Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ludzka pluripotencjalna hodowla komórek macierzystych na hydrożelach z polialkoholem winylowym i kwasem ko-itakonowym o różnej sztywności w warunkach wolnych od ksenotypów

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57314

⸱

3 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół przygotowania hydrożeli z polialkoholu winylowego i kwasu ko-itakonowego o różnej sztywności, które zostały zaszczepione z oligopeptydami i bez nich, w celu zbadania wpływu sztywności biomateriałów na różnicowanie i proliferację komórek macierzystych. Sztywność hydrożeli była kontrolowana przez czas sieciowania.

Streszczenie

Wpływ fizycznych wskazówek, takich jak sztywność biomateriałów, na proliferację i różnicowanie komórek macierzystych, został zbadany przez kilku badaczy. Jednak większość z tych badaczy używała hydrożeli poliakrylamidowych do hodowli komórek macierzystych w swoich badaniach. W związku z tym ich wyniki są kontrowersyjne, ponieważ mogą one wynikać ze specyficznych cech poliakrylamidu, a nie z fizycznej wskazówki (sztywności) biomateriałów. W tym miejscu opisujemy protokół przygotowania hydrożeli, które nie są oparte na poliakrylamidze, w którym można hodować różne komórki macierzyste, w tym ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ES) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS). Hydrożele o różnej sztywności przygotowano z bioobojętnego kwasu polialkoholowo-ko-itakonowego (P-IA), o sztywności kontrolowanej stopniem usieciowania poprzez zmianę czasu sieciowania. Hydrożele P-IA szczepione z oligopeptydami pochodzącymi z macierzy zewnątrzkomórkowej i bez nich zostały zbadane jako przyszła platforma do hodowli i różnicowania komórek macierzystych. Hodowla i pasaż komórek macierzystych płynu owodniowego, komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej, ludzkich komórek ES i ludzkich komórek iPS jest szczegółowo opisana tutaj. Hydrożele oligopeptydowe P-IA wykazały lepsze osiągi, które były indukowane przez ich właściwości sztywnościowe. Protokół ten informuje o syntezie biomateriału, manipulacji jego powierzchnią, wraz z kontrolą właściwości sztywności i wreszcie o ich wpływie na los komórek macierzystych w warunkach hodowli wolnej od kseno. Na podstawie najnowszych badań, takie zmodyfikowane substraty mogą działać jako przyszłe platformy wspierające i kierujące losem różnych linii komórek macierzystych do różnych połączeń; a ponadto regenerować i przywracać funkcje utraconego narządu lub tkanki.

Wprowadzenie

Wiadomo, że los różnicowania komórek macierzystych w określoną linię komórek i długoterminowej proliferacji komórek macierzystych, zwłaszcza ludzkich komórek pluripotencjalnych (iPS) i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES), jest regulowany przez inhibitory, czynniki wzrostu i/lub małe bioaktywne cząsteczki w pożywkach hodowlanych. Ostatnio fizyczne oznaki biomateriałów, w szczególności sztywność biomateriałów do hodowli komórkowych, zostały uznane za ważny czynnik kierujący losami proliferacji i różnicowania komórek macierzystych1,2,3,4,5,6. W związku z tym kilku badaczy zaczęło badać los komórek macierzystych, które są hodowane na hydrożelach, po różnicowaniu, głównie przy użyciu hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności.

Sztywność biomateriałów może kontrolować zrosty ogniskowe, morfologię komórek, fenotyp komórek i adhezję komórek macierzystych, szczególnie w uprawie dwuwymiarowej (2-D)1,2,3,5. Mechano-wykrywanie biomateriałów przez komórki macierzyste jest na ogół kontrolowane przez ogniskową sygnalizację adhezyjną za pośrednictwem receptorów integrynowych. NMMIIA, niemięśniowa miozyna IIA zależna od cytoszkieletu aktyny odgrywa kluczową rolę w procesie mechanowykrywania komórek macierzystych w systemach hodowli komórek 2-D3,4,5,7,8,9,10,11.

Engler i jego koledzy wymyślili ciekawe pojęcie, że dorosłe komórki macierzyste, takie jak komórki macierzyste szpiku kostnego (BMS) hodowane na biomateriałach hodowlanych o podobnej sztywności do sztywności określonych tkanek, mają tendencję do różnicowania się w komórki pochodzące z określonych tkanek5. Komórki BMS inkubowane na miękkich hydrożelach poliakrylamidowych 2D pokrytych kolagenem typu I (o sztywności porównywalnej do sztywności tkanek mózgowych) w pożywkach ekspandacyjnych były spontanicznie indukowane do różnicowania się we wczesne linie neuronów, podczas gdy komórki BMS hodowane na hydrożelach o sztywności podobnej do sztywności tkanek mięśniowych lub kolagenowych kości indukowały różnicowanie do wczesnych linii miocytów i osteoblastów, odpowiednio na hydrożelach poliakrylamidowych 2D3,5. Wielu badaczy badało los komórek macierzystych różnicowania hodowanych na hydrożelach poliakrylamidowych unieruchomionych kolagenem typu I12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Należy jednak wspomnieć, że istnieją pewne sprzeczne raporty1,18,22,23,24 istnieją dla dobrze znanego pomysłu zasugerowanego przez Englera i wsp.5 Dzieje się tak dlatego, że pomysł Englera5 został opracowany wyłącznie na hydrożelach poliakrylamidowych, a ich wyniki wynikają ze specyficznych cech biomateriału (poliakrylamidu), a nie wyłącznie z fizycznej wskazówki (sztywności) biomateriału. Dlatego ważne jest, aby opracować inny rodzaj hydrożelu, którego sztywność można kontrolować poprzez sieciowanie hydrożeli. W tym celu opracowano bioobojętne hydrożele, które przygotowano z kwasu polialkoholowo-ko-itakonowego (P-IA) o różnej sztywności, która była kontrolowana przez stopień usieciowania przy zmieniającym się czasie sieciowania25,26,27,28,29,30,31,32. Komórki macierzyste mogą być hodowane na niemodyfikowanych hydrożelach P-IA, a także hydrożelach P-IA szczepionych matrycami zewnątrzkomórkowymi (ECM) i oligopeptydami. W poprzednim badaniu25, ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste (hHSC) z krwi pępowinowej hodowano na hydrożelach P-IA o różnych wartościach sztywności w zakresie od 3 kPa do 30 kPa modułu magazynowania, gdzie fibronektyna lub oligopeptyd pochodzący z fibronektyny (CS1, EILDVPST) były szczepione na hydrożele P-IA. Wysoką ekspansję fałdową ex vivo hHSC zaobserwowano w hydrożelach P-IA szczepionych CS1 lub fibronektyną, które wykazywały sztywność pośrednią w zakresie od 12 kPa do 30 kPa25.

Ludzkie komórki iPS i ES nie mogą być hodowane na konwencjonalnych podłożach z polistyrenu do hodowli tkankowych (TCP)33,34, ponieważ ludzkie komórki ES i iPS wymagają specyficznego wiązania z ECM, takimi jak witronektyna lub laminina, aby utrzymać swoją pluripotencję podczas długotrwałej hodowli. W związku z tym zaprojektowano i przygotowano kilka struktur hydrożeli P-IA szczepionych oligopeptydami o optymalnej charakterystyce sztywności, w formacjach pojedynczego łańcucha, pojedynczego łańcucha z segmentem stawowym, podwójnego łańcucha z segmentem stawowym oraz łańcucha rozgałęzionego 32. Sekwencje oligopeptydowe wybrano z domen wiążących integryny i glikozaminoglikany ECM. Hydrożele P-IA szczepione oligopeptydami pochodzącymi z witronektyny z podwójnym łańcuchem lub segmentem stawowym, które mają moduł spichrzeniowy na poziomie około 25 kPa, wspierały długoterminową hodowlę ludzkich komórek ES i iPS przez ponad 12 pasaży w warunkach wolnych od ksenozy i zdefiniowanych chemicznie32. Segment stawowy i podwójny łańcuch z cząsteczkami adhezyjnymi komórek na hydrożelach ułatwiły proliferację i pluripotencję ludzkich komórek ES i iPS32. W tym miejscu opisano protokół przygotowania hydrożeli P-IA (o module spichrzeniowym od 10 kPa do 30 kPa, który mierzono w wilgotnych warunkach w powietrzu) szczepionych z oligopeptydami lub ECM i bez nich. Pokazano, jak hodować i pasażować kilka komórek macierzystych (w tym komórki macierzyste płynu owodniowego, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej, ludzkie komórki ES i ludzkie komórki iPS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty w tym badaniu zostały zatwierdzone przez komisje etyczne Tajwańskiego Szpitala Landseed (IRB-13-05) i National Central University. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi i obowiązującymi wytycznymi i przepisami rządowymi i instytucjonalnymi podczas tego badania.

1. Przygotowanie roztworu i podłoża

  1. Oczyszczanie polimerów
    1. Oczyść P-IA grupą kwasów karboksylowych o stopniu hydrolizy >96,5% przez przemywanie P-IA etanolem. Umieścić 20 g P-IA w 200 ml etanolu w stożkowej zlewce o pojemności 500 ml i mieszać na mieszadle magnetycznym przez 24-30 godzin. Wymieniaj etanol na świeży etanol co 8-10 godzin.
    2. Usunąć P-IA z etanolu przez filtrację za pomocą lejka Büchnera.
    3. Suszyć P-IA przez suszenie próżniowe w temperaturze pokojowej przez 24 h.
      UWAGA: Zaleca się częste czyszczenie syfonu w systemie suszenia próżniowego (poprzez usunięcie etanolu), szczególnie w ciągu pierwszych kilku godzin, ponieważ pułapka ma tendencję do zapychania się po usunięciu dużej ilości etanolu z P-IA.
  2. Przygotowanie roztworu P-IA
    UWAGA: Dodawać polimer bardzo powoli do rozpuszczalnika (wody). Zaleca się poświęcenie co najmniej 15 minut na dodanie P-IA do rozpuszczalnika. Jeśli rozpuszczalnik zostanie dodany do polimeru, polimer nie zostanie całkowicie rozpuszczony. Należy uważać, aby nie doprowadzić do wybuchowego wrzenia roztworu P-IA. Podczas przygotowywania roztworu P-IA należy używać okularów ochronnych. Proces podgrzewania roztworu P-IA jest niezbędny do rozpuszczenia krystalicznego P-IA. Sugeruje się (i najlepiej) przygotowanie roztworu P-IA w stosunkowo czystym pomieszczeniu eksperymentalnym, jeśli to możliwe.
    1. Rozpuść P-IA w czystej wodzie do stężenia 0,050% wagowego dla eksperymentu hodowli komórek lub stężenia 0,50% wagowego dla pomiaru reometru: na przykład rozpuść 50 mg P-IA w 100 ml czystej wody do hodowli komórkowej i 500 mg P-IA w 100 ml wody dejonizowanej (DI) do pomiarów reometru.
    2. Mieszać roztwór P-IA przez 1 godzinę na płycie grzejnej.
      UWAGA: Aby uniknąć wybuchowego wrzenia, nie podgrzewaj roztworu powyżej 95 °C. Wybuchowe gotowanie roztworu polimeru w wysokiej temperaturze może spowodować oparzenia skóry. Dlatego należy bardzo ostrożnie wykonywać ogrzewanie P-IA i monitorować temperaturę roztworu P-IA podczas ogrzewania.
    3. Po schłodzeniu roztworu P-IA w temperaturze otoczenia należy mieszać roztwór P-IA w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Pozostawić gorący roztwór P-IA na płycie grzejnej bez podgrzewania, a następnie pozostawić go bez mieszania w temperaturze pokojowej na 20-24 godziny, aby upewnić się, że w roztworze P-IA nie ma pęcherzyków powietrza.
  3. Przygotowanie roztworu sieciującego
    1. Skład roztworu sieciującego należy skomponować 1,0% wagowo aldehydu glutarowego z 25% wodnego roztworu aldehydu glutarowego, 20,0% wagowo% Na2SO4 przy użyciu czystości 99% > i 1,0% wagowo% H2SO4. Na przykład na jedną 6- lub 12-dołkową płytkę do hodowli komórkowej dodaj 100 μl roztworu aldehydu glutarowego, 2 g siarczanu sodu i 100 μl kwasu siarkowego do 10 ml czystej wody.
  4. Pożywka do hodowli komórek ludzkich ES/PS
    UWAGA: Użyj pożywki DMEM/F12, pożywki Essential 6 i pożywki Essential 8 do hodowli komórkowej.
    1. Zamrożony suplement 50X Essential 8 należy powoli umieścić w roztworze przez noc, rozmrażając go w lodówce o temperaturze 4 °C.
    2. Dodaj jedną butelkę suplementu 50X Essential 8 do jednej butelki pożywki podstawowej Essential 8. Rozdzielić pożywkę na małe porcje (po 50 ml każda) w probówkach wirówkowych o pojemności 100 ml, a następnie przechowywać pożywkę w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie potrawy hydrożelowej P-IA

  1. Przygotowanie filmu P-IA
    1. Wstrzyknąć 1 ml porcji roztworu P-IA do naczynia TCP o średnicy 35 mm i wysuszyć naczynie w piekarniku o temperaturze 45 °C przez 2 dni, aby uzyskać film P-IA w czystej ławce.
  2. Sieciowanie naczyń hydrożelowych P-IA
    1. Zanurz folie P-IA w wodnym roztworze sieciującym dla 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 i 48 godzin
      UWAGA: "P-IA-X" (np. P-IA-12 h) odnosi się do hydrożelu usieciowanego P-IA przez X h (np. 12 h).
    2. Po usieciowaniu hydrożele P-IA należy przepłukać czystą wodą o temperaturze otoczenia, a następnie przechowywać hydrożele w czystej wodzie o temperaturze otoczenia w czystej ławce.
    3. Wysterylizuj hydrożele P-IA przez zanurzenie w roztworze etanolu o stężeniu 75,0 objętości / objętości na 1 minutę, przepłucz hydrożele P-IA w czystej wodzie sześć razy, a następnie trzymaj hydrożele P-IA w czystej wodzie do momentu użycia do hodowli komórek.
  3. Przygotowanie naczyń hydrożelowych P-IA szczepionych oligopeptydem lub ECM
    1. Aktywować hydrożele P-IA przez zanurzenie w 1 ml roztworu wodnego zawierającego 10 mg/ml chlorowodorku N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimidu (EDC) i 10 mg/ml N-hydroksysukcynimidu (NHS) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub 4 godziny w temperaturze 4 °C.
    2. Przepłukać hydrożele P-IA 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,2) 3 razy i zanurzyć hydrożele P-IA w roztworze PBS zawierającym 1 ml oligopeptydu (100-1,500 μg/ml) lub ECM (10-100 μg/ml) przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Sekwencje oligopeptydowe i ECM stosowane do hodowli komórek macierzystych podsumowano w Tabeli 1.
    3. Po zaszczepieniu oligopeptydu lub ECM przemyj hydrożele P-IA czystą wodą 3 razy.
      UWAGA: Hydrożele P-IA szczepione Y μg/ml oligopeptydu lub ECM (Z) są dalej określane jako P-IA-X h-Z lubP-IA-X h-Z-Y, gdzie X odnosi się do czasu sieciowania (h), Y oznacza stężenie oligopeptydu lub ECM, a Z oznacza inny oligopeptyd lub ECM.

3. Hodowla komórek ludzkich ES/iPS

  1. Sposób pasażu i utrzymania niezróżnicowanych ludzkich komórek ES i iPS
    1. Utrzymuj ludzkie komórki ES (np. WA09 lub H9) lub ludzkie komórki iPS (np. HS0077) na Matrigel w pożywce Essential 8 na 6 cm szalkach, używając standardowych protokołów hodowli ludzkich komórek ES/iPS28,32.
    2. Inkubować prawie zlewające się ludzkie komórki ES / iPS z 2,0 mg / ml dyspazy II w pożywce DMEM / F-12 w temperaturze 37 °C przez 8-10 minut, a następnie dwukrotnie płukać ludzkie komórki ES / iPS pożywką DMEM / F12.
    3. Po dodaniu 2 ml pożywki DMEM/F-12 do szalek do hodowli komórek ludzkich ES/iPS, należy odłączyć słabo przylegające kolonie za pomocą skrobaka do komórek lub pipetowania.
    4. Zebrać ludzkie komórki ES/iPS do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i odwirować ludzkie komórki ES/iPS w temperaturze 160 × g przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Po odwirowaniu wyrzuć DMEM/F12 i zawieś ludzkie komórki ES / iPS w 1 ml pożywki E8, a następnie policz gęstość komórek za pomocą licznika komórek.
    6. Zaszczepić komórki ES / iPS po odpowiednim dostosowaniu gęstości (1-5 x 10,4 komórki nacm2 w przypadku pasażowania lub zgodnie ze wskazaniami) w nowych szalkach hodowlanych (hydrożele P-IA szczepione oligopeptydem lub ECM).

4. Charakterystyka ludzkich komórek ES/iPS

  1. Ocena aktywności fosfatazy alkalicznej (AP)
    1. Zmierz aktywność fosfatazy alkalicznej (AP) ludzkich komórek ES / iPS za pomocą standardowego barwienia żywej fosfatazy alkalicznej.
  2. Barwienie immunologiczne
    1. Wykonaj barwienie immunologiczne Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 i Oct3/4 na komórkach hES i hiPS, aby zbadać pluripotencję zgodnie z konwencjonalnym protokołem28,32.
    2. Dodać 0,5 ml objętości 4% (objętość/objętość) paraformaldehydu do każdego 24-dołkowego naczynia, w którym hodowano ludzkie komórki ES/iPS, a następnie inkubować szalki przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia komórek.
    3. Odessać roztwór paraformaldehydu z każdej studzienki. Następnie dodaj 1 ml PBS na studzienkę i odessaj PBS, aby przepłukać komórki. Wykonaj proces płukania 3 razy.
    4. Przepuszczalność błon komórkowych polega na dodaniu 0,5 ml 0,3% (objętość/objętość) roztworu Triton-X 100 w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać roztwór Triton-X 100 i dodać 300 μl 2% (wagowo/objętościowo) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS (bufor blokujący) do każdej studzienki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Usunąć bufor blokujący przez pipetowanie, a następnie dodać pożądane przeciwciała pierwszorzędowe (Oct3/4 (1:200), Sox2 (1:200), SSEA-4 (1:200) i Tra-1-81(1:200) za pomocą pipety, patrz Tabela 2) do każdego dołka, gdzie 1:200 oznacza, że przeciwciała zostały rozcieńczone PBS 200-krotnie i inkubowane przez jeden dzień w temperaturze 4 °C.
    7. Odessać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć komórki 300 μl 0,05% Tween 20 w roztworze PBS 3 razy w temperaturze pokojowej.
    8. Dodać 300 μl przeciwciał drugorzędowych (1:200, patrz Tabela 2), które są specyficzne dla pierwszorzędowego podtypu IgG, w 2% (wagowo/objętościowo) roztworze BSA do każdego dołka i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    9. Umyj komórki 300 μl 0,05% Tween 20 w roztworze PBS 3 razy w temperaturze pokojowej w ciemności.
    10. Analizuj wybarwione komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub mikroskopii konfokalnej.
  3. Tworzenie ciała zarodka
    1. Zbadanie pluripotencji ludzkich komórek ES/iPS poprzez tworzenie ciała zarodkowego (EB) w pasażach 10 i 20,
      UWAGA: Blisko 80% konfluencja w płytkach 6-dołkowych jest wystarczająca do przygotowania tworzenia EB.
    2. Przepłukać ludzkie komórki ES lub iPS dwukrotnie 2 ml pożywki DMEM/F-12, a następnie zanurzyć komórki w 1,5 ml pożywki Essential 6.
    3. Pokrój prawie 80% zlewających się ludzkich komórek ES lub iPS na około 32 części za pomocą końcówek o pojemności 200 μl. Następnie odłącz komórki od naczyń za pomocą skrobaka do komórek.
    4. Zbierz ludzkie komórki ES/iPS i przenieś je do 6-dołkowej płytki o ultraniskim nasadce.
    5. Wymieniaj pożywki Essential 6, pipetując stare pożywki i dodając nowe pożywki co 2 dni.
      UWAGA: Hodować komórki w zawiesinie przez 2 tygodnie w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    6. Po tym, jak EB zostały jednorodnie zawieszone w pożywce Essential 6, przenieś EB do hodowli na 24-dołkowych szalkach TCP pokrytych 0,1% wagowo żelatyny i hoduj komórki w pożywce Essential 6 przez dodatkowy tydzień.
    7. Wybarwić komórki przeciwciałami przeciwko markerom komórek pochodzących z trzech embrionalnych listków linii rozrodczej [AFP (endoderma), GFA (ektoderma), β III-tubulina (ektoderma) i SMA (mezoderma)] i ocenić komórki za pomocą metody barwienia immunologicznego opisanej powyżej.
  4. Powstawanie potworniaka
    1. Zbadaj pluripotencję ludzkich komórek ES / iPS poprzez tworzenie potworniaka w pasażach 10 i 20,
      UWAGA: 5 szalek o prawie 80% konfluencji w płytkach 6-dołkowych wystarczy do powstania potworniaka (do eksperymentów z tworzeniem potworniaka niezbędne są co najmniej 3 x 106 komórek).
    2. Przepłucz komórki dwukrotnie 2 ml pożywki DMEM/F-12, a następnie dodaj 1,5 ml pożywki DMEM/F-12 do naczyń do kultur komórkowych.
    3. Pokrój prawie 80% zlewających się ludzkich komórek ES lub iPS na około 32 części za pomocą końcówek o pojemności 200 μl. Następnie odłącz komórki od naczyń za pomocą skrobaka do komórek.
    4. Zebrać ludzkie komórki ES/iPS do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować komórki pod ciśnieniem 160 × g przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Po odwirowaniu zawiesić granulki komórkowe w 100 μL DMEM/F12, a następnie wymieszać granulki komórkowe ze 100 μl Matrigel (stosunek objętości 1:1).
    6. Przenieść zawiesinę komórek do strzykawki o temperaturze -20 °C, wstępnie schłodzonej. Wstrzyknąć w sumie co najmniej 3 × 106 komórek podskórnie do męskiego NOD-SCID (NOD. Myszy CB17-Prkda scid/JNarl (5-8 tygodni).
    7. Po 5-8 tygodniach wypreparować potworniaki, utrwalić 4,0% (wagowo/objętościowo) roztworem paraformaldehydu, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.
    8. Napraw potworniaka parafiną, pokrój potworniaki zatopione w parafinie i zabarwij hematoksyliną i eozyną (H&E) za pomocą standardowego protokołu28,32.
      UWAGA: Badacze mogą wysłać do firmy utrwaloną tkankę potworniaka, aby naprawić potworniaki parafiną, pokroić potworniaki zatopione w parafinie i wybarwić próbkę H&E, który jest zwykle używany na Wydziale Patologii w szpitalach.
  5. Hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADS)
    1. Ciepłe pożywki hodowlane (DMEM zawierające 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)), 0,25% trypsyny-EDTA i PBS do 37 °C w łaźni wodnej przed użyciem.
    2. Przemyć ludzkie komórki ADS, pipetując 10 ml PBS do każdego 6-centymetrowego naczynia hodowlanego, w którym hoduje się komórki.
    3. Dodać 1 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,25%) do 6-centymetrowych szalek hodowlanych i inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    4. Obserwuj komórki w 6-centymetrowych szalkach hodowlanych pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki są oderwane.
    5. Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać równą objętość pożywki hodowlanej (DMEM zawierającej 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego i 10% FBS) do probówki wirówkowej w celu zneutralizowania trypsyny-EDTA.
    6. Odwirować komórki w temperaturze 250 × g przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    7. Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie, nie naruszając osadu komórkowego.
    8. Ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej, a następnie wysiać komórki o odpowiedniej gęstości (5-10 x 10,3 komórki nacm2 w przypadku pasażowania lub zgodnie ze wskazaniami) na nowe szalki hodowlane (hydrożele P-IA szczepione z oligopeptydami i ECM i bez nich).
  6. Hodowla komórek macierzystych ludzkiego płynu owodniowego (AFS)
    1. Ciepłe podłoża hodowlane (DMEM/MCDB 201 (2:3) zawierające 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ng/ml bFGF i 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego), 0,25% trypsyny-EDTA i PBS do 37 °C w łaźni wodnej przed użyciem.
    2. Przemyć ludzkie komórki AFS, pipetując 10 ml PBS do każdego 6-centymetrowego naczynia hodowlanego, w którym hoduje się komórki.
    3. Dodać 1 ml roztworu trypsyny-EDTA (0,25%) do 6-centymetrowych szalek hodowlanych i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    4. Obserwuj komórki na 6-centymetrowych szalkach hodowlanych pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki są oderwane.
    5. Zebrać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać równą objętość pożywki hodowlanej (DMEM/MCDB 201 (2:3) zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ng/ml bFGF i 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego) do probówki wirówkowej w celu zneutralizowania trypsyny-EDTA.
    6. Odwirować komórki w temperaturze 250 × g przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    7. Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu komórkowego przez pipetowanie.
    8. Ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej, a następnie wysiać komórki o odpowiedniej gęstości (5-10x10,3 komórki nacm2 w przypadku pasażowania lub zgodnie ze wskazaniami) na nowe szalki hodowlane (hydrożele P-IA szczepione z oligopeptydem i ECM i bez niego).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hydrożele P-IA szczepione oligopeptydem pochodzącym z ECM (oligoECM) lub ECM o różnych wartościach sprężystości zostały przygotowane zgodnie ze schematem reakcji przedstawionym na Rysunku 1A, z zastosowaniem różnych typów oligoECM (Rysunek 1B). Sprężystość hydrożeli regulowano poprzez zastosowanie odpowiedniej intensywności (czasu) sieciowania (Rysunek 1C). Hydrożele P-IA szczepione oligopeptydami po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hydrożele P-IA-oligoECM i P-IA-ECM o różnej sztywności opracowano do długotrwałej ekspansji ludzkich komórek ES i iPS zachowujących ich pluripotencję przez ponad dziesięć pasaży w warunkach wolnych od ksenoizolacji, a także do hodowli ludzkich komórek AFS, komórek ADS i hematopoetycznych komórek macierzystych 25,28,32. Hydrożele P-IA immobilizowane oligoECM są doskonałym kandydatem na materiał do hodowli komórek do badania wpływ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu w ramach grantów o numerach 106-2119-M-008 -003, 105-2119-M-008-006 i 104-2221-E-008-107-MY3. Badania te były również wspierane przez Taiwan Landseed Hospital Project (NCU-LSH-105-A-001). Przyznano również dotację na badania naukowe (numer 15K06591) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii. A. Higuchi pragnie podziękować za Międzynarodowy Program Partnerstwa Naukowego (ISPP-0062) Prorektorat ds. Studiów Podyplomowych i Badań, Uniwersytet Króla Sauda, Rijad 11451, Królestwo Arabii Saudyjskiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GTPGPQGIAGQRGVVPH JaponiabrakSpecyfikacja: Oligopeptide
Skrót: Cykliczny RGD, cRGD
GACRGDCLGAPH JaponiabrakSpecyfikacja: Oligopeptide
Skrót: FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH JaponiabrakSpecyfikacja: Oligopeptide
Skrót: CS1
EILDVPSTPH JaponiabrakSpecyfikacja: Oligopeptide
Skrót: VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH JaponiabrakSpecyfikacja: Oligopeptide
Skrót: HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH JaponiabrakSpecyfikacja: Oligopeptide
Skrót: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH JaponiabrakSpecyfikacja: Oligopeptide
Skrót: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JaponiabrakSpecyfikacja: Oligopeptide
Skrót: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JaponiabrakSpecyfikacja: Macierz zewnątrzkomórkowa
Skrót: rVN
VitronectinThermo Fisher scientificA14700Specyfikacja: Macierz zewnątrzkomórkowa
Skrót: FN
FibronectinSigma-AldrichF2006Specyfikacja: Dostępny w handlu materiał powłokowy
Skrót: Synthemax II
Synthemax IICorning3535Specyfikacja: Polimer
Kwas poliwinyloalkoholowo-itakonowyJaponia VAM & PovalAF-17Specyfikacja: Chemiczny
aldehyd glutarowySigma-AldrichG5882Specyfikacja: Chemiczny
Na2SO4Sigma-Aldrich239313Specyfikacja: Chemiczny
H2SO4Sigma-Aldrich339741Specyfikacja: Chemiczny
Skrót:
Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimiduSigma-AldrichE7750Specyfikacja: Chemical
Skrót: NHS
N-hydroksysukcynimidSigma-Aldrich56480Specyfikacja: Chemiczny
paraformaldehydSigma-AldrichP6148Specyfikacja: Chemiczny
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Specyfikacja: Materiał eksploatacyjny do hodowli komórkowych
Skrobak do komórekCorning3008Specyfikacja: Materiał eksploatacyjny do hodowli komórkowych
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693Specyfikacja: Pożywka do hodowli komórkowych
Essential 6Thermo Fisher A1516401naukowy Specyfikacja: Pożywka do hodowli komórkowych
Essential 8Thermo Fisher A1517001Specyfikacja: Pożywka do hodowli komórkowych
DMEM/F12Thermo Fisher scientific11330-032Specyfikacja: Pożywka do hodowli komórkowych
DMEMThermo Fisher scientific12800-017Specyfikacja: Pożywka do hodowli komórkowych
MCDB 201Sigma-AldrichM6770Specyfikacja: Komórka ES
Ludzka komórka ESWiCell Research Institute, Inc.WA09Specyfikacja: Ludzka
komórka iPS Ludzka komórka iPSRiken Cell BankHS0077Specyfikacja: 35 mm
Skrót:
Miska TCP TCPCorning353001Specyfikacja: 60 mm
Skrót:
Naczynie TCP TCPCorning353002Specyfikacja: Danie 24-dołkowe Naczynie
24-dołkoweCorning353047Specyfikacja: Blokowanie agent
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA8806Specyfikacja: Odczynnik do wykrywania
Żywa plama fosfatazy alkalicznejThermo Fisher scientificA14353Specyfikacja: Odczynnik do wykrywania
Hematoksyliny i eozynySigma-Aldrich1.05175Specyfikacja: Naczynie formujące EB
6-dołkowe naczynie z ultraniskim mocowaniemCorning3471Specyfikacja: Materiał powlekający
żelatynaSigma-AldrichG9391Specyfikacja: Materiał powłokowy
MatrigelCorning354230Specyfikacja: Myszy
myszy NOD-SCIDNarodowe Laboratoria Badań StosowanychBrakSpecyfikacja: Surowica Surowica
bydlęcaPrzemysł biologiczny04-001-1ASpecyfikacja: Antybiotyk
antybiotyk przeciwgrzybiczyThermo Fisher scientific15240-062Specyfikacja: Przeciwciało
Przeciwciało dla NanogInvitrogenMA1-017Specyfikacja:
Przeciwciało Przeciwciało dla SSEA4Abcamab16287Specyfikacja:
Przeciwciało Przeciwciało dla OCT3 / 4InvitrogenPA5-27438Specyfikacja:
Przeciwciało Przeciwciało dla Sox2Invitrogen48-1400Specyfikacja: Przeciwciało
przeciwko aktynie mięśni gładkichInvitrogenPA5-19465Specyfikacja:
Przeciwciało przeciwko AFPInvitrogenPA5-21004Specyfikacja: Przeciwciało
GFAPInvitrogenMA5-15086Specyfikacja: Przeciwciało
Alexa Fluor 555 – sprzężone przeciwciało anty-myszy KozyInvitrogenA-21422Specyfikacja: Przeciwciało
Alexa Fluor 488 i sprzężone kozie przeciwciało anty-królikoweInvitrogenA-11008Specyfikacja: Przeciwciało
EDC płodu

Bibliografia

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493(2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778(2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312(2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136(2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647(2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146(2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ludzkie pluripotencjalne komórki macierzystehydrożele P-IAhodowla wolna od komponentów pochodzenia zwierzęcegokontrola sztywności hydrożeluszczepienie oligopeptydówróżnicowanie komórek macierzystychmikroskopia fluorescencyjnaprotokół pasażowania komóreksynteza biomateriałumacierz zewnątrzkomórkowa
Ludzka pluripotencjalna hodowla komórek macierzystych na hydrożelach z polialkoholem winylowym i kwasem ko-itakonowym o różnej sztywności w warunkach wolnych od ksenotypów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.