 3
Dzień przygotowawczyWzrost mutantów zestawu PA14NR na podłożu agarowym LBWzrost mutantów zestawu PA14NR w płynnej pożywce LBPrzenoszenie kultur mutantów PA14NR Set na płytki docelowe

Tabela 1: Harmonogram powielania od 1 do 6 kopii zestawu PA14NR. Powielanie niewielkiej liczby kopii może odbywać się zgodnie z tygodniowym cyklem pracy.

Dzień 0Dzień 1Dzień 2Dzień 3Dzień 4
Dzień przygotowawczyWzrost mutantów zestawu PA14NR na agarze LBWzrost mutantów zestawu PA14NR w płynnej pożywce LBPrzeniesienie kultur mutantów z 3. dnia w celu wygenerowania pierwszego zestawu 6 kopii zestawu PA14NRPrzeniesienie 4-dniowych kultur mutantów w celu przygotowania drugiego zestawu 6 kopii zestawu PA14NR
Wzrost mutantów zestawu PA14NR w płynnym medium LB

Tabela 2: Harmonogram replikacji do 12 kopii zestawu PA14NR. Replikacja większej liczby kopii będzie wymagała warstwowego planowania w ramach tygodniowego cyklu pracy.

  1. Dzień 1: Wzrost kopii matki zestawu PA14NR na płytkach agar LB
    1. Podczas pracy z zestawem PA14NR należy używać rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i maseczki.
    2. Uporządkować blat i przetrzeć jego powierzchnię 70% etanolem.
    3. Przygotować podłoże agar LB43 i wysterylizować w autoklawie przez 25 min. Schłodzić podłoże do 5 °C w kąpieli wodnej i dodać albo 15 µg/mL gentamicinyny (dla mutantów z insercjami transpozonu MAR2xT7), albo 20 µg/mL kanamycyny (dla mutantów z insercjami TnphoA).
    4. Wylać roztopiony agar LB do płytek prostokątnych, używając około 60 mL podłoża na płytkę. Suszyć płytki w sterylnej komorze przez około 1 h przed użyciem. Upewnić się, że na powierzchni agaru nie ma kondensacji wody. W razie potrzeby przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.
    5. Stworzyć sterylne pole za pomocą palnika Bunsena na przetartym etanolem blacie i przygotować pojemniki z odpowiednimi roztworami do sterylizacji pinów replikatora (patrz krok 1.1.9). Do sterylizacji pinów replikatora używać otwartych pojemników plastikowych (o przybliżonych wymiarach 5,25"D x 4,25"S x 1,75"W). Pojemniki plastikowe należy wysterylizować w autoklawie przed użyciem.
      UWAGA: Ciepło płomienia palnika Bunsena tworzy prąd konwekcyjny, który ogrzewa przestrzeń nad płomieniem i unosi wszelkie cząstki z powietrza z dala od chłodniejszego powietrza poniżej, utrzymując obszar roboczy w stanie sterylnym.
    6. Wyjąć maksymalnie cztery płytki matki zestawu PA14NR z zamrażarki -80 °C (aby uniknąć niepotrzebnego rozmrażania) i umieścić je na suchej lodzie w 4 L pojemniku do lodu.
    7. Wyjąć z suchego lodu 96-dołkową płytkę matki przeznaczoną do replikacji i położyć ją na blacie, aby krótko odmarła; zajmie to tylko czas niezbędny do sterylizacji pinów replikatora (około 3-4 min) (patrz krok 1.1.8). Przed stemplowaniem zaznaczyć pozycję współrzędnej A1 na płytce agarowej. Wyrównać płytkę matki i płytkę agarową tak, aby współrzędna A1 obu płytek znajdowała się w lewym górnym rogu.
    8. Zsterylizować „piny” replikatora zgodnie z poniższymi krokami. Po każdym kroku lekko opukać replikator, aby usunąć nadmiar cieczy.
      1. Zanurzyć piny w 250 mL 0,3-0,5% podchlorynu sodu (10% wybielacza domowego) na 30 sekund. Zminimalizować kontakt z roztworem podchlorynu sodu, ponieważ może to prowadzić do uszkodzenia pinów. Zanurzyć piny w 250 mL sterylnej ddH2O lub sterylnej wodzie ultrapurej przez 10 sekund, następnie w 250 mL 70% etanolu przez 30 sekund, a następnie w 250 mL 95% etanolu przez 2 min.
      2. Zsterylizować piny replikatora w płomieniu, trzymając replikator prostopadle do płomienia palnika Bunsena, powoli zbliżając go do płomienia, aż etanol zapłonie, a następnie natychmiast odsuwając go od ognia. Płomień zgaśnie po wypaleniu całego etanolu. W razie potrzeby trzymać w pobliżu pokrywkę lub podobny pojemnik, aby zdusić płonący etanol.
        UWAGA: Zachować szczególną ostrożność podczas pracy z etanolem w pobliżu płomienia. NIE trzymać replikatora bezpośrednio nad płomieniem.
      3. Schłodzić piny, odciskając je na nieużywanej sterylnej prostokątnej płytce zawierającej podłoże agar LB przez 30 sekund.
    9. Przed odklejeniem aluminiowej folii z płytki matki zestawu PA14NR krótko ogrzać ją dłonią. Wykonać to podczas chłodzenia pinów replikatora. Ostrożnie zdjąć folię aluminiową, aby nie dotknęła ona ponownie płytki. Użyć pęsety do usunięcia wszelkich pozostałości folii aluminiowej.
    10. Wprowadzić piny replikatora do płytki matki, delikatnie dociskając i poruszając replikatorem we wszystkich czterech kierunkach, aby upewnić się, że piny mają kontakt z zamrożonymi kulturami bakterii w każdym z 96 dołków. Zwrócić szczególną uwagę na dołki znajdujące się na zewnętrznej krawędzi płytki, dociskając piny replikatora do zamrożonych kultur w dołkach położonych przy krawędzi.
    11. Delikatnie przyłożyć piny replikatora do powierzchni płytki agarowej. Poruszać replikatorem w lekkim ruchu okrężnym, aby utworzyć mini-kolonie o średnicy około 4-5 mm dla każdego szczepu mutantów. Unikać nakładania się mini-kolonii, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
    12. Zapieczętować płytkę matki zestawu PA14NR nową sterylną folią aluminiową. W żadnym momencie nie dotykać klejącej strony folii, aby uniknąć zanieczyszczenia. Używając wałka do płytek, upewnić się, że każdy dołek i krawędzie płytki są całkowicie szczelne. Zwrócić płytkę 96-dołkową na suchy lód.
    13. Powtórzyć procedurę dla każdej płytki matki.
    14. Po pracy z zestawem PA14NR przetrzeć wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
    15. Przenieść zreplikowane płytki agarowe do inkubatora 37 °C i inkubować przez noc.
  2. Dzień 2: Wzrost kopii matki zestawu PA14NR w płynnym bulionie LB
    1. Przygotować płynny bulion LB43 zawierający albo 15 µg/mL gentamicinyny (dla mutantów z insercjami transpozonu MAR2xT7), albo 20 µg/mL kanamycyny (dla mutantów z insercjami TnphoA).
    2. Uprzątnąć z komory z laminarnym przepływem powietrza zbędny sprzęt i włączyć wentylator komory na minimum 10 min przed rozpoczęciem pracy. Przetrzeć powierzchnie komory i wszystkie przedmioty umieszczone w niej 70% etanolem.
    3. Wypełnić 2 mL bloki z głębokimi dołkami 525 µL płynnego bulionu LB z odpowiednimi antybiotykami w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając 12-kanałowej elektronicznej pipety 50-120 µL. Następnie przenieść wypełnione podłożem bloki na przetarty etanolem blat. Używać końcówek wielokrotnie, dopóki zachowane są warunki sterylności.
    4. Podczas pracy z zestawem PA14NR należy używać rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i maseczki.
    5. Uporządkować blat i przetrzeć jego powierzchnię 70% etanolem.
    6. Przenieść na blat płytki agarowe z mutantami wyhodowanymi przez noc.
    7. Stworzyć sterylne pole za pomocą palnika Bunsena na przetartym etanolem blacie i przygotować pojemniki z odpowiednimi roztworami do sterylizacji pinów replikatora (patrz następny krok).
    8. Zsterylizować „piny” replikatora zgodnie z poniższymi krokami. Po każdym zanurzeniu lekko opukać replikator, aby usunąć nadmiar cieczy.
      1. Zanurzyć piny w 250 mL 0,3-0,5% podchlorynu sodu przez 30 sekund. Zminimalizować kontakt pinów replikatora z roztworem podchlorynu sodu, ponieważ może to prowadzić do uszkodzenia pinów. Następnie zanurzyć piny w 250 mL sterylnej ddH2O lub wodzie ultrapurej przez 10 sekund, potem w 250 mL 70% etanolu przez 30 sekund, a następnie w 250 mL 95% etanolu przez 2 min.
      2. Zsterylizować piny replikatora w płomieniu, a następnie schłodzić piny, odciskając je w nieużywanej prostokątnej płytce zawierającej podłoże agar LB przez 30 sekund.
        UWAGA: Zachować szczególną ostrożność podczas pracy z etanolem w pobliżu płomienia (patrz 1.1.8).
    9. Delikatnie przyłożyć piny replikatora do płytki agarowej z hodowlami mutantów i sprawdzić, czy piny mają kontakt ze wszystkimi 96 mutantami na płytce, a następnie zanurzyć piny w głębokich dołkach zawierających płynny bulion LB. Unikać dotykania ścianek dołków pinami.
    10. Zapieczętować blok z głębokimi dołkami sterylną, przepuszczalną membraną uszczelniającą. Użyć wałka do płytek, aby upewnić się, że każdy pojedynczy dołek jest prawidłowo szczelny.
    11. Powtórzyć procedurę dla każdej płytki agarowej.
    12. Po pracy z zestawem PA14NR przetrzeć wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
    13. Hodować zaszczepione kultury płynne przez 15-16 h w temperaturze 37°C przy 950 rpm, używając szybkowirówki, jeśli jest dostępna.
      UWAGA: Jeśli szybkowirówka nie jest dostępna, dopuszczalna jest inkubacja bloków z głębokimi dołkami w wytrząsarce przy 250-300 rpm. Istnieje jednak większa szansa na pojawienie się wariantów małokolonijnych (SCVs)25 w warunkach niskiego natlenienia. Dlatego przy niższych prędkościach wytrząsania zdecydowanie zaleca się utrzymanie czasu inkubacji poniżej 15-16 h. Niepożądana proliferacja SCV w dołkach z mutantami może zmienić ich fenotypy podczas wykorzystywania biblioteki do przesiewów genetycznych.
      Niektóre dołki w zestawie PA14NR zawierają mutanty wolno rosnące/nierastące, brakujące klony lub niezaszczepione podłoże. Lokalizacja tych dołków została odnotowana i znajduje się w pliku Supplemental PA14NR Set Wells Information dołączonym do tej publikacji.
  3. Dzień 3: Przenoszenie nocnych kultur zestawu PA14NR do płytek docelowych
    1. Uprzątnąć komorę z laminarnym przepływem powietrza i włączyć wentylator komory na minimum 10 min przed rozpoczęciem pracy. Przetrzeć powierzchnie komory i wszystkie przedmioty umieszczone w niej 70% etanolem.
    2. Wydrukować wodoodporne etykiety samoprzylepne (szablon znajduje się w pliku Supplemental PA14NR Set Labels). Wyjąć płytki 96-dołkowe z folii ochronnej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Odkleić etykietę i umieścić ją wzdłuż krawędzi płytki najbliżej dołków od A1 do H1 płytki docelowej. Lekko unieść pokrywkę płytki docelowej i nakleić etykietę na dolnej krawędzi, tak aby była widoczna, gdy płytka jest przykryta pokrywką.
    3. Przygotować 3,5 L 60% glicerolu (v/v) i wysterylizować w autoklawie przez 20 min.
    4. Podczas pracy z zestawem PA14NR należy używać rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i maseczki. Wyjąć bloki z głębokimi dołkami z szybkowirówki lub zwykłej wytrząsarki.
    5. Przenieść bloki z głębokimi dołkami do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza i ostrożnie usunąć przepuszczalną membranę uszczelniającą. Zastąpić ją folią aluminiową. Odwirować bloki z głębokimi dołkami z bardzo niską prędkością, aby zebrać kondensację (30 sekund przy 50-150 x g, a następnie szybkie hamowanie przy użyciu hamulca wirówki).
    6. Przenieść bloki z głębokimi dołkami z powrotem do sterylnej komory i za pomocą 12-kanałowej elektronicznej pipety 50-1200 µL oraz sterylnych końcówek z filtrem dodać 525 µL mieszaniny glicerolu i bulionu LB (równe części bulionu LB i 60% roztworu glicerolu) do każdego dołka. Wymieszać, delikatnie pipetując 30 µL w górę i w dół 3 razy elektroniczną pipetą. Przed wyrzuceniem końcówek dotknąć ścianki dołka, aby zapobiec kapaniu. Wyrzucić końcówki i kontynuować z następnym rzędem, aż cały blok zostanie wypełniony.
    7. Używając 12-kanałowej elektronicznej pipety powtarzalnej i końcówek z filtrem, aby zapobiec kontaminacji między dołkami podczas alikwotowania, pobrać 90 µL kultury mutanta i rozdzielić po 150 µL do każdej z 96-dołkowych płytek docelowych, aby stworzyć 6 kopii płytki biblioteki. Zapobiegać kapaniu poprzez dotykanie ścianek dołków końcówkami przed rozpoczęciem przenoszenia kultury do płytek docelowych. Jeśli pipeta powtarzalna nie jest dostępna, użyć pipety wielokanałowej do rozdzielenia 150 µL do każdej z sześciu 96-dołkowych płytek, stosując opisaną powyżej technikę zapobiegania kapaniu.
    8. Użyć sterylnych folii aluminiowych do przykrycia płytek i wałka do płytek, aby całkowicie uszczelnić krawędzie płytek i wszystkie dołki. Należy upewnić się, że folia aluminiowa nie zakrywa etykiety identyfikacyjnej. Nie wstrząsać płytkami, ponieważ kultura może rozbryzgać się na ściankach dołków lub na folii aluminiowej.
    9. Wyjąć zapieczętowane płytki z komory i umieścić je na płaskiej, równej powierzchni w zamrażarce -80 °C.
    10. Po pracy z biblioteką przetrzeć wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
    11. Przeprowadzić kontrole jakości po replikacji biblioteki oraz po wykorzystaniu biblioteki do przesiewów genetycznych (patrz Protokół III).

2. Protokół II: Przechowywanie i postępowanie z poszczególnymi mutantami z zestawu PA14NR

  1. Dzień 1: Posiew wybranego mutanta
    1. Zidentyfikuj położenie interesującego mutanta poprzez link do zestawu PA14NR http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS lub korzystając z pliku Nonredundant Library.xls pobranego z linku http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi). Zanotuj antybiotyk niezbędny do selekcji każdego konkretnego mutanta (gentamycyna lub kanamycyna).
    2. Przygotuj podłoże agarowe LB, wysterylizuj w autoklawie przez 20-25 min i schłodź do 5 °C w kąpieli wodnej. Dodaj 15 µg/mL gentamycyny dla mutantów zawierających insercje transpozonu MAR2xT7 oraz 200 µg/mL kanamycyny dla mutantów zawierających insercje transpozonu TnphoA. Wlej podłoże LB agar na płytki (odpowiednie są płytki okrągłe lub prostokątne). Susz płytki w sterylnej komorze przez około 30 min do 1 h przed użyciem.
    3. Wszystkie elementy plastikowe i materiały nisterylne wysterylizuj w autoklawie przed użyciem.
    4. Podczas pracy z zestawem PA14NR używaj rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i maseczki. Uporządkuj blat i przetrzyj powierzchnię 70% etanolem przed rozpoczęciem pracy z zestawem PA14NR.
    5. Stwórz strefę sterylną za pomocą palnika Bunsena.
    6. Wyjmij płytkę 96-dołkową z zestawu PA14NR z wybranym mutantem z zamrażarki -80 °C i umieść ją na suchym lodzie, przenieś pojemnik z suchym lodem na blat i na krótko połóż płytkę 96-dołkową na blacie, aby lekko odmarzła (około 1-2 min).
      UWAGA: Prowadź rejestr wszystkich użytych płytek 96-dołkowych z zestawu PA14NR w celu wyselekcjonowania poszczególnych mutantów, ponieważ częstsze otwieranie płytek bibliotecznych wiąże się z większym ryzykiem kontaminacji między dołkami.
    7. Rozgrzej aluminiową folię uszczelniającą dłonią przed jej odklejeniem, uważając, aby folia nie dotknęła ponownie płytki. Użyj pęsety do usunięcia wszelkich pozostałości folii aluminiowej.
    8. Zlokalizuj interesującego mutanta na płytce 96-dołkowej. Użyj sterylnego patyczka drewnianego lub sterylnego końcówki pipety, aby pobrać niewielką ilość zamrożonej kultury z poszczególnego dołka zawierającego wybrany mutant.
    9. Wykonaj posiew mrożonej kultury na płytce agarowej w celu uzyskania pojedynczych kolonii mutanta w następujący sposób: delikatnie roznieś bakterie po części płytki, tworząc pas 1; używając świeżego, sterylnego patyczka drewnianego lub końcówki pipety, przeciągnij przez pas 1 i roznieś bakterie po drugiej części płytki, tworząc pas 2. Używając trzeciego sterylnego patyczka drewnianego lub końcówki pipety, przeciągnij przez pas 2 i roznieś bakterie po ostatniej części płytki, tworząc pas 3.
    10. Zabezpiecz płytkę źródłową nową sterylną folią aluminiową. Pod żadnym pozorem nie dotykaj strony klejącej folii aluminiowej, aby uniknąć kontaminacji. Upewnij się, że każdy dołek i krawędzie płytki są całkowicie uszczelnione, używając wałka do płytek. Przenieś płytkę 96-dołkową z powrotem na suchy lód, a następnie do zamrażarki -80 °C.
    11. Inkubuj płytkę agarową w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc.
    12. Po pracy z biblioteką przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
  2. Dzień 2: Wzrost wybranego mutanta w płynnym podłożu LB
    1. Przygotuj płynne podłoże LB zawierające 15 µg/mL gentamycyny lub 20 µg/mL kanamycyny, zgodnie z rodzajem insercji transpozonu.
    2. Podczas pracy z P. aeruginosa używaj rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i maseczki.
    3. Uporządkuj blat i przetrzyj powierzchnię 70% etanolem. Stwórz strefę sterylną za pomocą palnika Bunsena.
    4. Przenieś 3 - 5 mL podłoża LB z odpowiednim antybiotykiem do sterylnej probówki z zakrętką.
    5. Używając sterylnego aplikatora lub sterylnej końcówki pipety, pobierz pojedynczą kolonię szczepu mutantowego i zaszczep ją do podłoża LB.
    6. Inkubuj płynne kultury LB w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką przy 25 - 250 rpm przez noc.
    7. Po pracy z P. aeruginosa przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
  3. Dzień 3: Przechowywanie wybranego mutanta w zamrażarce -80 °C
    1. Oznakuj kriotubkę nazwą mutanta, dodanym do podłoża LB antybiotykiem oraz datą przechowywania.
    2. Przygotuj 50 mL 50% glicerolu (v/v) i wysterylizuj w autoklawie.
    3. Podczas pracy z P. aeruginosa używaj rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i maseczki.
    4. Uporządkuj blat i/lub komorę laminarną i przetrzyj powierzchnię 70% etanolem.
    5. Wyjmij probówkę z kulturą mutanta z wytrząsarki.
    6. Przygotuj niewielki pojemnik z suchym lodem.
    7. Użyj komory z laminarnym przepływem powietrza lub stwórz sterylną strefę na przetartym etanolem blacie za pomocą palnika Bunsena.
    8. W warunkach sterylnych dodaj do oznakowanej kriotubki równe ilości kultury bakteryjnej i 50% glicerolu, a następnie delikatnie wymieszaj pipetą (objętość końcowa 1 - 2 mL/probówka, w zależności od rozmiaru użytych kriotubek). Umieść kriotubkę na suchym lodzie w celu szybkiego zamrożenia.
    9. Umieść kriotubkę w oznakowanym pudełku w zamrażarce -80 °C.
    10. Po pracy z P. aeruginosa przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.

3. Protokół III: Kontrola jakości zestawu PA14NR

  1. Wybierz losowy zestaw mutantów z nowo powielonych płytek, aby wykryć ewentualną kontaminację między studziami (zaleca się przetestowanie 30-40 mutantów).
    UWAGA: W przypadkach, gdy konieczne jest potwierdzenie tożsamości mutanta wykorzystywanego do charakterystyki konkretnego genu, zaleca się przeprowadzenie amplifikacji PCR przy użyciu starterów specyficznych dla genu, zaprojektowanych dla znanej sekwencji genu zawierającego insercję transpozonu. Mimo że jest to trudniejsze, korzyści z zastosowania dowolnych starterów PCR zamiast starterów specyficznych dla genu podczas amplifikacji fragmentów DNA z mutantów transpozonowych obejmują łatwość potwierdzania mutantów na dużą skalę oraz możliwość wykrycia potencjalnych zanieczyszczeń. W celach kontroli jakości nie jest konieczne uzyskiwanie wysokiej jakości danych z sekwencjonowania PCR dla wszystkich losowo wybranych mutantów, o ile przebadano wystarczającą liczbę mutantów, aby ocenić poziom błędów.
  2. Postępuj zgodnie z „Protokołem II”, aby wysiać i wyhodować szczepy mutantów.
  3. Autoklawuj wszystkie wyroby plastikowe i materiały niesterylne przed użyciem.
  4. Wyizoluj DNA genomowe preferowaną metodą. Do analizy opisanej w niniejszej pracy wykorzystano zestaw do izolacji DNA genomowego zgodnie z protokołami producenta. Można jednocześnie analizować wiele szczepów mutantów.
  5. Zmierz stężenie DNA genomowego za pomocą spektrofotometru mikrometricznego. Dostosuj stężenie DNA genomowego do około 10 ng/µL.
  6. Wykorzystaj DNA genomowe jako matrycę do przeprowadzenia „reakcji PCR1” zgodnie z opisem w kroku 1 tabeli 3, generując fragmenty PCR Arb1 (Rycina 3). Startery do tego kroku wymieniono w tabeli 4.
  7. Dodaj 0,5 µL 10-krotnego buforu do ładowania do 5 µL reakcji PCR1, nanieś na żel agarozowy 1,5-2% i prowadź elektroforezę przy napięciu 80-150 V.
    UWAGA: Nie oczekuje się konkretnej długości fragmentu ani określonego zakresu fragmentów; może wystąpić więcej niż jeden prążek, ponieważ dowolny starter może wiązać się w wielu miejscach.
  8. Wykorzystaj DNA z reakcji PCR1 jako matrycę do przeprowadzenia „reakcji PCR2” zgodnie z opisem w kroku 2 tabeli 3, generując fragmenty PCR Arb2 (Rycina 3). Startery do tego kroku wymieniono w tabeli 4.
  9. Dodaj 0,5 µL 10-krotnego buforu do ładowania do 5 µL reakcji PCR2, nanieś na żel agarozowy 1,5-2% i prowadź elektroforezę przy napięciu 80-150 V.
    UWAGA: Nie oczekuje się konkretnej długości fragmentu ani określonego zakresu fragmentów; może wystąpić więcej niż jeden prążek, ponieważ dowolny starter może wiązać się w wielu miejscach.
  10. Przekaż produkt reakcji PCR2 wraz z odpowiednim starterem specyficznym dla transpozonu do sekwencjonowania.
  11. Analizuj wyniki sekwencjonowania, przeprowadzając analizę BLAST w stosunku do pełnego genomu PA14, korzystając z łącza BLAST dostępnego na stronie biblioteki PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) lub przeprowadzając analizę BLAST bezpośrednio w stosunku do specyficznej sekwencji genu interesującego mutanta.
    UWAGA: Informacje o wybranych mutantach można znaleźć, przeszukując stronę zestawu PA14NR (szukaj pod adresem http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS lub pobierz plik Nonredundant Library.xls z łącza http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi).

Schemat zagnieźdżonej reakcji PCR dla insercji transpozonu, przedstawiający etapy i primery wraz z sekwencjonowaniem DNA.
Rycina 3: Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie mutantów z insercją transpozonu. Schematyczny widok etapów amplifikacji PCR i sekwencjonowania w celu weryfikacji tożsamości mutanta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przygotowanie reakcji PCR
Krok 1Krok 2
PCR1 reakcja:PCR2 reakcja:
23.25 µL woda (klasy biologii molekularnej)19.15 µL Woda (klasy biologii molekularnej)
3µL Bufor 10x do polimerazy Taq5 µL Bufor 10x do polimerazy Taq
0.5µL polimeraza Taq0.6 µL Polimeraza Taq
0.625 µL 20 µM Starter Arb1D (Tabela 4)0.625 µL 20 µM Starter Arb2A (Tabela 4)
0.625 µL 20 µM Starter specyficzny dla transpozonu (PMFLGM.GB 3a lub Tn5Ext) (tabela 4)0,625 ml 20 µM Starter specyficzny dla transposonu (PMFLGM.GB 2a lub Tn5Int2) (Tabela 4)
1 µL 10 mM dNTP1 µL 10 mM dNTP
1 µL DNA genomiczne, 10 ng5 µL PCR1 reakcja
30 µL Końcowa objętość reakcji30 µL Końcowa objętość reakcji
Parametry reakcji PCR
PCR1 Warunki termocyklera:PCR2 Warunki termocyklera:
95 °C – 2 min95 °C – 2 min
Powtórz 5 cykli:Powtórz 30 cykli:
95 °C – 30 s95 °C – 30 s
30 °C – 1 min54 °C – 30 s
72 °C – 1 min72 °C – 1,5 min
Powtórz 30 cykli:72 °C – 10 min
95 °C – 30 s4 °C – Przytrzymać
45 °C – 30 s
72 °C – 1 min
72 °C – 10 min
4°C – Przytrzymać

Tabela 3: Konfiguracja reakcji PCR i warunki termocyklera zastosowane w arbitralnej reakcji PCR. Reakcje arbitralnej PCR są przeprowadzane sekwencyjnie, a fragmenty wygenerowane podczas pierwszej reakcji (PCR1) służą jako matryca w drugiej reakcji (PCR2). Dla każdego zestawu reakcji stosowane są specyficzne ustawienia termocyklera.

Nazwa starteraSekwencja startera
Startery specyficzne dla transpozonu MAR2xT7
PMFLGM.GB-3aTACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM.GB-2aTGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
Starter do sekwencjonowania transpozonu MAR2xT7
PMFLGM.GB-4aGACCGAGATAGGGTTGAGTG
TnphoA Startery specyficzne dla transpozonów
Tn5ExtGAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
TnphoA Starter do sekwencjonowania transpozonów
Tn5IntCGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
Startery arbitralne
ARB1DGGCCAGGCCTGCAGATGATGNNGTAT
ARB2AGGCCAGGCCTGCAGATGATG

Tabela 4: Lista starterów użytych w eksperymentach kontroli jakości. Startery użyte do amplifikacji PCR i sekwencjonowania mutantów z insercją transpozonu w celu potwierdzenia tożsamości mutantów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dwanaście nowych kopii zestawu PA14NR zostało powielonych zgodnie z Protokołem I, a następnie przeprowadzono ocenę kontroli jakości wygenerowanych nowych kopii zgodnie z Protokołem III.

Płyty mutantów zestawu PA14NR wraz z płytami kontrolnymi, składającymi się z dołków zaszczepionych szczepem dzikim PA14 oraz dołków niezaszczepionych, rozmieszczonych naprzemiennie według ustalonego wzoru (Rysunek 4A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Plik P. aeruginosa powiedział: Zestaw PA14NR jest cennym zasobem dla społeczności naukowej. Zgodnie ze zbiorem danych z marca 2017 r. z bazy danych Essential Science Indicators firmy Clarivate Analytics, Liberati et al. (2006)37, który opisuje budowę zestawu PA14NR, znajduje się w czołówce 1% publikacji mikrobiologicznych. Google Scholar informuje o ponad 600 cytatach oryginalnego rękopisu Liberati et al. (2006) z sierpnia 2017 r. Biblioteka odegrała ważną rolę ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie informują o finansowych konfliktach interesów. Eliana Drenkard i Frederick Ausubel brali udział w tworzeniu biblioteki mutantów transpozonów PA14. Bryan Hurley i Lael Yonker obecnie przechowują i dystrybuują bibliotekę mutantów jako część Oddziału Pediatrii w Massachusetts General Hospital.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Lisie Philpotts z MGH Treadwell Virtual Library za jej wskazówki w przeszukiwaniu bazy danych. Prace te były wspierane przez Fundację Mukowiscydozy (YONKER16G0 i HURLEY16G0) oraz NIH NIAID (BPH i ADE: R01 A1095338).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały do replikacji bibliotecznej
Sterylna 96-dołkowa hodowla tkankowa, przypadek 50Corning Life Sciences353072za pośrednictwem Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μ L Deep Well Plates, skrzynka 25Corning Life Sciences3960przez Fisher Scientific
Nunc OmniTray (prostokątne płytki), skrzynka 60Thermo Scientific Rochester242811przez Fisher
Scientific Rectangular Ice Pan, Midi (4L)Corning Life Sciences432104przez Fisher
Scientific Secure-Gard Cone Mask, skrzynka 300Cardinal HealthAT7509przez Fisher Scientific
AluminaSeal, opakowanie 100 sztukDiversified BiotechALUM-100za pośrednictwem
membrany Fisher Scientific Breathe-Easy, opakowanie 100sztuk Diversified BiotechBEM-1via Sigma-Aldrich
Sterylne, pakowane pojedynczo, 50 ml koryto roztworu/zbiornik odczynnika, opakowanie 100SorensonS50100przez Westnet Incorporated
Wałek płytkowyVWR60941-118via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2,64" x 0,277", opakowanie 16 arkuszyGA InternationalRCL-11T1-WHprzez Labtag.com (szablon do druku dostępny również od Labtag.com)
96-dołkowy replikatorV & P Naukowy, Inc.Custom 407C, średnica sworznia 3,18 mm, długość 57 mmprzez V & P Naukowy, Inc.
Multitron Pro, inkubator z wytrząsaniem 3 mmInfors HTl10003Pprzez Infors HT
Picus 12 kanałów 50-1200μ l Pipeta elektronicznaSartorius735491PRprzez
końcówki filtrujące Sartorius 50-1200μ L, opakowanie 960Biohit14-559-512przez Fisher Scientific; Używaj elektronicznych końcówek kompatybilnych z wieloma kanałami
Suchy lódDostawca
emMateriały do indywidualnego przechowywania mutantów
Probówki do mikrowirówek premium Fisherbrand: 1,5 mlFisher Scientific05-408-130przez Fisher Scientific
Pipety (P1000, P200, P20, P2)GilsonF167370za pośrednictwem Gilson
Materiały do kontroli jakości Probówki do mikrowirówek premium PCR
Fisherbrand: 1,5 mlFisher Scientific05-408-130przez Fisher
Scientific NanoDropThermo ScientificND-2000przez
ThermoFisher PCR Thermo Cycler
Probówki do PCR Omnistrips z wypukłymi pokrywkamiThermo ScientificAB0404przez Fisher
Scientific ART Barierowe końcówki do pipet o niskiej retencji (10 uL, 100 uL, 1000 uL)Molecular BioProducts, Inc.Z676543 (10 μl), Z676713 (100 μl), Z676802 (1000 μl)Sigma-Aldrich
(P1000, P200, P20, P2)ProbówkiGilson F167370 przez Gilson
Fisherbrand Premium: 1,5 mlFisher Scientific05-408-130przez Fisher
Scientific MasterZestaw do oczyszczania DNA PureEpicentreMCD85201za pośrednictwem Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, gotowy do użyciaThermo ScientificSM1333przez ThermoFisher
RediLoad Loading BufferInvitrogen750026przez ThermoFisher
Chemicals
Chemicals do przechowywania w bibliotece i indywidualnych mutantów
Glycerol MB Grade, 1LSigma AldrichG5516przez Sigma-Aldrich
LB Rosółna 1L dH2O: 10g tryptonu, 5g ekstraktu drożdżowego, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Aktualne protokoły w biologii molekularnej.  Wiley, 1994).
TryptonSigma AldrichT7293przez ekstrakt drożdżowy Sigma-Aldrich
Sigma AldrichY1625przez Sigma-Aldrich
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653przez Sigma-Aldrich
Sodium HydroxideSigma AldrichS8045przez Sigma-Aldrich
LB  agarZobacz przygotowanie powyżej, dodaj 15g Bacto Agar
Bacto AgarSigma AldrichA5306przez Sigma-Aldrich
Siarczan gentamycyny, 10gBioReagent1405-41-0Sigma-Aldrich
Gibco11815024przez ThermoFisher
Etanol, 190 proofDecon04-355-221przez Fisher Scientific
Chemicals do kontroli jakości PCR
StarteryPreferowany przez użytkownika dostawcaZobacz startery wymienione w Tabeli 3
Corning cellgro Biologia molekularna Klasa WodaCorning46000CVprzez Fisher Scientific
Taq Bufor polimerazyInvitrogen10342020przez ThermoFisher
Taq DNA Polimeraza, rekombinowanaInvitrogen10342020przez ThermoFisher
dNTPsInvitrogen10297018przez ThermoFisher
AgaroseSigmaA9539przez Sigma-Aldrich
za pomocą pipet wirówkowe przez siarczan kanamycyny

Bibliografia

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39(2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88(2012).
  10. Foundation, C. F. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report. , Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016).
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6(2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118(2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113(2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548(2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083(2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813(2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144(2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biblioteka mutantów transpozonowychreplikacja bibliotekitechnika sterylnasterylizacja pinów replikatorapłytki z agarem LBblok głębokich dołkówprzechowywanie w glicerolukontrola jakościzapobieganie kontaminacji
Replikacja uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów insercji transpozonów Pseudomonas aeruginosa szczepu PA14
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.