Artykuł metodologiczny

Replikacja uporządkowanej, nieredundantnej biblioteki mutantów insercji transpozonów Pseudomonas aeruginosa szczepu PA14

DOI:

10.3791/57298

⸱

4 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie Pseudomonas aeruginosa powoduje znaczną zachorowalność u wrażliwych gospodarzy. Nieredundantna biblioteka mutantów insercji transpozonów szczepu PA14 P. aeruginosa, oznaczona jako PA14NR Set, ułatwia analizę funkcjonalności genów w wielu procesach. Przedstawiono tutaj protokół do generowania wysokiej jakości kopii biblioteki mutantów PA14NR Set.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa to fenotypowo i genotypowo zróżnicowana i zdolna do adaptacji bakteria Gram-ujemna, wszechobecna w środowisku ludzkim. P. aeruginosa jest zdolny do tworzenia biofilmów, rozwijania oporności na antybiotyki, wytwarzania czynników wirulencji i szybkiej ewolucji w przebiegu przewlekłej infekcji. Tak więc P. aeruginosa może powodować zarówno ostre, jak i przewlekłe, trudne do leczenia infekcje, powodując znaczną zachorowalność w niektórych populacjach pacjentów. Szczep PA14 P. aeruginosa jest ludzkim izolatem klinicznym o konserwatywnej strukturze genomu, który infekuje różnych gospodarzy ssaków i bezkręgowców, co czyni PA14 atrakcyjnym szczepem do badania tego patogenu. W 2006 roku stworzono nieredundantną bibliotekę mutantów do insercji transpozonów, zawierającą 5459 mutantów odpowiadających 4596 przewidywanym genom PA14. Od tego czasu dystrybucja biblioteki PA14 pozwoliła społeczności badawczej lepiej zrozumieć funkcję poszczególnych genów i złożonych szlaków P. aeruginosa. Utrzymanie integralności biblioteki poprzez proces replikacji wymaga odpowiedniej obsługi i precyzyjnych technik. W tym celu w niniejszym manuskrypcie przedstawiono protokoły, które szczegółowo opisują etapy związane z replikacją biblioteki, kontrolą jakości biblioteki i prawidłowym przechowywaniem poszczególnych mutantów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa to fenotypowo i genotypowo zróżnicowana i zdolna do adaptacji bakteria Gram-ujemna, obecna w glebie, wodzie i większości środowisk ludzkich, a także mikroflory skóry. W porównaniu z wieloma gatunkami bakterii, P. aeruginosa ma stosunkowo duży genom 5,5-7 Mbp przy wysokiej zawartości G+C (65-67%). Co więcej, znaczna część jego genów jest zaangażowana w zdolności adaptacyjne metaboliczne i jest częścią sieci regulacyjnych, co pozwala na dużą elastyczność w odpowiedzi na stres środowiskowy1. P. aeruginosa wykazuje ekspresję wielu czynników wirulencji, wykazuje skłonność do tworzenia biofilmów, posiada zdolność koordynowania odpowiedzi poprzez wiele ścieżek quorum sensing i wykazuje znaczącą zdolność do rozwijania oporności i tolerancji na antybiotyki2,3,4,5,6,7,8. Cechy te stanowią poważne wyzwanie w leczeniu zakażeń wywołanych przez P. aeruginosa.

Przewlekłe infekcje P. aeruginosa mogą występować w wielu stanach chorobowych. Mukowiscydoza (CF), choroba genetyczna spowodowana mutacją genu CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), powoduje zainfekowane wydzieliny w drogach oddechowych, postępujące rozstrzenie oskrzeli i ostatecznie śmierć z powodu niewydolności oddechowej9. W wieku dorosłym większość pacjentów z mukowiscydozą jest przewlekle zakażona P. aeruginosa, który odgrywa kluczową rolę w zachorowalności i śmiertelności związanej z tą chorobą10. Dodatkowo, pacjenci z ciężkimi oparzeniami 11, tracheostomia12, wymiany stawów13, lub cewniki na stałe14 są narażeni na zakażenie P. aeruginosa związane ze zdolnością bakterii do tworzenia biofilmów i ucieczki przed reakcjami zapalnymi gospodarza15. Co więcej, kolonizacja zachodzi bez konkurencji po wybraniu populacji opornej lub tolerancyjnej na wiele antybiotyków poprzez sekwencyjne leczenie przeciwdrobnoustrojowe o szerokim spektrum działania12,16,17,18. Lepsze zrozumienie patogenezy P. aeruginosa będzie miało znaczące implikacje dla wielu stanów chorobowych.

Kilka klinicznych izolatów P. aeruginosa, w tym szczepy PAO1, PA103, PA14 i PAK, zostało intensywnie przebadanych w celu zbadania różnych cech patogenezy P. aeruginosa. Szczep PA14 to izolat kliniczny, który należy do jednej z najczęstszych grup klonów na świecie19,20 i nie został intensywnie przebadany w laboratorium. PA14 jest wysoce zjadliwy w modelach infekcji kręgowców, z godnym uwagi profilem endotoksyn21, pili structure22, wyspy chorobotwórcze23, system wydzielania typu III (TTSS), cytotoksyczność w stosunku do komórek ssaków24 oraz profile w zakresie oporności i trwałości antybiotyków25. Co więcej, PA14 jest również wysoce zjadliwy w wielu systemach modelowych gospodarz-patogen, w tym w modelach infiltracji liści roślin26,27,Caenorhabditis elegans infection models28,29, modele owadów30,31, a także modele zapalenia płuc u myszy32,33 oraz modele oparzeń skóry34.

Biblioteki mutantów całego genomu to zbiory izogenicznych mutantów w nieistotnych genach, które stanowią bardzo potężne narzędzia do zrozumienia biologii organizmu, umożliwiając analizę funkcji genów w skali genomowej. Dwie biblioteki mutantów transpozonów o niemal nasyceniu, zbudowane w P. aeruginosa, są obecnie dostępne do dystrybucji. Miejsca wstawiania transpozonów zostały określone dla obu bibliotek. Te tak zwane biblioteki nieredundantne ułatwiają badania całego genomu szczepów bakteryjnych, znacznie skracając czas i koszty związane z badaniami przesiewowymi niescharakteryzowanych losowych mutantów transpozonów. Biblioteka mutantów transpozonów P. aeruginosa PAO1, skonstruowana w izolacie MPAO1 szczepu PAO1 przy użyciu transpozonów ISphoA/hah i ISlacZ/hah35, jest kuratorowana przez laboratorium Manoil na Uniwersytecie Waszyngtońskim. Biblioteka składa się ze zweryfikowanej pod kątem sekwencji kolekcji 9 437 mutantów transpozonów, która zapewnia szeroki zakres genomu i zawiera dwie mutanty dla większości genów36. Informacje na temat biblioteki mutantów transpozonów P. aeruginosa PAO1 są dostępne na publicznej, dostępnej w Internecie stronie internetowej laboratorium Manoil pod adresem http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. Biblioteka mutantów nieredundantnych transpozonów szczepu PA14 szczepu PA14 (zestaw PA14NR) skonstruowana w szczepie PA14 przy użyciu transpozonów MAR2xT7 i TnphoA37 jest obecnie dystrybuowana przez Oddział Pediatrii w Massachusetts General Hospital. Zestaw PA14NR składa się z kolekcji ponad 5 800 mutantów z pojedynczymi insercjami transpozonów w nieistotnych genach37. Szczegóły dotyczące budowy zestawu PA14NR są opisane na ogólnodostępnej, dostępnej w Internecie stronie internetowej http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, która zawiera również różne narzędzia wyszukiwania online ułatwiające korzystanie z zestawu PA14NR.

Oryginalny zestaw PA14NR składał się z 5 459 mutantów, wybranych z obszernej biblioteki około 34 000 losowych mutantów insercji transpozonów, które odpowiadają 4 596 przewidywanym genom PA14 reprezentującym 77% wszystkich przewidywanych genów PA1437. Od czasu budowy biblioteki w 2006 roku dodawano nowe mutanty, a obecnie zestaw PA14NR zawiera ponad 5800 mutantów38, które reprezentują około 4600 genów PA14. Większość mutantów transpozonów PA14 została wygenerowana w wildtype background37. Szczegółowe informacje na temat każdego członka biblioteki mutantów, w tym tło genetyczne, są dostępne poprzez przeszukiwanie internetowej bazy danych lub poprzez pobranie arkusza kalkulacyjnego Nonredundant Library, obie funkcje są dostępne na stronie internetowej PA14 (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi). Większość mutantów została stworzona przy użyciu transpozonu MAR2xT7 (MrT7), z małym zestawem stworzonym za pomocą transpozonu TnPhoA (phoA) class37. Każdy transpozon posiada kasetę oporności na antybiotyki, która pozwala na selekcję mutantów za pomocą gentamycyny (MrT7) lub kanamycyny (phoA). Zestaw mutantów PA14NR jest przechowywany w sześćdziesięciu trzech 96-dołkowych płytkach i zawiera dwie dodatkowe 96-dołkowe płytki kontrolne, które składają się z dzikich dołków inokulowanych i nieinokulowanych PA14 interkalowanych w ustalony wzór. Format 96-dołkowej płytki w połączeniu z narzędziami wyszukiwania online znacznie ułatwia niestandardowe opracowywanie testów przesiewowych, które pozwalają użytkownikom łatwo zidentyfikować geny związane ze zmutowanymi fenotypami. Wyszukiwarki internetowe ułatwiają również wyszukiwanie i selekcję dodatkowych istotnych mutantów wymaganych do dalszych badań.

Biblioteki mutantów transpozonów PA14 i PAO1 są bardzo ważnymi globalnymi zasobami dla społeczności naukowej i uzupełniają się nawzajem w walidacji funkcji nieznanych genów i szlaków tego bakteryjnego patogenu. Przypadkowo, od czasu skonstruowania bibliotek mutacji transpozonów PAO1 i PA14, analiza sekwencjonowania pełnego genomu DNA wielu izolatów P. aeruginosa wykazała, że PAO1 i PA14 należą do różnych głównych podkladów filogenezy P. aeruginosa7,39,40,41. Ponieważ kliniczne izolaty P. aeruginosa są rozmieszczone w całej filogenezie, fakt, że PAO1 i PA14 należą do różnych podgrup P. aeruginosa, zwiększa wartość dwóch bibliotek mutacji transpozonów dla badań porównawczych.

Publikacje opisujące budowę i badania przesiewowe bibliotek mutantów bakteryjnych, w tym biblioteki P. aeruginosa35,37,42, są łatwo dostępne w literaturze. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie są dostępne żadne opublikowane protokoły opisujące szczegółowe procedury i techniki stosowane do replikacji, konserwacji i walidacji bibliotek mutantów bakteryjnych.

Metodologia opisana w tej publikacji opisuje zestaw trzech protokołów, które ułatwiają korzystanie i utrzymanie zestawu PA14NR. Pierwszy protokół opisuje replikację biblioteki zgodnie z zaleceniami dla odbiorców zestawu PA14NR. Drugi protokół zawiera wytyczne dotyczące smugowania, hodowli i przechowywania poszczególnych mutantów zidentyfikowanych za pomocą zestawu PA14NR. Trzeci protokół opisuje techniki kontroli jakości, w tym amplifikację PCR fragmentów mutantów transpozonów, a następnie sekwencjonowanie w celu potwierdzenia tożsamości mutanta. Ten zestaw protokołów może być również dostosowany do replikacji i utrzymania innych bibliotek lub kolekcji mutantów bakteryjnych. Zdecydowanie zaleca się replikację bibliotek lub kolekcji zmutowanych bakterii w celu zachowania integralności "kopii wzorcowej" (otrzymanej oryginalnej kopii). Replikacja kilku kopii zestawu PA14NR do rutynowego użytku laboratoryjnego minimalizuje prawdopodobieństwo zanieczyszczenia kopii głównej przez odwiert

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Stosuj standardowe środki bezpieczeństwa BSL-2 podczas obchodzenia się z P. aeruginosa, ludzkim patogenem. Jeśli jesteś osobą z obniżoną odpornością lub cierpisz na jakiekolwiek schorzenie, które zwiększa podatność na infekcje bakteryjne, zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy z P. aeruginosa. Skonsultuj się z biurem bezpieczeństwa biologicznego w swojej placówce i uzyskaj zgodę lekarza przed rozpoczęciem pracy z zestawem PA14 NR lub zmutowanymi bibliotekami patogenów bakteryjnych.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przegląd protokołu I: replikacja zestawu PA14NR. Dzień 1: Powtórzyć zamrożone kultury mutantów z "kopii wzorcowej" PA14NR Osadzonej w pożywce LB Agar i hodować mutanty przez noc w temperaturze 37 °C. Dzień 2: Przenieść wzrost mutantów z pożywki LB Agar do bloków głębokiej studzienek zawierających płynny bulion LB, rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 950 obr./min. Dzień 3: Wymieszaj nocne kultury LB z glicerolem, a następnie przenieś na 96-dołkowe płytki docelowe w celu długotrwałego przechowywania. Umieść 96-dołkowe płytki płasko w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Zalecana konfiguracja. Sterylność i płynny przebieg pracy powinny być utrzymane poprzez stosowanie odpowiednich środków ostrożności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Protokół I: Replikacja zestawu PA14NR

UWAGA: Replikacja biblioteki może być osiągnięta poprzez podzielenie zestawu PA14NR na cztery podzbiory po szesnaście płyt każdy, które mogą być przetworzone w ciągu czterech kolejnych tygodni. Generowanie od 1 do 6 kopii jest zgodne z tygodniowym przepływem pracy opisanym w Tabeli 1, podczas gdy generowanie więcej niż 6 kopii następuje zgodnie z tygodniowym przepływem pracy opisanym w Tabeli 2. Aby wygenerować 12 kopii zestawu PA14NR, należy zaszczepić ten sam podzbiór PA14NR w płynnym podłożu LB w dniu 2 i ponownie w dniu 3 (z tego samego zestawu płytek agarowych replikowanych w dniu 1) i przenieść zmutowane kultury na noc do płytek kopiujących odpowiednio w dniu 3 i dniu 4.

Dzień 0Dzień 1Dzień 2Dzień 3
Dzień przygotowawczyWzrost mutantów PA14NR Set na pożywkach agarowych LBWzrost mutantów PA14NR Set w płynnych podłożach LBTransfer zmutowanych kultur PA14NR Set na płytki docelowe

Tabela 1: Harmonogram replikacji 1 - 6 kopii zestawu PA14NR. Replikacja niewielkiej liczby kopii może odbywać się zgodnie z cotygodniowym przepływem pracy.

Dzień 0Dzień 1Dzień 2Dzień 3Dzień 4
Dzień przygotowawczyWzrost mutantów PA14NR Set na agarze LBHodowla mutantów PA14NR Set w płynnych podłożach LBTransfer kultur mutantów dnia 3 w celu wygenerowania 1. zestawu 6 kopii zestawu PA14NRTransfer zmutowanych kultur z dnia 4 w celu wygenerowania 2. zestawu 6 kopii zestawu PA14NR
Wzrost mutantów PA14NR Set w płynnych podłożach LB

Tabela 2: Harmonogram replikacji do 12 kopii zestawu PA14NR. Replikacja większej liczby kopii będzie wymagała nakładania warstw w ramach tygodniowego przepływu pracy.

  1. Dzień 1: Wzrost PA14NR Set Master na płytkach agarowych LB
    1. Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i maskę do obsługi zestawu PA14NR.
    2. Wyczyść ławkę i przetrzyj powierzchnię 70% etanolem.
    3. Przygotować pożywkę agarową LB43 i sterylizować w autoklawie przez 25 minut. Schłodzić podłoże do 55 °C w łaźni wodnej i dodać 15 μg/ml gentamycyny, dla mutantów zawierających insercje transpozonów MAR2xT7, lub 200 μg/ml kanamycyny, dla mutantów zawierających insercjeTn phoA.
    4. Wlać stopiony agar LB na prostokątne płytki, używając około 60 ml pożywki na płytkę. Suszyć płytki w sterylnym kapturze przez około 1 godzinę przed użyciem. Upewnij się, że na powierzchni agaru nie ma kondensacji wody. W razie potrzeby przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.
    5. Stwórz sterylne pole za pomocą palnika Bunsena na blacie wytartym etanolem i ustaw pojemniki z odpowiednimi roztworami do sterylizacji kołków replikatora (patrz krok 1.1.9). Używaj otwartych plastikowych pojemników (przybliżony rozmiar 5.25 "dł. x 4,25" szer. x 1,75 "wys.) do sterylizacji pinów replikatora. Autoklaw plastikowych pojemników przed użyciem.
      UWAGA: Ciepło płomienia palnika Bunsena wytwarza prąd konwekcyjny, który ogrzewa przestrzeń nad płomieniem i unosi wszelkie cząstki stałe w powietrzu w górę i z dala od chłodniejszego powietrza pod spodem, utrzymując sterylność obszaru roboczego.
    6. Wyjmij maksymalnie cztery płytki wzorcowe PA14NR Set z zamrażarki w temperaturze -80 °C (aby uniknąć niepotrzebnego rozmrażania) i umieść je na suchym lodzie w garnku o pojemności 4 l.
    7. Wziąć 96-dołkową płytkę wzorcową, która ma być odtworzona z suchego lodu i umieścić ją na stole do krótkotrwałego rozmrożenia, co zajmie jedynie czas niezbędny do sterylizacji kołków replikatora (około 3-4 min) (patrz krok 1.1.8). Zaznacz położenie współrzędnej A1 na płytce agarowej przed stemplowaniem. Wyrównaj płytkę wzorcową i płytkę agarową ze współrzędną A1 obu płytek w lewym górnym rogu.
    8. Wysterylizuj "szpilki" replikatora, wykonując czynności opisane poniżej. Dotknij lekko replikatora po każdym kroku, aby usunąć nadmiar płynu.
      1. Zanurz szpilki w 250 ml 0,3-0,5% podchlorynu sodu (10% domowy wybielacz) na 30 sekund. Zminimalizuj kontakt z roztworem podchlorynu sodu, ponieważ może to prowadzić do uszkodzenia kołków. Zanurz szpilki w 250 ml sterylnego ddH2O lub sterylnej ultraczystej wodzie na 10 sekund, następnie w 250 ml 70% etanolu na 30 sekund, a następnie w 250 ml 95% etanolu na 2 minuty.
      2. Sterylizuj płomieniem kołki replikatora, trzymając replikator prostopadle do płomienia palnika Bunsena, powoli zbliżając się do płomienia, aż etanol się zapali, a następnie natychmiast wycofując go z płomienia. Płomień zgaśnie, gdy wypali się cały etanol. Trzymaj pokrywkę lub podobny pojemnik w pobliżu, aby w razie potrzeby udusić palący się etanol.
        UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy z etanolem w pobliżu płomienia. NIE WOLNO trzymać replikatora bezpośrednio nad płomieniem.
      3. Schłodzić szpilki, przypinając je do nieużywanej sterylnej prostokątnej płytki zawierającej podłoże agarowe LB przez 30 sekund.
    9. Krótko podgrzej aluminiową uszczelkę od PA14NR Ustaw płytkę główną ręką przed jej odklejeniem. Zrób to podczas chłodzenia pinów replikatora. Ostrożnie zdejmij aluminiową uszczelkę, aby zapobiec retuszowi uszczelki płytki. Użyj pęsety, aby odkleić wszelkie resztki aluminiowej uszczelki.
    10. Włóż kołki replikatora do płytki głównej, delikatnie popychając i kołysząc replikator we wszystkich czterech kierunkach, aby upewnić się, że kołki stykają się z zamrożonymi kulturami bakteryjnymi w każdym z 96 dołków. Zwróć szczególną uwagę na studzienki znajdujące się na zewnętrznej krawędzi płytki, dociskając kołki replikatora do zamrożonych kultur w dołkach znajdujących się na krawędzi płytki.
    11. Delikatnie umieść kołki replikatora na powierzchni płytki agarowej. Przesuwaj replikator lekkimi ruchami okrężnymi, aby utworzyć mini-trawniki o wielkości około 4-5 mm dla każdego zmutowanego szczepu. Unikaj możliwości, że mini-trawniki mogą zachodzić na siebie, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    12. Seal PA14NR Zestaw płytki głównej z nową sterylną aluminiową uszczelką. W żadnym momencie nie dotykaj klejącej strony aluminiowej uszczelki, aby uniknąć zanieczyszczenia. Upewnij się, że każda studzienka i krawędzie płyty są całkowicie uszczelnione za pomocą wałka do płyty. Włożyć 96-dołkową płytkę z powrotem do suchego lodu.
    13. Powtórz procedurę dla każdej płytki wzorcowej.
    14. Po obsłudze zestawu PA14NR przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
    15. Przenieść zreplikowane płytki agarowe do inkubatora o temperaturze 37 °C i inkubować przez noc.
  2. Dzień 2: Wzrost PA14NR Set Master w płynnym bulionie LB
    1. Przygotuj płynny bulion LB 43 zawierający 15 μg/ml gentamycyny, dla mutantów zawierających insercje transpozonów MAR2xT7, lub 200 μg/ml kanamycyny, dla mutantów zawierających insercjeTn phoA.
    2. Oczyść okap z przepływu laminarnego ze zbędnego sprzętu i włącz dmuchawę okapu na minimum 10 minut przed rozpoczęciem pracy. Wytrzyj powierzchnie okapu i wszelkie przedmioty umieszczone w okapie za pomocą 70% etanolu.
    3. Napełnij bloki głębokiej studzienki o pojemności 2 ml 525 μl płynnego bulionu LB zawierającego odpowiednie antybiotyki w okapie z przepływem laminarnym za pomocą 12-kanałowej pipety elektronicznej o pojemności 50-1200 μl. Następnie przenieś wypełnione pożywką bloki głębinowe na blat stołu wytartego etanolem. Używaj końcówek ponownie, o ile zachowane są sterylne warunki.
    4. Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i maskę do obsługi zestawu PA14NR.
    5. Wyczyść ławkę i przetrzyj powierzchnię 70% etanolem.
    6. Przynieś płytki agarowe z wyhodowanymi przez noc zmutowanymi szczepami na stół
      7. .
    7. Stwórz sterylne pole za pomocą palnika Bunsena na blacie wytartym etanolem i ustaw pojemniki z odpowiednimi roztworami do sterylizacji pinów replikatora (patrz następny krok).
    8. Wysterylizuj "szpilki" replikatora, wykonując czynności opisane poniżej. Lekko postukaj w replikator po każdym zanurzeniu, aby usunąć nadmiar płynu.
      1. Zanurz szpilki w 250 ml 0,3-0,5% podchlorynu sodu na 30 sekund. Zminimalizuj kontakt pinów replikatora z roztworem podchlorynu sodu, ponieważ może to prowadzić do uszkodzenia pinów. Następnie zanurz szpilki w 250 ml sterylnego ddH2O lub ultraczystej wodzie na 10 sekund, następnie w 250 ml 70% etanolu na 30 sekund, a następnie w 250 ml 95% etanolu na 2 minuty.
      2. Wysterylizuj płomieniowo kołki replikatora, a następnie schłodzić szpilki, wkładając je do nieużywanej prostokątnej płytki zawierającej pożywkę agarową LB przez 30 sekund.
        UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy z etanolem w pobliżu płomienia (patrz 1.1.8).
    9. Delikatnie umieścić szpilki replikatora na płytce agarowej zawierającej wzrost mutantów i sprawdzić, czy szpilki stykają się ze wszystkimi 96 mutantami na płytce agarowej, a następnie zanurzyć szpilki w głębokich studzienkach zawierających płynny bulion LB. Unikaj dotykania boków studzienek szpilkami.
    10. Uszczelnij blok studni głębinowej sterylną, oddychającą membraną uszczelniającą. Użyj wałka do płyty, aby upewnić się, że każda pojedyncza studzienka jest odpowiednio uszczelniona.
    11. Powtórz procedurę dla każdej płytki agarowej.
    12. Po obsłudze zestawu PA14NR przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
    13. Hoduj zaszczepione płynne kultury przez 15 - 16 godzin w temperaturze 37°C przy 950 obr./min za pomocą wytrząsarki o dużej prędkości, jeśli jest dostępna.
      UWAGA: Jeśli wytrząsarka o dużej prędkości nie jest dostępna, możliwa jest inkubacja bloków studni głębinowych w wytrząsarce z prędkością 250-300 obr./min. Istnieje jednak większe prawdopodobieństwo, że warianty małych kolonii (SCV)25 pojawią się w warunkach niskiego natlenienia. Dlatego bardzo zaleca się utrzymywanie czasu inkubacji poniżej 15 - 16 godzin podczas uprawy kultur w głębokich blokach studzienek przy niższych prędkościach wytrząsarki. Niepożądana proliferacja SCV w zmutowanych studzienkach może zmienić zmutowane fenotypy podczas korzystania z biblioteki do przeprowadzania badań genetycznych.
      Niektóre studzienki w zestawie PA14NR zawierają wolno rosnące/nierosnące mutanty, brakujące klony lub zawierają niezaszczepione pożywki. Lokalizacja tych studni została zarejestrowana i można ją znaleźć w pliku uzupełniającym PA14NR Set Wells Information dołączonym do niniejszej publikacji.
  3. Dzień 3: Przeniesienie nocnych kultur PA14NR Set na płytki docelowe
    1. Wyczyść okap z przepływem laminarnym i włącz dmuchawę okapu na co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem pracy. Wytrzyj powierzchnie okapu i wszelkie przedmioty umieszczone w okapie za pomocą 70% etanolu.
    2. Wydrukuj wodoodporne etykiety samoprzylepne (szablon znajduje się w pliku uzupełniającym PA14NR Set Labels). Wyjmij 96-dołkowe płytki z folii plastikowej wewnątrz okapu z przepływem laminarnym. Odklej etykietę na płytkę i umieść ją wzdłuż krawędzi płytki najbliżej dołków A1 do H1 płytki docelowej. Lekko podnieś pokrywę tabliczki docelowej i umieść etykietę na dolnej krawędzi, aby wyświetlić etykietę, gdy płyta jest przykryta pokrywką.
    3. Przygotuj 3,5 l 60% glicerolu (v/v) i sterylizuj przez 20 minut w autoklawie.
    4. Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i maskę do obsługi zestawu PA14NR. Usuń bloki studni głębinowej z wytrząsarki szybkoobrotowej lub zwykłej wytrząsarki.
    5. Przenieś bloki studni głębinowej do sterylnego okapu z przepływem laminarnym i ostrożnie usuń oddychającą membranę uszczelniającą. Wymień na aluminiową uszczelkę. Odkręć bloki studni głębinowej z bardzo małą prędkością, aby zebrać kondensację (30 sekund przy 50-150 x g, a następnie szybko zwolnij, włączając hamulec wirówki).
    6. Przenieś bloki głębokiej studzienki z powrotem do sterylnego kaptura i za pomocą 12-kanałowej pipety elektronicznej o pojemności 50-1200 μl i sterylnych końcówek z filtrem dodaj 525 μl płynnej mieszanki bulionu glicerol/LB (równe części płynnego bulionu LB i 60% roztworu glicerolu) do każdej studzienki. Wymieszać, delikatnie pipetując 300 μl w górę i w dół 3 razy za pomocą pipety elektronicznej. Dotknij końcówek z boku studni przed wysunięciem końcówek, aby zapobiec kapaniu. Wysuń końcówki i kontynuuj następny rząd, aż skończysz z całym blokiem studni głębinowej.
    7. Korzystając z 12-kanałowej elektronicznej pipety powtarzalnej i końcówek z filtrem, aby zapobiec zanieczyszczeniu międzydołkowemu podczas porcjowania, należy pobrać 900 μl zmutowanej kultury i dozować 150 μl do każdej 96-dołkowej płytki docelowej, aby wygenerować 6 kopii płytki bibliotecznej. Zapobiegaj kapaniu, dotykając ścianki studzienek końcówkami przed rozpoczęciem przenoszenia kultury na płytki docelowe. Jeśli nie jest dostępna powtórna pipeta, użyj pipety wielokanałowej, aby dozować 150 μl do każdej z sześciu 96-dołkowych płytek, stosując technikę opisaną powyżej, aby zapobiec kapaniu.
    8. Użyj sterylnych aluminiowych uszczelek do zakrycia płyt i użyj wałka do płyt, aby całkowicie uszczelnić krawędzie płyt i wszystkie dołki. Upewnij się, że nie zakrywasz identyfikatora etykiety aluminiową uszczelką. Nie potrząsaj płytkami, ponieważ kultura może rozprysnąć się po bokach studzienek lub na aluminiowej uszczelce.
    9. Wyjmij szczelnie zamknięte talerze z okapu i umieść je na płaskiej, równej powierzchni w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    10. Po kontakcie z biblioteką przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
    11. Przeprowadzanie kontroli jakości po replikacji biblioteki i po użyciu biblioteki do przeprowadzenia badań genetycznych (patrz Protokół III).

2. Protokół II: Postępowanie i przechowywanie indywidualnych mutantów z zestawu PA14NR

  1. Dzień 1: Ciekawy mutant serii
    1. Zidentyfikuj lokalizację interesującego mutanta za pomocą http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS łącza PA14NR Set lub za pomocą pliku Nonredundant Library.xls pobranego z linku http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi). Zanotuj antybiotyk potrzebny do wybrania każdego konkretnego mutanta (gentamycyna lub kanamycyna).
    2. Przygotować podłoże agarowe LB, sterylizować w autoklawie przez 20-25 minut i schłodzić do 55 °C w łaźni wodnej. Dodać 15 μg/ml gentamycyny dla mutantów zawierających insercje transpozonów MAR2xT7 i 200 μg/ml kanamycyny dla mutantów zawierających insercjetranspozonów Tn phoA. Wlać pożywkę agarową LB na płytki (odpowiednie są płytki okrągłe lub prostokątne). Suszyć płytki w sterylnym kapturze przez około 30 minut do 1 godziny przed użyciem.
    3. Przed użyciem należy sterylizować w autoklawie wszystkie plastikowe naczynia i materiały niesterylne.
    4. Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i maskę do obsługi zestawu PA14NR. Wyczyść ławkę i przetrzyj powierzchnię 70% etanolem przed rozpoczęciem pracy z zestawem PA14NR.
    5. Stwórz sterylne pole za pomocą palnika Bunsena.
    6. Wyjmij z zamrażarki -80 °C PA14NR Set 96-dołkową płytkę z mutantem będącym przedmiotem zainteresowania i umieść ją na suchym lodzie, przenieś pojemnik na suchy lód na ławkę i na krótko umieść 96-dołkową płytkę na wierzchu ławki, aby umożliwić lekkie rozmrożenie (około 1-2 min).
      UWAGA: Prowadź rejestr wszystkich 96-dołkowych płytek PA14NR Set, do których uzyskano dostęp w celu smugowania poszczególnych mutantów, ponieważ większy dostęp do płytek bibliotecznych jest skorelowany z większym ryzykiem zanieczyszczenia międzydołkowego.
    7. Ogrzać aluminiową uszczelkę ręką przed jej odklejeniem, uważając, aby uszczelka nie retuszowała płytki. Użyj pęsety, aby odkleić wszelkie resztki aluminiowej uszczelki.
    8. Zlokalizuj interesującego mutanta na 96-dołkowej płytce. Użyj sterylnego drewnianego patyczka lub sterylnej końcówki pipety, aby pobrać niewielką ilość zamrożonej kultury z indywidualnej studzienki zawierającej interesującego mutanta.
    9. Zamrożoną kulturę smugową na płytce agarowej dla pojedynczych kolonii mutantów w następujący sposób: Delikatnie rozprowadź bakterie na części płytki, aby utworzyć smugę 1, używając świeżego, sterylnego drewnianego patyczka lub końcówki pipety, przeciągnij przez smugę 1 i rozprowadź bakterie na drugiej części płytki, aby utworzyć smugę 2. Używając trzeciego sterylnego drewnianego patyczka lub końcówki pipety, przeciągnij przez smugę 2 i rozprowadź bakterie na ostatniej części płytki, aby utworzyć smugę 3.
    10. Uszczelnij płytę źródłową za pomocą nowej sterylnej aluminiowej uszczelki. W żadnym momencie nie dotykaj kleju aluminiowej uszczelki, aby uniknąć zanieczyszczenia. Upewnij się, że każda studzienka i krawędzie płyty są całkowicie uszczelnione za pomocą wałka do płyty. Włożyć 96-dołkową płytkę do suchego lodu, a następnie do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
    11. Inkubować płytkę agarową w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez noc.
    12. Po kontakcie z biblioteką przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
  2. Dzień 2: Wzrost zainteresowania mutanta w płynnym bulionie LB
    1. Przygotować płynny bulion LB zawierający 15 μg/ml gentamycyny lub 200 μg/ml kanamycyny, zgodnie z insercją transpozonu.
    2. Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i maskę, aby poradzić sobie z P. aeruginosa.
    3. Wyczyść ławkę i przetrzyj powierzchnię 70% etanolem. Stwórz sterylne pole za pomocą palnika Bunsena.
    4. Przenieś 3 - 5 ml bulionu LB z odpowiednim antybiotykiem do sterylnej probówki hodowlanej z nakrętką.
    5. Używając sterylnego aplikatora lub sterylnej końcówki do pipet, wybierz pojedynczą kolonię zmutowanego szczepu i zaszczep ją w pożywce LB.
    6. Inkubować płynne kultury LB w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przy 225–250 obr./min przez noc.
    7. Po kontakcie z P. aeruginosa przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.
  3. Dzień 3: Przechowuj interesujący mutant w zamrażarce w temperaturze -80 °C
    1. Etykieta kriowialna z nazwą mutanta, antybiotykiem dodanym do bulionu LB i datą przechowywania.
    2. Przygotuj 500 ml 50% glicerolu (v/v) i sterylizuj w autoklawie.
    3. Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny i maskę, aby poradzić sobie z P. aeruginosa.
    4. Przezroczysta ławka i/lub laminarny okap przeciwpowodziowy i przetrzyj powierzchnię 70% etanolem.
    5. Wyjąć probówkę zawierającą zmutowaną kulturę z shakera.
    6. Przygotuj mały pojemnik z suchym lodem.
    7. Użyj okapu z przepływem laminarnym lub stwórz sterylne pole na blacie wytartym etanolem za pomocą palnika Bunsena.
    8. Dodać równe ilości kultury bakteryjnej i 50% glicerolu do oznakowanego kriowialu w sterylnych warunkach i delikatnie wymieszać pipetą (ostateczna objętość 1 - 2 ml / fiolkę w zależności od wielkości użytych kriowialiów). Umieść kriowial na suchym lodzie do szybkiego zamrożenia.
    9. Umieść kriowial w oznakowanym pudełku w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
    10. Po kontakcie z P. aeruginosa przetrzyj wszystkie powierzchnie robocze 70% etanolem.

3. Protokół III: Kontrola jakości zestawu PA14NR

  1. Wybierz losowy zestaw mutantów z nowo zreplikowanych płytek, aby wykryć możliwe zanieczyszczenie międzydołkowe (zaleca się testowanie 30-40 mutantów).
    UWAGA: W przypadkach, gdy konieczne jest potwierdzenie tożsamości mutanta wykorzystywanego do scharakteryzowania określonego genu, zaleca się wykonanie amplifikacji PCR przy użyciu starterów specyficznych dla genu zaprojektowanych dla znanej sekwencji genu, który zawiera insercję transpozonu. Chociaż jest to trudniejsze, korzyści płynące z używania arbitralnych starterów PCR zamiast starterów PCR specyficznych dla genu podczas amplifikacji fragmentów DNA z mutantów transpozonów obejmują łatwość potwierdzania mutantów na dużą skalę i możliwość wykrywania obecności potencjalnych zanieczyszczeń. Do celów kontroli jakości nie jest konieczne uzyskiwanie wysokiej jakości danych z sekwencjonowania PCR dla wszystkich losowo wybranych mutantów, o ile wystarczająca liczba mutantów zostanie poddana badaniom przesiewowym w celu oceny poziomu błędu.
  2. Postępuj zgodnie z "Protokołem II", aby tworzyć smugi i hodować zmutowane szczepy.
  3. Przed użyciem należy sterylizować w autoklawie wszystkie plastikowe naczynia i materiały niesterylne.
  4. Wyizoluj genomowe DNA preferowaną metodą. Do analizy opisanej w tej pracy wykorzystano zestaw do izolacji genomowego DNA zgodnie z protokołami producenta. Wiele zmutowanych szczepów może być analizowanych jednocześnie.
  5. Zmierz stężenie genomowego DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Dostosuj stężenie genomowego DNA do około 100 ng/μl.
  6. Użyj genomowego DNA jako matrycy do uruchomienia "reakcji PCR1", jak opisano w kroku 1 w tabeli 3, generując fragmenty Arb1 PCR (Rysunek 3). Podstawy do tego etapu są wymienione w Tabeli 4.
  7. Dodać 0,5 μl 10-krotnego buforu ładującego do 5 μl reakcji PCR1, załadować do 1,5-2% żelu agarozowego i uruchomić żel przy 80-150 V.
    UWAGA: Nie oczekuje się określonej długości fragmentu lub określonego zakresu fragmentów, a więcej niż jedno pasmo może być obecne, ponieważ dowolny starter może wiązać się z wieloma lokalizacjami.
  8. Użyj DNA z reakcji PCR1 jako matrycy, aby uruchomić "reakcję PCR2" zgodnie z opisem w kroku 2 w tabeli 3, generując fragmenty Arb2 PCR (Rysunek 3). Podstawy do tego etapu są wymienione w Tabeli 4.
  9. Dodaj 0,5 μl 10-krotnego buforu ładującego do 5 μl reakcji PCR2, załaduj do 1,5-2% żelu agarozowego i uruchom żel przy 80-150 V.
    UWAGA: Nie oczekuje się określonej długości fragmentu lub określonego zakresu fragmentów, a więcej niż jedno pasmo może być obecne, ponieważ dowolny starter może wiązać się z wieloma lokalizacjami.
  10. Wyślij reakcję PCR2 wraz z odpowiednim starterem specyficznym dla transpozonu do sekwencjonowania.
  11. Analizuj wyniki sekwencjonowania poprzez BLASTing ich w stosunku do pełnego genomu PA14 za pomocą linku BLAST udostępnionego na stronie internetowej biblioteki PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) lub poprzez bezpośrednie BLASTowanie ich w stosunku do określonej sekwencji genu interesującego mutanta.
    UWAGA: Informacje o wybranych mutantach można znaleźć przeszukując stronę PA14NR Set (wyszukaj http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS lub pobierz plik Nonredundant Library.xls z linku http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi).

figure-protocol-3
Rysunek 3: Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie mutantów insercyjnych transpozonów. Schematyczny widok etapów związanych z amplifikacją i sekwencjonowaniem PCR w celu weryfikacji tożsamości mutanta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Konfiguracja reakcji PCR
Krok 1Krok 2
Reakcja PCR1:Reakcja PCR2:
23,25 μL wody (klasa biologii molekularnej)19,15 μL wody (klasa biologii molekularnej)
3μL 10x Bufor polimerazy Taq5 μL 10x bufor polimerazy Taq
0,5 μl polimerazy Taq0,6 μl polimerazy Taq
0,625 μL 20 μM Podkład Arb1D (Tabela 4)0,625 μL 20 μM Podkład Arb2A (Tabela 4)
0,625 μL 20 μM Podkład specyficzny dla transpozonu (PMFLGM. GB 3a lub Tn5Ext ) (Tabela 4)0,625 ml 20 μM Podkład specyficzny dla transpozonu (PMFLGM. GB 2a lub Tn5Int2) (Tabela 4)
1 μL 10 mM dNTP1 μL 10 mM dNTP
1 μl genomowego DNA, 100 ng5 μL reakcji PCR1
30 μl Końcowa objętość reakcyjna30 μl Końcowa objętość reakcyjna
Ustawienia reakcji PCR
Warunki termocyklera PCR1:Warunki termocyklera PCR2:
95 °C – 2 min95 °C – 2 min
Powtórz 5 cykli:Powtórz 30 cykli:
95 °C – 30 s95 °C – 30 s
30 °C – 1 min54 °C – 30 s
72 °C – 1 min72 °C – 1,5 min
Powtórz 30 cykli:72 °C – 10 min
95 °C – 30 s4 °C – Wstrzymanie
45 °C – 30 s
72 °C – 1 min
72 °C – 10 min
4°C – Wstrzymanie

Tabela 3: Konfiguracja reakcji PCR i warunki termocyklera używane do dowolnego PCR. Arbitralne reakcje PCR są przeprowadzane sekwencyjnie, a fragmenty powstałe podczas reakcji PCR1 są wykorzystywane jako matryca w reakcji PCR2. Dla każdego zestawu reakcji używane są określone ustawienia termocyklera.

powiedział: powiedział:
Nazwa podkładuSekwencja podkładowa
MAR2xT7 Startery specyficzne dla transpozonów
PMFLGM. GB-3aTACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM. GB-2aTGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG TGTCAACTGGGTTCGTGTGTGT
MAR2xT7 Podkład sekwencjonowania transpozonów
PMFLGM. GB-4aGACCGAGATAGGGTTGAGTG
Startery specyficzne dlatranspozonu Tn phoA
Tn5ExtGAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
TnphoA Podkład sekwencjonowania transpozonów
Tn5IntCGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC powiedział:
Arbitralne startery
Układ ARB1DGGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNNNGTAT
Certyfikat ARB2AGGCCAGGCCTGCAGATGATG powiedział:

Tabela 4: Lista starterów używanych w eksperymentach kontroli jakości. Startery stosowane do amplifikacji PCR i sekwencjonowania mutantów insercji transpozonów w celu potwierdzenia tożsamości mutanta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwanaście nowych kopii zestawu PA14NR zostało zreplikowanych przy użyciu Protokołu I, a ocena jakości nowo wygenerowanych kopii została przeprowadzona przy użyciu Protokołu III.

PA14NR Zestaw zmutowanych płytek wraz z płytkami kontrolnymi, które składają się z dzikich dołków inokulowanych i nieinokulowanych PA14 interkalowanych w ustalony wzór (Rysunek 4A), zostały zreplikowane zgodnie z metodologią opisaną w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plik P. aeruginosa powiedział: Zestaw PA14NR jest cennym zasobem dla społeczności naukowej. Zgodnie ze zbiorem danych z marca 2017 r. z bazy danych Essential Science Indicators firmy Clarivate Analytics, Liberati et al. (2006)37, który opisuje budowę zestawu PA14NR, znajduje się w czołówce 1% publikacji mikrobiologicznych. Google Scholar informuje o ponad 600 cytatach oryginalnego rękopisu Liberati et al. (2006) z sierpnia 2017 r. Biblioteka odegrała ważną rolę ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie informują o finansowych konfliktach interesów. Eliana Drenkard i Frederick Ausubel brali udział w tworzeniu biblioteki mutantów transpozonów PA14. Bryan Hurley i Lael Yonker obecnie przechowują i dystrybuują bibliotekę mutantów jako część Oddziału Pediatrii w Massachusetts General Hospital.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Lisie Philpotts z MGH Treadwell Virtual Library za jej wskazówki w przeszukiwaniu bazy danych. Prace te były wspierane przez Fundację Mukowiscydozy (YONKER16G0 i HURLEY16G0) oraz NIH NIAID (BPH i ADE: R01 A1095338).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały do replikacji bibliotecznej
Sterylna 96-dołkowa hodowla tkankowa, przypadek 50Corning Life Sciences353072za pośrednictwem Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μ L Deep Well Plates, skrzynka 25Corning Life Sciences3960przez Fisher Scientific
Nunc OmniTray (prostokątne płytki), skrzynka 60Thermo Scientific Rochester242811przez Fisher
Scientific Rectangular Ice Pan, Midi (4L)Corning Life Sciences432104przez Fisher
Scientific Secure-Gard Cone Mask, skrzynka 300Cardinal HealthAT7509przez Fisher Scientific
AluminaSeal, opakowanie 100 sztukDiversified BiotechALUM-100za pośrednictwem
membrany Fisher Scientific Breathe-Easy, opakowanie 100sztuk Diversified BiotechBEM-1via Sigma-Aldrich
Sterylne, pakowane pojedynczo, 50 ml koryto roztworu/zbiornik odczynnika, opakowanie 100SorensonS50100przez Westnet Incorporated
Wałek płytkowyVWR60941-118via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2,64" x 0,277", opakowanie 16 arkuszyGA InternationalRCL-11T1-WHprzez Labtag.com (szablon do druku dostępny również od Labtag.com)
96-dołkowy replikatorV & P Naukowy, Inc.Custom 407C, średnica sworznia 3,18 mm, długość 57 mmprzez V & P Naukowy, Inc.
Multitron Pro, inkubator z wytrząsaniem 3 mmInfors HTl10003Pprzez Infors HT
Picus 12 kanałów 50-1200μ l Pipeta elektronicznaSartorius735491PRprzez
końcówki filtrujące Sartorius 50-1200μ L, opakowanie 960Biohit14-559-512przez Fisher Scientific; Używaj elektronicznych końcówek kompatybilnych z wieloma kanałami
Suchy lódDostawca
emMateriały do indywidualnego przechowywania mutantów
Probówki do mikrowirówek premium Fisherbrand: 1,5 mlFisher Scientific05-408-130przez Fisher Scientific
Pipety (P1000, P200, P20, P2)GilsonF167370za pośrednictwem Gilson
Materiały do kontroli jakości Probówki do mikrowirówek premium PCR
Fisherbrand: 1,5 mlFisher Scientific05-408-130przez Fisher
Scientific NanoDropThermo ScientificND-2000przez
ThermoFisher PCR Thermo Cycler
Probówki do PCR Omnistrips z wypukłymi pokrywkamiThermo ScientificAB0404przez Fisher
Scientific ART Barierowe końcówki do pipet o niskiej retencji (10 uL, 100 uL, 1000 uL)Molecular BioProducts, Inc.Z676543 (10 μl), Z676713 (100 μl), Z676802 (1000 μl)Sigma-Aldrich
(P1000, P200, P20, P2)ProbówkiGilson F167370 przez Gilson
Fisherbrand Premium: 1,5 mlFisher Scientific05-408-130przez Fisher
Scientific MasterZestaw do oczyszczania DNA PureEpicentreMCD85201za pośrednictwem Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, gotowy do użyciaThermo ScientificSM1333przez ThermoFisher
RediLoad Loading BufferInvitrogen750026przez ThermoFisher
Chemicals
Chemicals do przechowywania w bibliotece i indywidualnych mutantów
Glycerol MB Grade, 1LSigma AldrichG5516przez Sigma-Aldrich
LB Rosółna 1L dH2O: 10g tryptonu, 5g ekstraktu drożdżowego, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Aktualne protokoły w biologii molekularnej.  Wiley, 1994).
TryptonSigma AldrichT7293przez ekstrakt drożdżowy Sigma-Aldrich
Sigma AldrichY1625przez Sigma-Aldrich
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653przez Sigma-Aldrich
Sodium HydroxideSigma AldrichS8045przez Sigma-Aldrich
LB  agarZobacz przygotowanie powyżej, dodaj 15g Bacto Agar
Bacto AgarSigma AldrichA5306przez Sigma-Aldrich
Siarczan gentamycyny, 10gBioReagent1405-41-0Sigma-Aldrich
Gibco11815024przez ThermoFisher
Etanol, 190 proofDecon04-355-221przez Fisher Scientific
Chemicals do kontroli jakości PCR
StarteryPreferowany przez użytkownika dostawcaZobacz startery wymienione w Tabeli 3
Corning cellgro Biologia molekularna Klasa WodaCorning46000CVprzez Fisher Scientific
Taq Bufor polimerazyInvitrogen10342020przez ThermoFisher
Taq DNA Polimeraza, rekombinowanaInvitrogen10342020przez ThermoFisher
dNTPsInvitrogen10297018przez ThermoFisher
AgaroseSigmaA9539przez Sigma-Aldrich
za pomocą pipet wirówkowe przez siarczan kanamycyny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39(2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88(2012).
  10. Foundation, C. F. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report. , Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016).
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6(2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118(2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113(2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548(2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083(2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813(2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144(2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biblioteka mutant w transpozonowychreplikacja bibliotekitechnika sterylnasterylizacja pin w replikatorap ytki z agarem LBblok g bokich do k wprzechowywanie w glicerolukontrola jako cizapobieganie kontaminacji

Powiązane artykuły