Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Summary

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Abstract

Ze względu na niedawny postęp technologiczny, mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) szybko staje się standardową metodą analizy strukturalnej kompleksów białkowych do rozdzielczości atomowej. Wąskim gardłem pozostają jednak techniki izolacji białek i metody przygotowania próbek do EM. Stosunkowo niewielka liczba (od 100 000 do kilku milionów) pojedynczych cząstek białka musi zostać zobrazowana w celu analizy białek w wysokiej rozdzielczości metodą EM pojedynczej cząstki, co umożliwia zastosowanie zminiaturyzowanych technik obsługi próbek i zasad mikroprzepływowych.

Przedstawiono zminiaturyzowaną, wolną od bibuły metodę przygotowania siatki EM do wstępnego kondycjonowania próbki, gruntowania siatki EM i obróbki końcowej, która zużywa tylko nanolitrowe objętości próbki. Metoda wykorzystuje system dozowania z precyzją sub-nanolitrów do kontrolowania wchłaniania cieczy i zalewania siatki EM, platformę do kontrolowania temperatury siatki, określając w ten sposób wilgotność względną nad siatką EM, oraz mechanizm podnoszenia i zanurzania do witryfikacji próbki. W przypadku cryo-EM siatkę EM umieszcza się na stoliku o kontrolowanej temperaturze, a próbkę zasysa się do kapilary. Końcówka kapilarny jest umieszczana w pobliżu powierzchni siatki, siatka jest ładowana próbką, a nadmiar jest ponownie zasysany do mikrokapilary. Następnie folia próbki jest stabilizowana i nieznacznie rozcieńczana przez kontrolowane parowanie wody regulowane przesunięciem temperatury platformy w stosunku do punktu rosy. W pewnym momencie uruchamiany jest mechanizm podnoszenia i zanurzania, który szybko przenosi zalaną siatkę EM do ciekłego etanu w celu zeszklenia próbki. Alternatywnie dostępne są metody kondycjonowania próbki w celu przygotowania objętości próbki o wielkości nanolitrów do barwienia ujemnego (NS) EM.

Metodologie znacznie zmniejszają zużycie próbek i unikają podejść potencjalnie szkodliwych dla białek, takich jak bibuła filtracyjna stosowana w konwencjonalnych metodach. Co więcej, niewielka ilość wymaganej próbki pozwala na nowatorskie strategie eksperymentalne, takie jak szybkie kondycjonowanie próbek, połączenie z lizą pojedynczych komórek w celu "wizualnej proteomiki" lub "bezstratne" przygotowanie całkowitej próbki do analizy ilościowej złożonych próbek.

Introduction

Sprzęt i oprogramowanie do analizy strukturalnej kompleksów białkowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) znacznie się rozwinęło w ostatnich latach. Wprowadzone ulepszenia utorowały drogę do "rewolucji w rozwiązywaniu"^1,2 i fundamentalnie zmieniły badania strukturalne. Rewolucja rozpoczęła się wraz z pojawieniem się mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM)^3,4, umożliwiającej przygotowanie próbek biologicznych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, przy jednoczesnym zmniejszeniu czułości na promieniowanie i zapobieganiu parowaniu próbki w wysokiej próżni transmisyjnego mikroskopu elektronowego⁵. W kolejnych latach stopniowy postęp technologiczny stopniowo zwiększał osiągalną rozdzielczość. Wśród tych innowacji znalazło się zastosowanie pistoletów z emisją polową^6,7, a ostatnio ulepszone algorytmy analizy danych, takie jak metody maksymalnego prawdopodobieństwa^8,9. Kamery do bezpośredniego detektora elektronów^10,11,12,13, obrazowanie w trybie filmowym i towarzyszące mu rozwój oprogramowania^14,15,16,17, pod warunkiem ostatecznego przełomu wymaganego do osiągnięcia rozdzielczości atomowej dla próbek biologicznych za pomocą analizy pojedynczych cząstek (przegląd patrz Cheng, Grigorieff, et al.¹⁸). Znaczenie cryo-EM zostało niedawno docenione poprzez przyznanie Nagrody Nobla w dziedzinie chemii trzem pionierom.

Aby zobrazować próbkę biologiczną za pomocą TEM, metoda użyta do załadowania siatki EM próbką (później określana jako "przygotowanie siatki") musi zapewnić, że wynikowa warstwa próbki (i) jest wystarczająco cienka (<100 nm), aby uniknąć rozległego szumu przez nieelastyczne lub wielokrotnie rozproszone elektrony, (ii) wytrzymuje wysoką próżnię mikroskopu elektronowego, oraz (iii) chroni biomolekuły przed uszkodzeniem przez promieniowanie. Aby spełnić te wymagania, stosuje się dwie główne metody: Barwienie ujemne (NS) < klasa sup = "xref" >19^,< klasa sup = "xref" > 20 procedur (Rysunek 1A) adsorbuj próbkę do cienkiej warstwy węgla, osadź biomolekuły w amorficznym metalu ciężkim, a następnie pozwól zespołowi wyschnąć na powietrzu. Jest to proste i szybkie, a załadowane siatki EM (zwane dalej "siatkami próbek") są łatwe do przechowywania i mogą być przechowywane przez dłuższy czas (zwykle lata). W TEM preparaty wykazują wysoki kontrast ze względu na NS i tolerują wyższe dawki elektronów niż kriopreparaty, ale rozdzielczość jest ograniczona do około 20 A. Procedury Cryo-EM (Rysunek 1B) wykorzystują dziurawe nośniki węglowe. Cienka warstwa roztworu próbki jest rozciągana w poprzek otworów, a siatka EM jest zanurzana w kriogenie, zwykle skroplonym etanie, w celu szybkiego schłodzenia poniżej -150°C. Rezultatem jest amorficzna, zeszklona warstwa roztworu o grubości od 50 do 100 nm w otworach nośnych. Ta cienka, amorficzna warstwa wytrzymuje wysoką próżnię w mikroskopie elektronowym i, w idealnym przypadku, zachowuje struktury biologiczne w ich naturalnym stanie. Procedura pozwala na obrazowanie próbek biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Siatka próbki musi być jednak zawsze utrzymywana w temperaturze poniżej -150 °C, aby uniknąć dewitryfikacji. Można go obrazować przy użyciu stosunkowo wysokich dawek elektronów ze względu na niską temperaturę, ale kontrast i stosunek sygnału do szumu są mimo to niskie. W związku z tym stosuje się techniki uśredniania w celu zwiększenia kontrastu, a pod warunkiem, że próbka jest obrazowana pod różnymi kątami, można zrekonstruować trójwymiarową mapę (3D) o wysokiej rozdzielczości. Obecnie najczęściej stosowaną i bardzo skuteczną metodą rekonstrukcji 3D jest podejście pojedyncze cząstki. Aby zapoznać się z najnowszą recenzją, zobacz Cheng pod adresem al.¹⁸.

Negatywny barwnik TEM (NS-EM) jest ważny dla badań przesiewowych i kontroli jakości, gdy wymagany jest wysoki kontrast lub gdy dostępne są tylko ograniczone ilości próbki (adsorpcja na folii węglowej zazwyczaj koncentruje próbkę). Krio-EM z pojedynczą cząstką jest złotym standardem, jeśli dąży się do rekonstrukcji 3D struktury białka w wysokiej rozdzielczości.

Rysunek 1: Zasady przygotowania siatki TEM i porównanie podejścia klasycznego (panel A, B) i mikroprzepływowego (panel C, D). A) Klasyczne przygotowanie siatki NS-EM: Około 3 μl próbki pipetuje się ręcznie na siatkę EM pokrytą ciągłą warstwą węglową (zwaną dalej "siatką NS-EM") (i). Po inkubacji przez ok. 10 s bibuła filtracyjna jest używana do usuwania nadmiaru cieczy z boku (ii), pozostawiając zaadsorbowane biomolekuły w cienkiej warstwie wody. Następnie białko inkubuje się w roztworze soli metali ciężkich, np. 2% octanu uranylu, przez 20 s (iii), a następnie ponownie ciecz jest usuwana przez osuszanie z boku za pomocą bibuły filtracyjnej (iv). Na koniec siatkę EM-grid pozostawia się do wyschnięcia na powietrzu. B) Klasyczne przygotowanie siatki kriogenicznej: Około 3 μl próbki pipetuje się ręcznie na dziurawą folię węglową. Aby utworzyć cienką warstwę próbki, nadmiar cieczy jest usuwany przez bibułę papierową od strony do przodu z jednej lub obu stron (ii). Na koniec siatka jest szybko zanurzana w ciekłym etanie w celu zeszklenia (iii). C) Przygotowanie siatki NS-EM za pomocą konfiguracji cryoWriter: Objętość 5 nL jest zasysana z próbki za pomocą mikrokapilary (i). W celu kondycjonowania próbki końcówkę mikrokapilarną zanurza się w roztworze kondycjonującym, np. 2% octanie amonu. Jony i małe cząsteczki są wymieniane przez dyfuzję (ii). Należy pamiętać, że wymiary mikrokapilary zapewniają, że cały proces jest napędzany dyfuzją. Białka mają znacznie niższe stałe dyfuzji niż jony soli i nie są znacząco tracone²⁴. Na koniec próbkę dozuje się na siatkę i pozostawia do wyschnięcia (iii). D) Zasady przygotowania siatki kriogenicznej metodą opartą na cryoWriter: Siatka EM pokryta dziurawym filmem węglowym jest umieszczana na powierzchni platformy o kontrolowanej temperaturze i przytrzymywana pęsetą. Temperatura platformy jest kontrolowana z przesunięciem w stosunku do temperatury punktu rosy środowiska sieci. Siatkę przesuwa się względem mikrokapilary zawierającej próbkę, a następnie mikrokapilarę opuszcza się do momentu, gdy znajdzie się kilka mikrometrów nad siatką. Następnie dozuje się z niego kilka nanolitrów próbki, podczas gdy stolik porusza się po spirali; Nadmiar cieczy jest ponownie zasysany (i). Po zagruntowaniu siatki EM mikrokapilara jest wycofywana, a siatka pozostaje na platformie o kontrolowanej temperaturze (określanej następnie jako stopień punktu rosy (DP)) przez krótki czas, aby umożliwić odparowanie kontrolowanej ilości próbki. W przypadku zamrażania wgłębnego siatka jest szybko wyjmowana ze stolika za pomocą pęsety (ii), obracana o 90° do pozycji pionowej i zanurzana w kąpieli kriogenicznej (iii) (określanej później jako mechanizm "pick-and-plunge"). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Niestety, metody przygotowania siatki używane do NS i cryo-EM nie uległy znaczącej poprawie od czasu ich wynalezienia. Obecne wady to wysokie zużycie próbki (ok. 3 μL białka 1 mg/ml) oraz duża ilość (> 99%) utraconej próbki (Rysunek 1A,B). Co więcej, klasyczna metoda stosowana do przygotowania siatek do krio-EM jest surową procedurą dla białek: po pierwsze, obejmuje ona obszerny etap bibułowania papieru (Rysunek 1B, ii), a po drugie, białko jest wystawione na działanie granicy faz powietrze-woda przez znaczny okres czasu²¹. W tym miejscu przedstawiono alternatywną metodę wstępnego kondycjonowania próbki, przygotowania siatki próbki i obróbki końcowej (suszenie siatki lub witryfikacja) dla NS-EM ( Rysunek 1C) lub krio-EM ( Rysunek 1D). Zbudowana przez nas instalacja, zwana "cryoWriter", wykorzystuje zminiaturyzowaną technologię obsługi próbek i zasady mikroprzepływowości do aspiracji, kondycjonowania i dozowania próbki, całkowicie unikając plam papieru i zapewniając alternatywne metody dla cienkich próbek do cryo-EM. Znacznie zmniejsza to zużycie próbki i poprawia kontrolę użytkownika nad przygotowaniem próbki jako całości. Co więcej, metoda ta pozwala na nowatorskie zastosowania eksperymentalne; takie jak przygotowanie wyizolowanych składników biologicznych poszczególnych komórek w podejściu zwanym "wizualną proteomiką pojedynczej komórki"^22,23,24,25.

Protocol

A "cryoWriter" (Rysunek 2; szczegóły zobacz poprzednie prace^24,26,27) lub równoważne oprzyrządowanie jest wymagane dla następujących protokołów. Lista dostawców głównych części i materiałów eksploatacyjnych znajduje się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie siatki do barwienia ujemnego (NS)

1. Włącz instrument i uruchom oprogramowanie. Zainicjuj wszystkie niezbędne moduły (sterownik pompy strzykawkowej, stopnie z napędem, kamery monitorujące i stopień punktu rosy).
2. Schłodzić podporę próbki i stolik punktu rosy. W razie potrzeby upewnij się, że temperatura stage punktu rosy jest regulowana o 1 - 2 °C powyżej punktu rosy.
   UWAGA: Stolik jest chłodzony przez komercyjne urządzenie Peltiera z regulatorem PID.
3. Przygotować NS, napełniając probówkę PCR o pojemności 100 lub 200 μl 100 - 150 μl NS (np. dostępnym w handlu 2% wolframianem metyloaminy). Umieść rurkę na schłodzonym wsporniku próbki instrumentu.
4. Ustawić próbkę.
   1. Umieść próbkę (0,5 - 1 μM) w probówce PCR o pojemności 100 lub 200 μl. Jeśli dostępna jest mniejsza niż 50 μl próbki, odetnij dno probówki do PCR żyletką i użyj jej jako dołka na próbkę. Dzięki temu mikrokapilara będzie mogła łatwo dotrzeć do próbki.
      UWAGA: Najłatwiej jest zasysać próbki z probówek PCR o pojemności 100 lub 200 μl, ponieważ mikrokapilara używana później do zasysania próbki jest lekko nachylona, a kierunek osi z na wysokości przesuwu jest ograniczony.
   2. Umieść probówkę/pojemnik do PCR na schłodzonym nośniku próbki w urządzeniu, aby zapobiec parowaniu. Alternatywnie, próbki można zasysać z płytek studzienkowych w inkubatorze ze stopniem mikroskopu w temperaturze pokojowej; Chłodzenie nie jest realizowane w przypadku płyt studzienkowych.
5. Definiowanie pozycji. Użyj joysticka cryoWriter, który steruje zmotoryzowanym stolikiem xy i przyciskami sterowania oprogramowaniem dla liniowych stolików osi x, y i z, aby ustawić mikrokapilarę. Użyj aparatu, aby sprawdzić położenie kapilary.
   1. Przenieś mikrokapilar do zbiornika na próbkę. Zanurz końcówkę w cieczy próbki i zapisz tę pozycję jako "próbka".
   2. Przenieś mikrokapilę do probówki NS PCR, zanurz końcówkę w roztworze NS i zapisz tę pozycję jako "plamę".
   3. Umieść mikrokapilę około 100 μm powyżej środka szczeliny, w której zostanie umieszczona siatka EM i zapisz tę pozycję jako "grid_save".
6. Odessać próbkę i kondycjonować ją pod kątem NS-EM.
   1. Jeśli nie jest jeszcze zainstalowana, zamontuj strzykawkę 10 μl (średnica wewnętrzna 0,46 mm) na precyzyjnej pompie strzykawkowej.
   2. Przykleić jeden koniec mikrokapilary z topionej krzemionki o długości 30 cm (średnica zewnętrzna 360 μm, średnica wewnętrzna 150 μm) do wylotu strzykawki.
   3. Podłącz drugi koniec mikrokapilary do krótkiej (5 cm) stożkowej mikrokapilary za pomocą złącza wciskanego. Zwężająca się końcówka krótkiej mikrokapilary tworzy końcówkę dozującą.
   4. Napełnić strzykawkę odgazowaną, podwójnie destylowaną wodą (_ddH2O; płyn systemowy) i unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza.
   5. Dozuj kilkadziesiąt nanolitrów płynu systemowego i usuń wszelkie krople z mikrokapilary za pomocą niestrzępiącej się chusteczki.
   6. Kliknij dwukrotnie zapisaną pozycję próbki. W ten sposób mikrokapilar znajduje się w dołku próbki. Podczas ruchu kapilary należy dozować 3 x 0,5 nl płynu systemowego tuż przed zanurzeniem końcówki mikrokapilary w próbce, aby zapobiec uwięzieniu tam pęcherzyków powietrza (patrz uwaga 2 poniżej).
   7. Odessać 5 nl próbki.
   8. Kliknij dwukrotnie zapisaną pozycję NS. Mikrokapila jest pobierana z pojemnika na próbkę i automatycznie przenoszona do zbiornika NS. Gdy kapilara się porusza, należy ręcznie dozować 3 x 0,5 nL próbki cieczy tuż przed zanurzeniem końcówki w zbiorniku, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza (patrz uwaga 2 poniżej).
      UWAGA: WAŻNE: (1) Podczas przełączania z trybu zasysania na tryb dozowania lub odwrotnie występuje niewielka utrata skoku tłoka z powodu luzu w kołach zębatych pompy strzykawkowej. Według producenta luz nowej jednostki wynosi od 7 do 12 μm. W przypadku naszej strzykawki o średnicy cylindra 0,46 mm przekłada się to na 1-2 nL. W związku z tym można "dozować" 1-2 nL, zanim próbka zostanie faktycznie dozowana. Zwykle maleńka kropelka zaczyna opuszczać końcówkę mikrokapilary po trzecim kroku dozowania 0,5 nL. (2) Pęcherzyk powietrza uwięziony powyżej/poniżej próbki sprawiłby, że dozowanie byłoby mniej dokładne i uniemożliwiłoby kondycjonowanie próbki przez dyfuzję.
   9. Pozostawić mikrokapilar zanurzoną na 3-12 minut, w zależności od bufora próbki i geometrii dyszy.
      UWAGA: Im wyższe stężenie soli i/lub fosforanu w buforze, tym dłuższy wymagany czas zanurzenia. NS (stosunkowo szybko) dyfunduje do czopa próbki, podczas gdy sole buforowe (stosunkowo szybko) i białko (znacznie wolniej) dyfundują na zewnątrz. Obniża to stężenie soli buforowych w próbce, zapobiegając ich krystalizacji po wyschnięciu załadowanej siatki. Ponadto fosforan ma tendencję do tworzenia osadu w połączeniu z NS.
7. Przygotować siatkę i umieścić miejsce kondycjonowanej próbki.
   1. Podczas kondycjonowania próbki weź kawałek taśmy klejącej i blok PDMS i wyczyść górną stronę PDMS, nakładając i usuwając taśmę samoprzylepną, aby upewnić się, że nie ma kurzu. Umieść blok PDMS na szalce Petriego.
      UWAGA: Nowe bloki PDMS są pobierane z pomieszczenia czystego.
   2. Ostrożnie podnieś siatkę (np. Cu, oczko 200 lub 400 pokryte folią Parlodion/C). Upewnij się, że pęsetą dotykasz tylko krawędzi siatki. Umieść go na czystym bloku PDMS z folią węglową skierowaną do góry.
   3. Umieść blok PDMS z rusztem w jednostce wyładowczej jarzeniowej i rozładowuj go jarzeniowo przez 20 s z mocą 100 W przy 0,4 mbar. Przechowuj siatkę na zamkniętej szalce Petriego. Dłuższe czasy wyładowania jarzeniowego zazwyczaj prowadzą do większego rozproszenia objętości osadzonej próbki na siatce. W efekcie warstwa bejcy staje się cieńsza (słabsza plama).
   4. Na 1 minutę przed upływem czasu zanurzenia chwyć rozżarzoną siatkę za pomocą pęsety cryoWriter. Upewnij się, że elektromagnes jest włączony; w przeciwnym razie włącz go w oprogramowaniu. Zamontuj pęsetę na elektromagnesie i użyj ręcznej mikromanipulatora, aby wyrównać siatkę płasko na stoliku z punktem rosy, stroną z folią węglową do góry. Upewnij się, że temperatura stage punktu rosy jest regulowana o 1-2 °C powyżej punktu rosy, aby zmniejszyć szybkość parowania po załadowaniu próbki.
   5. Gdy czas zanurzenia dobiegnie końca, kliknij dwukrotnie "grid_save". Końcówka mikrokapilarna zostanie bezpiecznie umieszczona nad powierzchnią siatki. Ręcznie zetknąć końcówkę mikrokapilary z siatką. Podnieś dyszę o 10 μm i umieść ją powyżej środka.
      ostrożność: Niektóre próbki zawierające detergenty mają tendencję do przesuwania się w górę wzdłuż zewnętrznej powierzchni mikrokapilary, gdy dozowana jest ciecz ze względu na niższe napięcie powierzchniowe. Ważne jest, aby znajdować się bardzo blisko powierzchni siatki, aby zapobiec takim stratom.
   6. Nanieść 5 nl próbki na siatkę. W suchy dzień, gdy na końcówce mikrokapilarnej następuje szybkie parowanie, można również powoli dozować do momentu, aż próbka znajdzie się na samej końcówce, a następnie szybko dozować 5 nL.
   7. Wycofać mikrokapilę i pozostawić kondycjonowaną próbkę do powolnego wyschnięcia na stopniu punktu rosy (stopień DP).
   8. Po wyschnięciu miejsca pobierania próbek zdejmij siatkę i przechowuj ją w temperaturze pokojowej w siatce lub na szalce Petriego.
   9. Dozować 500 nL płynu systemowego z mikrokapilary i usunąć go niestrzępiącą się chusteczką. Przepłukać kapilatę 5 razy etanolem, detergentem lub 1 M NaOH. W ten sposób mikrokapila jest czyszczona, co pozwala na użycie jej z inną próbką.

2. Przygotowanie do kriokraty

1. Aby przygotować przyrząd i próbkę, wykonaj kroki od 1.1 do 1.5 opisane powyżej. Jeśli NS nie jest wymagany, pomiń kroki 1.3 i 1.5.2. W celu wymiany buforu próbki lub kondycjonowania próbki do krio-EM za pomocą dializy, np. w celu zmniejszenia stężenia soli buforowych lub wprowadzenia dodatków (np. trehalozy, detergentów), należy użyć żądanego buforu zamiast NS w krokach 1.3 i 1.5.2.
2. Przygotuj ciekły etan w standardowym pojemniku kriogenicznym.
   1. Zmontuj kubek na etan, uchwyt na kriopojemnik i pająk i napełnij pojemnik kriogeniczny po brzegi ciekłym azotem; zwykle wymaga około 200 ml. Odczekaj kilka minut, aż kubek z etanem ostygnie i będzie wolny od ciekłego azotu.
   2. Otwórz butlę z etanem i powoli pozwól, aby gaz wpłynął do kubka na etan. Pozwól mu napełnić się ciekłym etanem, aż poziom znajdzie się 2-3 mm poniżej góry; Zajmuje to kilka minut i wymaga około 5 ml ciekłego etanu.
   3. Weź pudełko kriogeniczne i umieść je w wolnym gnieździe w pojemniku kriogenicznym.
   4. Usuń pająka, umieść pokrywkę z polistyromu na górze i umieść pojemnik kriogeniczny na uchwycie w cryoWriterze.
3. Rozładowanie żarowe siatki EM.
   1. Weź kawałek taśmy klejącej i blok polidimetylosiloksanu (PDMS) i wyczyść górną stronę PDMS, nakładając i usuwając taśmę klejącą (usuwa kurz). Umieść blok PDMS na szalce Petriego.
   2. Ostrożnie wybierz siatkę z pola siatki. Upewnij się, że pęsetą dotykasz tylko krawędzi siatki. Umieść go na czystym bloku PDMS z dziurawą folią węglową skierowaną do góry.
   3. Umieść blok PDMS z siatką w myjce plazmowej i oczyść plazmowo powierzchnię kratki (np. użyj 75% Ar/25% H_2, moc 50 W, ciśnienie 25 mTorr). Umieść blok PDMS z siatką rozżarzoną na szalce Petriego.
4. Ustaw siatkę w instrumencie
   1. Chwyć rozżarzoną siatkę za pomocą pęsety cryoWriter. Upewnij się, że elektromagnes jest włączony; w przeciwnym razie włącz go w oprogramowaniu. Zamontuj pęsetę na elektromagnesie i użyj ręcznej mikromanipulatora, aby wyrównać siatkę płasko na scenie, stroną z folią węglową do góry.
   2. Kliknij dwukrotnie "grid_save". Wyreguluj położenie mikrokapilary tak, aby końcówka znajdowała się ok. 10 μm nad powierzchnią siatki. Upewnij się, że mikrokapilara może swobodnie poruszać się po siatce, nie dotykając jej gdziekolwiek, w razie potrzeby wycofaj mikrokapilę o kilka mikrometrów.
   3. Wróć do środka siatki i zapisz nową pozycję jako "siatkę".
      ostrożność: Poprawne nazewnictwo jest niezbędne, aby skrypt makra działał.
5. Napisz próbkę i zamroź siatkę.
   1. Przepłucz mikrokapilę kilkudziesięcioma nanolitrami płynu systemowego i usuń wszelkie krople z mikrokapilary za pomocą niestrzępiącej się chusteczki.
   2. Uruchom skrypt makra. Makro wykona następujące kroki:
      1. Dozować 5 nL (aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z końcówki) i przejść do pozycji próbki.
      2. Odessać 65 nl próbki. Wlej 5 nl z powrotem do probówki z próbką. Uwzględnia to luz systemu i umożliwia zsynchronizowany zapis, tj. w celu zapewnienia, że dozowanie i ruch etapu rozpoczynają się w tym samym czasie.
      3. Przejdź do pozycji "siatka".
      4. Zainicjuj "wzorzec zapisu", który spowoduje, że mikrokapilara przesunie się po siatce, jednocześnie dozując 45 nL próbki.
      5. Następnie przesuń mikrokapilę z powrotem na środek siatki, opuść ją o kolejne 10 μm i pobierz nadmiar cieczy próbki.
      6. Wyjmij mikrokapilę i wyłącz elektromagnes. Spowoduje to zwolnienie pęsety i zainicjowanie zamrażania wgłębnego.
6. Chwyć pęsetę i ostrożnie zwolnij adapter magnetyczny z tłoka. Szybko przenieś siatkę z kubka na etan do pojemnika kriogenicznego zawierającego pudełko kriogeniczne i umieść siatkę w wolnym gnieździe.

3. Przygotowanie lizatu jednokomórkowego

1. Przygotuj mikrokapilary do elektroporacji.
   UWAGA: Stożkowe (ciągnięte laserowo i kontrolowane) mikrokapilary ze stopionej krzemionki mają ochronną powłokę poliimidową na zewnątrz, z wyjątkiem końcówki, gdzie powłoka jest wypalana podczas procesu zwężania.
   1. Aby pokryć mikrokapilary warstwą przewodzącą, zamontuj je pod kątem 45° na metalowej szynie, końcówkami skierowanymi do góry. Użyj folii aluminiowej, aby osłonić dolny koniec (2 cm) końcówek, ponieważ niepowlekany poliimid tworzy najlepsze uszczelnienie z zastosowanymi później łącznikami wciskanymi.
   2. Napylanie osadza lepką warstwę Ti/W o grubości 20 nm, a następnie warstwę Pt o grubości 200 nm.
2. Spraw, aby końcówka mikrokapilarna była hydrofobowa.
   1. Przygotować 1 M roztwór 1-dodekanetiolu w EtOH.
   2. Rozładowanie jarzeniowe mikrokapilary w powietrzu przez 1 minutę o mocy 100 W przy 0,4 mbar.
   3. Zanurzyć końcówkę mikrokapilary w 1 M roztworze 1-dodekanetiolu na kilka godzin (najlepiej na noc).
      UWAGA: Końcówki najlepiej przygotować na świeżo dzień przed użyciem.
3. Zainstaluj nową mikrokapilę.
   1. Usunąć mikrokapilar z roztworu 1-dodekanetiolu, spłukać z zewnątrz etanolem i przepłukać wnętrze etanolem za pomocą strzykawki.
      UWAGA: Jeśli nie są dostępne funkcjonalizowane mikrokapilary, szybko rozładuj końcówkę mikrokapilary i zanurz ją w kropli środka do obróbki szyb samochodów komercyjnych, która jest mieszaniną PDMS i kwasu siarkowego. Wynikająca z tego funkcjonalizacja hydrofobowa nie jest tak dobra jak w przypadku 1-dodekanetiolu, ale generalnie wystarczająca.
   2. Rozetnij jego niepowlekany koniec za pomocą noża do kapilarek.
      UWAGA: Czyste cięcie jest ważne dla dobrego uszczelnienia za pomocą złącza wciskanego.
   3. Użyj wykałaczki, aby nałożyć srebrną pastę na ostrą granicę utworzoną między szkłem a powłoką poliimidową, gdy powłoka poliimidowa została spalona przez laser podczas ciągnięcia kapilary.
      UWAGA: To wzmocnienie jest konieczne, ponieważ powłoka Pt jest bardzo słaba w tym obszarze, a przewodzenie elektryczne może łatwo ulec awarii.
   4. Przemyć poliimidowy koniec mikrokapilary acetonem. Na końcu pozostaw niewielką kroplę acetonu i włóż ją do otworu złącza wciskanego. Zastosuj lekki nacisk, aby uzyskać dobre uszczelnienie.
4. Skalibruj położenie mikrokapilary.
   1. Włącz instrument i uruchom oprogramowanie zgodnie z opisem w kroku 1.1. Dodatkowo zainicjuj kamerę mikroskopu i generator funkcji.
   2. Umieść szklane szkiełko mikroskopowe w uchwycie szkiełka na mikroskopie.
   3. Opuść mikrokapilę blisko szkiełka i wyśrodkuj ją nad obiektywem mikroskopu, aż pojawi się w widoku kamery mikroskopu. Użyj stopni liniowych osi x i y, aby ustawić końcówkę mikrokapilary na środku obrazu. Następnie powoli opuść końcówkę, aż lekko dotknie szklanego szkiełka.
      ostrożność: Wybierz bardzo małe kroki (5 μm) w kierunku ostatecznego podejścia. W przeciwnym razie końcówka może zostać uszkodzona.
   4. Naciśnij przycisk "Kalibruj dyszę". Spowoduje to cofnięcie mikrokapilary o 40 mm i ustawienie tej pozycji jako pozycji wyjściowej.
5. Przygotowanie tłoczonych elementów PDMS i szkiełek ITO
   1. Wymieszać PDMS i środek sieciujący w proporcji 10:1, przelać na dużą szalkę Petriego na głębokość około 2-3 mm. Piec w temperaturze 60°C przez kilka godzin w inkubatorze do hybrydyzacji lub podobnym urządzeniu.
   2. Za pomocą młotka i stempla (średnica 12 mm) wyciąć otwory w warstwie PDMS. Następnie za pomocą skalpela wytnij kwadraty lub prostokąty o długości 2 cm, w tym otwory, aby uzyskać wytłoczone kawałki, które zmieszczą się na szkiełku mikroskopowym. Zwykle dwa wytłoczone elementy są montowane na jednym szkiełku mikroskopowym.
   3. Umyj elementy PDMS i szkiełka ITO najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem. Umieść je mokre na szalce Petriego i pozwól etanolowi całkowicie odparować w piekarniku w temperaturze 60 ° C.
   4. Wyładowanie jarzeniowe ITO przesuwa się przez 1 minutę z mocą 100 W przy 0,4 mbar, a następnie nanosi 1 ml roztworu powlekającego (np. poli-L-lizyny (PLL)). Inkubować przez 5 minut, usunąć roztwór pipetą i nałożyć 1 ml ddH₂O. Lekko mieszać przez 1 minutę, a następnie usunąć ddH₂O za pomocą pipety. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze 60°C.
6. Przygotuj kulturę komórkową. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem hodowli komórek przylegających (np. Arnold i wsp.^24,25). Komórki nasienne na ITO podczas normalnych przebiegów rozłupywania/pasażowania.
   1. Weź świeżo pokryty PLL szkiełko ITO i dodaj kawałek PDMS. Zastosuj pewien nacisk, aby utworzyć wodoszczelne uszczelnienie. W ten sposób powstają małe studnie, których podstawą jest zjeżdżalnia.
   2. Dodać około 300 μl komórek zawieszonych w świeżej pożywce do studzienek PDMS. Gęstość wysiewu powinna wynosić około 75 000 komórek na studzienkę.
   3. Inkubuj szkiełka ITO przez 1-2 dni w standardowych warunkach.
7. Przygotuj się do eksperymentu z lizą komórek:
   1. Podgrzej wstępnie kilka mililitrów buforu do elektroporacji (np. soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)).
   2. Przygotowanie do przygotowania sieci NS-EM
      UWAGA: Szczegóły dotyczące przygotowania konfiguracji są pokazane w krokach 1.1-1.5 (dla NS) lub krokach 2.1-2.4 (dla krio). Poniżej opisujemy najważniejsze etapy przygotowania NS.
      1. Przygotować NS, napełniając probówkę PCR o pojemności 100 lub 200 μl 100-150 μl NS (np. dostępnym w handlu 2% wolframianem metyloaminy). Umieść rurkę na schłodzonym wsporniku próbki instrumentu.
      2. Przenieś mikrokapilę do probówki NS PCR, zanurz końcówkę w roztworze NS i zapisz tę pozycję jako "plamę".
   3. Załaduj standardowe parametry lizy, np. napięcie lizy.
   4. Wyjmij szkiełko ITO z inkubatora i zamontuj je na wkładzie mikroskopu. Użyj dwóch, aby przymocować prowadnicę do aluminiowej wkładki i zapewnić kontakt elektryczny między powłoką ITO prowadnicy a elektrycznie uziemioną aluminiową ramą.
   5. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć dwukrotnie 300 μl buforu do elektroporacji. Przechowuj ogniwa w buforze do elektroporacji.
   6. Umieść aluminiową wkładkę przytrzymującą szkiełko ITO w inkubatorze z żywymi komórkami stage na zestawie.
   7. Zlokalizuj hodowlę komórkową w widoku mikroskopu i wybierz obszar, w którym nie ma komórek. Zbliż końcówkę do powierzchni ITO i delikatnie jej dotknij, a następnie wycofaj końcówkę na 100 μm i zapisz pozycję jako "komórki".
   8. Szybko opuść hodowlę komórkową i przepłucz końcówkę mikrokapilary kilkudziesięcioma nanolitrami płynu systemowego, a następnie ponownie włóż go do hodowli komórkowej. Dozuj kilka nanolitrów podczas zanurzania w studni PDMS, aby upewnić się, że żadne pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione na końcówce.
   9. Delikatnie zbliż się do powierzchni ITO (początkowo musisz znajdować się w pozycji "komórki", tj. 100 μm nad powierzchnią). Po zetknięciu wycofaj końcówkę 10 μm.
   10. Wybierz pobliską komórkę do lizy. Umieść końcówkę mikrokapilary nad docelową komórką.
8. Uruchom skrypt makra do lizy pojedynczych komórek.
   1. Nazwij pozycję, do której mikrokapilara powinna zostać przesunięta po pomyślnej lizie komórki. Będzie to zbiornik NS (NS-EM), bufor odsalający (cryo-EM) lub siatka EM (cryo-EM). Unikaj błędów ortograficznych i naciśnij "ok".
   2. Makro przebiega bez interwencji użytkownika:
      1. i) Stolik mikroskopu i hodowla komórkowa o 100 μm są przesuwane w lewo, wykonywana jest migawka docelowej komórki i dozowanie 50 nL cieczy systemu ddH₂O z mikrokapilary. Powoduje to wyparcie i rozcieńczenie buforu o wysokiej zawartości soli oraz wywieranie ciśnienia osmotycznego na ogniwo.
      2. ii) Stolik zostanie przesunięty z powrotem, aby ponownie umieścić końcówkę nad komórką docelową. Stosowany jest wstępnie zdefiniowany impuls napięcia, a po 500 ms system pompowy zaczyna zasysać 3 nL próbki przy natężeniu przepływu 2 μL/min.
      3. iii) Stolik zostanie ponownie przesunięty w lewo, co pozwoli na inspekcję komórki. Pojawi się okno z prośbą o wprowadzenie danych przez użytkownika.
   3. Powiedz, czy etap lizy zakończył się sukcesem, czy nie.
      1. Jeśli odpowiedź brzmi "nie", przejmij kontrolę, przepłucz mikrokapilarnę i skieruj się na nową komórkę.
      2. Jeśli odpowiedź jest twierdząca, wykonywana jest migawka usuniętej (zlizowanej) komórki, a następnie mikrokapilara jest przenoszona do miejsca określonego w ppkt 3.8.1. Jeśli jest to NS lub zbiornik buforowy, użyj standardowego interfejsu użytkownika, aby dozować 3 x 0.5 nl płynu podczas ruchu mikrokapilary, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Końcówka jest zanurzana w cieczy zbiornika przez makro.
         UWAGA: Można kontynuować kondycjonowanie próbki i przygotowywać siatki, jak wyjaśniono w sekcjach 1.6.9 - 1.7.9 dla NS-EM lub sekcjach 2.2 - 2.6 dla cryo-EM. Poniżej wyjaśniono niezbędne kroki do przygotowania siatki NS.
   4. Pozostaw mikrokapilę zanurzoną w zanurzeniu na 8-12 minut, w zależności od geometrii dyszy
      UWAGA: Wysokie stężenie fosforanów w buforze wymaga dłuższego czasu zanurzenia w celu kondycjonowania.
   5. Dozować 5 ml kondycjonowanego lizatu komórkowego na siatkę.
   6. Usunąć mikrokapilę i pozostawić kondycjonowaną próbkę do powolnego wyschnięcia na stopniu punktu rosy (stopień DP) regulowanym o 1 - 2°C powyżej temperatury punktu rosy.
   7. Wyjmij siatkę i przechowuj ją w temperaturze pokojowej w pudełku z siatką lub na szalce Petriego.

Results

Konfiguracja "cryoWriter" została opracowana (przedstawiona w Rysunek 2) w celu przetestowania zminiaturyzowanych procedur przygotowania siatki EM zaproponowanych w Rysunek 1C,D. Rysunek 2A pokazuje przegląd różnych komponentów zamontowanych na mikroskopie odwrotnej fluorescencji. Moduł do hodowli komórkowej jest zainstalowany po lewej stronie mikroskopu; moduł do przygotowania siatki EM znajduje się po prawej stronie. Moduł hodowli komórkowej (Rysunek 2B) umożliwia wzrost przylegających komórek eukariotycznych i obrazowanie żywych komórek hodowli komórkowej za pomocą mikroskopu świetlnego. Poszczególne komórki są poddawane lizie przez połączone działanie szoku osmotycznego, elektroporacji i aspiracji zawartości komórki do mikrokapilary (Rysunek 2B, Rysunek 6A)^24,25. Zasysaną próbkę lizatu można następnie wykorzystać do przygotowania siatek dla NS lub cryo-EM. Alternatywnie, źródłem próbki może być podstawowy roztwór białkowy w probówce do PCR. Zastosowana mikrokapilara (Rysunek 2B) jest podłączona do systemu pomp o wysokiej precyzji, umożliwiającego zasysanie i dozowanie próbek z precyzją poniżej nL. Jak wyszczególniono w protokołach, całe przetwarzanie próbek odbywa się w tej mikrokapilarze lub na samej siatce EM bez znaczącego transportu próbki. Na przykład ta sama mikrokapilara służy do lizy pojedynczych komórek eukariotycznych, odsysania lizatu, kondycjonowania go, a na końcu dozowania porcji na siatki EM. Moduł przygotowania siatki składa się z ruchomego stolika DP, który pozwala na precyzyjną kontrolę temperatury umieszczonej na nim siatki EM (Rysunek 2C). W przypadku NS-TEM przygotowaną siatkę na próbkę można następnie po prostu usunąć z zimnego etapu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Należy jednak unikać tak zwanych efektów pierścienia kawy, które mogą wówczas wystąpić, w przypadku ilościowego TEM, w którym zliczane są "cząstki" białka. W tym celu kratki są suszone powoli na stopniu DP przy użyciu stopniowo rosnącego gradientu temperatury, aby spowolnić parowanie cieczy. W przypadku cryo-EM temperatura siatki jest utrzymywana na poziomie zbliżonym do punktu rosy; wybiera się dodatnie przesunięcie około 8 °C, co pozwala na kontrolowane odparowanie próbki cieczy w celu stabilizacji cienkiej warstwy i rozcieńczenia, które w razie potrzeby można monitorować za pomocą czujnika²⁶. Po upływie wybranego czasu przerzedzania uruchamiany jest mechanizm podnoszenia i wgłębniania, a próbka jest zeszklona (Rysunek 2C). Należy pamiętać, że ten mechanizm wgłębny nie jest potrzebny w przypadku siatek NS-EM, które są przechowywane w temperaturze pokojowej.

Rysunek 2: Przegląd konfiguracji cryoWriter. A) Przegląd konfiguracji cryoWriter zamontowanej na odwróconym mikroskopie świetlnym (1). B) Wstawka obszaru wskazanego po lewej stronie w panelu A. Komora do hodowli komórek (2), z mikrokapilarą (3) do manipulacji próbką i lizy komórek umieszczoną nad zminiaturyzowaną płytką do hodowli komórkowej opartą na PDMS (4). C)Wstawka obszaru wskazanego po prawej stronie w panelu A. Mechanizm "Pick-and-plunge". Między końcówkami pęsety (6) montuje się dziurawą siatkę EM z filmu węglowego (5) i umieszcza poziomo w bezpośrednim kontakcie ze stopniem o kontrolowanej temperaturze (7), zwanym w tekście głównym stopniem punktu rosy (stopień DP). Temperatura stopnia jest ściśle kontrolowana za pomocą regulatora PID i chłodzonego wodą elementu Peltiera, utrzymując ją na poziomie lub zbliżonym do temperatury punktu rosy, w zależności od otoczenia. Stopień DP (7) jest zamontowany na zmotoryzowanej osi xy, aby przesuwać siatkę względem mikrokapilary. Sama mikrokapila jest zamontowana na stoliku Z i może być opuszczana, aż znajdzie się bardzo blisko powierzchni siatki EM i służy do dozowania objętości o rozmiarach nanolitrów na pokrywający ją nośnik próbki (ciągła cienka warstwa węgla dla NS-EM lub dziurawa warstwa węglowa dla cryo-EM). Należy pamiętać, że pobieranie i dozowanie cieczy odbywa się za pomocą precyzyjnego systemu pomp (8). Dozowaną ciecz można rozprowadzać, przesuwając siatkę względem mikrokapilary w spiralny wzór. W przypadku przygotowania cryo-EM, mechanizm zamrażania typu pick-and-plunge (9) szybko przenosi siatkę załadowaną próbką do ciekłego etanu (10) w celu szybkiego schłodzenia i zeszklenia próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne wyniki uzyskane dla siatek NS-EM przygotowanych przy użyciu konfiguracji cryoWriter. Końcówkę mikrokapilary załadowano 5 nL próbki z roztworu podstawowego i zanurzono w zbiorniku roztworu NS (2% wolframian metyloaminy) na kilka minut, aby umożliwić dyfuzyjną wymianę jonów NS i soli (dyskusja teoretyczna znajduje się w Arnold i wsp.²⁴). Następnie kondycjonowaną próbkę nanoszono na cienką warstwę węglową siatki NS-EM i suszono. Rysunek 3A pokazuje użycie siatki szczelinowej w ten sam sposób do wizualizacji całej kropli, co jest wymagane dla ilościowego TEM. Aby uniknąć efektu pierścienia kawy, świeżo rozżarzona siatka była początkowo utrzymywana w temperaturze punktu rosy (brak parowania wody), a następnie powoli podgrzewana na stopniu DP. Należy pamiętać, że w przypadku większości zastosowań (np. kontrola jakości próbki lub analiza strukturalna) ten proces powolnego suszenia nie jest potrzebny. Wysokiej jakości preparaty NS uzyskuje się bez niego, jak pokazano w Rysunek 3B,C. Czas kondycjonowania bezfosforanowych o niskiej zawartości soli wynosi około 3 minut, np. z buforem Tris o niskiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl pH 7,4 z 50 mM NaCl), jak pokazano na Rysunek 3B przy użyciu wirusa mozaiki tytoniu (TMV) jako próbki. Rysunek 3C przedstawia najgorszy scenariusz, ponieważ TMV znajdował się w buforze PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4). Jony fosforanowe tworzą przejściowe kryształy z jonami metali ciężkich NS (patrz Rysunek 5C), wydłużając wymagany czas kondycjonowania (7 min). Inne sole metali ciężkich mogą być również stosowane z modułem przygotowania siatki, np. 2% wanadan metyloaminy lub molibdenian amonu (patrz również Arnold i wsp.²⁴). Jednak octan uranylu nie jest odpowiedni; efekt sieciowania tego barwnika prowadzi do powstania agregatów, jeśli próbka białka jest kondycjonowana w roztworze, przed adsorpcją do filmu węglowego (patrz Rysunek 5E)23.

Rysunek 3: Typowe wyniki dla siatek NS przygotowane przy użyciu konfiguracji cryoWriter, jak pokazano w Rysunek 1C. ZA)Obraz poglądowy kropli o pojemności 3 nL dozowanej na siatkę szczelinową po kondycjonowaniu 2% wolframianem metyloaminy. B) TMV w buforze TRIS 20 mM. Wstawka pokazuje 3-krotne powiększenie wskazanego obszaru. Na podstawie Arnold, et al.²⁴ (dalsze uprawnienia związane z fragmentem materiału należy kierować do ACS). C) Wirus mozaiki tytoniu (TMV) w buforze PBS. Wstawka pokazuje 3-krotne powiększenie wskazanego obszaru. Na podstawie Arnold, et al.²⁴ (dalsze uprawnienia związane z fragmentem materiału należy kierować do ACS). Podziałka liniowa: A, 100 μm; B, 50 nm; C, 80 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Typowe wyniki uzyskane dla siatek cryo-EM przygotowanych za pomocą konfiguracji cryoWriter są przedstawione w Rysunek 4. Tablica 4A przedstawia atlas siatkowy obszaru pokrytego próbką zeszkloną. Panel 4B pokazuje jednorodność szklistego lodu w wybranej szczelinie siatki. W obu przypadkach próbka znajdowała się w 25 mM HEPES-KOH pH 7,5, 50 mM buforze NaCl zawierającym 0,05% detergentu Fos 14. Przetestowano wiele próbek i i uzyskano porównywalną wysokiej jakości lód szklisty, ale wymagane warunki są zależne od buforu (zobacz również dyskusję na temat Rysunek 5). Panel 4C pokazuje cząsteczki apoferrytyny i bakteriofaga w buforze Tris-HCl (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl; pH 7,4) zobrazowane przy wysokim rozmyciu w celu zwiększenia kontrastu. Panel 4D przedstawia białko błonowe o masie 200 kDa stabilizowane przez amfipole.

Rysunek 4: Typowe wyniki dla siatek cryo-EM przygotowanych za pomocą konfiguracji cryoWriter, jak pokazano w Rysunek 1D. Próbki i różnią się w przedstawionych przykładach. Wszystkie próbki zostały załadowane na dziurawe folie węglowe. A) Kolaż obrazów poglądowych ("atlas siatki") próbki zawierającej białko błonowe o masie 150 kDa, obrzeża lodu szklistego są oznaczone białymi strzałkami. B) Powiększona szczelina siatki z siatki przygotowanej z tym samym buforem, przedstawiająca dziurawaty film węglowy z lodem szklistym. Niektóre otwory nie są wypełnione buforem próbki, jak wskazują białe strzałki. C) Otwór węglowy z zeszkloną próbką zawierającą kompleksy białkowe apoferrytyny i bakteriofagi. Wstawka: dwukrotne powiększenie ukazujące ogon bakteriofaga. Biała gwiazdka oznacza film węglowy. Zwróć uwagę, że obraz został nagrany z wysokim rozmyciem w celu zwiększenia kontrastu. D) Białko błonowe o masie 200 kDa odtworzone w amfipolach. Wstawka: 2-krotne powiększenie wskazanego obszaru pokazane ze zwiększonym kontrastem. Podziałka liniowa: A, 100 μm; B, 10 μm; C i D, 80 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Konfiguracja cryoWriter umożliwia systematyczne badanie przesiewowe w celu uzyskania optymalnych warunków przygotowania sieci EM; przykład jest pokazany w Rysunek 5A (apoferrytyna w 25 mM HEPES-KOH pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,05% Fos 14). W tym eksperymencie temperatura "rozrzedzania" lodu szklistego była zmienna, ale czas rozrzedzania (tj. odstęp czasu między nałożeniem próbki a zamrożeniem wgłębnym) pozostał stały (1 s). Przy niskich temperaturach przesunięcia (np. 8 K) warstwa próbki była zbyt gruba. Przy wyższych temperaturach przesunięcia szklisty lód w otworach był cieńszy (10 K, 12 K), aż w pewnym momencie (powyżej 18 K) siatka stawała się całkowicie sucha (nie pokazano). W przedstawionych tutaj wynikach przesunięcie o 12 K doprowadziło do dużego jednorodnego obszaru lodu szklistego, jak wskazują czarne strzałki. Takie eksperymenty optymalizacyjne można przeprowadzić z buforem próbki docelowej przy użyciu białek "testowych" (takich jak apoferrytyna). Najlepsze znalezione warunki są następnie stosowane do próbki docelowej. Co więcej, siatki o parametrach dalekich od optymalnych mogą być często rozpoznawane podczas procedury przygotowania i nie muszą być badane w mikroskopie elektronowym, co pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu. Rysunek 5 pokazuje również galerię typowych artefaktów cryo-EM (Panel B) i NS-EM (Panele C do E) specyficznych dla konfiguracji cryoWriter. Siatka krio-EM pokazana w panelu 5B z TMV w PBS zawierającym 0,1% decylo-β-D-maltopyranozyd (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4, 0,1% s.m.) była nadmiernie rozrzedzona. Tło obrazu jest ziarniste, ponieważ stężenie soli stało się zbyt wysokie. Ogólnie rzecz biorąc, wygląd próbki nie wydaje się być liniową funkcją stężenia soli; Ziarna nagle stają się widoczne, gdy podczas procesu przerzedzania zostanie osiągnięte stężenie progowe. Należy zauważyć, że niepożądane substancje mogą być usunięte na etapie kondycjonowania przed przygotowaniem siatki, jak opisano dla NS-EM w sekcji 1.6 protokołu. NS może powodować inne artefakty. W przykładzie pokazanym w Panelu 5C, bufor PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4) bez próbki kondycjonowano w 2% wolframastanie metyloaminy przez 3 min. Osady i kryształy są widoczne i wywierają duże siły na powierzchnię węgla, prowadząc do pęknięć. Osady tworzą się tylko w określonym zakresie stężeń PBS i NS i można ich uniknąć, kondycjonując próbkę przez dłuższy czas (porównaj Rysunek 3C). Panel 5D przedstawia obrzeża dozowanej kropli próbki NS z "pierścieniem kawy". Zakłóciłoby to ilościową, całkowitą analizę próbki i można tego uniknąć, spowalniając proces suszenia, tj. utrzymując siatkę EM na poziomie temperatury punktu rosy podczas nakładania próbki, a następnie stopniowo zwiększając temperaturę w celu jej wysuszenia (patrz Rysunek 3A). Panel 5E (apoferrytyna w 20 mM HEPES, pH 7,0, kondycjonowany 3 min) pokazuje aktywność sieciującą 2% barwienia octanem uranylu, którego nie można stosować do kondycjonowania próbek białek przed ich adsorpcją na nośnikach filmu węglowego.

Rysunek 5: Systematyczne zmiany i artefakty zaobserwowane, gdy konfiguracja cryoWriter została użyta do przygotowania siatek dla NS- i cryo-EM. A) Systematyczna zmiana grubości lodu szklistego; optymalizacja przygotowania siatki dla cryo-EM. Temperatura przesunięcia stopnia DP była zróżnicowana (od 8 K do 12 K), utrzymując stały czas rozrzedzania (1 s). Strzałki wskazują obrzeża warstwy próbki. B) Wpływ soli; zbyt mocno skoncentrowany, tj. etap przerzedzania był zbyt długi. Wstawka przedstawia 2-krotne powiększenie wskazanego obszaru. C) Wytrącanie się soli powstające w buforze PBS w obecności soli metali ciężkich. Próbki zawierające bufor PBS muszą być kondycjonowane dłużej niż próbki w innych. W tym przypadku bufor PBS bez próbki kondycjonowano w 2% wolframianie metyloaminy przez 3 minuty, co jest czasem typowym dla innych próbnych. Zwróć uwagę na pęknięcie filmu węglowego najprawdopodobniej spowodowane silnymi siłami od osadów działających na cienkie podłoże podczas procesu suszenia. D) Efekt "pierścienia kawowego". E) Apoferrytyna kondycjonowana w 2% octanie uranylu przez 3 min. Jony uranylowe wykazują znaczną aktywność sieciowania, a klastry apoferrytyny tworzą duże agregaty. Podziałka liniowa: A, 80 μm; B, 80 nm C, 12 μm; D, 80 μm; E, 200 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Niewielka ilość i objętość wymagana do przygotowania siatki EM za pomocą konfiguracji cryoWriter umożliwia nowe rodzaje eksperymentów. Na przykład, całkowita zawartość pojedynczej komórki może zostać zebrana i przygotowana dla NS- i cryo-EM. Procedura jest opisana w Rysunek 6A. Przylegające, eukariotyczne ogniwo (HEK 293) jest lizowane przez jednoczesną elektroporację i aspirację próbki (Panel 6A)²⁵. Odsysana jest całkowita objętość 3 nL, która zawiera lizat komórkowy i jest zatrzymywana w mikrokapilarze do dalszego przetwarzania. W przypadku NS-EM pokazanego w panelu 6B, pożywkę do hodowli komórek wymieniono z buforem PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na₂HPO₄·7H2O, pH 7,4) przed lizą komórek. Zawartość komórek odsysano do buforu o pojemności 3 nL i kondycjonowano w zbiorniku NS, jak wskazano w Rysunek 1C przez 10 minut. Następnie objętość 5 nL została dozowana na ciągłą folię węglową siatki NS-EM. Na obrazie można rozpoznać pojedyncze białka, np. aktynę nitkowatą i plamy błonowe z przyłączonymi białkami. W przypadku krio-EM, pokazanego na rysunku6C, objętość 3 nL dozowano na dziurawą siatkę węglową EM bez ponownego zasysania w celu usunięcia cieczy. Stosunkowo gruba warstwa utworzonej próbki została znacznie rozrzedzona przed witryfikacją. Aby to zrobić, temperatura stopnia DP była stopniowo zwiększana, zaczynając od temperatury punktu rosy. Proces rozrzedzania był monitorowany przez system czujników w czasie rzeczywistym, aż do osiągnięcia wcześniej określonego progu, który uruchamiał mechanizm "pick-and-plunge" i witryfikację próbki (szczegóły patrz Arnold i wsp.²⁶). Struktury błonowe i białka można rozpoznać na obrazie.

Rysunek 6: Proteomika wizualna pojedynczej komórki przy użyciu zestawu cryoWriter. A) Liza pojedynczej przylegającej komórki eukariotycznej. Komórka jest hodowana (1, zielona) na funkcjonalizowanym, pokrytym ITO (czerwonym) szkiełku podstawowym (2) w zminiaturyzowanej szalce Petriego (3)²⁵. Warstwa ITO jest uziemiona elektrycznie. Do komórki zbliża się mikrokapilara (4), która jest pokryta platyną. Początkowy wstrząs osmotyczny (niewskazany) jest podawany w celu ułatwienia lizy, która jest wykonywana przez serię impulsów elektrycznych i siły ścinające wywierane podczas aspiracji lizatu komórkowego. Proces można monitorować za pomocą mikroskopii świetlnej; Wskazana jest soczewka obiektywu mikroskopu (5). Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz naszą poprzednią wersję^24,25. B) Obraz NS-EM lizatu z pojedynczej komórki HEK 293. Widoczne są nitkowate łaty aktyny i błony z przyłączonymi białkami. Panel zaczerpnięty z Arnold, et al.²⁴ (dalsze uprawnienia związane z fragmentem materiału należy kierować do ACS). C) Obraz Cryo-EM lizatu z pojedynczej komórki HEK 293. Wstawka pokazuje 2-krotne powiększenie wskazanego obszaru, w którym widoczne są typowe struktury błonowe z powiązanymi białkami. Panel C zaadaptowany z Arnold, et al. ²⁶ Podziałka skali: B, 50 nm; C, 80 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Przedstawiono przyrząd "cryoWriter" oraz protokoły wymagane do przygotowania siatek próbek dla NS i cryo-EM z całkowitej objętości próbki o rozmiarach nL i całkowitego uniknięcia klasycznego etapu blottingu. Jest to możliwe dzięki połączeniu zasad mikroprzepływowości i systemu mikromechanicznego w cryoWriterze.

Z naszego doświadczenia wynika, że w przypadku zastosowania zminiaturyzowanych metod przedstawionych w tym manuskrypcie, przestrzeń parametrów do przygotowania siatki EM-grid jest większa niż w przypadku metod klasycznych i znajduje się pod ściślejszą kontrolą użytkownika. Co ważne, osiągnięta zwiększona odtwarzalność umożliwia wstępne badanie przesiewowe za pomocą systemu buforowego próbki, uzupełnionego łatwo dostępnym białkiem testowym, w celu określenia optymalnych parametrów przed przeprowadzeniem właściwego eksperymentu. Ogranicza to konsumpcję interesującej nas próbki do absolutnego minimum i jest wysoce zalecane. Krytycznymi etapami przygotowania sieci zarówno NS, jak i cryo-EM są: (i) Zalewanie systemu pompy; W przypadku dozowania objętości poniżej nanolitrów ciecz systemowa (woda) musi być odgazowana i pozbawiona pęcherzyków. (ii) Precyzyjna kontrola etapu wyładowania jarzeniowego lub czyszczenia plazmowego; charakterystyka powierzchni siatki EM ma kluczowe znaczenie dla powtarzalnych wyników. (iii) kondycjonowanie próbki; czas potrzebny do kondycjonowania, np. za pomocą NS, zależy od rodzaju buforu, zawartości soli i stężenia (rysunek 3), a także od geometrii dyszy mikrokapilary²⁴. (iv) szybkości parowania preparatów NS-EM dla ilościowych EM; efekt pierścienia kawy może uniemożliwić analizę ilościową preparatów NS-EM i musi być stłumiony przez powolne tempo parowania kontrolowane przez stopień DP.

Różne aspekty prezentowanych metod przygotowania siatek można dowolnie łączyć, co pozwala na opracowanie wszechstronnych protokołów dla konkretnych próbek. Typowymi przykładami mogą być usunięcie substancji, która zapobiega powstawaniu elektromagnetyczu o wysokiej rozdzielczości, np. glicerolu, poprzez etap kondycjonowania przed przygotowaniem siatki do krio-emu; wprowadzenie cząsteczek mediatorowych, takich jak ligandy, poprzez kondycjonowanie przed przygotowaniem siatek; lub badanie lizatu jednokomórkowego za pomocą NS- lub cryo-EM (ryc. 6).

Zastosowanie mikrofluidyki i minimalnych ilości próbek w prezentowanych metodach całkowicie eliminuje konieczność wykonywania etapów bibuły. Jest to ogromna zaleta, ponieważ bibuła jest surowym traktowaniem białek, potencjalnie zanieczyszczając próbkę niechcianymi jonami i z natury prowadząc do masowej utraty próbki. Z drugiej strony, nie można uniknąć efektów, które mogą być spowodowane przez granicę faz powietrze-woda cienkiej warstwy próbki utworzonej, gdy próbki cryo-EM są przygotowywane w klasyczny sposób, gdy używany jest cryoWriter. Siatki odpowiednie do krio-EM można przygotować z czasem oczekiwania krótszym niż 0,2 s między nałożeniem próbki a witryfikacją (dane nie pokazane). Ponieważ jednak białka przemieszczają się przez dyfuzję o długości kilku dziesiątych nanometra w ciągu kilku nanosekund, wciąż jest wystarczająco dużo czasu, aby kilkakrotnie zderzyć się z powierzchnią międzyfazową powietrze-woda warstwy próbki o grubości 100 nm. Jednak ilość białek przylegających do granicy faz powietrze-woda może być znacznie zmniejszona przez te krótkie przerwy czasowe i może zapobiec denaturacji białek lub ograniczonej orientacji cząstek. Innym obiecującym podejściem, które może chronić wrażliwe białka przed granicą faz powietrze-woda, jest pokrycie błony próbki substancjami powierzchniowo czynnymi o niskiej masie cząsteczkowej. Związki te mogą być szybko wprowadzone przez etap kondycjonowania w cryoWriter przed przygotowaniem siatki. Wysoki stosunek powierzchni do objętości układów mikroprzepływowych jest kolejnym ograniczeniem cryoWriter, ponieważ próbka może zostać potencjalnie utracona przez niespecyficzną adsorpcję na powierzchni mikrokapilary i zakłócić analizę ilościową podczas zliczania cząstek. Problem ten można rozwiązać na dwa sposoby: po pierwsze, próbka nie pokonuje dużych odległości w obrębie mikrokapilary. Rzeczywiście, objętość próbki w nanolitrach pozostaje na końcówce kapilary przez cały czas przetwarzania. Po drugie, stosunek powierzchni do objętości jest dodatkowo zmniejszony dzięki zastosowaniu mikrokapilar o stosunkowo dużych średnicach wewnętrznych, np. 180 μm. Po trzecie, powierzchnie mikrokapilar można w razie potrzeby łatwo pasywować, np. poprzez obróbkę ich dostępnymi w handlu glikolami polilizynowo-etanolowymi (PLL-PEG).

Analiza białek w wysokiej rozdzielczości metodą pojedynczych cząstek stosowana w EM wymaga jedynie od 100 000 do kilku milionów obrazów pojedynczych cząstek białka. Oznacza to, że techniki mikroprzepływowe mogą dostarczyć wystarczającą ilość kompleksów białkowych do badania strukturalnego. Zminiaturyzowana metoda immunoprecypitacji do szybkiej izolacji kompleksów białkowych (około 1 godziny) od minimalnej ilości komórek (ok. 40 000 komórek) została opracowana wcześniej²⁸. Metoda ta będzie teraz bezpośrednio powiązana ze zminiaturyzowanym etapem przygotowania próbki w cryoWriterze. Ostatecznym celem jest opracowanie zintegrowanego rurociągu mikroprzepływowego do ultraszybkiej izolacji białek i przygotowania siatki kriogenicznej, co zajmuje w sumie mniej niż dwie godziny. Ponadto, jak pokazano na rysunku 6, niewielka ilość i objętość materiału potrzebnego do przygotowania próbki oraz prawie bezstratna procedura kondycjonowania i przygotowania siatki osiągnięta za pomocą cryoWriter umożliwiają badanie kompleksów białkowych poszczególnych komórek. Zminiaturyzowana metoda immunoprecypitacji i cryoWriter stanowią podstawę nowej metody proteomicznej zwanej "proteomiką wizualną pojedynczej komórki", co niedawno wykazaliśmy w eksperymentach z szokiem cieplnym²⁴. Obecnie testowane są algorytmy analizy danych ukierunkowane na analizę obrazów "proteomiki wizualnej".

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Obsługa cieczy
Końcówka mikrokapilarna	Nowy obiektyw	FS360-100-30-N-20	KrzemionkaKońcówki 30 i mikro; m ID końcówki, 100 i mikro; m ID , pk. 20
		FS360-150-30-N-20	KrzemionkaKońcówki 30 & mikro; m ID końcówki, 150 i mikro; m ID , pk. 20
Tuleja przewodząca	Nowy obiektyw	CONGAS-1	Elastomer przewodzący do styku WN, długość 12"
Rurki z topionej krzemionki	BGB-Analytik	TSP-150375	TSP Standardowe rurki FS, 150 i mikro; m ID, 363 &mikro; m OD, 5 metrów
Złącze PressFit	BGB-Analytik	2525LD	Deact. Łącznik PressFit 0,25 do 0,25 mm średnica wewnętrzna, ok. 25
Strzykawka 10 i mikro; l	BGB-Analytik	HA-80001	Hamilton 1701 LT - Końcówka Luer (igła nie jest dołączona)
Sterownik pompy strzykawkowej	Sterownik Cetoni	A3921000093	neMESYS
Jednostka dozująca pompę strzykawkową	Cetoni	A3921000095	jednostka dozująca neMESYS
Kontrola temperatury
Czujnik punktu rosy	Meltec	UFT75-AT	, obliczanie punktu rosy, USB i wbudowana biblioteka DLL
Temperatura czujnik	Sensorshop24.ch	LS7-PT1000-1.0-3L	Czujnik temperatury do montażu powierzchniowego Pt1000
Sterownik Peltiera	Cooltronic	TC2812	Regulator temperatury PID do aktywacji układów napędzanych Peltierem z wyjściem stałonapięciowym
Element Peltiera	Distrelec.ch	PE-127-14-15-S	40x40 mm
Blok chłodzący wodę	-		Blok chłodzenia wodą do elementu Peltiera 40x40 mm, podstawa miedziana
Pompa wodna	Digitec.ch	294877	XSPC X20 750 Podwójna pompa zbiornikowa 5.25 blok
wodnego wymiennika ciepła	-		Blok wodnego wymiennika ciepła z 2 wentylatorami do schładzania wody krążącej
Małe chłodnice wodne	PCHC.ch	223050	Alphacool MCX ram copper edition 2 szt
Małe elementy ogniwa petiera	Distrelec.ch	PE-031-10-15-S	Laird 15x15 mm 3,4 A 8,1 W 3,8 V 74 ° C, 2 szt
Mechanika
Stolik liniowy oś z	Dyneos AG	M-404.2PD	Precyzyjny stolik translacyjny o dużym obciążeniu, zakres przesuwu 50 mm, silnik prądu stałego
Sterownik stopnia	Dyneos AG	C-863	Sterownik serwomechanizmu Mercury Stopień
xy	Wcześniejszy	H117EIL5	Stopień zmotoryzowany do Zeiss Axiovert 200 mikroskop odwrócony
Małe magnesy trwałe	Supermagnete	S-05-08-N	Magnes prętowy & Oslash; 5 mm, wysokość 8,47 mm, neodymowy, N45, niklowany, pk. 10
Mały elektromagnes	Schramme	EG1025A02/110	Elektromagnes 24V 220 N 150 N 2,5 W
Sterownik elektromagnesu	Conrad.ch	MST-1630.001 7	Płytka PCB sterująca elektromagnesem
Piasta	elektromagnetycznaDistrelec.ch	HD8286-R-F-24V100%	Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini pęseta	Mikroskopia elektronowa Sciences	0302-M5S-PS	Dumont Type 5 mini, super cienkie końcówki
Różne części optomechaniczne	Thorlabs	-
różne części mechaniczne	Warsztat Biozentrum, Uniwersytet w Bazylei	-	Specjalnie zaprojektowane płyty adaptera, uchwyty itp. zobacz załączone pliki CAD
Optics
Laser diode	Thorlabs	CPS780S	780 nm moduł diody laserowej 2,5 mW
Fotodetektor	Thorlabs	PDA100A-EC	Si Przełączany detektor wzmocnienia, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mmSiatki 2
EM
DURASIN FILM TEM		emsdiasum.comDTF-03523	30 nm DuraSiN™ membrany z azotku krzemu do TEM, opakowanie 5 sztuk
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1	Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3	Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS	Sigma	D8537  SIGMA	Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanem
NanoVan 2%	nanoprobes.com	NanoW
			Ujemna plama na bazie wolframu
Software
openBEB			2 jest dostępny na żądanie, wersja 3 będzie dostępna do pobrania
Kontrola CryoWriter oprogramowanie (wtyczka openBEB)		Dostępne na żądanie, mogą obowiązywać dodatkowe opłaty za oprogramowanie sterownika innych firm.