Gel-seq: metoda jednoczesnego przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA i RNA przy użyciu matryc hydrożelowych

Summary

Gel-seq umożliwia badaczom jednoczesne przygotowanie bibliotek dla sekwencji DNA i RNA przy znikomych dodatkowych kosztach, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek

.

Abstract

Zdolność do amplifikacji i sekwencjonowania zarówno DNA, jak i RNA z małych próbek wyjściowych została osiągnięta dopiero w ciągu ostatnich pięciu lat. Niestety, standardowe protokoły generowania bibliotek genomicznych lub transkryptomicznych są niekompatybilne i badacze muszą wybrać, czy sekwencjonować DNA, czy RNA dla określonej próbki. Gel-seq rozwiązuje ten problem, umożliwiając naukowcom jednoczesne przygotowanie bibliotek zarówno dla DNA, jak i RNA, zaczynając od 100 - 1000 komórek za pomocą prostego urządzenia hydrożelowego. W artykule przedstawiono szczegółowe podejście do wytwarzania urządzenia, a także protokół biologiczny do generowania sparowanych bibliotek. Zaprojektowaliśmy Gel-seq tak, aby mógł być łatwo wdrożony przez innych badaczy; wiele laboratoriów genetycznych posiada już niezbędny sprzęt do odtworzenia produkcji urządzenia Gel-seq. Nasz protokół wykorzystuje powszechnie używane zestawy zarówno do amplifikacji całego transkryptu (WTA), jak i przygotowania biblioteki, które prawdopodobnie będą również znane badaczom już zorientowanym w generowaniu bibliotek genomicznych i transkryptomicznych. Nasze podejście pozwala naukowcom wykorzystać moc sekwencjonowania zarówno DNA, jak i RNA na pojedynczej próbce bez podziału i przy znikomych dodatkowych kosztach.

Introduction

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) miało ogromny wpływ na sposób prowadzenia badań genetycznych. Tam, gdzie kiedyś naukowcy koncentrowali się na sekwencjonowaniu genomu całego gatunku, teraz możliwe jest sekwencjonowanie genomu pojedynczego guza lub nawet pojedynczej komórki w jednym eksperymencie. ¹ NGS również umożliwił sekwencjonowanie transkryptów RNA znajdujących się w komórce, zbiór danych znany jako transkryptom. Zdolność do amplifikacji i sekwencjonowania DNA lub RNA z małych próbek wyjściowych została osiągnięta dopiero w ciągu ostatnich pięciu lat. ^2,3,4 Niestety, standardowe protokoły są niekompatybilne i badacze muszą wybrać, czy sekwencjonować DNA czy RNA dla danej próbki. Gdy próbka wyjściowa jest wystarczająco duża, można ją podzielić na pół. Jednak w mniejszych skalach utrata materiału spowodowana podziałem próbek może wpłynąć na jakość biblioteki, a łączenie próbek może uśrednić interesujące różnice między komórkami. ⁵ Ponadto, badacze są coraz bardziej zainteresowani badaniem próbek, które nie mogą być podzielone, takich jak pojedyncze komórki lub małe heterogeniczne biopsje guza. ⁶

Aby rozwiązać ten problem, ostatnio opracowano trzy protokoły sekwencjonowania zarówno DNA, jak i RNA z tej samej próbki początkowej: Gel-seq⁷, G&T-seq⁸, oraz DR-seq⁹. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół dla Gel-seq, który może być używany do jednoczesnego generowania bibliotek DNA i RNA z zaledwie 100 komórek przy znikomych dodatkowych kosztach. Nowatorskim aspektem Gel-seq jest zdolność do rozdzielania DNA i RNA wyłącznie na podstawie wielkości przy użyciu tanich matryc hydrożelowych. Podstawową innowacją protokołu Gel-Seq jest fizyczna separacja DNA od RNA. Separacja ta jest osiągana elektroforetycznie za pomocą kombinacji membran poliakrylamidowych, które wykorzystują różnice wielkości między tymi cząsteczkami. Aby umieścić te różnice wielkości w kontekście, zastanówmy się, w jaki sposób obrazuje się DNA i RNA: podczas gdy DNA istnieje w skali mikronowej i można je oglądać za pomocą tradycyjnych mikroskopów, RNA istnieje w skali nanometrowej i musi być obrazowane przy użyciu złożonych technik, takich jak mikroskopia krioelektronowa. ¹⁰

Podejście do separacji DNA i RNA w tym protokole jest pokazane w Rysunek 1. Lewy panel pokazuje DNA i RNA swobodnie unoszące się w roztworze w pobliżu błony. Po przyłożeniu pola elektrycznego, jak pokazano na prawym panelu, DNA i RNA doświadczają siły elektroforetycznej, która indukuje migrację przez błonę. Dostrajając właściwości błony, stworzyliśmy półprzepuszczalną błonę, która oddziela DNA od RNA. Cząsteczki DNA są dociskane do błony, ale ze względu na swój duży rozmiar plączą się na krawędzi. Z drugiej strony małe cząsteczki RNA mogą rekonfigurować i przeplatać się przez błonę. Proces ten, znany jako reptacja, jest podobny do sposobu, w jaki wąż porusza się po trawie. W końcu te cząsteczki RNA są zatrzymywane przez drugą membranę o dużej gęstości, która jest zbyt trudna do przebicia dla nawet mniejszych polimerów (>200 par zasad). Po fizycznym rozdzieleniu DNA i RNA można odzyskać i przetworzyć w celu wygenerowania informacji zarówno o genomie, jak i transkryptomie. Chociaż możemy oddzielić DNA i RNA, odkryliśmy, że lepsze wyniki uzyskuje się, jeśli RNA jest odwrotnie transkrybowane do cDNA przed rozdzieleniem. Hybrydy cDNA/RNA są bardziej stabilne niż samo RNA i nadal mogą przechodzić przez błonę o niskiej gęstości.

Rysunek 1. Zasada działania Gel-seq.Podstawowa zasada używana do fizycznego oddzielania DNA i RNA. W przyłożonym polu elektrycznym małe cząsteczki RNA migrują przez błonę o niskiej gęstości, ale duże cząsteczki DNA są uwięzione na powierzchni. Ten rysunek został powielony z Ref. 7 za zgodą Królewskiego Towarzystwa Chemicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ten artykuł szczegółowo opisuje zarówno produkcję urządzenia Gel-seq, jak i biologiczny protokół generowania sparowanych bibliotek DNA i RNA. Przegląd obu tych elementów przedstawiono na rysunku 2. Urządzenie jest wytwarzane przez nakładanie na siebie trzech żeli poliakrylamidowych o różnej gęstości w procesie podobnym do tworzenia standardowych żeli do układania w stosy. ¹¹ Protokół biologiczny zaczyna się od 100 - 1000 komórek zawieszonych w PBS. Komórki są poddawane lizie, a RNA jest przekształcane w cDNA, zanim urządzenie zostanie użyte do oddzielenia genomowego DNA od hybryd cDNA/RNA. Po separacji i odzyskaniu biblioteki genomiczne i transkryptomiczne są przygotowywane przy użyciu procesu, który jest ściśle zgodny ze standardowym protokołem zestawu do przygotowania biblioteki całego genomu. Więcej szczegółów na temat rozwoju i walidacji Gel-seq można przeczytać w publikacji Lab on a Chip "Gel-seq: sekwencjonowanie całego genomu i transkryptomu poprzez jednoczesne przygotowanie biblioteki DNA i RNA o niskim nakładzie przy użyciu półprzepuszczalnych barier hydrożelowych."⁷

Rysunek 2. Protokół Gel-seq.Przegląd etapów produkcji urządzenia Gel-seq i protokołu generowania sparowanych bibliotek DNA i RNA. Fragmenty tego rysunku zostały zreprodukowane z Ref. 7 za zgodą Królewskiego Towarzystwa Chemicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby wygenerować biblioteki DNA i RNA z pojedynczych komórek, badacze powinni rozważyć użycie G&T-seq lub DR-seq. G&T-Seq, podobnie jak Gel-seq, opiera się na fizycznym oddzieleniu RNA od genomowego DNA. Podejście to opiera się na poliadenylowanym ogonie 3′ informacyjnego RNA (mRNA) jako celu ściągania. mRNA jest wychwytywane na kulce magnetycznej za pomocą biotynylowanego startera oligo-dT. Po wychwyceniu mRNA kulki są przytrzymywane na miejscu za pomocą magnesu, a supernatant zawierający genomowe DNA można usunąć i przenieść do innej probówki. Po zakończeniu tej fizycznej separacji można wygenerować oddzielne biblioteki z mRNA i DNA. ⁸ To podejście działa dobrze, jeśli interesujący nas RNA jest poliadenylowany, jednak nie może być używany do badania transkryptów niepoliadenylowanych, takich jak rybosomalne RNA, tRNA lub RNA od prokariontów.

DR-seq opiera się na etapie wstępnej amplifikacji, gdzie zarówno DNA, jak i cDNA pochodzące z RNA są amplifikowane w tej samej probówce. Próbka jest następnie dzielona na dwie części i przetwarzana równolegle w celu przygotowania bibliotek sekwencyjnych DNA i RNA. Aby odróżnić genomowe DNA od cDNA pochodzącego z RNA, DR-seq przyjmuje podejście obliczeniowe. Sekwencje, w których obecne są tylko eksony, są obliczeniowo tłumione w danych genomowego DNA, ponieważ mogły one pochodzić zarówno z DNA, jak i RNA. ⁹ Zaletą tego podejścia jest to, że DNA i cDNA/RNA nie muszą być fizycznie oddzielone, jak to ma miejsce w Gel-seq i G&T-seq. Wadą jest jednak to, że DR-seq wymaga wiedzy a priori na temat genomu i transkryptomu (tj. eksonów kontra intronów) i może nie być idealny do zastosowań takich jak sekwencjonowanie jąder, w których wiele transkryptów nie jest jeszcze w pełni splicingowanych i nadal zawiera introny. ¹²

Nowością w Gel-seq jest możliwość rozdzielania DNA i RNA w setkach komórek wyłącznie na podstawie rozmiaru. Metoda ta nie wymaga wiedzy a priori na temat genomu lub transkryptomu, jest odporna na niepełne splicing i nie ogranicza się do transkryptów poli-adenylowanych. W przypadku zastosowań, w których badacz może zacząć od co najmniej 100 komórek, Gel-seq zapewnia proste podejście przy użyciu tanich i powszechnie dostępnych materiałów.

Protocol

1. Przygotowanie roztworu chemicznego

UWAGA: Poniższe kroki służą do przygotowania roztworów chemicznych wymaganych w późniejszych krokach. Można je wytwarzać luzem i przechowywać przez kilka miesięcy.

1. Na początek przygotuj 50 ml oczyszczonej, dejonizowanej wody, sterylizując w piecu sieciującym UV o długości fali 254 nm przez 15 minut (całkowita ekspozycja 15 mJ/^cm2), aby zneutralizować wszelkie zanieczyszczenia DNA. Podgrzać do 37 °C do użycia w następujących krokach.
2. Przygotować 10 ml 40% całkowitego (T) i 3,3% roztworu prekursora poliakryloamidu (C) (29:1). Odważyć 3,867 g monomeru akryloamidu i 0,133 g monomeru bis-akryloamidu. Połączyć i zwiększyć objętość do 10 ml ciepłą, oczyszczoną wodą i wirować aż do rozpuszczenia. Przechowywać w bezpiecznym miejscu w temperaturze pokojowej, w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Wstępnie zmieszane roztwory poliakryloamidu 40% T, 3,3% C (29:1) można kupić w handlu.
3. Przygotuj 10 ml 50% T, 5% C roztworu żelu. Odważyć 4,750 g monomeru akryloamidu i 0,250 g monomeru bis-akryloamidu. Połączyć i zwiększyć objętość do 10 ml za pomocą ciepłej oczyszczonej wody i wirować aż do rozpuszczenia. Przechowywać w bezpiecznym miejscu w temperaturze pokojowej.
4. Przygotować 10 ml 50% (w/v) roztworu sacharozy. Dodać 5 g sacharozy do cylindra z podziałką i dodać ciepłą oczyszczoną wodę do całkowitej objętości 10 ml. Wirować do rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze pokojowej.
5. Przygotuj 10 ml 10% APS (w/v). Dodać 1 g nadsiarczanu amonu (APS) do cylindra z podziałką. Dodaj zimną (~4° C) oczyszczoną wodę do całkowitej objętości 10 ml i wiruj aż do rozpuszczenia. Natychmiast zamrozić w porcjach po 200 μl.

2. Produkcja kaset żelowych

Uwaga: Gel-seq został pierwotnie opracowany z pionowymi kasetami (zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać więcej informacji); jednak ten protokół może być dostosowany do pracy z każdą standardową kasetą do elektroforezy żelowej.

1. Przygotować prekursory żelu w trzech oddzielnych probówkach z tworzywa sztucznego, dodając odczynniki, jak pokazano poniżej w tabeli 1. Nie należy dodawać ani APS, ani tetrametyloetylenodiaminy (TEMED), dopóki nie zostanie to zalecone w poniższych krokach. Składniki dokładnie wymieszać.

Prekursor żelu wypełniającego Prekursor żelu o wysokiej gęstości Prekursor żelu o niskiej gęstości 40% T, 3,3% C Roztwór bisakryloamidu akryloamidu 1,6 ml 50% T, 5% C Roztwór bisakryloamidu akryloamidu 2,4 ml 40% T, 3,3% C Roztwór bisakryloamidu akryloamidu 0,6 ml Dejonizowana 10,2 ml Dejonizowana 1,0 ml Dejonizowana 4,8 ml Roztwór sacharozy (50% w/v) 2,6 ml Roztwór sacharozy (50% w/v) 0,6 ml 10X Tris-Boran-EDTA 1,6 ml 10X Tris-Boran-EDTA 0,6 ml Nadsiarczan amonu (10% m/v) 104,0 μL Nadsiarczan amonu (10% m/v) 50,0 μL Nadsiarczan amonu (10% m/v) 39,0 μl TEMED 6,0 μl TEMED 1,0 μl TEMED 2,2 μl Całkowita objętość 16,1 ml Całkowita objętość 4,1 ml Całkowita objętość 6,0 ml

Tabela 1. Odczynniki do syntezy żelu.Odczynniki prekursorowe w żelu poliakrylamidowym wystarczające do wytworzenia 2 kaset.

2. Roztwory monomerów żelowych odgazowujących poprzez włożenie igły przez nasadkę rurki i podłączenie tej igły do domowej linii próżniowej. Zanurz ten zespół w kąpieli ultradźwiękowej ustawionej na wysoką temperaturę i poczekaj, aż pęcherzyki przestaną wyłaniać się z cieczy, zanim przejdziesz do następnego kroku (~60 sekund / rurka).
   UWAGA: Jakość próżni i moc kąpieli ultradźwiękowej nie jest krytyczna, o ile z roztworu widać pęcherzyki.
3. Dodaj TEMED i APS do prekursora żelu wypełniającego i krótko wiruj. Natychmiast dodać 6 ml prekursora żelu wypełniającego do każdej kasety żelowej, pipetując roztwór do górnej części kasety. Użyj mikropipety o pojemności 1 ml, aby dodać prekursor w sześciu krokach, aby uniknąć rozlania. Całkowity czas wykonania tego kroku powinien być krótszy niż 3 minuty.
4. Upewnij się, że płyn jest wypoziomowany, ustawiając kasety pionowo na równym stole. Napełnij pozostałą część kasety dejonizowaną, odgazowaną wodą. Odpipetuj wodę, ponownie z dokładnością 1 ml, powoli do środka kasety, aby zminimalizować mieszanie. Pozostaw polimer do utwardzenia przez co najmniej godzinę, do nocy.
5. Po utwardzeniu polimeru odwróć kasety z żelem nad zlewem, aby usunąć nakładkę wodną. Pistolet na sprężone powietrze może być użyty do delikatnego osuszenia interfejsu poprzez wdmuchiwanie powietrza przez górny otwór kasety z odległości 6 cali.
6. Dodaj TEMED i APS do prekursora żelu o dużej gęstości i krótko wiruj. Natychmiast dodać 320 μl prekursora o dużej gęstości do kasety, ponownie za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Upewnij się, że płyn równomiernie pokrywa warstwę żelu wypełniającego, kołysząc kasetą w przód iw tył około 3 razy. Ten krok powinien zająć mniej niż trzy minuty.
7. Napełnij pozostałą część kasety dejonizowaną, odgazowaną wodą. Pipetować powoli pipetą o pojemności 1 ml do środka kasety, aby zminimalizować mieszanie. Pozostaw polimer do utwardzenia przez co najmniej piętnaście minut, najlepiej godzinę.
8. Ponownie odwróć kasety z żelem, aby usunąć nakładkę wodną. Sprężone powietrze może być użyte do delikatnego osuszenia interfejsu. Dodaj TEMED i APS do prekursora żelu o niskiej gęstości i krótko wiruj. Natychmiast napełnij pozostałą część kasety (~1,65 ml) prekursorem żelu o niskiej gęstości i włóż grzebień żelowy.
9. Odpipetować nadmiar prekursora rezerwowego w górnej części grzebienia, ponieważ zostanie on wchłonięty podczas polimeryzacji. Pozostaw polimer do utwardzenia przez co najmniej 4 godziny, najlepiej przez noc. Żele można przechowywać przez tydzień lub dłużej w buforze kwasu tris-boranowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (bufor TBE).

3. Przygotowanie próbki i odwrotna transkrypcja

1. Zaczynając od zawieszenia komórek będących przedmiotem zainteresowania i pracując w kapturze z przepływem laminarnym reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), użyj hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, aby obliczyć stężenie komórek. Rozcieńczyć komórki do stężenia od 100 do 1000 komórek na μl w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   UWAGA: Ten protokół został zwalidowany na wielu komórkach, w tym PC3, HeLa i komórkach wątroby myszy.
2. Używając odczynników znajdujących się w zestawie WTA (patrz tabela materiałów), wymieszaj 19 μl buforu do lizy i 1 μl inhibitora RNazy, aby przygotować 10-krotny roztwór podstawowy buforu reakcyjnego. Utworzyć główną mieszaninę do lizy o wystarczającej objętości, zawierającą 0,5 μl buforu reakcyjnego i 2,75 μl wody wolnej od nukleaz dla każdej próbki.
3. Pipetować zawiesinę komórek w górę i w dół 5 razy, aby ponownie zawiesić osadzone komórki, a następnie pipetować 1 μl próbki do probówki paskowej o pojemności 200 μl wolnej od nukleaz, sterylizowanej promieniami UV. Powtórzyć w razie potrzeby w zależności od liczby próbek. Należy pamiętać o uwzględnieniu kontroli ujemnej poprzez pipetowanie 1 μl wody wolnej od nukleaz zamiast komórek dla jednej reakcji. Następnie dodaj 3,25 μl głównej mieszanki lizy do każdej próbki i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół 5 razy.
4. Rozgrzej termocykler (z podgrzewaną pokrywą) do temperatury 72 °C. Do każdej próbki dodać 1 μl startera RT i 1 μl 20 μM losowego heksameru z adapterem WTA (5′-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′). Zarezerwuj co najmniej jedną probówkę jako kontrolę pozytywną do przygotowania biblioteki gDNA i dodaj 2 μl wody zamiast starterów.
   UWAGA: Losowy heksamer z adapterem WTA jest opcjonalny i ma minimalny wpływ na wyniki sekwencjonowania.
5. Próbki inkubować w temperaturze 72 °C w nagrzanym termocyklerze przez 3 minuty w celu lizy komórek. Usuń komórki z termocyklera i umieść na lodzie na 2 minuty. Przechowywać kontrolę dodatnią w temperaturze 4 °C do etapu 5.
6. Podczas lizy komórek należy utworzyć wystarczającą objętość głównej mieszaniny odwrotnej transkrypcji dla wszystkich próbek RNA zawierających następujące proporcje odczynników: 2 μl buforu pierwszej nici, 0,5 μl oligonukleotydu przełącznika matrycowego (TSO), 0,25 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (100 U/μL).
7. Rozgrzej termocykler do temperatury 42 °C. Do pozostałych próbek dodać 3,75 μl głównej mieszanki z odwrotną transkrypcją, zwiększając całkowitą objętość próbki do 10 μl. Wymieszać, pipetując 5 razy w górę i w dół.
8. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję, natychmiast umieszczając próbki w podgrzanym termocyklerze. Uruchom następujący program: 42 °C przez 90 min, 70 °C przez 10 min, 4 °C na zawsze. Jest to bezpieczny punkt postoju.

4. Separacja żelu i odzyskiwanie próbek

1. Ostrożnie wyczyść żelową komorę do elektroforezy za pomocą produktu do usuwania DNA. Nałóż kilka ml płynnego środka czyszczącego na jednorazową, niestrzępiącą się chusteczkę i przetrzyj wszystkie powierzchnie komory, a następnie napełnij komorę czystym 0,5x TBE. Aby uzyskać optymalne wyniki, umieść całe urządzenie w piecu sieciującym UV 254 nm i sterylizuj przez 15 minut (15 mJ/cm²).
2. Włóż kasetę Gel-seq do komory elektroforezy żelowej i zablokuj ją na miejscu. Powoli wyjmij grzebień żelowy, pociągając prosto do góry. Poruszaj się powoli, aby uniknąć rozerwania żelu lub rozerwania któregokolwiek z ramion.
3. Trzymając próbki z etapu 3 na lodzie, należy zarezerwować co najmniej jedną próbkę jako kontrolę pozytywną do wygenerowania biblioteki cDNA. Przechowywać ten regulator w temperaturze 4 °C do kroku 6. Do pozostałych próbek dodać 2 μl barwnika o 6-krotnym obciążeniu, zwiększając całkowitą objętość do ~12 μL. Dokładnie wymieszaj próbki, pipetując 5 razy w górę i w dół.
4. Połącz 1 μl drabiny DNA z 2 μl 6x barwnika ładującego i 7 μl wody. Odpipetować tę mieszaninę do toru 1 kasety Gel-seq jako kontrolę elektroforezy. Odpipetować próbki z poprzedniego kroku do oddzielnych pasów kasety Gel-seq. Należy uważać, aby zapobiec zanieczyszczeniu między studzienkami, wkładając pipetę całkowicie do każdej studzienki i wyjmując ją tylko ruchem pionowym.
5. Korzystając ze standardowego zasilacza do elektroforezy żelowej, przyłóż pole elektryczne 250 V do kasety Gel-seq przez 30 minut, aby oddzielić gDNA od hybryd cDNA/RNA. Po oddzieleniu wyjmij kasetę Gel-seq z komory elektroforezy żelowej i otwórz dwie połówki kasety, podważając krawędzie narzędziem do skrobania.
6. Za pomocą skalpela przetnij żel na pół tuż pod warstwą o dużej gęstości. Wyrzuć połowę zawierającą żel wypełniający, podnosząc ją ręką w rękawiczce. Delikatnie oderwij pozostały żel od kasety, zeskrobując ją skrobakiem do farby lub innym podobnym narzędziem. Umieść tę część żelu w naczyniu zawierającym ~30 ml 0,5x TBE z 3 μl barwnika żelowego.
7. Przykryj pojemnik, aby zminimalizować fotowybielanie i namocz żel, delikatnie potrząsając pojemnikiem przez 5 minut. Umieść żel na folii i wykonaj zdjęcie UV za pomocą systemu dokumentacji żelu (więcej szczegółów patrz Ref. 13). 30-sekundowa ekspozycja zazwyczaj daje wyraźne obrazy. Sprawdź, czy nastąpiła separacja.
8. Przenieś żel do transiluminatora UV, aby ułatwić wizualizację kwasów nukleinowych. Nosząc odpowiednie okulary UV, potwierdź wyniki z systemu dokumentacji żelu. GDNA powinno znajdować się na początku żelu o niskiej gęstości, a cDNA na granicy regionów o niskiej i dużej gęstości.
9. Za pomocą skalpela wytnij obszary żelu zawierające gDNA i cDNA. Próbki najlepiej odzyskać poprzez nacięcie prostokątnego odcinka żelu o wymiarach 4 mm na 10 mm; Jednak dokładna geometria będzie zależeć od zastosowanego systemu elektroforezy żelowej. Pamiętaj również, aby przeciąć pas ruchu obciążony kontrolą ujemną.
10. Umieść każdą wyciętą część żelu w tubce z paskiem za pomocą pęsety z końcem. Uważaj, aby nie przykładać zbyt dużej siły, w przeciwnym razie żel rozpadnie się na kilka części. Jeśli tak się stanie, po prostu podnieś każdy kawałek i dodaj go do tuby.
11. Zmielić żel w każdej probówce za pomocą końcówki pipety (dobrze sprawdzają się końcówki do pipet o pojemności 200 μl), przesuwając końcówkę pipety w sposób okrężny po dnie probówki. Dodaj wodę wolną od nukleaz (40 μl do próbek gDNA i 80 μl do próbek cDNA) do każdej probówki przed wyjęciem końcówki pipety używanej do mielenia żelu, aby zminimalizować utratę próbki.
12. Umieścić probówki paskowe w mieszalniku wirowym w inkubatorze o temperaturze 37 °C i wstrząsać przez 8 - 12 godzin. Pozwala to kwasom nukleinowym dyfundować z żelu i jest naturalnym punktem zatrzymania tego wielodniowego protokołu.
13. Pobrać pipetować próbki do płytki filtracyjnej o oczkach 8 μm i obracać płytką o wymiarach 2600 x g przez 5 minut, aby odcedzić fragmenty żelu. Odsunąć siatkową płytkę filtracyjną od płyty obudowy i odpipetować próbki wody bez żelu do nowej probówki z paskiem o pojemności 200 μl.
14. Dodać 1 μl proteazy (0,9 AU/ml) do każdej próbki zawierającej gDNA, dobrze wymieszać pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze 50 °C przez 15 minut, a następnie inaktywować termicznie w temperaturze 70 °C przez 15 minut. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla zubożenia nukleosomów i sprawia, że gDNA jest dostępne dla kolejnych etapów reakcji.
15. Za pomocą igły o rozmiarze 18 zrób otwory w nakrętkach wszystkich probówek z próbkami. Umieść próbki w próżni, aby zmniejszyć objętość cieczy. Próbki gDNA należy zmniejszyć do 5 μl, a próbki cDNA do 10 μl.
16. W zależności od próżni i liczby próbek, całkowity czas parowania będzie się wahał od 30 do 60 minut. Jeśli objętość próbki spadnie poniżej objętości docelowej, po prostu dodaj wodę wolną od nukleaz, aby zwiększyć objętość próbki.

5. Przygotowanie biblioteki gDNA

1. Za pomocą fluorometru lub podobnej technologii określić ilościowo stężenie DNA w każdej próbce gDNA z kroku 4, a także kontrolę pozytywną z kroku 3. Szczegółowy protokół znajduje się w instrukcji obsługi fluorometru. ¹⁴
2. Rozcieńczyć próbki do 0,2 ng/μl DNA. W zależności od typu komórki wyjściowej i wymaganej jakości wyników, niższe stężenia mogą nadal tworzyć żywotne biblioteki. Wymagane będą pewne eksperymenty; jednak autorzy odnieśli sukces z bibliotekami o niskim poziomie 0,1 ng/μl.
3. Zakończ przygotowanie biblioteki gDNA, postępując zgodnie z protokołem przygotowania biblioteki połowy objętości reakcji w kroku 7.

6. Przygotowanie biblioteki cDNA

1. Zaczynając od 10 μl próbek cDNA i kontroli pozytywnej z kroku 4, dodaj 12,5 μl mieszanki 2X qPCR, 0,5 μl startera cDNA PCR i 2 μl wody wolnej od nukleaz.
2. Wykonaj PCR w termocyklerze w czasie rzeczywistym przy użyciu następującego protokołu: gorący start w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, następnie 20-30 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 sekund, 65 °C przez 30 s i 72 °C przez 3 minuty. Całkowita objętość próbki wynosi 25 μl. Monitoruj krzywe reakcji i zatrzymaj amplifikację, zanim reakcje opuszczą fazę wykładniczą (liniowy wzrost sygnału w funkcji liczby cyklu), aby uniknąć PCR artefakty spowodowane nadmiernym wzmocnieniem. Więcej informacji na temat unikania nadmiernego wzmacniania można znaleźć w sekcji dyskusji tego artykułu, a także w Ref. 15.
3. Po amplifikacji wyczyść produkt za pomocą kulek odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej (SPRI) zgodnie z protokołem w kroku 8. Po zakończeniu przejdź do następnego kroku.
4. Za pomocą fluorometru lub podobnej technologii określ ilościowo stężenie DNA w każdej próbce cDNA, a także kontrolę pozytywną z kroku 4. W razie potrzeby rozcieńczyć próbki, aby zawierały około 0,2 ng/μl DNA. Nieco niższe stężenia nadal tworzą opłacalne biblioteki. Konieczne będą pewne eksperymenty, jednak autorzy odnieśli sukces z bibliotekami o niskim poziomie 0,1 ng/μl.
5. Krok opcjonalny: Wykonaj standardową separację elektroforezą w żelu poliakrylamidowym na 1 - 2 μl każdego produktu qPCR, aby sprawdzić, czy zadziałała reakcja generowania biblioteki. Przykładowy obraz pomyślnego wyniku jest pokazany w Rysunek 4. Szczegółowy protokół dotyczący przeprowadzania elektroforezy w żelu poliakrylamidowym znajduje się w Ref. 16.
6. Zakończ przygotowanie biblioteki cDNA, postępując zgodnie z protokołem reakcji połowy objętości zestawu do przygotowania biblioteki w kroku 7.

7. Przygotowanie biblioteki z reakcjami połówkowymi

objętości

1. Przygotowanie biblioteki odbywa się zgodnie z protokołem zestawu do przygotowania biblioteki z wykorzystaniem reakcji połówkowych objętości. ¹⁷ Wszystkie odczynniki, o których mowa w tej sekcji protokołu, pochodzą z zestawu do przygotowania biblioteki (patrz Tabela materiałów). Rozpocznij od sterylizacji UV wystarczającej liczby probówek paskowych do liczby próbek do przetworzenia.
2. Przeprowadzić reakcję transpozazy, dodając 5 μl buforu transpozazy do każdej probówki paskowej, która ma być użyta w teście. Następnie dodać 2,5 μl wejściowego DNA przy 0,2 ng/μl (łącznie 0,5 ng), a następnie 2,5 μl transpozy. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 5 razy.
3. Inkubować w temperaturze 55 °C przez 5 minut, a następnie utrzymywać w temperaturze 10 °C. Gdy próbka osiągnie temperaturę 10 °C, wyjmij ją z termocyklera i natychmiast dodaj 2,5 μl buforu zatrzymującego transpozazę do każdej próbki. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
4. Przygotować reakcję PCR w celu amplifikacji próbki poddanej transpozycji, dodając 7,5 μl mieszanki PCR do przygotowania biblioteki, 2,5 μl startera o indeksie 1 i 2,5 μl startera o indeksie 2. Te podkłady są zastrzeżone i są dostarczane przez producenta zestawu do przygotowania biblioteki. Dobrze wymieszać, pipetując 5 razy w górę i w dół.
   UWAGA: Upewnij się, że dla każdej próbki używane są unikalne kombinacje podkładów. Dostępnych jest 12 różnych starterów indeksu 1 i 8 różnych starterów indeksu 2, co umożliwia unikalne etykietowanie do 96 różnych próbek. Wybierz unikalną kombinację podkładów dla każdej próbki.
5. Wykonaj PCR za pomocą poniższego programu na termocyklerze. Objętość próbki wynosi 25 μl.
   72 °C przez 3 minuty
   95 °C przez 30 sekund
   12 cykli:
   95 °C przez 10 sekund
   72 °C przez 30 sekund
   55 °C przez 30 sekund
   72 °C przez 5 minut
   Przechowywać w temperaturze 10 °C
6. Wyczyść przygotowane biblioteki za pomocą koralików SPRI zgodnie z protokołem w kroku 8. Biblioteki powinny być walidowane za pomocą elektroforezy żelowej lub podobnego testu. Zapoznaj się z podręcznikiem zestawu do przygotowywania bibliotek, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat sprawdzania poprawności bibliotek. ¹⁷

8. Czyszczenie biblioteki koralików do odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej

1. Kulki odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej (SPRI) powinny być przechowywane w podwielokrotnościach o pojemności 1,5 ml i powinny być doprowadzone do temperatury pokojowej przed każdym użyciem. Zaleca się również przygotowanie świeżego 80% etanolu do każdego eksperymentu. Poniższe kroki są oparte na protokole koralików SPRI w instrukcji zestawu WTA. ¹⁸
2. Dodać 1 μl buforu do lizy zestawu WTA do każdego produktu PCR. Wirować kulki SPRI aż do równomiernego wymieszania, a następnie dodać 50 μl kulek SPRI do każdej próbki. Wymieszać, pipetując próbkę w górę i w dół 10 razy, a następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 8 minut.
3. Krótko obrócić próbki, aby zebrać płyn z boku probówek. Umieść próbki na urządzeniu do separacji magnetycznej na ~5 minut, aż ciecz stanie się całkowicie klarowna.
4. Gdy próbki znajdują się w urządzeniu do separacji magnetycznej, powoli odpipetuj supernatant i wyrzuć - należy uważać, aby nie naruszyć pierścienia kulek na probówce. Następnie dodaj 200 μl 80% etanolu do każdej próbki, nie naruszając kulek. Odczekać 30 sekund, a następnie ostrożnie odpipetować supernatant. Powtórz ten krok (mycie etanolem) raz.
5. Pozostawić próbki do wyschnięcia na 30 s - 1 min. Nie należy nadmiernie suszyć próbek, ponieważ duże fragmenty zostaną trwale związane z kulkami.
   UWAGA: Zalecany jest krótki czas schnięcia, aby upewnić się, że wszystkie ślady etanolu zostały usunięte. Jeśli śladowe ilości etanolu pozostaną w tyle, mogą one nieznacznie zahamować dalsze reakcje.
6. Wyjmij próbki z urządzenia do separacji magnetycznej i dodaj 15 μl wody do każdej próbki, aby wymyć DNA z kulek. Pipetuj w górę iw dół i upewnij się, że koraliki zostały usunięte z boków probówek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Krótko obrócić próbki, a następnie umieścić je na urządzeniu do separacji magnetycznej na ~1 minutę, aż roztwór stanie się klarowny.
7. Gdy próbki znajdują się w urządzeniu do separacji magnetycznej, powoli odpipetuj supernatant i przenieś go do czystych probówek. Uważaj, aby nie naruszyć pierścienia koralików na rurce. Wyrzuć rurki z koralikami.

Results

Fizyczne rozdzielenie hybryd gDNA i cDNA/RNA w urządzeniu Gel-seq można zobrazować za pomocą fluorescencyjnego obrazowania żelowego; reprezentatywny wynik jest pokazany w Rysunek 3. Panel A przedstawia wyprodukowane urządzenie Gel-seq; Fałszywy kolor został dodany w celu rozróżnienia różnych obszarów żelu. Panel B pokazuje zbliżenie czterech różnych separacji używanych do walidacji. Trzeci pas, kontrola ujemna, stanowi tło i pokazuje, że na granicy faz nie ma...

Discussion

Istnieje kilka krytycznych kroków związanych z produkcją urządzenia Gel-seq, a także z samym protokołem. Podczas produkcji zalecamy rozpoczęcie od zalecanych grubości warstw dla różnych obszarów żelu. Poświęciliśmy dużo czasu na testowanie różnych opcji produkcyjnych, a opisany tutaj protokół zapewnia najlepsze urządzenia dla kaset wymienionych w Tabeli materiałów i odczynników. Jeśli badacze korzystają z alternatywnego systemu kasetowego, mogą uznać za konieczne dostosowanie głośności używanej podczas t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynniki
Monomer akryloamidu	Sigma	Aldrich A8887-100G
Nadsiarczan amonu	Sigma Aldrich	A3678-25G
Koraliki Ampure XP	Beckman Coulter	A63880	Określany w tekście jako kulki odwracalnego immobilizacji w fazie stałej (SPRI)
Barwnik ładujący żel DNA (6x)	ThermoFisher Naukowy	R0611	Określany w tekście jako 6-krotny barwnik ładujący
Alkohol etylowy	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST Jednoetapowe zestawy qRT-PCR	Kapa BioSystems	7959613001	Określany w tekście jako mieszanina 2X qPCR
N,N′-Metylenobis(akrylamid)	Sigma Aldrich	146072-100G	Znany również jako bis-akryloamid
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (określany w tekście jako zestaw do przygotowania biblioteki)	Illumina	FC-131-1024	Zawiera: TD (określany w tekście jako bufor transpozazy), ATM (określany w tekście jako transposase), NT (określany w tekście jako bufor zatrzymujący transpozę) i NPM (określany w tekście jako mieszanka PCR do przygotowania biblioteki)
Woda	wolna od nukleazMillipore	3098
Proaza	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (określany w tekście jako zestaw do amplifikacji całego transkryptu (WTA))	Takara/Clontech	634888	Zawiera: Bufor do lizy, inhibitor RNazy, 3' SMART-Seq CDS Primer II A (określany w tekście jako starter RT), 5X Ultra Low First Nici Buffer (określany w tekście jako bufor pierwszej nici), SMART-Seq v4 Oligonukleotyd (określany w tekście jako oligonukleotyd przełącznika matrycy (TSO)), odwrotna transkryptaza SMART-Scribe (określana w tekście jako odwrotna transkryptaza) i PCR Primer II A (określany w tekście jako starter cDNA PCR)
Losowy heksamer z adapterem WTA	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sacharoza	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Odkażacz powierzchniowy	ThermoFisher Scientific	7010PK	Określany w tekście jako produkt do usuwania DNA
Bufor Tris-Boran-EDTA (stężenie 10X)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Gel Stain (10 000X Koncentrat w DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Określany w tekście jako barwnik żelowy
Sprzęt
BD Precisionglide  igły strzykawkowe, rozmiar 18	Sigma Aldrich	Z192554	Dopuszczalne jest każde równoważne osprzęt
Kąpiel ultradźwiękowa Branson serii CPX	Sigma Aldrich	Z769363	Dopuszczalne jest dowolne równoważne osprzęt
Puste kasety na żel, mini, 1,0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Każdy równoważny sprzęt jest dopuszczalny
Płyta filtracyjna siatkowa - Corning  HTS Transwell 96 dobrze przepuszczalne podpory - 8,0 &mikro; m rozmiar porów	Sigma Aldrich	CLS3374	Określany w tekście jako płyta filtracyjna z siatką 8 um
Zasilacz PowerPac HC	Bio-Rad	1645052	Dopuszczalny jest każdy równoważny sprzęt
Fluorometr kubitowy	ThermoFisher Scientific	Q33216	Dopuszczalny jest każdy równoważny sprzęt
Koncentrator próżniowy	Eppendorf	22822993	Dopuszczalny jest każdy równoważny sprzęt
System XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher Scientific	EI0001	Dopuszczalny jest dowolny równoważny sprzęt
Bio-Rad CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad	1855195	Każdy równoważny sprzęt jest dopuszczalny
Środek sieciujący ultrafioletem Amersham UVC 500	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Wycofane, dopuszczalne są wszelkie równoważne urządzenia
System dokumentacji żelu Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195	Określany w tekście jako gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Określany w tekście jako transilluminator UV
Ultradźwiękowe  Wanna	Bransonic	1207K35	Każda równoważna kąpiel ultradźwiękowa jest dopuszczalna.