Method Article

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

DOI:

10.3791/57311

⸱

June 9th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular Neurogenetics, German Cancer Research Center (DKFZ), DKFZ-ZMBH Alliance, 2Division of Molecular Genetics, German Cancer Research Center (DKFZ), and German Cancer Consortium (DKTK), 3Hopp-Children's Cancer Center at the NCT Heidelberg (KiTZ), 4Division of Pediatric Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), and German Cancer Consortium (DKTK), 5Department of Pediatric Hematology and Oncology, Heidelberg University Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne badania utraty funkcji genów przy użyciu zwierząt nokautujących często były kosztowne i czasochłonne. Mutageneza somatyczna oparta na CRISPR oparta na elektroporacji jest potężnym narzędziem do zrozumienia funkcji genów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę analizy fenotypów nokautu w proliferujących komórkach móżdżku.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wady rozwojowe mózgu są często spowodowane mutacjami genetycznymi. Rozszyfrowanie mutacji w tkankach pochodzących od pacjentów pozwoliło zidentyfikować potencjalne czynniki sprawcze chorób. Aby potwierdzić wkład dysfunkcji zmutowanych genów w rozwój choroby, jednym z oczywistych podejść jest generowanie modeli zwierzęcych zawierających mutacje. Chociaż genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) są popularnymi narzędziami biologicznymi i dają powtarzalne wyniki, są ograniczone czasem i kosztami. Tymczasem GEMM niepochodzące od linii zarodkowej często umożliwiają badanie funkcji genów w bardziej realny sposób. Ponieważ niektóre choroby mózgu (np. guzy mózgu) wydają się wynikać z mutacji somatycznych, ale nie mutacji linii zarodkowej, chimeryczne modele myszy niezwiązane z linią zarodkową, w których współistnieją normalne i nieprawidłowe komórki, mogą być pomocne w analizie istotnej dla choroby. W tym badaniu przedstawiamy metodę indukcji mutacji somatycznych w móżdżku, w których pośredniczy CRISPR. W szczególności wykorzystaliśmy warunkowe myszy knock-in, w których Cas9 i GFP są przewlekle aktywowane przez promotor CAG (wzmacniacz CMV / ß-aktyna kurczaka) po rekombinacji genomu za pośrednictwem Cre. Samodzielnie zaprojektowane jednoprzewodnikowe RNA (sgRNA) i sekwencja rekombinazy Cre, obie zakodowane w pojedynczym konstrukcie plazmidowym, zostały dostarczone do komórek macierzystych / progenitorowych móżdżku w stadium embrionalnym za pomocą elektroporacji in utero. W związku z tym transfekowane komórki i ich komórki potomne znakowano zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), co ułatwiło dalsze analizy fenotypowe. W związku z tym metoda ta nie tylko pokazuje dostarczanie genów do embrionalnych komórek móżdżku w oparciu o elektroporację, ale także proponuje nowatorskie podejście ilościowe do oceny fenotypów utraty funkcji, w których pośredniczy CRISPR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby mózgu są jedną z najstraszniejszych chorób śmiertelnych. Często wynikają one z mutacji genetycznych i późniejszej dysregulacji. Aby zrozumieć molekularne mechanizmy chorób mózgu, nieustanne wysiłki zmierzające do rozszyfrowania genomów ludzkich pacjentów doprowadziły do odkrycia wielu potencjalnych genów sprawczych. Do tej pory genetycznie modyfikowane modele zwierzęce linii zarodkowej były wykorzystywane do analiz in vivo wzmocnienia funkcji (GOF) i utraty funkcji (LOF) takich genów kandydujących. Ze względu na przyspieszony rozwój funkcjonalnych badań walidacyjnych pożądany jest bardziej wykonalny i elastyczny system testów genowych in vivo do badania funkcji genów.

Zastosowanie systemu transferu genów opartego na elektroporacji in vivo do rozwijającego się mózgu myszy jest odpowiednie do tego celu. W rzeczywistości kilka badań wykorzystujących elektroporację in utero wykazało ich potencjał do przeprowadzania analiz funkcjonalnych w rozwijającym się mózgu1,2,3. W rzeczywistości kilka regionów mózgu myszy, takich jak kora mózgowa4, retina5, diencephalon6, hindbrain7, cerebellum8 i rdzeń kręgowy9 były do tej pory celem somatycznych metod dostarczania genów.

Rzeczywiście, przejściowa ekspresja genów metodą elektroporacji in vivo na embrionalnych mózgach myszy od dawna jest wykorzystywana do analizy GOF. Najnowsze technologie integracji genomowej oparte na transpozonach umożliwiły dalszą długoterminową i/lub warunkową ekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania10,11, co jest korzystne dla analizy funkcji genów w sposób przestrzenny i czasowy podczas rozwoju. W przeciwieństwie do analizy GOF, analiza LOF była bardziej wymagająca. Chociaż przeprowadzono przejściową transfekcję siRNA i plazmidów przenoszących shRNA, długoterminowe efekty LOF genów nie są gwarantowane ze względu na ostateczną degradację egzogennie wprowadzonych kwasów nukleinowych, takich jak plazmidy i dsRNA. Jednak technologia CRISPR/Cas stanowi przełom w analizach LOF. Geny kodujące białka fluorescencyjne (np. GFP) lub białka bioluminescencyjne (np. lucyferaza świetlika) zostały połączone z CRISPR-Cas9 i sgRNA w celu znakowania komórek narażonych na mutacje somatyczne za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Niemniej jednak podejście to może mieć ograniczenia w badaniach funkcjonalnych nad proliferującymi komórkami, ponieważ egzogenne geny markerowe są rozcieńczane i degradowane po długotrwałej proliferacji. Podczas gdy transfekowane komórki i ich komórki potomne przechodzą mutacje wywołane przez CRISPR w swoich genomach, ich ślady mogą z czasem zaginąć. W związku z tym metody znakowania genetycznego byłyby odpowiednie do przezwyciężenia tego problemu.

Niedawno opracowaliśmy metodę LOF opartą na CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku, które ulegają długotrwałej proliferacji podczas różnicowania12. Aby genetycznie znakować transfekowane komórki, skonstruowaliśmy plazmid przenoszący sgRNA wraz z Cre i wprowadziliśmy plazmid do móżdżku myszy Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP myszy13 za pomocą elektroporacji w macicy. W przeciwieństwie do zwykłych wektorów plazmidowych kodujących EGFP, podejście to z powodzeniem znakowało transfekowane prekursory neuronów ziarnistych (GNP) i ich komórki potomne. Metoda ta stanowi duże wsparcie w zrozumieniu funkcji in vivo genów będących przedmiotem zainteresowania w proliferacji komórek w prawidłowym rozwoju mózgu i tle podatnym na nowotwory.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt i zostały zatwierdzone przez odpowiedzialne władze (Regierungspräsidium Karlsruhe, numery zatwierdzenia: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 i G133/14).

1. Generuj plazmidy pU6-sgRNA-Cbh-Cre

  1. Zaprojektuj sgRNA tak, aby celował w gen będący przedmiotem zainteresowania zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem14.
    UWAGA: W tym eksperymencie dwa sgRNA są zaprojektowane tak, aby celować w mysi gen Top2b i nieukierunkowane kontrolne sgRNA (Tabela 1). Aby znokautować gen(y) za pomocą technologii CRISPR, sgRNA muszą być zaprojektowane tak, aby celowały w sekwencję kodującą region 5' lub podstawową domenę funkcjonalną białka. Jednym z wygodnych punktów wyjścia jest przetestowanie publicznie dostępnych, wstępnie zaprojektowanych sekwencji sgRNA, takich jak biblioteka puli nokautów myszy GeCKO v2 15 z laboratorium Zhang. Alternatywnie, sgRNA można projektować za pomocą publicznie dostępnego oprogramowania, takiego jak następująca strona internetowa: crispr.mit.edu.
  2. Sklonuj sgRNA do wektora pU6-sgRNA-Cbh-Cre.
    UWAGA: pU6-sgRNA-Cbh-Cre vector12 użyty w tym badaniu pochodzi z oryginalnego plazmidu pX330 16 poprzez zastąpienie sekwencji kodującej SpCas9 rekombinazą Cre.
    1. Zsyntetyzuj dwa oligonukleotydy DNA w następujący sposób. Sens: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antysens: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
      UWAGA: 20 N pokazane powyżej oznacza sekwencję sgRNA.
    2. Trawić pU6-sgRNA-Cbh-Cre za pomocą BbsI przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy użyciu następujących odczynników, załadować strawioną próbkę do 1% żelu agarozowego i oczyścić za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Użyj plazmidu 3 μg; 3 μL BbsI; 1 μl FastAP; 5 μL 10X bufor do wytrawiania; dodać ddH2O, aby uzyskać całkowitą objętość do 50 μl.
    3. Fosforylować i wyżarzać każdą parę oligonukleotydów sgRNA przy użyciu następujących odczynników (całkowita objętość 10 μL): 1 μL Dostosowany oligo sensacyjny (100 mM); 1 μL Dostosowany oligo antysensowny (100 mM); 1 μL 10X bufor ligacyjny T4; 6,5 μL ddH2O; 0,5 μL T4 PNK. Inkubować w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5 minut w temperaturze 95 °C, a następnie zmniejszyć do 25 °C w temperaturze 5 °C/min.
    4. Ustawić następującą reakcję ligacji i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (10 μl całkowitej objętości): X μL BbsI strawiony plazmid (50 ng); 1 μl fosforylowany i wyżarzany, oligo duplex (rozcieńczenie 1:200); 5 μl bufor do ligacji 2X; X μL ddH2O; 1 μl szybkiej ligazy.
    5. Dodać 2 μl produktu do ligacji do 50 μl chemicznie kompetentnych komórek DH5α Escherichia coli. Po 30 minutach inkubacji na lodzie należy poddawać próbce szok termiczny przez 90 s w temperaturze 42 °C i inkubować przez 2 minuty na lodzie. Dodać 100 μl pożywki LB i ułożyć ją na płytce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny.
      UWAGA: Integracja sekwencji sgRNA z plazmidem pU6-sgRNA-Cbh-Cre odbywa się zgodnie z etapami klonowania dla plazmidu pX330 klasa 14.
    6. Zaszczepić dwie kolonie, każda w 2 ml pożywki LB w temperaturze 37 °C przez co najmniej 6 godzin, i przeprowadzić mini-preparacyjną izolację DNA za pomocą zestawu.
    7. Sanger zsekwencjonuj mini-prep DNA za pomocą startera hU6-Forward i zidentyfikuj kolonie z prawidłową insercją sgRNA, dopasowując się do sekwencji pokazanej w kroku 1.2.1. Sekwencję starterów przedstawiono w tabeli 1. Plazmidy użyte w tym badaniu zostały nazwane pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre i pU6-sgControl-Cbh-Cre.
    8. Zaszczepić prawidłowo zidentyfikowane kolonie i oczyścić plazmidowe DNA wolne od endotoksyn do elektroporacji in utero za pomocą zestawu, np. firmy Qiagen. Eluować DNA za pomocą wolnego od endotoksyn TE-Buffera rozcieńczonego w ddH2O w stosunku 1:10 (10% bufor TE). Stężenie DNA plazmidu musi być wyższe niż 2 mg/ml.
      UWAGA: Nie używaj zwykłego zestawu maxi-prep do przygotowania DNA. Roztwory plazmidów należy przechowywać w temperaturze 4 °C do regularnego, krótkotrwałego stosowania (do 4 tygodni) lub podać odpowiednią objętość około 25 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.

2. Przetestuj skuteczność sgRNA za pomocą systemu plazmidowego EGxxFP

UWAGA: Efektywność sgRNA jest zwykle testowana za pomocą testów Surveyor lub T7E1 (endonukleaza T7 I). W tym protokole zastosowano łatwe i skuteczne podejście alternatywne. Kluczem do tego podejścia jest użycie plazmidu pCAG-EGxxFP, który zawiera nakładające się na siebie fragmenty EGFP oddzielone sekwencją DNA zawierającą miejsce docelowe sgRNA17. Po ekspresji pCAG-EGxxFP wraz z sgRNA i Cas9 w transfekowanych komórkach, pęknięcie podwójnej nici (DSB) za pośrednictwem Cas9 w sekwencji docelowej jest naprawiane przez endogenne mechanizmy zależne od homologii, co odtwarza kasetę ekspresji EGFP.

  1. Zaprojektuj startery do amplifikacji regionu genomowego wyśrodkowanego za pomocą sekwencji docelowych sgRNA. Amplikon PCR wynosi około 500 pz. W tym eksperymencie zastosowano zespół DNA w celu sklonowania fragmentu amplifikowanego PCR do plazmidu pCAG-EGxxFP.
    UWAGA: Alternatywnie, odpowiednie miejsca restrykcyjne można dodać do końca 5' starterów PCR. Dostępne miejsca ograniczeń w wektorze pCAG-EGxxFP to BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI i EcoRV.
  2. Amplifikuj genomowe DNA za pomocą zaprojektowanych starterów, korzystając z poniższych parametrów formy i PCR. Załadować próbkę (19,7 μLH 2O; 0,3 μL 10 ng/μL genomowego DNA myszy; 2,5 μL 10 μM EGxxFP-Top2b-F; 2,5 μL 10 μM EGxxFP-Top2b-R; 25 μL 2X PCR master mix; 50 μl objętości całkowitej) na 1% żel agarozowy i oczyścić fragmenty PCR żelem za pomocą zestawu do ekstrakcji żelem. Stosować następujące warunki reakcji: 95 °C przez 3 min; następnie 35 razy cykle po 98 °C przez 20 s, 60 °C przez 15 s, 72 °C przez 20 s i 72 °C przez 1 min; 4 °C, na czas nieokreślony.
    UWAGA: W tym eksperymencie jeden region w eksonie 1 Top2b został amplifikowany; odnaleźć sekwencje starterów w tabeli 1.
  3. Trawić wektor pCAG-EGxxFP z enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie załadować próbkę do 1% żelu agarozowego i oczyścić szkielet wektora żelem za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Należy użyć następujących odczynników (całkowita objętość 50 μl): X μl plazmidu (3 μg); 2 μL BamHI; 2 μl EcoRI; 5 μL Bufor 10X; X μL ddH2O.
  4. Ustaw reakcję składania DNA18 zgodnie z instrukcjami producenta i przekształć się w E. coli kompetentną dla DH5α.
  5. Zaszczepić dwie kolonie, każda w 2 ml pożywki LB w temperaturze 37 °C przez co najmniej 6 godzin, przeprowadzić izolację DNA mini-prep za pomocą zestawu, np. firmy Qiagen, i zidentyfikować kolonie z prawidłową insercją (zwaną dalej pCAG-EG-Top2b-FP) za pomocą sekwencjonowania Sangera ze starterem EGxxFP-Top2b-F.
  6. Transfekcja komórek HEK293T.
    1. Wysiewaj HEK293T komórki na 24-dołkową płytkę 24 godziny przed transfekcją.
      UWAGA: Komórki hodowano w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C z 5% CO2 , w DMEM z suplementem glutaminy zawierającym 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. Upewnij się, że komórki zlewają się w 60% w dniu transfekcji. W tym eksperymencie użyliśmy samodzielnie wykonanych komórek HEK293T stabilnie eksprymujących SpCas9 do testowania pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Jednak komórki HEK293T typu dzikiego mogą być używane, jeśli zostanie dostarczony wektor wyrażenia SpCas9.
    2. Transfekować HEK293T komórki za pomocą odczynnika polietyleniminowego (PEI). Transfekować komórki 120 ng/dołek plazmidu plazmidu pCAG-EG-Top2b-FP 12 i 120 ng/dołek pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre lub pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre w płytce 24-dołkowej. Wymieszać plazmidowe DNA i 1,8 μl odczynnika PEI w 80 μl niesuplementowanej pożywki DMEM z dodatkiem glutaminy i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej po wirowaniu.
    3. 6 godzin po transfekcji usunąć pożywkę i zastąpić ją świeżą.
    4. Monitoruj obecność żywych komórek GFP+ 48 godzin po transfekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 20-krotnym powiększeniu.
      UWAGA: Liczba komórek GFP+ wskazuje na skuteczność celowania sgRNA. Wyniki skutecznych i nieefektywnych sgRNA (odpowiednio sgTop2b-1 i sgTop2b-2) są pokazane w Rysunek 2A.

3. Wykonaj elektroporację w macicy

  1. Wyhoduj myszy w wieku od 6 do 8 tygodni i przygotuj narzędzia do elektroporacji in utero. Skrzyżowanie samców homozygotycznych myszy Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP z samicami myszy CD-1. Czas ciąży myszy CD-1 od dnia wykrycia czopa dopochwowego (E0,5). Zarodki są elektropostowane w dniu E13.5.
    1. Wyciągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica wewnętrzna: 0,6-0,8 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet. Użyj następujących ustawień: P = 500, Ciepło = 560, Ciąg = 150, Vel = 75, Czas = 250. Oznacz końcówkę kapilarną czarnym tuszem, aby uzyskać lepszą wizualizację podczas wstrzykiwania. Przytnij stożek kapilarny pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą linijki i ostrej pęsety igłowej i przytnij końcówkę na długość około 6 mm.
    2. Utrzymuj jedność naczyń włosowatych, aby eksperyment był powtarzalny. Utwórz jednostronnie ściętą krawędź podczas przycinania. Końcówka powinna być jak najbardziej ostra, aby ułatwić penetrację ściany macicy i uniknąć uszkodzenia tkanek zarodka.
      UWAGA: Alternatywnie, użyj mikro młynka, aby wyregulować kąt 35°19. Kapilary można przechowywać w temperaturze pokojowej na 10-centymetrowej szalce Petriego w warunkach wolnych od patogenów.
    3. Autoklaw narzędzi chirurgicznych.
    4. Wymieszać plazmidy sgRNA w równych częściach z pT2K-IRES-Luc do końcowego stężenia co najmniej 1 μg/μL dla każdego plazmidu i zabarwić roztwór plazmidu szybką zielenią (końcowe stężenie 0,05%). Przygotuj 1% szybki zielony roztwór podstawowy z wodą destylowaną wolną od endotoksyn i przefiltruj przez filtr 0,22 μm, aby usunąć cząsteczki barwnika z roztworu.
      UWAGA: Kotransfekcja pT2K IRES-Luc jest opcjonalna, ale pozwala na identyfikację zdolnych do życia zwierząt poddanych elektroporacji po urodzeniu za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Zobacz krok 3.5. Przygotować wystarczającą ilość mieszanki plazmidów dla całkowitej liczby ciężarnych myszy, które mają być operowane. Użyj około 15-20 μL mieszanki na mysz (~ 12 zarodków). Natychmiast przystąp do zabiegu.
  2. Przygotuj myszy do operacji.
    1. Znieczulenie ciężarnych myszy CD-1 izofluranem. Wywołać znieczulenie w pudełku za pomocą izofluranu o stężeniu 3-4% obj. (natężenie przepływu tlenu: 1,5 l/min) i utrzymywać je na poziomie 2% obj. podczas operacji przez stożek nosowy.
      UWAGA: Cały zabieg nie powinien trwać dłużej niż 30 minut. W razie potrzeby należy zmniejszyć liczbę wstrzykiwanych i elektroporowanych zarodków. Do zabiegu należy używać sterylnych rękawiczek.
    2. Połóż mysz na plecach na poduszce grzewczej i dostosuj znieczulenie.
    3. Wstrzyknąć środek przeciwbólowy (Metamizol, 800 mg/kg masy ciała, podskórnie (s.c.), 24 h depot).
      UWAGA: Można stosować inne dopuszczone leki przeciwbólowe niż Metamizol.
    4. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu.
    5. Przymocuj kończyny taśmą i wysterylizuj brzuch środkiem dezynfekującym. Przykryj mysz gazą, pozostawiając odsłonięte tylko obszar chirurgiczny. Rozprowadź 70% etanolu na obszarze operacyjnym i gazie.
    6. Wykonaj nacięcie skóry o długości około 2 cm i delikatnie poszerz szczelinę prostymi nożyczkami chirurgicznymi. Zlokalizuj linea alba i wykonaj nieco mniejsze drugie nacięcie przez otrzewną za pomocą nożyczek do tkanek z końcówką.
    7. Zwilż otwartą jamę brzuszną wstępnie podgrzanym sterylnym 1x PBS.
    8. Ostrożnie wyjmij rogi macicy z jamy brzusznej za pomocą kleszczy pierścieniowych. Pociągnij delikatnie, chwytając ścianę macicy wyłącznie w szczelinie między woreczkami żółtkowymi dwóch sąsiednich zarodków. Unikaj wywierania nacisku na zarodek podczas przeciągania go przez nacięcie. W razie potrzeby powiększ nacięcie i zachowaj szczególną ostrożność, aby ułożyć rogi macicy na brzuchu, nie uciskając przepływu krwi przez tętnicę macicy.
      UWAGA: W niektórych przypadkach zaleca się wyjmowanie jednego rogu macicy na raz i zastąpienie go przed przystąpieniem do drugiego rogu macicy.
  3. Iniekcja i elektroporacja plazmidowego DNA
    1. Odessać około 15 μl kolorowego roztworu plazmidu za pomocą przygotowanej szklanej kapilary. Podczas tego procesu należy unikać pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Roztwór plazmidu może łatwo zatkać końcówkę, jeśli jego stężenie jest wysokie. Przetestuj naczynia włosowate, uwalniając część DNA tuż przed wstrzyknięciem.
    2. Delikatnie przytrzymaj zarodek kleszczami pierścieniowymi i zlokalizuj obszar szyi.
      UWAGA: Jeśli zarodek znajduje się w pozycji trudnej do wstrzyknięcia, pomiń go i przejdź do następnego zarodka. Zwiększona repozycja zarodka może zwiększyć ryzyko ich uszkodzenia.
    3. Powoli przebić końcówką wcześniej przygotowanej szklanej kapilary do czwartej komory, przenikając przez grzbiet tyłomózgowia, a następnie wstrzyknąć około 1 μl mieszanki plazmidów. Upewnij się, że barwione DNA nie wycieka z mózgu i jest widoczne jako struktura w kształcie rombu.
      UWAGA: Opcjonalnie użyj 2,5-krotnych szkieł powiększających, aby uzyskać lepszą wizualizację czwartej komory i otaczających ją naczyń krwionośnych. Dostarczyć impulsy elektryczne natychmiast po wstrzyknięciu, aby zapobiec dyfuzji roztworu plazmidu do innych komór.
    4. Zastosuj elektryczne impulsy kwadratowe (5 impulsów, 32 mV, 50 ms-włączone, 950 ms-wyłączone) za pomocą platynowej pęsety przypominającej kleszcze (patrz Tabela materiałów). Umieść elektrody bocznie, tak aby biegun ujemny zakrywał ucho, a biegun dodatni znajdował się w zawiązkach móżdżku nad ścianą macicy. Użyj płytek elektrod o średnicy 5 mm do skutecznej elektroporacji zarodków E13.5.
      UWAGA: Zwiększ przeżywalność młodych, manipulując mniej niż 2/3 całkowitej liczby zarodków na matkę. Unikaj zarodków zbyt blisko szyjki macicy. Jeśli zostaną zmanipulowane, mogą spowodować komplikacje podczas porodu i zagrozić całemu miotowi. Jeśli elektrody znajdują się zbyt blisko serca zarodka, może to spowodować zatrzymanie akcji serca.
  4. Opieka pozabiegowa i pooperacyjna
    1. Ostrożnie umieść rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej i wypełnij wstępnie podgrzanym sterylnym 1x PBS. Pozwól rogom macicy przesunąć się do naturalnej pozycji.
    2. Zamknij otrzewną i skórę oddzielnie za pomocą prostego ciągłego szwu.
      UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie przebić ściany macicy podczas szycia otrzewnej.
    3. Wyłącz znieczulenie i umieść zwierzę brzuchem w dół w nowej klatce.
    4. Monitoruj zwierzę w fazie czuwania i ponownie 24 godziny po zabiegu. Umieść klatkę pod lampą grzewczą, jeśli drżenie nie ustąpi w ciągu 15 minut, a zwierzę nie zacznie się pielęgnować.
    5. Potwierdź udaną elektroporację za pomocą obrazowania lucyferazy.
      1. Upewnij się, że operowane matki upuszczają zarodki na czas (w E19.5).
        UWAGA: Data urodzenia może zostać przesunięta na następny dzień, prawdopodobnie z powodu operacji.
      2. Znieczulić wyelektropostowane młode (P5-P7) 2,5% izofluranem i wstrzyknąć (dootrzewnowo (i.p.)) D-Lucyferynę (3 mg/kg masy ciała) 5 minut przed obrazowaniem.
      3. Wykrywanie sygnałów lucyferazy u elektryzowanych szczeniąt za pomocą imagera bioluminescencyjnego.
        UWAGA: Czas ekspozycji wynoszący 1 minutę jest wystarczający do wykrycia sygnału lucyferazy. Blask (p/s/cm2/sr) wynosi około >1 x 106.

4. Przygotuj kriosekcje z elektroporowanego móżdżku

  1. Poddaj eutanazji młode P7 naelektryzowane i wypreparuj móżdżek.
    UWAGA: Sygnał GFP można obserwować za pomocą stereoskopu epifluorescencyjnego.
  2. Utrwal móżdżek na noc w 5 ml na mózg 4% PFA w PBS w temperaturze 4 °C.
  3. Przenieś utrwalony móżdżek na noc w 10 ml na mózg 30% sacharozy w PBS w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Tkanka powinna dotrzeć do dna 15-mililitrowej probówki po inkubacji w roztworze sacharozy.
  4. Po wchłonięciu pozostałego roztworu sacharozy kawałkiem celulozowej bibuły filtracyjnej, zanurz móżdżek w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w jednorazowej plastikowej formie i zamroź go na suchym lodzie. Blok kriogeniczny może być przechowywany w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  5. Pociąć blok kriogeniczny na sekcje o grubości 10 μm za pomocą kriostatu i utrzymywać sekcje w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Ekspresję GFP można potwierdzić w skrawkach, po wypłukaniu związku OCT za pomocą PBS.

5. Barwienie immunologiczne kriosekcji

  1. Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut i myć dwukrotnie przez 10 minut w PBS.
  2. Okrążyć skrawki płynnym wstrzykiwaczem blokującym i inkubować skrawki w roztworze blokującym (10% normalnej surowicy osła w PBS zawierającej 0,1% Triton-X100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko cząsteczkom będącym przedmiotem zainteresowania (np. GFP i topoizomerazie II beta (Top2B) w tym badaniu) w roztworze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Nazwy i stężenia zastosowanych przeciwciał są wymienione w Tabeli Materiałów. W celu wzmocnienia sygnałów GFP, przeciwciało anty-GFP może być opcjonalnie stosowane razem z innymi przeciwciałami.
  4. Płukać szkiełka 0,1% PBST 3X zawierającym Tryton przez 10 minut. Inkubować skrawki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem rozcieńczonym w roztworze blokującym zawierającym DAPI.
  5. Myj szkiełka w PBS 3X przez 10 minut. Zamontuj szkiełka i trzymaj w temperaturze 4 °C do momentu obrazowania.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

6. Obrazowanie i analiza

  1. Zobrazuj przekroje za pomocą mikroskopu konfokalnego przy 20-krotnym powiększeniu.
  2. Policz liczbę komórek GFP dodatnich, które tracą ekspresję białka docelowego. Reprezentatywny obraz jest pokazany w Rysunek 2B.
  3. Sprawdź fenotyp molekularny po ablacji docelowych genów w GNP i ich potomstwie za pomocą immuostaining12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla analizy funkcjonalnej in vivo kluczowe jest zidentyfikowanie komórek, do których wprowadzono egzogenne geny. Podczas gdy ekspresja markera, takiego jak GFP, w komórkach nieproliferujących może być obserwowana przez długi czas, sygnał jest sekwencyjnie tracony w komórkach proliferujących. Ilustracja tego efektu jest pokazana w Rysunek 1. Aby uniknąć utraty śladu transfekowanych komórek w analizach LOF, opracowaliśmy nowatorskie podejście, łącząc d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z elektroporacji egzomacicznej , wcześniej opisaliśmy analizy funkcjonalne in vivo Atoh1 oparte na siRNA na wczesnym etapie różnicowania komórek ziarnistych móżdżku8. Ze względu na rozcieńczenie/degradację siRNA i odsłonięcie zarodków poza ścianą macicy, analiza fenotypowa elektroporowanych komórek ziarnistych była ograniczona do stadiów embrionalnych. Obecna metoda umożliwiła jednak analizę fenotypu zwierząt po urodzeniu.

Nasze poprzednie ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Laurze Sieber, Annie Neuerburg, Yassinowi Harimowi i Petrze Schroeter za pomoc techniczną. Dziękujemy również doktorom K. Reifenbergowi, K. Dellowi i P. Prücclowi za pomocną pomoc w eksperymentach na zwierzętach w DKFZ; Centra Obrazowania DKFZ i Centrum Obrazowania Carl Zeiss w DKFZ do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (do D.K.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa 488 Koza anty-kurczakThermoFisherA110391:400 rozcieńczenie
Alexa 568 Donkey anti-MouseLife TechnologiesA-100371:400 rozcieńczenie
Alexa 594 Donkey anty-RabbitThermoFisherA212071:400 rozcieńczenie
Alexa 647 Donkey anti-RabbitLife TechnologiesA315731:400 rozcieńczenie
Alkaliczne Fosfataza (FastAP)ThermoFisherEF0654
Taśma autoklawuKisker Biotech150262
BamHI (HF)NEBR3136S
BbsI (FastDigest)ThermoFisherFD1014
Celulozowa bibuła filtracyjna (Whatman)Sigma-AldrichWHA10347525
TkaninaTork530378
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZeissLSM800
D-Luciferinbiovision7903-1
DAPISigma-AldrichD9542rozcieńczenie 1:1000
Jednorazowe formy plastikowe (Tissue-Tek Cyromold)VWR4566
DMEM GlutamaxThermoFisher31966047
SerumosłaSigma-AldrichD9663
EcoRI (HF)NEBR3101S
Electro Square PoratorBTXECM830
Endofree Maxi KitQiagen12362
EtanolMerck107017
Maść do oczu (Bepanthen)Bayer81552983
Fast GreenMerck104022
FBSThermoFisher10270-016
Filtr (0,22 &mikro; m)MerckF8148
Fluorescencyjny aparat do obrazowania komórek (ZOE)Biorad1450031
Kleszcze prosteFine Science Tools91150-20
Gaza (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)Fisher Scientific15387311
Przeciwciało GFPAbcamab139701:1000 rozcieńczenie
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S Szklana
kapilara z żarnikiemNarishigeGD1-2
Poduszka grzewczaThermoLux463265 / -67
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu (ImageJ i Fidżi)insulinowa NIH
(B. Braun OMNICAN U-100)Carl RothAKP0.1
IsofluraneZoetisTU061219
IVIS Lumina LT Series III SuwmiarkaPerkin ElmerCLS136331
Igły do szwów KaltNarzędzia do nauki12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY mixPrzeciwciało Kapa BiosystemsKK2601
Ki67Abcamab155801:500 Rozcieńczenie
Wskaźnik świetlnyPhotonicPL3000
Długopis blokujący cieczKisker BiotechMKP-1
MetamizolWDT-Microgrinder
NarishigeEG-45
MikrowtryskiwaczNarishigeIM300
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.P-97
ZEN
nić do szwów jedwabnych (0,12 mm)Fine Science Tools18020-50
Związek O.C.T. (Tissue-Tek)VWR4583
p27 przeciwciałoBD bioscience610241Rozcieńczenie 1:200
ParaformaldehydRoth335,3
PBS ( 1x)Life Technologies14190169
pCAG-EGxxFPAddgene50716
PolietyleninicaSigma-Aldrich408727
plazmid pX330Addgene42230
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28704
Zestaw do szybkiego podwiązywania NEBM2200S
Kleszcze pierścienioweFine Science Tools11103-09
Slajdy (SuperFrost)ThermoFisher10417002
Oprogramowanie do biostatystyki (Prism 7)Oprogramowanie GraphPad,Inc-Spitacid
EcoLab3003840
StereomikroskopNikonC-PS
SacharozaSigma-AldrichS5016
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools91460-11
Nożyczki chirurgiczne z końcówkąFine Science Tools14072-10
Szew (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))SMI220340
T4 Bufor do ligacji DNANEBB0202S
T4 PNKNEBM0201S
Nożyczki do tkanek Blunt (11,5 cm)Fine Science Tools14072-10
Przeciwciało TOP2BSanta Cruzsc13059Trypsyna w rozcieńczeniu 1:200
(2,5%)Pęseta ThermoFisher15090046
z elektrodami dyskowymi 5 mm i Oslash PlatinumXceltis GmbHCUY650P5
WaporyzatorDrä gerwerk AGGS186
Strzykawka precyzyjnej Oprogramowanie mikroskopu Zeiss-Niesterylna powiedział:

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  2. Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391(2015).
  3. Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
  4. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  5. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
  6. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
  7. Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
  8. Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
  9. Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
  10. Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
  11. Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
  12. Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758(2017).
  13. Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  14. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  15. Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  16. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355(2013).
  18. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
  19. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303(2016).
  20. Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Loss Of FunctionIn Utero ElectroporationCerebellar Granule CellsGene Transfer MethodCas9 GFP ReporterPlasmid Construct DeliveryImmunohistochemistry AnalysisFluorescent Cell ImagingCryosection PreparationBrain Tumor Modeling

Related Articles