Artykuł metodologiczny

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

22.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57310

⸱

27 lipca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Cellular Imaging and NanoAnalytics (C-CINA), Biozentrum, University of Basel, 2Swiss Nanoscience Institute, University of Basel, 3BioEM lab, Biozentrum, University of Basel

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Streszczenie

Ze względu na niedawny postęp technologiczny, mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) szybko staje się standardową metodą analizy strukturalnej kompleksów białkowych do rozdzielczości atomowej. Wąskim gardłem pozostają jednak techniki izolacji białek i metody przygotowania próbek do EM. Stosunkowo niewielka liczba (od 100 000 do kilku milionów) pojedynczych cząstek białka musi zostać zobrazowana w celu analizy białek w wysokiej rozdzielczości metodą EM pojedynczej cząstki, co umożliwia zastosowanie zminiaturyzowanych technik obsługi próbek i zasad mikroprzepływowych.

Przedstawiono zminiaturyzowaną, wolną od bibuły metodę przygotowania siatki EM do wstępnego kondycjonowania próbki, gruntowania siatki EM i obróbki końcowej, która zużywa tylko nanolitrowe objętości próbki. Metoda wykorzystuje system dozowania z precyzją sub-nanolitrów do kontrolowania wchłaniania cieczy i zalewania siatki EM, platformę do kontrolowania temperatury siatki, określając w ten sposób wilgotność względną nad siatką EM, oraz mechanizm podnoszenia i zanurzania do witryfikacji próbki. W przypadku cryo-EM siatkę EM umieszcza się na stoliku o kontrolowanej temperaturze, a próbkę zasysa się do kapilary. Końcówka kapilarny jest umieszczana w pobliżu powierzchni siatki, siatka jest ładowana próbką, a nadmiar jest ponownie zasysany do mikrokapilary. Następnie folia próbki jest stabilizowana i nieznacznie rozcieńczana przez kontrolowane parowanie wody regulowane przesunięciem temperatury platformy w stosunku do punktu rosy. W pewnym momencie uruchamiany jest mechanizm podnoszenia i zanurzania, który szybko przenosi zalaną siatkę EM do ciekłego etanu w celu zeszklenia próbki. Alternatywnie dostępne są metody kondycjonowania próbki w celu przygotowania objętości próbki o wielkości nanolitrów do barwienia ujemnego (NS) EM.

Metodologie znacznie zmniejszają zużycie próbek i unikają podejść potencjalnie szkodliwych dla białek, takich jak bibuła filtracyjna stosowana w konwencjonalnych metodach. Co więcej, niewielka ilość wymaganej próbki pozwala na nowatorskie strategie eksperymentalne, takie jak szybkie kondycjonowanie próbek, połączenie z lizą pojedynczych komórek w celu "wizualnej proteomiki" lub "bezstratne" przygotowanie całkowitej próbki do analizy ilościowej złożonych próbek.

Wprowadzenie

Sprzęt i oprogramowanie do analizy strukturalnej kompleksów białkowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) znacznie rozwinęły się w ostatnich latach. Wprowadzone ulepszenia utorowały drogę do „rewolucji rozdzielczości”1,2 i zasadniczo zmieniły badania strukturalne. Rewolucja ta rozpoczęła się wraz z pojawieniem się kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM)3,4, która umożliwiła przygotowanie próbek biologicznych w warunkach bliskich fizjologicznym, jednocześnie zmniejszając wrażliwość na promieniowanie i zapobiegając odparowywaniu próbek w wysokiej próżni mikroskopu transmisyjnego5. W kolejnych latach stopniowy postęp technologiczny sukcesywnie zwiększał osiągalną rozdzielczość. Wśród tych innowacji znalazło się zastosowanie działek z emisją polową6,7, a w późniejszym czasie udoskonalone algorytmy analizy danych, takie jak metody maksymalnej wiarygodności8,9. Kamery z bezpośrednimi detektorami elektronów10,1,12,13, obrazowanie w trybie filmowym oraz towarzyszący im rozwój oprogramowania14,15,16,17 zapewniły ostateczny przełom niezbędny do osiągnięcia rozdzielczości atomowej dla próbek biologicznych za pomocą analizy pojedynczych cząsteczek (przegląd dostępny w pracy Cheng, Grigorieff, et al.18). Znaczenie cryo-EM zostało niedawno uznane poprzez przyznanie Nagrody Nobla w dziedzinie chemii trojgu pionierom tej metody.

Aby obrazować próbkę biologiczną za pomocą TEM, metoda ładowania siatki EM próbką (dalej określana jako „przygotowanie siatki”) musi zapewniać, aby powstała warstwa próbki (i) była wystarczająco cienka (<10 nm), aby uniknąć znacznego szumu wywołanego przez elektrony rozproszone nieelastycznie lub wielokrotnie, (ii) wytrzymywała wysoką próżnię mikroskopu elektronowego oraz (iii) chroniła biomolekuły przed uszkodzeniami radiacyjnymi. Do spełnienia tych wymagań stosuje się dwie główne metody: procedury barwienia negatywowego (NS)19,20 (Rysunek 1A) polegają na adsorpcji próbki na cienkiej błonie węglowej, zanurzeniu biomolekuł w amorficznym ciężkim metalu, a następnie wysuszeniu zespołu na powietrzu. Jest to metoda prosta i szybka, a załadowane siatki EM (dalej określane jako „siatki z próbką”) są łatwe w przechowywaniu i mogą być zachowane przez długi czas (zazwyczaj lata). W TEM preparaty te wykazują wysoki kontrast dzięki NS i tolerują wyższe dawki elektronów niż preparaty kriogeniczne, jednak rozdzielczość jest ograniczona do około 20 Å. Procedury Cryo-EM (Rysunek 1B) wykorzystują perforowane podłoża węglowe. Cienka warstwa roztworu próbki jest rozciągnięta nad otworami, a siatka EM jest zanurzana w kriogenie, zazwyczaj w upłynnionym etanie, aby szybko schłodzić ją poniżej -150°C. Wynikiem jest amorficzna, witryfikowana warstwa roztworu o grubości od 50 do 10 nm w otworach podłoża. Ta cienka, amorficzna warstwa wytrzymuje wysoką próżnię w mikroskopie elektronowym i w idealnym przypadku zachowuje struktury biologiczne w ich stanie natywnym. Procedura ta pozwala na obrazowanie próbek biologicznych z wysoką rozdzielczością. Jednak siatka z próbką musi być przez cały czas przechowywana w temperaturach poniżej -150 °C, aby uniknąć dewitryfikacji. Można ją obrazować przy użyciu stosunkowo wysokich dawek elektronów ze względu na niską temperaturę, niemniej jednak kontrast i stosunek sygnału do szumu są niskie. Dlatego stosuje się techniki uśredniania w celu zwiększenia kontrastu i, pod warunkiem obrazowania próbki pod różnymi kątami, można zrekonstruować trójwymiarową (3D) mapę o wysokiej rozdzielczości. Obecnie najczęściej stosowaną i niezwykle skuteczną metodą rekonstrukcji 3D jest podejście pojedynczych cząsteczek (single particle approach). Nowoczesny przegląd literatury przedstawiono w pracy Cheng i wsp.18.

TEM z barwieniem negatywowym (NS-EM) jest istotny w procesach przesiewania i kontroli jakości, gdy wymagany jest wysoki kontrast lub gdy dysponujemy ograniczoną ilością próbki (adsorpcja do błony węglowej zazwyczaj zagęszcza próbkę). Kriomikroskopia elektronowa pojedynczych cząsteczek (single particle cryo-EM) jest złotym standardem, jeśli celem jest uzyskanie wysokorozdzielczych rekonstrukcji 3D struktury białka.

Procesy nanotechnologiczne: schemat manipulacji kroplami, etapy mikrofabricatedacji, układ eksperymentalny.
Rycina 1Zasady przygotowania siatki do TEM oraz porównanie metody klasycznej (panel A, B) i podejścia mikrofluidycznego (panel C, D). A) Klasyczne przygotowanie siatek do NS-EM: Opis 3 µL próbkę pipetuje się ręcznie na siatkę do EM pokrytą ciągłą warstwą węgla (w dalszej części określaną jako „siatka NS-EM”) (i). Po inkubacji przez ok. 10 s nadmiar cieczy odsącza się z boku za pomocą papieru filtracyjnego (ii), pozostawiając zaadsorbowane biomolekuły w cienkiej warstwie wody. Następnie białko inkubuje się w roztworze soli ciężkiego metalu, np., 2% octanu uranylu przez 20 s (iii), a następnie ponownie usuwa się ciecz, osuszając brzeg papierem filtracyjnym (iv). Na koniec siatkę do EM pozostawia się do wyschnięcia na powietrzu. B) Klasyczne przygotowanie siatek do kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM): Opis 3 µL próbki przenosi się pipetą na błonę z dziurawego węgla. Aby utworzyć cienką warstwę próbki, nadmiar cieczy usuwa się poprzez osuszanie papierem filtrującym z jednej lub obu stron (ii). Na koniec siatkę szybko zanurza się w ciekłym etanie w celu witryfikacji (iii). C) Przygotowanie siatek do NS-EM przy użyciu zestawu cryoWriter: za pomocą mikrokapilary (i) aspiruje się 5 nL objętości z zapasu próbki. W celu kondycjonowania próbki końcówka mikrokapilary zostaje zanurzona w roztworze kondycjonującym, np., 2% octanu amonu. Jony i małe cząsteczki są wymieniane drogą dyfuzji (ii). Należy zauważyć, że wymiary mikrokapilary zapewniają, iż cały proces jest napędzany przez dyfuzję. Białka mają znacznie niższe stałe dyfuzji niż jony soli i nie ulegają w znacznym stopniu stracie24Na koniec próbkę nanosi się na siatkę i pozostawia do wyschnięcia (iii). D) Zasady przygotowywania siertek do krio-EM z wykorzystaniem metody opartej na urządzeniu cryoWriter: Siertekę EM pokrytą dziurkowaną błoną węglową umieszcza się na powierzchni platformy z kontrolowaną temperaturą i przytrzymuje pęsetą. Temperatura platformy jest regulowana z zachowaniem określonej różnicy względem temperatury punktu rosy w otoczeniu siertek. Sierteka jest przesuwana względem mikrokapilary zawierającej próbkę, a następnie mikrokapilara jest obniżana aż do momentu, gdy znajdzie się kilka mikrometrów nad sierteką. Następnie nanosi się z niej kilka nanolitrów próbki, podczas gdy stolik porusza się po trajektorii spiralnej; nadmiar cieczy jest ponownie zasysany (i). Po przygotowaniu siertek EM mikrokapilara jest wycofana, a sierteka pozostaje na platformie z kontrolowaną temperaturą (zwanej dalej stolikiem punktu rosy (DP)) przez krótki czas, aby umożliwić odparowanie kontrolowanej ilości próbki. W celu mrożenia szokowego sierteka jest szybko zdejmowana ze stolika za pomocą pęsety (ii), a następnie odwracana przez 90° do pozycji pionowej, a następnie zanurzono w kąpieli kriogenicznej (iii) (dalej określany jako mechanizm „pick-and-plunge”). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Niestety metody przygotowywania siatek stosowane w NS i cryo-EM nie uległy znaczącej poprawie od czasu ich opracowania. Obecnymi wadami są wysokie zużycie próbki (ok. 3 µL o stężeniu 1 mg/ml białka) oraz dużą ilość (> 9%) próbki utracono (Rycina 1A,B). Ponadto klasyczna metoda stosowana do przygotowania siatek do kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) jest procedurą drastyczną dla białek: po pierwsze, obejmuje ona etap intensywnego osuszania za pomocą papieru filtracyjnego (blottingu) z przodu (Rycina 1B, ii), a po drugie, białko jest wystawione na działanie granicy faz powietrze-woda przez znaczny czas21W niniejszej pracy przedstawiono alternatywną metodę przygotowania próbek, przygotowania siatek obiektowych oraz post-processingu (suszenia lub witryfikacji siatek) dla NS-EM (Rycina 1C) lub krio-EM (Rysunek 1D) zostaje przedstawiony. Opracowany wewnętrznie układ, nazwany „cryoWriter”, wykorzystuje zminiaturyzowaną technologię obsługi próbek oraz zasady mikroprzepływowe do aspiracji, kondycjonowania i dozowania próbki, co pozwala całkowicie uniknąć stosowania papierowych pasków do odsączania i zapewnia alternatywne metody rozcieńczania próbek do krio-EM. Rozwiązanie to znacząco zmniejsza zużycie próbek i zwiększa kontrolę użytkownika nad całym procesem ich przygotowania. Co więcej, metoda ta umożliwia nowe zastosowania eksperymentalne, takie jak przygotowanie wyizolowanych komponentów biologicznych pojedynczych komórek w podejściu zwanym „wizualną proteomiką pojedynczych komórek”.22,23,24,25.

Protokół

A "cryoWriter" (Rysunek 2; szczegóły zobacz poprzednie prace24,26,27) lub równoważne oprzyrządowanie jest wymagane dla następujących protokołów. Lista dostawców głównych części i materiałów eksploatacyjnych znajduje się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie siatki do barwienia ujemnego (NS)

  1. Włącz instrument i uruchom oprogramowanie. Zainicjuj wszystkie niezbędne moduły (sterownik pompy strzykawkowej, stopnie z napędem, kamery monitorujące i stopień punktu rosy).
  2. Schłodzić podporę próbki i stolik punktu rosy. W razie potrzeby upewnij się, że temperatura stage punktu rosy jest regulowana o 1 - 2 °C powyżej punktu rosy.
    UWAGA: Stolik jest chłodzony przez komercyjne urządzenie Peltiera z regulatorem PID.
  3. Przygotować NS, napełniając probówkę PCR o pojemności 100 lub 200 μl 100 - 150 μl NS (np. dostępnym w handlu 2% wolframianem metyloaminy). Umieść rurkę na schłodzonym wsporniku próbki instrumentu.
  4. Ustawić próbkę.
    1. Umieść próbkę (0,5 - 1 μM) w probówce PCR o pojemności 100 lub 200 μl. Jeśli dostępna jest mniejsza niż 50 μl próbki, odetnij dno probówki do PCR żyletką i użyj jej jako dołka na próbkę. Dzięki temu mikrokapilara będzie mogła łatwo dotrzeć do próbki.
      UWAGA: Najłatwiej jest zasysać próbki z probówek PCR o pojemności 100 lub 200 μl, ponieważ mikrokapilara używana później do zasysania próbki jest lekko nachylona, a kierunek osi z na wysokości przesuwu jest ograniczony.
    2. Umieść probówkę/pojemnik do PCR na schłodzonym nośniku próbki w urządzeniu, aby zapobiec parowaniu. Alternatywnie, próbki można zasysać z płytek studzienkowych w inkubatorze ze stopniem mikroskopu w temperaturze pokojowej; Chłodzenie nie jest realizowane w przypadku płyt studzienkowych.
  5. Definiowanie pozycji. Użyj joysticka cryoWriter, który steruje zmotoryzowanym stolikiem xy i przyciskami sterowania oprogramowaniem dla liniowych stolików osi x, y i z, aby ustawić mikrokapilarę. Użyj aparatu, aby sprawdzić położenie kapilary.
    1. Przenieś mikrokapilar do zbiornika na próbkę. Zanurz końcówkę w cieczy próbki i zapisz tę pozycję jako "próbka".
    2. Przenieś mikrokapilę do probówki NS PCR, zanurz końcówkę w roztworze NS i zapisz tę pozycję jako "plamę".
    3. Umieść mikrokapilę około 100 μm powyżej środka szczeliny, w której zostanie umieszczona siatka EM i zapisz tę pozycję jako "grid_save".
  6. Odessać próbkę i kondycjonować ją pod kątem NS-EM.
    1. Jeśli nie jest jeszcze zainstalowana, zamontuj strzykawkę 10 μl (średnica wewnętrzna 0,46 mm) na precyzyjnej pompie strzykawkowej.
    2. Przykleić jeden koniec mikrokapilary z topionej krzemionki o długości 30 cm (średnica zewnętrzna 360 μm, średnica wewnętrzna 150 μm) do wylotu strzykawki.
    3. Podłącz drugi koniec mikrokapilary do krótkiej (5 cm) stożkowej mikrokapilary za pomocą złącza wciskanego. Zwężająca się końcówka krótkiej mikrokapilary tworzy końcówkę dozującą.
    4. Napełnić strzykawkę odgazowaną, podwójnie destylowaną wodą (ddH2O; płyn systemowy) i unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    5. Dozuj kilkadziesiąt nanolitrów płynu systemowego i usuń wszelkie krople z mikrokapilary za pomocą niestrzępiącej się chusteczki.
    6. Kliknij dwukrotnie zapisaną pozycję próbki. W ten sposób mikrokapilar znajduje się w dołku próbki. Podczas ruchu kapilary należy dozować 3 x 0,5 nl płynu systemowego tuż przed zanurzeniem końcówki mikrokapilary w próbce, aby zapobiec uwięzieniu tam pęcherzyków powietrza (patrz uwaga 2 poniżej).
    7. Odessać 5 nl próbki.
    8. Kliknij dwukrotnie zapisaną pozycję NS. Mikrokapila jest pobierana z pojemnika na próbkę i automatycznie przenoszona do zbiornika NS. Gdy kapilara się porusza, należy ręcznie dozować 3 x 0,5 nL próbki cieczy tuż przed zanurzeniem końcówki w zbiorniku, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza (patrz uwaga 2 poniżej).
      UWAGA: WAŻNE: (1) Podczas przełączania z trybu zasysania na tryb dozowania lub odwrotnie występuje niewielka utrata skoku tłoka z powodu luzu w kołach zębatych pompy strzykawkowej. Według producenta luz nowej jednostki wynosi od 7 do 12 μm. W przypadku naszej strzykawki o średnicy cylindra 0,46 mm przekłada się to na 1-2 nL. W związku z tym można "dozować" 1-2 nL, zanim próbka zostanie faktycznie dozowana. Zwykle maleńka kropelka zaczyna opuszczać końcówkę mikrokapilary po trzecim kroku dozowania 0,5 nL. (2) Pęcherzyk powietrza uwięziony powyżej/poniżej próbki sprawiłby, że dozowanie byłoby mniej dokładne i uniemożliwiłoby kondycjonowanie próbki przez dyfuzję.
    9. Pozostawić mikrokapilar zanurzoną na 3-12 minut, w zależności od bufora próbki i geometrii dyszy.
      UWAGA: Im wyższe stężenie soli i/lub fosforanu w buforze, tym dłuższy wymagany czas zanurzenia. NS (stosunkowo szybko) dyfunduje do czopa próbki, podczas gdy sole buforowe (stosunkowo szybko) i białko (znacznie wolniej) dyfundują na zewnątrz. Obniża to stężenie soli buforowych w próbce, zapobiegając ich krystalizacji po wyschnięciu załadowanej siatki. Ponadto fosforan ma tendencję do tworzenia osadu w połączeniu z NS.
  7. Przygotować siatkę i umieścić miejsce kondycjonowanej próbki.
    1. Podczas kondycjonowania próbki weź kawałek taśmy klejącej i blok PDMS i wyczyść górną stronę PDMS, nakładając i usuwając taśmę samoprzylepną, aby upewnić się, że nie ma kurzu. Umieść blok PDMS na szalce Petriego.
      UWAGA: Nowe bloki PDMS są pobierane z pomieszczenia czystego.
    2. Ostrożnie podnieś siatkę (np. Cu, oczko 200 lub 400 pokryte folią Parlodion/C). Upewnij się, że pęsetą dotykasz tylko krawędzi siatki. Umieść go na czystym bloku PDMS z folią węglową skierowaną do góry.
    3. Umieść blok PDMS z rusztem w jednostce wyładowczej jarzeniowej i rozładowuj go jarzeniowo przez 20 s z mocą 100 W przy 0,4 mbar. Przechowuj siatkę na zamkniętej szalce Petriego. Dłuższe czasy wyładowania jarzeniowego zazwyczaj prowadzą do większego rozproszenia objętości osadzonej próbki na siatce. W efekcie warstwa bejcy staje się cieńsza (słabsza plama).
    4. Na 1 minutę przed upływem czasu zanurzenia chwyć rozżarzoną siatkę za pomocą pęsety cryoWriter. Upewnij się, że elektromagnes jest włączony; w przeciwnym razie włącz go w oprogramowaniu. Zamontuj pęsetę na elektromagnesie i użyj ręcznej mikromanipulatora, aby wyrównać siatkę płasko na stoliku z punktem rosy, stroną z folią węglową do góry. Upewnij się, że temperatura stage punktu rosy jest regulowana o 1-2 °C powyżej punktu rosy, aby zmniejszyć szybkość parowania po załadowaniu próbki.
    5. Gdy czas zanurzenia dobiegnie końca, kliknij dwukrotnie "grid_save". Końcówka mikrokapilarna zostanie bezpiecznie umieszczona nad powierzchnią siatki. Ręcznie zetknąć końcówkę mikrokapilary z siatką. Podnieś dyszę o 10 μm i umieść ją powyżej środka.
      ostrożność: Niektóre próbki zawierające detergenty mają tendencję do przesuwania się w górę wzdłuż zewnętrznej powierzchni mikrokapilary, gdy dozowana jest ciecz ze względu na niższe napięcie powierzchniowe. Ważne jest, aby znajdować się bardzo blisko powierzchni siatki, aby zapobiec takim stratom.
    6. Nanieść 5 nl próbki na siatkę. W suchy dzień, gdy na końcówce mikrokapilarnej następuje szybkie parowanie, można również powoli dozować do momentu, aż próbka znajdzie się na samej końcówce, a następnie szybko dozować 5 nL.
    7. Wycofać mikrokapilę i pozostawić kondycjonowaną próbkę do powolnego wyschnięcia na stopniu punktu rosy (stopień DP).
    8. Po wyschnięciu miejsca pobierania próbek zdejmij siatkę i przechowuj ją w temperaturze pokojowej w siatce lub na szalce Petriego.
    9. Dozować 500 nL płynu systemowego z mikrokapilary i usunąć go niestrzępiącą się chusteczką. Przepłukać kapilatę 5 razy etanolem, detergentem lub 1 M NaOH. W ten sposób mikrokapila jest czyszczona, co pozwala na użycie jej z inną próbką.

2. Przygotowanie do kriokraty

  1. Aby przygotować przyrząd i próbkę, wykonaj kroki od 1.1 do 1.5 opisane powyżej. Jeśli NS nie jest wymagany, pomiń kroki 1.3 i 1.5.2. W celu wymiany buforu próbki lub kondycjonowania próbki do krio-EM za pomocą dializy, np. w celu zmniejszenia stężenia soli buforowych lub wprowadzenia dodatków (np. trehalozy, detergentów), należy użyć żądanego buforu zamiast NS w krokach 1.3 i 1.5.2.
  2. Przygotuj ciekły etan w standardowym pojemniku kriogenicznym.
    1. Zmontuj kubek na etan, uchwyt na kriopojemnik i pająk i napełnij pojemnik kriogeniczny po brzegi ciekłym azotem; zwykle wymaga około 200 ml. Odczekaj kilka minut, aż kubek z etanem ostygnie i będzie wolny od ciekłego azotu.
    2. Otwórz butlę z etanem i powoli pozwól, aby gaz wpłynął do kubka na etan. Pozwól mu napełnić się ciekłym etanem, aż poziom znajdzie się 2-3 mm poniżej góry; Zajmuje to kilka minut i wymaga około 5 ml ciekłego etanu.
    3. Weź pudełko kriogeniczne i umieść je w wolnym gnieździe w pojemniku kriogenicznym.
    4. Usuń pająka, umieść pokrywkę z polistyromu na górze i umieść pojemnik kriogeniczny na uchwycie w cryoWriterze.
  3. Rozładowanie żarowe siatki EM.
    1. Weź kawałek taśmy klejącej i blok polidimetylosiloksanu (PDMS) i wyczyść górną stronę PDMS, nakładając i usuwając taśmę klejącą (usuwa kurz). Umieść blok PDMS na szalce Petriego.
    2. Ostrożnie wybierz siatkę z pola siatki. Upewnij się, że pęsetą dotykasz tylko krawędzi siatki. Umieść go na czystym bloku PDMS z dziurawą folią węglową skierowaną do góry.
    3. Umieść blok PDMS z siatką w myjce plazmowej i oczyść plazmowo powierzchnię kratki (np. użyj 75% Ar/25% H2, moc 50 W, ciśnienie 25 mTorr). Umieść blok PDMS z siatką rozżarzoną na szalce Petriego.
  4. Ustaw siatkę w instrumencie
    1. Chwyć rozżarzoną siatkę za pomocą pęsety cryoWriter. Upewnij się, że elektromagnes jest włączony; w przeciwnym razie włącz go w oprogramowaniu. Zamontuj pęsetę na elektromagnesie i użyj ręcznej mikromanipulatora, aby wyrównać siatkę płasko na scenie, stroną z folią węglową do góry.
    2. Kliknij dwukrotnie "grid_save". Wyreguluj położenie mikrokapilary tak, aby końcówka znajdowała się ok. 10 μm nad powierzchnią siatki. Upewnij się, że mikrokapilara może swobodnie poruszać się po siatce, nie dotykając jej gdziekolwiek, w razie potrzeby wycofaj mikrokapilę o kilka mikrometrów.
    3. Wróć do środka siatki i zapisz nową pozycję jako "siatkę".
      ostrożność: Poprawne nazewnictwo jest niezbędne, aby skrypt makra działał.
  5. Napisz próbkę i zamroź siatkę.
    1. Przepłucz mikrokapilę kilkudziesięcioma nanolitrami płynu systemowego i usuń wszelkie krople z mikrokapilary za pomocą niestrzępiącej się chusteczki.
    2. Uruchom skrypt makra. Makro wykona następujące kroki:
      1. Dozować 5 nL (aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z końcówki) i przejść do pozycji próbki.
      2. Odessać 65 nl próbki. Wlej 5 nl z powrotem do probówki z próbką. Uwzględnia to luz systemu i umożliwia zsynchronizowany zapis, tj. w celu zapewnienia, że dozowanie i ruch etapu rozpoczynają się w tym samym czasie.
      3. Przejdź do pozycji "siatka".
      4. Zainicjuj "wzorzec zapisu", który spowoduje, że mikrokapilara przesunie się po siatce, jednocześnie dozując 45 nL próbki.
      5. Następnie przesuń mikrokapilę z powrotem na środek siatki, opuść ją o kolejne 10 μm i pobierz nadmiar cieczy próbki.
      6. Wyjmij mikrokapilę i wyłącz elektromagnes. Spowoduje to zwolnienie pęsety i zainicjowanie zamrażania wgłębnego.
  6. Chwyć pęsetę i ostrożnie zwolnij adapter magnetyczny z tłoka. Szybko przenieś siatkę z kubka na etan do pojemnika kriogenicznego zawierającego pudełko kriogeniczne i umieść siatkę w wolnym gnieździe.

3. Przygotowanie lizatu jednokomórkowego

  1. Przygotuj mikrokapilary do elektroporacji.
    UWAGA: Stożkowe (ciągnięte laserowo i kontrolowane) mikrokapilary ze stopionej krzemionki mają ochronną powłokę poliimidową na zewnątrz, z wyjątkiem końcówki, gdzie powłoka jest wypalana podczas procesu zwężania.
    1. Aby pokryć mikrokapilary warstwą przewodzącą, zamontuj je pod kątem 45° na metalowej szynie, końcówkami skierowanymi do góry. Użyj folii aluminiowej, aby osłonić dolny koniec (2 cm) końcówek, ponieważ niepowlekany poliimid tworzy najlepsze uszczelnienie z zastosowanymi później łącznikami wciskanymi.
    2. Napylanie osadza lepką warstwę Ti/W o grubości 20 nm, a następnie warstwę Pt o grubości 200 nm.
  2. Spraw, aby końcówka mikrokapilarna była hydrofobowa.
    1. Przygotować 1 M roztwór 1-dodekanetiolu w EtOH.
    2. Rozładowanie jarzeniowe mikrokapilary w powietrzu przez 1 minutę o mocy 100 W przy 0,4 mbar.
    3. Zanurzyć końcówkę mikrokapilary w 1 M roztworze 1-dodekanetiolu na kilka godzin (najlepiej na noc).
      UWAGA: Końcówki najlepiej przygotować na świeżo dzień przed użyciem.
  3. Zainstaluj nową mikrokapilę.
    1. Usunąć mikrokapilar z roztworu 1-dodekanetiolu, spłukać z zewnątrz etanolem i przepłukać wnętrze etanolem za pomocą strzykawki.
      UWAGA: Jeśli nie są dostępne funkcjonalizowane mikrokapilary, szybko rozładuj końcówkę mikrokapilary i zanurz ją w kropli środka do obróbki szyb samochodów komercyjnych, która jest mieszaniną PDMS i kwasu siarkowego. Wynikająca z tego funkcjonalizacja hydrofobowa nie jest tak dobra jak w przypadku 1-dodekanetiolu, ale generalnie wystarczająca.
    2. Rozetnij jego niepowlekany koniec za pomocą noża do kapilarek.
      UWAGA: Czyste cięcie jest ważne dla dobrego uszczelnienia za pomocą złącza wciskanego.
    3. Użyj wykałaczki, aby nałożyć srebrną pastę na ostrą granicę utworzoną między szkłem a powłoką poliimidową, gdy powłoka poliimidowa została spalona przez laser podczas ciągnięcia kapilary.
      UWAGA: To wzmocnienie jest konieczne, ponieważ powłoka Pt jest bardzo słaba w tym obszarze, a przewodzenie elektryczne może łatwo ulec awarii.
    4. Przemyć poliimidowy koniec mikrokapilary acetonem. Na końcu pozostaw niewielką kroplę acetonu i włóż ją do otworu złącza wciskanego. Zastosuj lekki nacisk, aby uzyskać dobre uszczelnienie.
  4. Skalibruj położenie mikrokapilary.
    1. Włącz instrument i uruchom oprogramowanie zgodnie z opisem w kroku 1.1. Dodatkowo zainicjuj kamerę mikroskopu i generator funkcji.
    2. Umieść szklane szkiełko mikroskopowe w uchwycie szkiełka na mikroskopie.
    3. Opuść mikrokapilę blisko szkiełka i wyśrodkuj ją nad obiektywem mikroskopu, aż pojawi się w widoku kamery mikroskopu. Użyj stopni liniowych osi x i y, aby ustawić końcówkę mikrokapilary na środku obrazu. Następnie powoli opuść końcówkę, aż lekko dotknie szklanego szkiełka.
      ostrożność: Wybierz bardzo małe kroki (5 μm) w kierunku ostatecznego podejścia. W przeciwnym razie końcówka może zostać uszkodzona.
    4. Naciśnij przycisk "Kalibruj dyszę". Spowoduje to cofnięcie mikrokapilary o 40 mm i ustawienie tej pozycji jako pozycji wyjściowej.
  5. Przygotowanie tłoczonych elementów PDMS i szkiełek ITO
    1. Wymieszać PDMS i środek sieciujący w proporcji 10:1, przelać na dużą szalkę Petriego na głębokość około 2-3 mm. Piec w temperaturze 60°C przez kilka godzin w inkubatorze do hybrydyzacji lub podobnym urządzeniu.
    2. Za pomocą młotka i stempla (średnica 12 mm) wyciąć otwory w warstwie PDMS. Następnie za pomocą skalpela wytnij kwadraty lub prostokąty o długości 2 cm, w tym otwory, aby uzyskać wytłoczone kawałki, które zmieszczą się na szkiełku mikroskopowym. Zwykle dwa wytłoczone elementy są montowane na jednym szkiełku mikroskopowym.
    3. Umyj elementy PDMS i szkiełka ITO najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem. Umieść je mokre na szalce Petriego i pozwól etanolowi całkowicie odparować w piekarniku w temperaturze 60 ° C.
    4. Wyładowanie jarzeniowe ITO przesuwa się przez 1 minutę z mocą 100 W przy 0,4 mbar, a następnie nanosi 1 ml roztworu powlekającego (np. poli-L-lizyny (PLL)). Inkubować przez 5 minut, usunąć roztwór pipetą i nałożyć 1 ml ddH2O. Lekko mieszać przez 1 minutę, a następnie usunąć ddH2O za pomocą pipety. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze 60°C.
  6. Przygotuj kulturę komórkową. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem hodowli komórek przylegających (np. Arnold i wsp.24,25). Komórki nasienne na ITO podczas normalnych przebiegów rozłupywania/pasażowania.
    1. Weź świeżo pokryty PLL szkiełko ITO i dodaj kawałek PDMS. Zastosuj pewien nacisk, aby utworzyć wodoszczelne uszczelnienie. W ten sposób powstają małe studnie, których podstawą jest zjeżdżalnia.
    2. Dodać około 300 μl komórek zawieszonych w świeżej pożywce do studzienek PDMS. Gęstość wysiewu powinna wynosić około 75 000 komórek na studzienkę.
    3. Inkubuj szkiełka ITO przez 1-2 dni w standardowych warunkach.
  7. Przygotuj się do eksperymentu z lizą komórek:
    1. Podgrzej wstępnie kilka mililitrów buforu do elektroporacji (np. soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)).
    2. Przygotowanie do przygotowania sieci NS-EM
      UWAGA: Szczegóły dotyczące przygotowania konfiguracji są pokazane w krokach 1.1-1.5 (dla NS) lub krokach 2.1-2.4 (dla krio). Poniżej opisujemy najważniejsze etapy przygotowania NS.
      1. Przygotować NS, napełniając probówkę PCR o pojemności 100 lub 200 μl 100-150 μl NS (np. dostępnym w handlu 2% wolframianem metyloaminy). Umieść rurkę na schłodzonym wsporniku próbki instrumentu.
      2. Przenieś mikrokapilę do probówki NS PCR, zanurz końcówkę w roztworze NS i zapisz tę pozycję jako "plamę".
    3. Załaduj standardowe parametry lizy, np. napięcie lizy.
    4. Wyjmij szkiełko ITO z inkubatora i zamontuj je na wkładzie mikroskopu. Użyj dwóch, aby przymocować prowadnicę do aluminiowej wkładki i zapewnić kontakt elektryczny między powłoką ITO prowadnicy a elektrycznie uziemioną aluminiową ramą.
    5. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć dwukrotnie 300 μl buforu do elektroporacji. Przechowuj ogniwa w buforze do elektroporacji.
    6. Umieść aluminiową wkładkę przytrzymującą szkiełko ITO w inkubatorze z żywymi komórkami stage na zestawie.
    7. Zlokalizuj hodowlę komórkową w widoku mikroskopu i wybierz obszar, w którym nie ma komórek. Zbliż końcówkę do powierzchni ITO i delikatnie jej dotknij, a następnie wycofaj końcówkę na 100 μm i zapisz pozycję jako "komórki".
    8. Szybko opuść hodowlę komórkową i przepłucz końcówkę mikrokapilary kilkudziesięcioma nanolitrami płynu systemowego, a następnie ponownie włóż go do hodowli komórkowej. Dozuj kilka nanolitrów podczas zanurzania w studni PDMS, aby upewnić się, że żadne pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione na końcówce.
    9. Delikatnie zbliż się do powierzchni ITO (początkowo musisz znajdować się w pozycji "komórki", tj. 100 μm nad powierzchnią). Po zetknięciu wycofaj końcówkę 10 μm.
    10. Wybierz pobliską komórkę do lizy. Umieść końcówkę mikrokapilary nad docelową komórką.
  8. Uruchom skrypt makra do lizy pojedynczych komórek.
    1. Nazwij pozycję, do której mikrokapilara powinna zostać przesunięta po pomyślnej lizie komórki. Będzie to zbiornik NS (NS-EM), bufor odsalający (cryo-EM) lub siatka EM (cryo-EM). Unikaj błędów ortograficznych i naciśnij "ok".
    2. Makro przebiega bez interwencji użytkownika:
      1. i) Stolik mikroskopu i hodowla komórkowa o 100 μm są przesuwane w lewo, wykonywana jest migawka docelowej komórki i dozowanie 50 nL cieczy systemu ddH2O z mikrokapilary. Powoduje to wyparcie i rozcieńczenie buforu o wysokiej zawartości soli oraz wywieranie ciśnienia osmotycznego na ogniwo.
      2. ii) Stolik zostanie przesunięty z powrotem, aby ponownie umieścić końcówkę nad komórką docelową. Stosowany jest wstępnie zdefiniowany impuls napięcia, a po 500 ms system pompowy zaczyna zasysać 3 nL próbki przy natężeniu przepływu 2 μL/min.
      3. iii) Stolik zostanie ponownie przesunięty w lewo, co pozwoli na inspekcję komórki. Pojawi się okno z prośbą o wprowadzenie danych przez użytkownika.
    3. Powiedz, czy etap lizy zakończył się sukcesem, czy nie.
      1. Jeśli odpowiedź brzmi "nie", przejmij kontrolę, przepłucz mikrokapilarnę i skieruj się na nową komórkę.
      2. Jeśli odpowiedź jest twierdząca, wykonywana jest migawka usuniętej (zlizowanej) komórki, a następnie mikrokapilara jest przenoszona do miejsca określonego w ppkt 3.8.1. Jeśli jest to NS lub zbiornik buforowy, użyj standardowego interfejsu użytkownika, aby dozować 3 x 0.5 nl płynu podczas ruchu mikrokapilary, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Końcówka jest zanurzana w cieczy zbiornika przez makro.
        UWAGA: Można kontynuować kondycjonowanie próbki i przygotowywać siatki, jak wyjaśniono w sekcjach 1.6.9 - 1.7.9 dla NS-EM lub sekcjach 2.2 - 2.6 dla cryo-EM. Poniżej wyjaśniono niezbędne kroki do przygotowania siatki NS.
    4. Pozostaw mikrokapilę zanurzoną w zanurzeniu na 8-12 minut, w zależności od geometrii dyszy
      UWAGA: Wysokie stężenie fosforanów w buforze wymaga dłuższego czasu zanurzenia w celu kondycjonowania.
    5. Dozować 5 ml kondycjonowanego lizatu komórkowego na siatkę.
    6. Usunąć mikrokapilę i pozostawić kondycjonowaną próbkę do powolnego wyschnięcia na stopniu punktu rosy (stopień DP) regulowanym o 1 - 2°C powyżej temperatury punktu rosy.
    7. Wyjmij siatkę i przechowuj ją w temperaturze pokojowej w pudełku z siatką lub na szalce Petriego.

Wyniki

Opracowano układ „cryoWriter” (przedstawiony na Rysunku 2) w celu przetestowania zminiaturyzowanych procedur przygotowania siatek do EM zaproponowanych na Rysunku 1C,D. Rysunek 2A przedstawia przegląd poszczególnych komponentów zamontowanych do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Po lewej stronie mikroskopu zainstalowano moduł do hodowli komórkowej, a po prawej znajduje się moduł do przygotowania siatek EM. Moduł hodowli komórkowej (Rysunek 2B) umożliwia wzrost adherentnych komórek eukariotycznych oraz obrazowanie żywych komórek hodowli za pomocą mikroskopu świetlnego. Pojedyncze komórki są lizowane poprzez połączone działanie szoku osmotycznego, elektroporacji i aspiracji zawartości komórki do mikrokapilary (Rysunek 2B, Rysunek 6A)24,25. Aspirowana próbka lizatu może następnie posłużyć do przygotowania siatek do NS-EM lub cryo-EM. Alternatywnie, źródłem próbki może być roztwór białka w probówce PCR. Zastosowana mikrokapilara (Rysunek 2B) jest podłączona do wysokoprecyzyjnego systemu pompowego, który pozwala na aspirację i dozowanie objętości próbek z precyzją poniżej nL. Jak szczegółowo opisano w protokołach, całe przetwarzanie próbek odbywa się wewnątrz tej mikrokapilary lub bezpośrednio na siatce EM, bez znaczącego transportu próbki. Na przykład ta sama mikrokapilara służy do lizy pojedynczych komórek eukariotycznych, aspiracji lizatu, jego kondycjonowania, a na koniec do dozowania alikwotów na siatki EM. Moduł przygotowania siatek składa się z ruchomego stolika DP, który umożliwia precyzyjną kontrolę temperatury umieszczonej na nim siatki EM (Rysunek 2C). W przypadku NS-TEM przygotowaną siatkę z próbką można po prostu zdjąć ze stolika chłodzącego i pozostawić do wyschnięcia w powietrzu w temperaturze pokojowej. Jednak w ilościowym TEM, gdzie zlicza się „cząsteczki” białek, należy unikać tzw. efektu pierścienia kawowego, który może wtedy wystąpić. W tym celu siatki są suszone powoli na stoliku DP, stosując stopniowo zwiększający się gradient temperatury, aby spowolnić odparowywanie cieczy. W przypadku cryo-EM temperatura siatki jest utrzymywana blisko punktu rosy; wybrano dodatkowe przesunięcie wynoszące około 8 °C, co pozwala na kontrolowane odparowywanie cieczy z próbki w celu stabilizacji i cieńczenia filmu, co w razie potrzeby może być monitorowane za pomocą czujnika26. Po wybranym czasie cieńczenia aktywowany jest mechanizm pick-and-plunge, a próbka zostaje witryfikowana (Rysunek 2C). Należy zauważyć, że ten mechanizm zanurzania nie jest potrzebny dla siatek NS-EM, które są przechowywane w temperaturze pokojowej.

Układ spektroskopowy do analizy DNA; obejmuje komponenty optyczne oraz system pozycjonowania próbki.
Rycina 2Przegląd konfiguracji systemu cryoWriter. A) Przegląd konfiguracji urządzenia cryoWriter zamontowanego na odwróconym mikroskopie świetlnym (1). B) Powiększenie obszaru wskazanego po lewej stronie w panelu A. Przedział do hodowli komórek (2) z mikrokapilarą (3) do manipulacji próbką i lizy komórek, umieszczoną nad zminiaturyzowaną płytką do hodowli komórek wykonaną z PDMS (4). C) powiększenie obszaru wskazanego po prawej stronie w panelu A. Mechanizm „pick-and-plunge”. Siatka EM z dziurawą warstwą węgla (5) jest zamocowana między końcówkami pęsety (6) i ustawiona poziomo w bezpośrednim kontakcie z platformą sterowaną temperaturowo (7), określaną w tekście głównym jako platforma punktu rosy (DP-stage). Temperatura platformy jest ściśle kontrolowana za pomocą regulatora PID i chłodzonego wodą elementu Peltiera, co pozwala utrzymać ją na poziomie temperatury punktu rosy lub w jej pobliżu, w zależności od otoczenia. Platforma DP-stage (7) jest zamontowana na zmotoryzowanej osi xy, aby umożliwić przesuwanie siatki względem mikrokapilary. Sama mikrokapilara jest zamontowana na platformie z i może być opuszczana, aż znajdzie się w bardzo bliskiej odległości od powierzchni siatki EM, i służy do dozowania objętości nanolitrowych na pokrywające ją podłoże próbki (ciągłą cienką warstwę węgla dla NS-EM lub dziurawą warstwę węgla dla cryo-EM). Należy zauważyć, że pobieranie i dozowanie cieczy odbywa się przy użyciu wysokoprecyzyjnego systemu pomp (8). Dozowana ciecz może być rozprowadzana poprzez przesuwanie siatki względem mikrokapilary po torze spiralnym. W przypadku przygotowania do cryo-EM mechanizm zamrażania „pick-and-plunge” (9) szybko przenosi załadowaną próbką siatkę do ciekłego etanu (10) w celu szybkiego schłodzenia i witryfikacji próbki. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Rycina 3 przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane dla siatek NS-EM przygotowanych przy użyciu zestawu cryoWriter. Końcówka mikrokapilary została wypełniona 5 nL próbki z roztworu zapasowego i zanurzona w zbiorniku z roztworem NS (2% tungstenu metyloaminy) na kilka minut, aby umożliwić dyfuzyjną wymianę jonów NS i soli (dyskusję teoretyczną zaprezentowano w pracy Arnold, et al.24). Następnie przygotowana próbka została naniosiona na cienką warstwę węglową siatki NS-EM i wysuszona. Rycina 3A pokazuje zastosowanie siatki szczelinowej w ten sam sposób w celu wizualizacji całej kropli, co jest wymagane dla ilościowego TEM. Aby uniknąć efektu pierścienia kawowego, świeżo poddaną glow-discharge siatkę utrzymywano początkowo w temperaturze punktu rosy (brak odparowania wody), a następnie powoli ogrzewano na platformie DP. Należy zauważyć, że w większości zastosowań (np. kontrola jakości próbki lub analiza strukturalna) ten proces powolnego suszenia nie jest konieczny. Wysokiej jakości preparaty NS uzyskuje się bez niego, co pokazano na Rycynie 3B,C. Czas przygotowania dla niskosolnych buforów bezfosforanowych wynosi około 3 min, np. w przypadku niskosolnego buforu Tris (20 mM Tris-HCl pH 7.4 z 50 mM NaCl), co pokazano na Rycynie 3B, wykorzystując wirusa mozaiki tytoniu (TMV) jako próbkę. Rycina 3C przedstawia najgorszy możliwy scenariusz, w którym TMV znajdował się w buforze PBS (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7.4). Jony fosforanowe tworzą przejściowe kryształy z jonami metali ciężkich z NS (patrz Rycina 5C), co wydłuża wymagany czas przygotowania (7 min). W module przygotowania siatek można stosować również inne sole metali ciężkich, np. 2% wanadan metyloaminy lub molibden amonu (patrz również Arnold, et al.24). Jednak octan uranylu nie jest odpowiedni; efekt sieciowania tego barwnika prowadzi do powstawania agregatów, jeśli próbka białkowa jest kondycjonowana w roztworze przed adsorpcją na warstwie węglowej (patrz Rycina 5E)23.

Mikroskopia elektronowa nanostruktur; A: cząstka, B-C: nanorurki, szczegóły strukturalne.
Rycina 3Typowe wyniki dla siatek NS przygotowanych przy użyciu zestawu cryoWriter, zgodnie z informacjami w Rycina 1C. A) Obrazzogólny kropli o objętości 3 nL naniesionej na siatkę z otworami po kondycjonowaniu 2% wolframianem metyloaminy. B) TMV w 20 mM buforze TRIS. Wstawka przedstawia 3-krotne powiększenie wskazanego obszaru. Adaptacja z Arnold, et al.24 (dalsze zezwolenia dotyczące wycinka materiału należy kierować do ACS). C) Wirus mozaiki tytoniu (TMV) w buforze PBS. Wstawka przedstawia trzykrotne powiększenie wskazanego obszaru. Adaptacja z Arnold i wsp.24 (dalsze zapytania o zezwolenia dotyczące wyciągu z materiałów należy kierować do ACS). Skale: A, 100 µm; B, 50 nm; C, 80 nm. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Typowe wyniki uzyskane dla siatek do krio-EM przygotowanych przy użyciu zestawu cryoWriter przedstawiono na Rysunku 4. Panel 4A przedstawia atlas siatki obszaru pokrytego witryfikowaną próbką. Panel 4B pokazuje jednorodność lodu witryfikowanego w wybranym okienku siatki. W obu przypadkach próbka znajdowała się w buforze 25 mM HEPES-KOH pH 7.5, 50 mM NaCl zawierającym 0,05% detergentu Fos 14. Przebadano wiele próbek i buforów, uzyskując porównywalnie wysoką jakość lodu witryfikowanego, jednak wymagane warunki zależą od rodzaju buforu (patrz również omówienie Rysunku 5). Panel 4C przedstawia cząsteczki apoferrytyny i bakteriofaga w buforze Tris-HCl (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl; pH 7.4) obrazowane przy dużym defokusie w celu zwiększenia kontrastu. Panel 4D przedstawia białko błonowe o masie 20 kDa stabilizowane przez amfipole.

Przygotowanie siatek do krio-EM, analiza za pomocą mikroskopii elektronowej, wizualizacja próbek, obrazowanie strukturalne.
Rysunek 4Typowe wyniki dla siatek cryo-EM przygotowanych przy użyciu zestawu cryoWriter, zgodnie z opisem w Rysunek 1DPróbki i bufory różnią się w przedstawionych przykładach. Wszystkie próbki naniesiono na perforowane folie węglowe. A) Kolaż obrazów przeglądowych („atlas siatki”) próbki zawierającej białko błonowe o masie 150 kDa; obrzeża lodu witryfikowanego wskazano białymi strzałkami. B) Powiększony fragment siatki z przygotowanej przy użyciu tego samego buforu, przedstawiający perforowaną folię węglową z lodem witryfikowanym. Niektóre otwory nie są wypełnione buforem z próbką, co wskazano białymi strzałkami. C) Otwór w warstwie węglowej z witryfikowaną próbką zawierającą kompleksy białkowe apoferrytyny i bakteriofagi. Wstawka: dwukrotne powiększenie przedstawiające ogon bakteriofaga. Biała gwiazdka oznacza błonę węglową. Należy zwrócić uwagę, że obraz został zarejestrowany przy dużym defokusie w celu zwiększenia kontrastu. D) Białko błonowe o masie 20 kDa zrekonstytuowane w amfifolach. Wstawka: 2-krotne powiększenie wskazanego obszaru przedstawione z zwiększonym kontrastem. Paski skali: A, 100 µm; B, 10 µm; C i D, 80 nm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Konfiguracja cryoWriter umożliwia systematyczny screening w celu optymalizacji warunków przygotowania siatek do EM; przykład przedstawiono na Rysunku 5A (apoferrytyna w 25 mM HEPES-KOH pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,05% Fos 14). W tym doświadczeniu zmieniano temperaturę „odchudzania” (thinning) lodu witryfikowanego, natomiast czas odchudzania (t.j. odstęp czasu między aplikacją próbki a mrożeniem w ciekłym etanie) pozostawał stały (1 s). Przy niskich temperaturach offsetu (np. 8 K) warstwa próbki była zbyt gruba. Przy wyższych temperaturach offsetu lód witryfikowany w otworach był cieńszy (10 K, 12 K), aż do momentu, gdy na pewnym etapie (powyżej 18 K) siatka stała się całkowicie sucha (nie pokazano). W zaprezentowanych tutaj wynikach offset wynoszący 12 K doprowadził do powstania dużego, jednorodnego obszaru lodu witryfikowanego, co wskazują czarne strzałki. Takie eksperymenty optymalizacyjne można przeprowadzać z użyciem buforu właściwego dla badanej próbki, stosując białka „testowe” (takie jak apoferrytyna). Wyznaczone optymalne warunki stosuje się następnie do próbki docelowej. Co więcej, siatki z parametrami znacznie odbiegającymi od optymalnych można często rozpoznać już podczas procedury przygotowania, dzięki czemu nie muszą być one analizowane pod mikroskopem elektronowym, co pozwala zaoszczędzić znaczną ilość czasu. Rysunek 5 przedstawia również galerię typowych artefaktów cryo-EM (Panel B) i NS-EM (Panele C-E) specyficznych dla konfiguracji cryoWriter. Siatka cryo-EM pokazana w Panelu 5B z TMV w PBS zawierającym 0,1% decylo-β-D-maltopiranozyd (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4, 0,1%DM) została nadmiernie odchudzona. Tło obrazu jest ziarniste, ponieważ stężenie soli stało się zbyt wysokie. W ogóle wygląd wizualny próbki nie wydaje się być funkcją liniową stężenia soli; ziarna stają się nagle wyraźne, gdy podczas procesu odchudzania zostanie osiągnięte stężenie progowe. Należy zauważyć, że niepożądane substancje można usunąć za pomocą etapu kondycjonowania przed przygotowaniem siatki, jak opisano dla NS-EM w sekcji protokołu 1.6. NS może powodować inne artefakty. W przykładzie pokazanym w Panelu 5C bufor PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4) bez próbki był kondycjonowany w 2% wolframianie metyloaminy przez 3 min. Widoczne są osady i kryształy, które wywierają duże siły na powierzchnię węgla, prowadząc do powstania pęknięć. Osady tworzą się tylko w określonym zakresie stężenia PBS i NS i można ich uniknąć poprzez dłuższe kondycjonowanie próbki (por. Rysunek 3C). Panel 5D pokazuje obwód naniesionej kropli próbki NS wykazujący efekt „pierścienia kawowego”. Mogłoby to zakłócić ilościową, całkowitą analizę próbki i można tego uniknąć poprzez spowolnienie procesu suszenia, t.j. utrzymując siatkę EM w temperaturze punktu rosy podczas aplikacji próbki, a następnie stopniowo zwiększając temperaturę w celu jej osuszenia (patrz Rysunek 3A). Panel 5E (apoferrytyna w 20 mM HEPES, pH 7,0, kondycjonowana przez 3 min) pokazuje aktywność sieciującą 2% octanu uranylu, którego nie można stosować do kondycjonowania próbek białkowych przed ich adsorpcją na nośnikach z błony węglowej.

Przygotowanie i analiza siatek do kriomikroskopii elektronowej; schematy przedstawiają siatkę, rozkład cząstek oraz szczegóły strukturalne.
Rycina 5Systematyczne zmiany i artefakty obserwowane podczas przygotowywania siatek do NS-EM i cryo-EM przy użyciu zestawu cryoWriter. A) Systematyczna zmiana grubości lodu witryfikowanego; optymalizacja przygotowania siatek do krio-EM. Zmieniano temperaturę offsetową stopnia DP (od 8 K do 12 K), utrzymując stały czas odchudzania (1 s). Strzałki wskazują obrys warstwy próbki. B) Efekty soli; zbyt wysokie stężenie, t. j.etap rozcieńczania był zbyt długi. Na wstawce przedstawiono dwukrotne powiększenie wskazanego obszaru. C) Wytrącanie się soli spowodowane zastosowaniem buforu PBS w obecności soli metali ciężkich. Próbki zawierające bufor PBS muszą być kondycjonowane dłużej niż próbki w innych buforach. W tym przypadku bufor PBS bez próbki był kondycjonowany w 2% wolframianie metyloaminy przez 3 min, co jest typowym czasem dla innych buforów do próbek. Należy zwrócić uwagę na pęknięcie błony węglowej, najprawdopodobniej spowodowane silnymi siłami działającymi na cienkie podłoże ze strony osadów podczas procesu suszenia. D) Efekt „pierścienia kawy”. E) Apoferrytyna inkubowana w 2% octanie uranylowym przez 3 min. Jony uranylu wykazują znaczną aktywność sieciującą, a klastry apoferrytyny tworzą duże agregaty. Paski skali: A, 80 µm; B, 80 nm C, 12 µm; D, 80 µm; E, 20 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Niewielka ilość i objętość wymagana do przygotowania siatki EM przy użyciu zestawu cryoWriter umożliwia przeprowadzanie nowych typów eksperymentów. Na przykład można zebrać i przygotować do NS-EM oraz cryo-EM całą zawartość pojedynczej komórki. Procedura ta została przedstawiona na Rycina 6A. Adherentna komórka eukariotyczna (HEK 293) zostaje poddana lizie poprzez jednoczesną elektroporację i aspirację próbki (Panel 6A)25. Aspirowana jest całkowita objętość 3 nL zawierająca lizat komórkowy, która zostaje zatrzymana w mikrokapilarze do dalszej obróbki. Dla NS-EM przedstawionego w Panelu 6B, przed lizą komórek pożywka hodowlana została zastąpiona buforem PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,9 mM Na2HPO4·7H2O, pH 7,4). Zawartość komórki została aspirowana w 3 nL buforu i kondycjonowana w rezerwuarze NS przez 10 min, zgodnie z Rysunkiem 1C. Następnie objętość 5 nL została naniesiona na ciągłą warstwę węglową siatki NS-EM. Na obrazie można rozpoznać pojedyncze białka, np. aktynę włóknistą, oraz fragmenty błon z przyłączonymi białkami. W przypadku cryo-EM, przedstawionego na Rysunku6C, objętość 3 nL została naniesiona na dziurkowaną węglową siatkę EM bez ponownej aspiracji w celu usunięcia nadmiaru cieczy. Powstała stosunkowo gruba warstwa próbki została poddana znacznemu ścieńczeniu przed witryfikacją. W tym celu temperaturę stopnia DP stopniowo zwiększano, zaczynając od temperatury punktu rosy. Proces ścieńczania monitorowano za pomocą systemu czujników w czasie rzeczywistym, aż do osiągnięcia określonego progu, który uruchomił mechanizm „pick-and-plunge” i witryfikację próbki (szczegóły patrz: Arnold, et al.26). Na obrazie można rozpoznać struktury błonowe i białka.

Proces elektroforezy, schemat z obrazami z mikroskopu elektronowego, analiza rozdziału ładunków.
Rysunek 6Wizualna proteomika pojedynczych komórek z wykorzystaniem układu cryoWriter. A) Lizaza pojedynczej adherentnej komórki eukariotycznej. Komórka jest hodowana (1, zielony) na funkcjonalizowanym szkiełku przedmiotowym (2) powleczonym ITO (czerwony) w miniaturowej szalce Petriego (3)25Warstwa ITO jest uziemiona elektrycznie. Do komórki zbliżana jest mikrokapilara (4) pokryta platyną. W celu ułatwienia lizy stosuje się wstępny szok osmotyczny (nie zaznaczony), która jest przeprowadzana za pomocą serii impulsów elektrycznych oraz sił ścinających powstających podczas aspiracji lizatu komórkowego. Proces można monitorować za pomocą mikroskopii świetlnej; zaznaczono obiektyw mikroskopu (5). Szczegóły znajdują się w naszej poprzedniej pracy.24,25. B) Obraz NS-EM lizatu z pojedynczej komórki HEK 293. Widoczne są filamenty aktyny oraz fragmenty błon z przyłączonymi białkami. Panel zaadaptowano z pracy Arnold i wsp.24 (dalsze zapytania dotyczące zezwoleń na wykorzystanie wyjętego fragmentu materiału należy kierować do ACS). C) Obraz cryo-EM lizatu z pojedynczej komórki HEK 293. Wstawka przedstawia dwukrotne powiększenie wskazanego obszaru, w którym widoczne są typowe struktury błonowe z powiązanymi białkami. Panel C opracowany na podstawie Arnold i wsp. 26 Skale: B, 50 nm; C, 80 nm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Przedstawiono przyrząd "cryoWriter" oraz protokoły wymagane do przygotowania siatek próbek dla NS i cryo-EM z całkowitej objętości próbki o rozmiarach nL i całkowitego uniknięcia klasycznego etapu blottingu. Jest to możliwe dzięki połączeniu zasad mikroprzepływowości i systemu mikromechanicznego w cryoWriterze.

Z naszego doświadczenia wynika, że w przypadku zastosowania zminiaturyzowanych metod przedstawionych w tym manuskrypcie, przestrzeń parametrów do przygotowania siatki EM-grid jest większa niż w przypadku metod klasycznych i znajduje się pod ściślejszą kontrolą użytkownika. Co ważne, osiągnięta zwiększona odtwarzalność umożliwia wstępne badanie przesiewowe za pomocą systemu buforowego próbki, uzupełnionego łatwo dostępnym białkiem testowym, w celu określenia optymalnych parametrów przed przeprowadzeniem właściwego eksperymentu. Ogranicza to konsumpcję interesującej nas próbki do absolutnego minimum i jest wysoce zalecane. Krytycznymi etapami przygotowania sieci zarówno NS, jak i cryo-EM są: (i) Zalewanie systemu pompy; W przypadku dozowania objętości poniżej nanolitrów ciecz systemowa (woda) musi być odgazowana i pozbawiona pęcherzyków. (ii) Precyzyjna kontrola etapu wyładowania jarzeniowego lub czyszczenia plazmowego; charakterystyka powierzchni siatki EM ma kluczowe znaczenie dla powtarzalnych wyników. (iii) kondycjonowanie próbki; czas potrzebny do kondycjonowania, np. za pomocą NS, zależy od rodzaju buforu, zawartości soli i stężenia (rysunek 3), a także od geometrii dyszy mikrokapilary24. (iv) szybkości parowania preparatów NS-EM dla ilościowych EM; efekt pierścienia kawy może uniemożliwić analizę ilościową preparatów NS-EM i musi być stłumiony przez powolne tempo parowania kontrolowane przez stopień DP.

Różne aspekty prezentowanych metod przygotowania siatek można dowolnie łączyć, co pozwala na opracowanie wszechstronnych protokołów dla konkretnych próbek. Typowymi przykładami mogą być usunięcie substancji, która zapobiega powstawaniu elektromagnetyczu o wysokiej rozdzielczości, np. glicerolu, poprzez etap kondycjonowania przed przygotowaniem siatki do krio-emu; wprowadzenie cząsteczek mediatorowych, takich jak ligandy, poprzez kondycjonowanie przed przygotowaniem siatek; lub badanie lizatu jednokomórkowego za pomocą NS- lub cryo-EM (ryc. 6).

Zastosowanie mikrofluidyki i minimalnych ilości próbek w prezentowanych metodach całkowicie eliminuje konieczność wykonywania etapów bibuły. Jest to ogromna zaleta, ponieważ bibuła jest surowym traktowaniem białek, potencjalnie zanieczyszczając próbkę niechcianymi jonami i z natury prowadząc do masowej utraty próbki. Z drugiej strony, nie można uniknąć efektów, które mogą być spowodowane przez granicę faz powietrze-woda cienkiej warstwy próbki utworzonej, gdy próbki cryo-EM są przygotowywane w klasyczny sposób, gdy używany jest cryoWriter. Siatki odpowiednie do krio-EM można przygotować z czasem oczekiwania krótszym niż 0,2 s między nałożeniem próbki a witryfikacją (dane nie pokazane). Ponieważ jednak białka przemieszczają się przez dyfuzję o długości kilku dziesiątych nanometra w ciągu kilku nanosekund, wciąż jest wystarczająco dużo czasu, aby kilkakrotnie zderzyć się z powierzchnią międzyfazową powietrze-woda warstwy próbki o grubości 100 nm. Jednak ilość białek przylegających do granicy faz powietrze-woda może być znacznie zmniejszona przez te krótkie przerwy czasowe i może zapobiec denaturacji białek lub ograniczonej orientacji cząstek. Innym obiecującym podejściem, które może chronić wrażliwe białka przed granicą faz powietrze-woda, jest pokrycie błony próbki substancjami powierzchniowo czynnymi o niskiej masie cząsteczkowej. Związki te mogą być szybko wprowadzone przez etap kondycjonowania w cryoWriter przed przygotowaniem siatki. Wysoki stosunek powierzchni do objętości układów mikroprzepływowych jest kolejnym ograniczeniem cryoWriter, ponieważ próbka może zostać potencjalnie utracona przez niespecyficzną adsorpcję na powierzchni mikrokapilary i zakłócić analizę ilościową podczas zliczania cząstek. Problem ten można rozwiązać na dwa sposoby: po pierwsze, próbka nie pokonuje dużych odległości w obrębie mikrokapilary. Rzeczywiście, objętość próbki w nanolitrach pozostaje na końcówce kapilary przez cały czas przetwarzania. Po drugie, stosunek powierzchni do objętości jest dodatkowo zmniejszony dzięki zastosowaniu mikrokapilar o stosunkowo dużych średnicach wewnętrznych, np. 180 μm. Po trzecie, powierzchnie mikrokapilar można w razie potrzeby łatwo pasywować, np. poprzez obróbkę ich dostępnymi w handlu glikolami polilizynowo-etanolowymi (PLL-PEG).

Analiza białek w wysokiej rozdzielczości metodą pojedynczych cząstek stosowana w EM wymaga jedynie od 100 000 do kilku milionów obrazów pojedynczych cząstek białka. Oznacza to, że techniki mikroprzepływowe mogą dostarczyć wystarczającą ilość kompleksów białkowych do badania strukturalnego. Zminiaturyzowana metoda immunoprecypitacji do szybkiej izolacji kompleksów białkowych (około 1 godziny) od minimalnej ilości komórek (ok. 40 000 komórek) została opracowana wcześniej28. Metoda ta będzie teraz bezpośrednio powiązana ze zminiaturyzowanym etapem przygotowania próbki w cryoWriterze. Ostatecznym celem jest opracowanie zintegrowanego rurociągu mikroprzepływowego do ultraszybkiej izolacji białek i przygotowania siatki kriogenicznej, co zajmuje w sumie mniej niż dwie godziny. Ponadto, jak pokazano na rysunku 6, niewielka ilość i objętość materiału potrzebnego do przygotowania próbki oraz prawie bezstratna procedura kondycjonowania i przygotowania siatki osiągnięta za pomocą cryoWriter umożliwiają badanie kompleksów białkowych poszczególnych komórek. Zminiaturyzowana metoda immunoprecypitacji i cryoWriter stanowią podstawę nowej metody proteomicznej zwanej "proteomiką wizualną pojedynczej komórki", co niedawno wykazaliśmy w eksperymentach z szokiem cieplnym24. Obecnie testowane są algorytmy analizy danych ukierunkowane na analizę obrazów "proteomiki wizualnej".

Oświadczenia

Autorzy, Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg i Thomas Braun, deklarują następujące konkurencyjne interesy finansowe: Koncepcja cryoWriter jest częścią wniosku patentowego PCT/ EP2015/065398 i EP16194230.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować warsztatom Biozentrum Uniwersytetu w Bazylei za wsparcie, S. A. Müllerowi za krytyczne dyskusje i uważne przeczytanie manuskryptu, A. Fecteau-LeFebvre za pomoc techniczną z EM, Ricardo Adaixo, Frankowi Lehmannowi za próbki do badań białek błonowych (wszystkie z C-CINA, Biozentrum, Uniwersytetu w Bazylei) i A. Engelowi, emerytowany Uniwersytet w Bazylei za inspirujące rozmowy. Próbki do badań zostały dostarczone przez mgr P. Ringlera. Mahi i T. Schwede (Biozentrum, Uniwersytet w Bazylei), P. Leiman (Laboratorium Biologii Strukturalnej i Biofizyki, EPFL) i R. Diaz-Avalos (New York Structural Biology Center, USA). Projekt był wspierany przez Szwajcarski Instytut Nanonauki (SNI, projekt P1401, projekt ARGOVIA MiPIS) oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNF, projekt 200021_162521).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Obsługa cieczy
Końcówka mikrokapilarnaNowy obiektywFS360-100-30-N-20KrzemionkaKońcówki 30 i mikro; m ID końcówki, 100 i mikro; m ID , pk. 20
FS360-150-30-N-20KrzemionkaKońcówki 30 & mikro; m ID końcówki, 150 i mikro; m ID , pk. 20
Tuleja przewodzącaNowy obiektywCONGAS-1 Elastomer przewodzący do styku WN, długość 12"
Rurki z topionej krzemionkiBGB-AnalytikTSP-150375TSP Standardowe rurki FS, 150 i mikro; m ID, 363 &mikro; m OD, 5 metrów
Złącze PressFitBGB-Analytik2525LDDeact. Łącznik PressFit 0,25 do 0,25 mm średnica wewnętrzna, ok. 25 
Strzykawka 10 i mikro; lBGB-AnalytikHA-80001Hamilton 1701 LT - Końcówka Luer (igła nie jest dołączona) 
Sterownik pompy strzykawkowejSterownik CetoniA3921000093neMESYS
Jednostka dozująca pompę strzykawkowąCetoniA3921000095jednostka dozująca neMESYS
Kontrola temperatury
Czujnik punktu rosyMeltecUFT75-AT, obliczanie punktu rosy, USB i wbudowana biblioteka DLL
Temperatura czujnikSensorshop24.chLS7-PT1000-1.0-3LCzujnik temperatury do montażu powierzchniowego Pt1000
Sterownik PeltieraCooltronicTC2812 Regulator temperatury PID do aktywacji układów napędzanych Peltierem z wyjściem stałonapięciowym
Element PeltieraDistrelec.chPE-127-14-15-S40x40 mm
Blok chłodzący wodę-Blok chłodzenia wodą do elementu Peltiera 40x40 mm, podstawa miedziana
Pompa wodnaDigitec.ch294877XSPC X20 750 Podwójna pompa zbiornikowa 5.25 blok
wodnego wymiennika ciepła-Blok wodnego wymiennika ciepła z 2 wentylatorami do schładzania wody krążącej
Małe chłodnice wodnePCHC.ch223050Alphacool MCX ram copper edition 2 szt
Małe elementy ogniwa petieraDistrelec.chPE-031-10-15-SLaird 15x15 mm 3,4 A 8,1 W 3,8 V 74 ° C, 2 szt
Mechanika
Stolik liniowy oś zDyneos AGM-404.2PDPrecyzyjny stolik translacyjny o dużym obciążeniu, zakres przesuwu 50 mm, silnik prądu stałego
Sterownik stopniaDyneos AGC-863Sterownik serwomechanizmu Mercury Stopień
xyWcześniejszyH117EIL5Stopień zmotoryzowany do Zeiss Axiovert 200 mikroskop odwrócony
Małe magnesy trwałeSupermagneteS-05-08-NMagnes prętowy & Oslash; 5 mm, wysokość 8,47 mm, neodymowy, N45, niklowany, pk. 10
Mały elektromagnesSchrammeEG1025A02/110Elektromagnes 24V 220 N 150 N 2,5 W
Sterownik elektromagnesuConrad.chMST-1630.001 7Płytka PCB sterująca elektromagnesem
PiastaelektromagnetycznaDistrelec.chHD8286-R-F-24V100%Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini pęsetaMikroskopia elektronowa Sciences0302-M5S-PSDumont Type 5 mini, super cienkie końcówki
Różne części optomechaniczneThorlabs-
różne części mechaniczneWarsztat Biozentrum, Uniwersytet w Bazylei-Specjalnie zaprojektowane płyty adaptera, uchwyty itp. zobacz załączone pliki CAD
Optics
Laser diodeThorlabsCPS780S780 nm moduł diody laserowej 2,5 mW
FotodetektorThorlabsPDA100A-ECSi Przełączany detektor wzmocnienia, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mmSiatki 2
EM
DURASIN FILM TEMemsdiasum.comDTF-0352330 nm DuraSiN™ membrany z azotku krzemu do TEM, opakowanie 5 sztuk
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBSSigmaD8537  SIGMADulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanem
NanoVan 2%nanoprobes.comNanoW
Ujemna plama na bazie wolframu
Software
openBEB2 jest dostępny na żądanie, wersja 3 będzie dostępna do pobrania
Kontrola CryoWriter oprogramowanie (wtyczka openBEB)Dostępne na żądanie, mogą obowiązywać dodatkowe opłaty za oprogramowanie sterownika innych firm.
. osi mikroskopu naukowy 2%nanoprobes.com Framework openBEB

Bibliografia

  1. Kuhlbrandt, W. Biochemistry: The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  2. Bai, X. -c, McMullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  3. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).
  4. Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. Electron microscopy of frozen biological suspensions. J Microsc. 129, Pt 1 89-102 (1983).
  5. Baker, L. A., Rubinstein, J. L. Radiation damage in electron cryomicroscopy. Methods Enzymol. , (2010).
  6. Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. Electron gun using a field emission source. Rev Sci Instrum. , (2003).
  7. Zemlin, F. Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy. Micron. 25 (3), 223-226 (1994).
  8. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  9. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).
  10. Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a, Cheng, Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat methods. 10, 584-590 (2013).
  11. Milazzo, A. -C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -H., Carragher, B., Potter, C. S. Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).
  12. Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy. J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).
  13. Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -y, Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors. J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).
  14. Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  15. Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. Processing of Cryo-EM movie data. Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).
  16. Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  17. McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy. J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).
  18. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  19. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  20. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  21. Glaeser, R. M. How good can cryo-EM become. Nat Methods. 13, 28-32 (2016).
  22. Engel, A. in . Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology. Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. 96, Springer Berlin. Heidelberg, Berlin. 417-431 (2010).
  23. Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. Connecting µ-fluidics to electron microscopy. J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).
  24. Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy. ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).
  25. Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy. J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).
  26. Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts. J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).
  27. Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements. BMC Bioinformatics. 15, 84(2014).
  28. Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy. Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kriomikroskopia elektronowazasady mikroprzepływoweobjętości nanolitroweprzygotowanie siatek EMkontrolowane odparowywanie wodymechanizm pick-and-plungelizja pojedynczej komórkiproteomika wizualnaEM z barwieniem negatywowym
Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.