Hepatektomia zrazikowa częściowa: chirurgiczny model morfologicznej regeneracji wątroby

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy nową metodę częściowej resekcji lewego płata wątroby u noworodków (dzień 0) myszy. Ten nowy protokół jest odpowiedni do badania ostrego uszkodzenia wątroby i reakcji na uraz u noworodków.

Streszczenie

Morfologiczna regeneracja narządów po ostrej utracie tkanek jest powszechna wśród niższych kręgowców, ale rzadko obserwowana w życiu pourodzeniowym ssaków. Regeneracja wątroby u dorosłych osób po częściowej hepatektomii w 70% powoduje przerost hepatocytów z pewną replikacją w pozostałych płatach z przywróceniem aktywności metabolicznej, ale z trwałą utratą morfologii i architektury uszkodzonego płata. W tym artykule szczegółowo opisujemy nową metodę chirurgiczną u noworodka, która pozostawia środowisko fizjologiczne sprzyjające regeneracji. Model ten obejmuje amputację wierzchołka lewego płata, a następnie zachowawczy schemat leczenia i nie ma konieczności podwiązywania głównych naczyń wątroby lub uszkodzenia chemicznego, pozostawiając środowisko fizjologiczne, w którym może nastąpić regeneracja. Rozszerzamy ten protokół na amputacje u młodych myszy (P7-14), podczas których uszkodzona wątroba przechodzi od regeneracji narządów do wzrostu kompensacyjnego przez hipertrofię. Przedstawiony, krótki, trwający 30 minut protokół stanowi ramy do badania mechanizmów regeneracji, jej spadku związanego z wiekiem u ssaków oraz charakterystyki przypuszczalnego pnia wątroby lub komórek progenitorowych.

Wprowadzenie

Uważano, że zdolność do regeneracji organu, czyli przywracania formy i funkcji, została w większości utracona w czasie ewolucji. Stwierdzono, że potencjał regeneracyjny wątroby dorosłego ssaka po ostrym urazie chemicznym lub fizycznym obejmuje mobilizację wszystkich pozostałych hepatocytów, co skutkuje falami przerostu i kilkoma rundami podziału komórek, co skutkuje funkcjonalnym, ale architektonicznie odmiennym narządem^1,2,3,4,5. Ostatnio rozpoczęły się badania charakteryzujące regeneracyjną reakcję narządów noworodków ssaków na uraz w ciągu pierwszego tygodnia życia^6,7,8. Badania te wykazały, że w przypadku uszkodzenia podczas rozwoju noworodka, niektóre narządy ssaków reagują regeneracją morfologiczną zamiast wzrostu kompensacyjnego lub zwłóknienia^7,8.

Ostatnie badania wykazały, że regeneracja zarówno globalnej struktury, jak i funkcji zachodzi we wczesnym okresie noworodkowym^6,7,8. Ustalone protokoły uszkodzenia wątroby obejmują uszkodzenie chemiczne lub podanie etanolu^9,10,11, acetaminofen^12,13,14,15, tetrachlorek węgla^16,17,18,19, 70% częściowa hepatektomia^4,20,21, czyli usunięcie lewego i środkowego płata. Podawanie chemiczne prowadzi do śmierci komórek hepatocytów, ale często pozostawia nienaruszone mikro- i makrostruktury. Regeneracja morfologiczna nie może być łatwo badana w tym kontekście, ponieważ ogólna architektura wątroby nie została zatarta. Hepatektomia częściowa w 70% polega na podwiązaniu szwem głównych naczyń, co jest konieczne do zatrzymania krwawienia, ale pozostawia niefizjologiczne środowisko z trwałym zaburzeniem naczyń krwionośnych. Co więcej, metoda ta była stosowana tylko na dorosłych gryzoniach, a jej zastosowanie u noworodków jest technicznie niezwykle trudne. Mając to na uwadze, opracowaliśmy metodę, w której 20-30% wierzchołka lewego płata jest usuwane u nowonarodzonej myszy P0 (Rysunek 1A-1B). Metoda ta jest chirurgicznie zachowawcza, mało inwazyjna, nie stanowi wyzwania technicznego i prowadzi do całkowitej utraty morfologii bez podwiązania naczyń krwionośnych, pozostawiając miejsce na regenerację. Powstały w ten sposób protokół krok po kroku, opisany poniżej, pozwala każdemu badaczowi na wykonanie częściowej hepatektomii zrazikowej na nowonarodzikowych myszach w celu zbadania regeneracji noworodków ssaków we wczesnych stadiach życia poporodowego. Metoda ta ma również wyraźne zastosowanie w badaniach porównawczych z zakresu medycyny regeneracyjnej i biologii komórek macierzystych, ponieważ może być stosowana w wątrobie na późniejszych etapach życia.

Najczęstsze badania nad ostrym uszkodzeniem wątroby to uszkodzenia wywołane chemicznie, amputacja wątroby u dorosłych lub 70% częściowa hepatektomia. Uszkodzenia chemiczne często obejmują dożylne, dootrzewnowe lub doustne podanie paracetamolu, czterochlorku węgla lub etanolu i są stosunkowo łatwym i nieinwazyjnym modelem urazu. Jak wspomniano wcześniej, uszkodzenie chemiczne powoduje śmierć komórek hepatocytów, ale często pozostawia nienaruszone struktury zrębu i miąższu, co utrudnia twierdzenie o regeneracji morfologicznej. Uszkodzenia chemiczne często koncentrują się na naczyniach wątrobowych, co sprawia, że jest to przydatna technika do badania uszkodzeń specyficznych dla miejsca i komórek, ale także utrudnia badanie, na poziomie całego narządu, innych populacji, które mogą znajdować się dalej od naczyń i które mogą przyczyniać się do regeneracji. Pomimo tych ograniczeń, uszkodzenia chemiczne nadal pozostają użytecznym i wysoce fizjologicznie istotnym modelem urazu.

Częściowa hepatektomia u dorosłych 70% polega na usunięciu lewego i środkowego płata po podwiązaniu naczyń krwionośnych wątroby. Reakcja na hepatektomię została dobrze scharakteryzowana: amputowana wątroba 14 dni po 70% częściowej hepatektomii rozwija znacznie inną architekturę niż pierwotny nieuszkodzony płat, ponieważ hepatocyty pozostałego prawego i ogoniastego płata ulegają przerostowi i kilku rundom podziału komórkowego^4,5. Uzupełnia to utraconą masę i funkcję, ale nie regeneruje dwóch amputowanych płatów, a zatem nie zastępuje morfologii ogólnej. W rezultacie, reakcja na uraz po częściowej hepatektomii w 70% jest przydatna do badania kompensacyjnych mechanizmów wzrostu przy ograniczonej regeneracji.

Tutaj w pełni opisujemy protokół częściowej hepatektomii zrazikowej u noworodków. Procedura obejmuje odpowiednią selekcję i przygotowanie zwierząt, przygotowanie pola operacyjnego, operację i rekonwalescencję. Optymalizacja i adaptacja każdego z tych kroków może być wymagana dla różnych zastosowań protokołu.

Przeprowadziliśmy szeroko zakrojone prace i zoptymalizowaliśmy ten protokół na dzikich szczeniętach C57BL/6J (JAX 000664), jednak do badania różnych populacji komórek i mechanizmów regeneracji, użyliśmy również różnych transgenicznych zwierząt, w tym myszy posiadających różne transgeny Cre i CreERT2 i/lub knock-iny (Axin2^CreERT2 JAX 018867 i Sox9^CreERT2 JAX 018829) w połączeniu z reporterami fluorescencyjnymi, takimi jak systemy Rainbow i mTmG (R26^VT2/GK3, R26^mT/mG)^22,23. Nie stwierdziliśmy potrzeby zmiany tej metodologii dla różnych szczepów myszy, ponieważ nie zaobserwowano żadnych różnic w wynikach przeżycia ani potencjale regeneracyjnym

.

Oprócz używania różnych szczepów zwierzęcych, przeprowadziliśmy również częściową hepatektomię zrazikową na noworodkach myszy leczonych małymi cząsteczkami, takimi jak 4-hydroksy-tamoksyfen i 5-etynylo-2′-deoksyurydyna (EdU). Jako rozpuszczalniki stosowano dimetylosulfotlenek (DMSO) i etanol, ponieważ stwierdzono, że olej kukurydziany był istotną przyczyną zachorowalności. Poza tym stwierdziliśmy, że dootrzewnowe podawanie małych cząsteczek nie wpływało na przeżycie ani wyniki regeneracji. Przewidujemy, że protokół ten zostanie zaadaptowany do stosowania z innymi małymi cząsteczkami w celu zbadania różnych aspektów regeneracji.

Operacje na noworodkach na myszach mogą być technicznie trudne i mogą wymagać specjalistycznej wiedzy w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami i mikroskopijnego preparowania. Wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli zwierząt jest niezbędna, aby uniknąć kanibalizmu u matki po operacji i w okresie rekonwalescencji.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) oraz Panel Administracyjny Uniwersytetu Stanforda ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (APLAC), (numer protokołu #10266) oraz w Stanach Zjednoczonych, czyli Europejską Ustawę o Dobrostanie Zwierząt, Dyrektywę 2010/63/UE. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Rządu Bawarii w Niemczech i otrzymał pozwolenie nr: 55.2-1-54-2532-150-2015.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Przygotuj pustą klatkę z odpowiednią ściółką na poduszce grzewczej.
2. Przed dotknięciem zwierząt w rękawiczkach wetrzyj pościel matki w rękawiczki.
3. Usuń wszystkie szczenięta od matki i umieść je w pustej klatce. Usuń część ściółki matki i umieść ją w pustej klatce ze szczeniętami.
4. Umieść matkę w oddzielnej, czystej, suchej klatce z dala od pola operacyjnego.
5. Załóż nowe, czyste, sterylne rękawice przed przygotowaniem pola operacyjnego.

2. Przygotowanie pola operacyjnego

1. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dodaj 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do 10-centymetrowej szalki Petriego.
2. Odpipetować pipetą 2 ml betadyny lub równoważnego roztworu antyseptycznego na 10-centymetrowej szalce Petriego.
3. Umieść lunetę sekcyjną na polu operacyjnym. Włącz lampę lunety sekcyjnej i dostosuj poziom światła do komfortu chirurga. Szczeniaka można umieścić w polu operacyjnym pod lampą prosektoryjną. Odpowiednie światło można potwierdzić przez brak cieni na brzusznej powierzchni młodego.
4. Przygotować komorę anestezjoterapeutyczną z izofluranem (patrz Tabela Materiałów) ze stożkiem nosowym. Komorę należy oczyścić bez śladów moczu lub kału. Umieść stożek nosowy i związane z nim rurki pod lunetą sekcyjną w polu operacyjnym. Przekierować przepływ tlenu i izofluranu wyłącznie do stożka nosowego.
5. Przygotować obszar rekonwalescencji pooperacyjnej za pomocą poduszki grzewczej ustawionej na około 37 °C. Rekonwalescencja pooperacyjna powinna składać się z 4 kawałków gazy umieszczonych na poduszce grzewczej. Jeśli to możliwe, wcieraj gaziki w pościel, kał i mocz matki, aby zachować zapach matki.
   UWAGA: Nie zaleca się używania lampy grzewczej, ponieważ utrudnia to kontrolowanie temperatury. Podwyższone temperatury spowodują śmierć nowonarodzonych myszy.
6. Przygotuj i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Potrzebne narzędzia to: nożyczki do mikropreparacji, kleszcze do mikropreparacji, gaza, hemostat i dowolny niewchłanialny szew monofilamentowy 6-0. Narzędzia chirurgiczne można sterylizować dowolnym sterylizatorem z kulkami szklanymi.

3. Częściowa hepatektomia zrazikowa

1. Znieczul szczeniaka, umieszczając go w stożku nosowym na plecach i delikatnie przyklejając stopy i dłonie na miejscu. Szczenię powinno otrzymywać 5% izofluranu w tlenie.
   1. Pozwól szczeniakowi siedzieć przez 5 minut lub do momentu, gdy zostanie odpowiednio znieczulony, co można zweryfikować za pomocą testu szczypania palców u nóg.
   2. Wstrzyknąć 5 mg/kg karprofenu podskórnie przed nacięciem.
      UWAGA: Cały zabieg nie powinien trwać dłużej niż 30 minut. Gorsze wyniki można zaobserwować u noworodków, które są w znieczuleniu ogólnym przez ponad 30 minut. Podejmij środki ostrożności, aby zminimalizować czas trwania operacji poprzez dokładne przygotowanie terenu i zwilżenie skóry przed zamknięciem, aby zminimalizować rozdarcia skóry wywołane szwami.
2. Delikatnie oczyść tylną ścianę brzucha małym gazikiem zwilżonym betadyną. Pozostaw betadynę do wyschnięcia na 1 minutę.
3. Wykonaj lewe nacięcie pośrodkowe obojczyka 0,5 cm bezpośrednio pod klatką piersiową za pomocą nożyczek do mikropreparowania i kleszczy. Delikatnie oddziel skórę za pomocą kleszczy i wykonaj drugie głębsze nacięcie w jamie otrzewnej (patrz rysunek 1C, po lewej i pośrodku)
4. Delikatnie wywieraj boczny nacisk z obu stron brzucha za pomocą tylnych, końców nożyczek do mikropreparowania i kleszczy, aby wypchnąć wierzchołek lewego płata z jamy otrzewnej. Lewy wierzchołek lewego płata powinien być łatwo widoczny (Rysunek 1C, po prawej).
5. Z wierzchołka amputuj i zważ ilość tkanki do usunięcia.
   1. Za pomocą nożyczek do mikropreparacji delikatnie amputuj żądaną ilość tkanki z wierzchołka lewego płata.
   2. Umieść amputowaną tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml wypełnionej PBS. Zważyć amputowaną tkankę za pomocą wagi analitycznej (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Połóż kawałek gazy lub papieru na wadze i wytaruj go. Następnie umieść amputowaną tkankę na gazie lub papierze i zmierz jej masę.
   3. Utrwalić amputowany obszar w 2% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i umieścić w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na suchym lodzie w celu analizy zamrożonych sekcji. Analizuj zamrożone sekcje, wycinając odcinki o wielkości 7-10 μm za pomocą dowolnego standardowego kriostatu.
6. Za pomocą zwiniętego kawałka gazy delikatnie włóż lewy płat do jamy otrzewnej. Pozostaw gazę w jamie do momentu ustania krwawienia.
7. Zdjąć gazę i zwilżyć pole operacyjne oraz okolice gazą nasączoną PBS.
8. Zamknij pole operacyjne monofilamentowymi, niewchłanialnymi szwami 6-0 ze ściegiem biegowym. Otrzewną i skórę należy zamykać oddzielnie.
   UWAGA: Delikatne zwilżenie skóry gazą nasączoną PBS może zminimalizować rozdarcia wywołane szwami.
9. Delikatnie, ale dokładnie oczyść szczenię gazą nasączoną PBS i upewnij się, że nie ma pozostałości krwi ani betadyny. Zwiń nasączony gazik i delikatnie wyszoruj ślad rany, aby usunąć krew lub betadynę.
   UWAGA: Jest to szczególnie ważne, ponieważ matka może kanibalizować młode, jeśli zostaną one nieodpowiednio oczyszczone.
10. Usuń szczenię ze stożka nosowego i umieść je w obszarze odzyskiwania, który obejmuje gaziki wystawione na kał i mocz matki. Gdy szczenię wyzdrowieje, zastąp szczenię w pustej klatce ściółką matki.
    UWAGA: Nie używaj lampy grzewczej. Użycie lampy grzewczej może spowodować przegrzanie noworodka.
11. Powtórz procedurę na żądanej liczbie szczeniąt. Chociaż wszystkie szczenięta mogą być wykorzystane, ogólnie zaleca się pozostawienie kilku młodych, które nie są operowane, aby zostały zastąpione razem z operowanymi szczeniętami.
12. Zastąp wszystkie szczenięta jednocześnie ściółką matki w klatce matki.

4. Odzyskiwanie i analiza

1. Codziennie obserwuj myszy.
   1. Sprawdź, czy rana pozostaje zamknięta i usuń wszelkie martwe szczenięta, jeśli są obecne.
   2. Jeśli rana otworzy się ponownie, przygotuj miejsce operacji i obszar rekonwalescencji zgodnie z wcześniejszym opisem i powtórz kroki od 3.8 do 3.12.
   3. Wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg karpofenu 24 i 48 godzin po zabiegu.
   4. Obserwuj szczenięta przez 56 dni lub dłużej.
2. Poddać zwierzęta eutanazji po pożądanej liczbie dni po operacji poprzez narażenie na dwutlenek węgla (CO₂) i zwichnięcie szyjki macicy.
   1. Umieść myszy w komorze indukcyjnej / eutanazyjnej i włącz CO₂ , aż myszy przestaną oddychać.
   2. Zapewnić eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy. Naciśnij grzbietową szyję myszy za pomocą palca wskazującego i kciuka, a drugą ręką pociągnij w dół za ogon.
3. Usuń całą wątrobę en bloc i zważ ją.
   1. Ostrożnie oddziel każdy płat i zważ osobno.
      UWAGA: Usuń wątrobę, ostrożnie preparując przeponę oraz naczynia wątrobowe i wrotne. Oddziel płaty od siebie, ostrożnie preparując każdy płat w jego bliższym przyczepie.
4. Określ zakres regeneracji, porównując masę amputowanego lewego płata z masą całej wątroby. Nieuszkodzony lewy płat stanowi około 30% całej wątroby.

Wyniki

Rysunek 1A przedstawia ogólny harmonogram częściowej hepatektomii zrazikowej u noworodków (schemat w Rysunek 1B) oraz oczekiwany czas oczekiwania na zaobserwowanie regeneracji. Subtelną regenerację lewego płata można zaobserwować po 7-14 dniach od zabiegu. Pełną regenerację często obserwowano po 56 dniach od zabiegu. Myszy nie powinny wykazywać żadnych oznak nieprawidłowości fizjologicznych po zabiegu.

Dyskusja

Ostre uszkodzenie wątroby było tradycyjnie badane przy użyciu modeli chemicznych (paracetamol, etanol, czterochlorek węgla) lub chirurgicznych (70% częściowa hepatektomia). Odpowiedź regeneracyjna po 70% częściowej hepatektomii została scharakteryzowana jako obejmująca globalny przerost hepatocytów i wiele rund podziału komórek ^4,5. Aby jednak zatrzymać krwotok, model ten jest ograniczony, ponieważ główne naczynia muszą zostać podwiązane, pozostawiając nienormaln...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zwierzęta
Matka z miotem 0 nowonarodzonych szczeniąt dnia 0 (dowolny szczep)
Matka zastępcza i miot zastępczy (opcjonalnie)
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Standardowe odczynniki
Fosforanowa surowica buforowana (PBS)
Prowidyna-jod lub równoważny roztwór
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Sprzęt chirurgiczny
Mikroskop preparacyjny	Zeiss	ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000
Mikronożyczki sprężynowe proste 3 mm	Vannas	72932-01
5SF Kleszcze	Dumont	11252-00
Proste kleszcze Kelly	Grainger	17-050G
Poduszka grzewcza	Sunbeam	000771-810-000
Isoflurane	Abbott Labs	0044-5260-05
System znieczulenia gryzoni	Kent Scientific	1205S
Gaza, 10,16 x 10,16 cm	Fisher Scientific	13-761-52
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wyposażenie standardowe
1,5 ml probówka do mikrowirówek	Eppendorf	22363204
6-0 Nici monokrylowe	Ethicon	MCP489G
szalka Petriego	Fisher Scientific	S35839
Pipet-Aid, Gładki, 110V	Drummond	4-000-110
Wagi analityczne Mettler Toledo NewClassic ME	Fisher Scientific	01-912-402
Niska komora indukcyjna	Kent Scientific	SOMNO-0730