Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

Summary

W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Abstract

Ryba karpiowata Nothobranchius furzeri jest nowym organizmem modelowym w dziedzinie ekotoksykologii i wykazano jej przydatność w testach ekotoksyczności ostrej i przewlekłej. Ogólnie rzecz biorąc, wrażliwość gatunku na związki toksyczne mieści się w zakresie lub jest wyższa niż w przypadku innych gatunków modelowych.

Ta praca opisuje protokoły dla ostrych, przewlekłych i wielopokoleniowych testów biologicznych pojedynczych i połączonych efektów stresorowych na N. furzeri. Ze względu na krótki czas dojrzewania i cykl życiowy, ten model kręgowców umożliwia badanie punktów końcowych, takich jak czas dojrzewania i płodność, w ciągu czterech miesięcy. Międzypokoleniowe badania narażenia w pełnym cyklu życia można przeprowadzić już po 8 miesiącach. Ponieważ gatunek ten wytwarza jaja, które są odporne na suszę i pozostają żywotne przez lata, hodowla gatunku na miejscu nie jest potrzebna, ale w razie potrzeby można rekrutować osobniki. Protokoły mają na celu pomiar cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Introduction

Opisano profile wrażliwości szeregu gatunków na strategicznie wybrane substancje toksyczne¹ dla europejskiego prawodawstwa REACH (Rejestracja, Ocena, Autoryzacja i Ograniczenia Chemikaliów). W tym celu najczęściej stosowano badania toksyczności ostrej lub krótkookresowej, ponieważ dają one szybkie wskazanie wrażliwości gatunku. Jednak w swoim naturalnym środowisku organizmy są narażone przez znacznie dłuższe okresy i może to mieć wpływ na pełne cykle życiowe, a nawet kilka pokoleń². Co więcej, organizmy w zanieczyszczonym środowisku są zazwyczaj narażone na więcej niż jeden stresor na raz, który może wchodzić ze sobą w interakcje, co może prowadzić do efektów synergicznych³. W związku z tym bezpieczne stężenia obliczone na podstawie badań ostrej toksyczności pojedynczego czynnika stresogennego mogą zaniżać rzeczywiste ryzyko, jakie stwarzają substancje toksyczne w środowisku naturalnym. W związku z tym wskazane jest również zbadanie przewlekłych i wielopokoleniowych skutków subletalnych stężeń substancji toksycznych w kontekście istotnym dla środowiska, zgodnie z zaleceniami Komisji Europejskiej^4,5 i USEPA (Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych)^6,7. Szczególnie w badaniach nad kręgowcami koszty pod względem pracy, pieniędzy i czasu są wysokie w przypadku wykonywania badań narażenia przewlekłego i wielopokoleniowego ze względu na stosunkowo długą żywotność kręgowców w porównaniu z modelowymi organizmami bezkręgowców. Dlatego wskazane jest, aby w zależności od pytania badawczego wybrać najbardziej odpowiedni organizm modelowy ryby. Ponadto powinien być dostępny szeroki wachlarz gatunków kręgowców w celu zbadania ogólności reakcji między gatunkami, aby móc dostosować przepisy w oparciu o najbardziej wrażliwe gatunki. Na razie istnieje potrzeba opracowania nowych, wydajnych protokołów z modelowymi gatunkami kręgowców charakteryzujących się krótkimi cyklami życiowymi, aby obniżyć koszty wykonywania przewlekłych i wielopokoleniowych ekspozycji na kręgowcach^7,8.

Turkusowa karpia Nothobranchius furzeri jest interesującym modelem ryb do wykorzystania w takich długoterminowych eksperymentach ekspozycyjnych, ze względu na krótki czas dojrzewania i cykl życia (czas generacji krótszy niż 4 tygodnie⁹). Oznacza to, że istotne z ekologicznego punktu widzenia punkty końcowe, takie jak czas dojrzewania i płodność, mogą być badane w krótkim czasie w porównaniu z innymi modelami ryb⁷. Co więcej, ryby te wytwarzają odporne na suszę, uśpione jaja, które zachowują żywotność przez kilka lat, gdy są przechowywane w standardowych warunkach, eliminując w ten sposób potrzebę ciągłej hodowli⁹. W badaniach ekotoksykologicznych oznacza to również, że wszystkie replikowane ryby mogą wykluć się dokładnie w tym samym momencie, co skutkuje synchronizacją czasową dla wszystkich zwierząt, nawet między partiami jaj wyprodukowanych w różnym czasie. Zalecamy korzystanie z laboratoryjnego szczepu GRZ do przeprowadzania eksperymentów ekspozycyjnych. Szczep ten dobrze radzi sobie w warunkach laboratoryjnych, jest homozygotyczny (z wyjątkiem chromosomów płciowych), a genom jest dobrze scharakteryzowany^10,11.

W badaniach ekotoksykologicznych ważne jest, aby wybrać odpowiedni zakres stężeń testowych. W tym celu można zastosować kilka uzupełniających się metod. Nominalny zakres stężeń może być oparty na czułości pokrewnego gatunku, takiego jak Nothobranchius guentheri¹². Alternatywnie, zakres może być oparty na czułości standardowych modeli ryb, takich jak danio pręgowany (Danio rerio)², które mają porównywalną czułość na większość substancji toksycznych (Philippe i wsp. (w trakcie przeglądu)). W połączeniu, z obiema tymi opcjami, należy przeprowadzić eksperyment ustalający zakres w celu wybrania nominalnego zakresu stężeń. W przypadku badań ostrych badacze powinni dążyć do leczenia stężeniem ze 100% śmiertelnością, śmiertelnością średnią i 0% śmiertelnością po 24 godzinach ekspozycji na substancję toksyczną. W przypadku badań przewlekłych zaleca się przeprowadzenie dwutygodniowego eksperymentu polegającego na ustaleniu zakresu stosowania w celu sprawdzenia, czy śmiertelność larw w stanie, w którym występują najwyższe stężenia testowe, nie przekracza 10 % w tym okresie referencyjnym.

Protokół może służyć jako punkt odniesienia do przeprowadzania ostrej i przewlekłej ekspozycji na zanieczyszczenia wodne na N. furzeri, badając potencjalne skutki stresorów zarówno na poziomie indywidualnym, jak i komórkowym. Można go również wykorzystać do prowadzenia badań nad wieloma czynnikami stresogennymi w celu uwzględnienia większego znaczenia ekologicznego, mieszania różnych związków toksycznych lub badania interaktywnych skutków między zanieczyszczeniem a innymi naturalnymi czynnikami stresogennymi (np. drapieżnictwo) lub stresorami antropogenicznymi (np. ocieplenie spowodowane zmianą klimatu).

Protocol

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki KULeuven.

1. Wylęg i ogólna pielęgnacja N. furzeri

1. Przygotować pożywkę rybną (pH 7) w temperaturze 14 °C i dodać oczyszczoną wodę typu II z dodatkiem standaryzowanych soli do przewodności 600 μS/cm (24 °C).
2. Wybierz jaja z linii laboratoryjnej GRZ (Gona-Rhe-Zhou), które były przechowywane w standardowych warunkach¹³. Wybierz jaja w fazie DIII (tj. gotowe do wyklucia), rozpoznawalne po obecności golden eyes⁹ i delikatnie przenieś je miękką pęsetą do plastikowego zbiornika o pojemności 2 litrów (nie więcej niż około 30 jaj na zbiornik).
   UWAGA: Aby mieć wystarczającą liczbę zdrowych organizmów testowych, należy wykluć dwa razy więcej jaj niż wymagana liczba larw ryb.
3. Dodać 1 cm podłoża rybnego w temperaturze 12 °C i pozwolić, aby temperatura wody stopniowo zbliżała się do temperatury pokojowej (24 °C)⁹. Ryby wyklują się w ciągu pierwszych 12 godzin.
4. Po 24 godzinach nakarm pisklęta skoncentrowaną dawką świeżo wyklutych Artemianauplii (więcej szczegółów na temat częstotliwości i ilości pokarmu można znaleźć w protokole hodowlanym Polačika i in. 2016⁹) i zwiększ głębokość wody do 5 cm, dodając podłoże dla ryb.
5. Po 36 godzinach nakarm pisklęta kolejną skoncentrowaną dawką świeżo wyklutych naupliów artemii i dodaj pożywkę rybną, aby zwiększyć głębokość wody do 10 cm.
6. Pojemniki na ryby należy inkubować w warunkach stałej temperatury (np. w inkubatorze, pomieszczeniu klimatycznym lub w podgrzewanej łaźni wodnej) w reżimie 14 h:10 h światło:ciemność.
7. Przed rozpoczęciem doświadczenia należy umieścić złożone pojemniki na ryby (bez ryb) w związku ekspozycyjnym, napełniając je medium o najwyższym stężeniu i pozostawiając je na noc w celu ograniczenia przenoszenia substancji toksycznych do pojemnika w rzeczywistym doświadczeniu.
8. 48 godzin po wykluciu wybierz zdrowe, pływające larwy, aby rozpocząć eksperyment ekspozycji. Pozbądź się tzw. brzuszków, które nie były w stanie napełnić pęcherza pławnego i w konsekwencji mają upośledzoną pływalność (ciągle opadają na dno).

2. Protokół krótkotrwałej ekspozycji

UWAGA: Badacze powinni dążyć do co najmniej 20 powtórzeń (20 ryb w oddzielnych słoikach) na zabieg. Oprócz pełnego leczenia kontrolnego, należy włączyć kontrolę rozpuszczalnika, jeśli roztwór podstawowy związku jest przygotowywany przy użyciu rozpuszczalnika. Kontrola rozpuszczalnika powinna zawierać ilość rozpuszczalnika równą stężeniu rozpuszczalnika w najwyższym stężeniu ekspozycji.

1. Przygotować pojemniki doświadczalne (szklane słoiki o pojemności 0,5 l), etykietując je i napełniając odpowiednim medium ekspozycyjnym (różne stężenia substancji toksycznych). Dodaj związek, aby uzyskać odpowiednie stężenie.
2. Larwy (48 godzin po wykluciu) przenieść pojedynczo do pojemników (1 ryba na pojemnik do indywidualnego monitorowania).
   UWAGA: Ryby są wystawiane indywidualnie, aby zminimalizować potencjalne zakłócające skutki interakcji społecznych, takie jak rywalizacja o pożywienie i agresja. Ryby mogą jednak wchodzić w interakcje wzrokowe zgodnie z normami etycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych.
3. Obserwuj tę ostrą ekspozycję przez okres do 2 tygodni. W tym czasie karm ryby ad libitum naupliami artemii dwa razy dziennie, 7 dni w tygodniu.
4. Odświeżaj podłoże co drugi dzień, aby utrzymać jakość wody i zminimalizować potencjalne skutki degradacji związku. Monitoruj kluczowe zmienne wody (poziom rozpuszczonego tlenu powinien przekraczać 80%, przewodność powinna mieścić się w zakresie od 600 do 700 μS/cm, pH od 7,8 do 8,2, a twardość (jako_CaCO3) między 350 a 450 mg/L, co leży w zakresie optymalnych warunków hodowli dla N. furzeri ⁹). Pobrać próbki wody przed i po odświeżeniu pożywki w celu określenia rzeczywistych stężeń związków.
5. Punkty końcowe
   1. Codziennie (rano, wieczorem) sprawdzaj ryby pod kątem śmiertelności, stresu (np. nieprawidłowego zachowania: pływania do góry nogami) lub chorób. Zapoznaj się z publikacją Shedd et al. (1999)¹², aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obserwacji śmiertelności, stresu lub choroby.
   2. Oblicz wartości LC₅₀ na podstawie śmiertelności przy użyciu krzywych dawka-odpowiedź (Ritz i Streibig, 2005) w różnych punktach czasowych. Użyj funkcji drm w pakiecie drc w języku R 3.2.3 (R Development Core Team, 2016) lub podobnych podejść statystycznych.

3. Protokół chronicznego narażenia

UWAGA: Celuj w minimum 25 ryb/kondycję na początku eksperymentu, aby zminimalizować szanse na wypaczenie proporcji płci i uwzględnić potencjalną śmiertelność tła z przyczyn naturalnych (np. śmiertelność związaną z wiekiem).

1. Wylęg (patrz sekcja 1)
2. Faza I (2 dni po wykluciu - 16 dni po wykluciu)
   1. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w 2.1 - 2.4
   2. Podobnie jak w drugiej fazie eksperymentu, podłoże będzie ulegać degradacji przez cały tydzień (bez odświeżania, patrz poniżej). Wymaganą ilość podłoża należy przechowywać przez tydzień w dużych obojętnych pojemnikach, aby umożliwić podobną degradację związku.
3. Faza II (16 dni po wykluciu - koniec)
   1. Przygotuj eksperymentalne szklane słoiki o pojemności 2 l, mieszając je ze związkiem. Napełnij słoiki odpowiednim medium ekspozycyjnym i dodaj rurkę powietrzną, aby napowietrzyć słoik. Trzymaj ryby pojedynczo w tych słoikach przez pozostałą część eksperymentu. Pozwól na interakcję wizualną, aby dostosować się do standardów etycznych.
   2. Odświeżaj podłoże raz w tygodniu. Przenieść rybę z siatką do nowego słoika zawierającego to samo podłoże ekspozycyjne. Pobieraj próbki wody codziennie przez tydzień, aby monitorować degradację związku w każdym stężeniu. Należy obliczyć krzywą degradacji dla każdego zabiegu, jeżeli badanych jest wiele czynników stresogennych (np. toksyczność związku w różnych reżimach temperaturowych). Mierz parametry abiotyczne (pH, temperatura, % rozpuszczonego tlenu, przewodność) trzy razy w tygodniu.
   3. Od 2 dni po wykluciu (dph) do 23 dph karmić ryby dwa razy dziennie, 7 dni w tygodniu ad libitum Artemia nauplii. Od 24 dph - 37 dph uzupełnij dietę ad libitumArtemia posiekanymi larwami Chironomus. Od 38 dph karm ryby dwa razy dziennie, 7 dni w tygodniu ad libitum mrożone larwy Chironomus.
4. Punkty końcowe
   1. Codziennie sprawdzaj ryby pod kątem śmiertelności, stresu lub choroby¹².
   2. Aby określić wzrost, mierz wielkość ciała co tydzień (9 dph - 16 dph - 21 dph - ...), przenosząc ryby na szalkę Petriego wypełnioną pożywką z ich zbiornika. Zrób 4 - 5 skalibrowanych zdjęć ryb z góry (na ustalonej wysokości) i przeanalizuj je cyfrowo za pomocą programu do pomiarów przestrzennych (np. ImageJ).
      UWAGA: W przypadku dorosłych ryb należy używać wyższej szalki Petriego, aby zminimalizować stres związany z obsługą, utrzymując wszystkie ryby zanurzone podczas całego procesu pomiaru.
   3. W przypadku dojrzewania samców należy codziennie sprawdzać wzrokowo ryby pod kątem wybarwienia od 15 dph. Sprawdź płetwy pod kątem pierwszych oznak ubarwienia godowego (drugorzędna cecha płciowa). Użyj pierwszego dnia, w którym jest to widoczne, jako wskaźnika czasu dojrzewania samców.
   4. Ryby bez płci należy łączyć w pary z samcami z tej samej grupy poddanej działaniu substancji lub samcami nieeksperymentalnymi trzy razy w tygodniu od 30 dph w celu określenia czasu dojrzewania samicy (dzień złożenia pierwszego jaja). W tym celu należy skorzystać z protokołu tarła opisanego w 3.4.5.
   5. W celu uzyskania płodności należy łączyć dojrzałe samice z dojrzałymi samcami 3 razy w tygodniu od 30 dph wzwyż, w ramach ich zabiegów przy użyciu schematu krzyżowania.
      1. Przygotuj zbiornik tarłowy (1 l) dla każdej pary, używając pożywki ekspozycyjnej z akwarium męskiego uzupełnionej podłożem tarłowym (drobny piasek <500 μm).
      2. Przenieś zarówno samca, jak i samicę do zbiornika tarłowego i pozwól im się tarlić przez dwie godziny. Podczas tego procesu zminimalizuj aktywność człowieka lub zakłócenia wokół pojemników tarłowych.
      3. Następnie należy delikatnie przenieść ryby z powrotem do ich pierwotnych pojemników, bez zbędnego mieszania wody, która spowodowałaby zawirowanie ikry w podłożu tarłowym.
      4. Odfiltruj jaja, wylewając podłoże tarłowe na siatkę o wielkości 500 μm. Policz jajka i przenieś je (za pomocą miękkiej pęsety) na wilgotny mech torfowy na szalkach Petriego^9,14.
      5. Codziennie usuwaj martwe jaja. Po tygodniu zamknąć szalkę Petriego folią uszczelniającą i przechowywać ją w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 28 °C i w cyklu 14:10 godzina światło:ciemność w celu natychmiastowego przejścia do fazy DIII (tj. gotowości do wyklucia po około trzech tygodniach). W przypadku długotrwałego przechowywania jaja należy przechowywać w temperaturze 17 °C w stałej ciemności, po której jaja wchodzą w fazę spoczynku i zachowują żywotność przez wiele lat. Podczas rekrutacji ryb z tych uśpionych jaj do eksperymentów, przenieś uśpione jaja do warunków 28 °C z cyklem światło:ciemność 14:10 h przez około trzy tygodnie, aby umożliwić rozwój do fazy DIII.
   6. Zmierz krytyczne maksimum termiczne (CTmax) (miara wydajności¹⁵) dorosłych ryb.
      1. Używać łaźni wodnej, która jest podgrzewana ze stałą prędkością 0,33 °C/min i w której woda jest stale cyrkulowana. Dodaj kilka akwariów o pojemności 1 l dla każdej ryby.
         UWAGA: Ze względu na ograniczenia przestrzenne w kąpieli wodnej konieczna jest praca w kilku seriach. Potencjalne różnice w warunkach między seriami powinny być brane pod uwagę przy przeprowadzaniu analizy statystycznej poprzez włączenie "serii" jako czynnika losowego.
      2. Rozpocznij próbę od dodania ryby do akwarium, gdy woda w akwarium osiągnie eksperymentalną temperaturę hodowli ryb (zwykle 28 °C). Monitoruj temperaturę w akwariach o pojemności 1 l wanny CTmax co 5 minut za pomocą termometru cyfrowego (skala 0,1 °C).
      3. Zakończ próbę, gdy ryba nie utrzyma pozycji grzbietowo-brzusznej pionowej lub zacznie mocno drgać^16,17. Zmierz temperaturę w akwarium o pojemności 1 l, co jest krytyczną temperaturą maksymalną. Przenieś rybę z powrotem do jej eksperymentalnego pomieszczenia w celu odzyskania.
   7. Zmierz wagę (z dokładnością do 0,1 mg) ryby w ostatnim dniu eksperymentu, osuszając ją i przenosząc na łódkę wagową. UWAGA: Wszystkie ryby należy zmierzyć cztery godziny po ostatnim karmieniu, aby ujednolicić masę pokarmu w przewodzie pokarmowym.
   8. Poddaj rybę eutanazji za pomocą 0,1% trikainy.

4. Protokół ekspozycji międzypokoleniowej

UWAGA: Aby zmierzyć międzypokoleniowy wpływ zanieczyszczeń na N. furzeri, postępuj zgodnie z protokołem chronicznego narażenia opisanym powyżej dla pierwszej generacji.

1. Dwa razy w tygodniu sprawdzaj rozwój wyprodukowanych jaj (tj. drugiego pokolenia) przechowywanych w temperaturze 28 °C 14:10h w cyklu światło-ciemność, sprawdzając szalki Petriego pod kątem zarodków w fazie DIII (zob. Polačik i wsp. 2016⁹). Gdy w pełni rozwinie się więcej niż 50 powtórzeń każdego leczenia rodzicielskiego, należy je wykluć zgodnie z protokołem opisanym w ppkt 1.1.
2. Wystaw zdrowe, wyporne ryby na dokładnie taką samą konfigurację i traktowanie, jak ryby rodzicielskie.

Results

Wyniki ostrej ekspozycji N. furzeri na różne stężenia miedzi, obliczone jak w 2.5.2, pokazują zależności cleardase-response (Rysunek 1). Wraz ze wzrostem stężenia substancji toksycznych następuje wzrost śmiertelności. Wartości LC₅₀ zmniejszają się z czasem, co oznacza, że wraz ze spadkiem stężeń mija więcej czasu, zanim 50% kontrprób umrze. Szczegółowe wyniki dotyczące ostrego i przewlekłego narażenia N. furzeri na miedź, a także ...

Discussion

Praca ta opisuje nowy test biologiczny wykorzystujący Nothobranchius furzeri, wyłaniający się organizm modelowy, do badania indywidualnych i połączonych długoterminowych skutków substancji toksycznych i innych czynników stresogennych. Przedstawione protokoły z powodzeniem zastosowano do pomiaru wrażliwości gatunku na szereg substancji toksycznych (miedź, kadm, 3,4-dichloroanilina i chloropiryfos). Ze względu na szybki cykl życiowy ten model kręgowców pozwala na ocenę skutków subletalnych i międzypokoleniowych w ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
woda oczyszczona Typ 1 (milli Q)	Millipore
Sea Salt	Instant Ocean
2L plastikowy zbiornik	SAVIC		Zawsze oddzielny materiał do kontroli i leczenia toksyczności
1L plastikowy zbiornik (tarło)	Avamoplast		Zawsze oddzielny materiał do kontroli i leczenia toksyczności
siatki	Aqua bilzen		Zawsze oddzielny materiał do kontroli i leczenia toksyczności
Słoiki szklane 2L	Sepac-Flacover		Zawsze oddzielny materiał do kontroli i leczenia toksyczności
0,5L słoiki szklane	Sepac-Flacover		Zawsze oddzielny materiał do leczenia kontroli i toksyczności
Jaja artemii	Ocean Nutrition
chironomus	Ocean Nutrition		mrożone
tricaine,	szalki Petriego Sigma, Aldrich
	VWR
Parafilm	VWR
,	MLS
, pęsety,	FST
500 i mikro; m sito siatkowe	/		samodzielnie wykonana
probówka do mikrowirówki (2 ml)	MARKA		Do przechowywania ryb w
szklanych fiolkach	zamrażarki Sigma aldrich		Do analizy wody
łódź ważąca	MLS
Jiffy 7c granulki	Jiffy
	Gilac		do
ciekłego azotu Ctmax	Termometr cyfrowy Air Liquide
	Testo AG	termiczna testo 926
HETO	Anker Schmitt
Kamera
	/
platforma do kamery	/		samodzielnie wykonany
zestaw wielofunkcyjny	HACH
Zamrażarka (-80° C)			niskotemperaturowa Panasonic Ultra
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fysio
homogenizacyjny	VWR		0,1  M TRIS– HCl, pH 8,5, 15 % poliwinylopirolidon, 153  &mikro; M MgSO4  i 0,2 % Triton X-100
chloroform: metanol	Sigma Aldrich
tripalmitynian glicerolu	Sigma Aldrich
amyloglukozydaza	Sigma	Aldrich A7420
odczynnik do oznaczania glukozy	Sigma Aldrich	G3293
Barwnik białkowy Biorad
	Greiner Bio-one
384 Rurki	Greiner Bio-one
2 ml Fiers			Do analizy zawartości tłuszczu
2,5 ml probówki eppendorfa Homogenizator	VWR
	Ultra-turrax TP 18/10
	Grzałka Infinite M200 TECAN
do szklanych probówek	Wirówka reaktorowa
	Eppendorf Wirówka 5415 R
Inkubator	Bumako