Adaptacja 3'szybkiej amplifikacji końców CDNA do mapowania transkryptów w raku

Summary

Dwa różne protokoły szybkiej amplifikacji końców cDNA (3' RACE) opisane tutaj wykorzystują dwie różne polimerazy DNA do mapowania sekwencji, które zawierają segment otwartej ramki odczytu (ORF), kodon stop i cały 3' UTR transkryptu za pomocą RNA uzyskanego z różnych linii komórek nowotworowych.

Abstract

Dojrzewanie eukariotycznych mRNA obejmuje tworzenie końca 3', co wiąże się z dodaniem ogona poli(A). W celu zmapowania końca 3' genu, tradycyjną metodą z wyboru jest szybka amplifikacja 3' końców cDNA (3' RACE). Protokoły dla 3' RACE wymagają starannego zaprojektowania i selekcji zagnieżdżonych starterów w nieulegającym translacji regionie 3' (3' UTR) docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak po kilku modyfikacjach protokół może być używany do uwzględnienia całego 3' UTR i sekwencji w otwartej ramce odczytu (ORF), zapewniając bardziej wszechstronny obraz relacji między ORF a 3' UTR. Jest to dodatek do identyfikacji sygnału poliadenylacji (PAS), a także miejsca rozszczepienia i poliadenylacji zapewnianego przez konwencjonalny 3' RACE. Rozszerzony 3' RACE może wykrywać nietypowe 3'UTR, w tym fuzje genów w obrębie 3' UTR, a informacje o sekwencji można wykorzystać do przewidywania potencjalnych miejsc wiązania miRNA, a także bogatych w AU elementów destabilizujących, które mogą wpływać na stabilność transkryptu.

Introduction

Tworzenie końca 3' jest krytycznym etapem dojrzewania mRNA, który obejmuje rozszczepienie pre-mRNA poniżej PAS, a następnie dodanie ~250 nieszablonowych adenin, które tworzą ogon poli(A)^1,2. Białko wiążące poli(A) (PABP) wiąże się z ogonem poli(A), co chroni transkrypt mRNA przed degradacją i ułatwia translację¹.

Obecne szacunki sugerują, że 70% ludzkich genów ma wiele PAS, a zatem ulega alternatywnej poliadenylacji, co skutkuje wielokrotnymi końcami 3'³. Dlatego ważne jest, aby określić, gdzie ogon poli(A) przyczepia się do reszty 3' UTR, a także zidentyfikować PAS używany przez dany transkrypt. Pojawienie się sekwencjonowania nowej generacji spowodowało jednoczesną identyfikację 3' UTR i PA tysięcy genów. Ten wzrost możliwości sekwencjonowania wymagał opracowania algorytmów bioinformatycznych do analizy danych obejmujących alternatywną poliadenylację końca 3'. Do wykrywania de novo lub walidacji PAS, a tym samym mapowania końca 3' poszczególnych genów na podstawie danych sekwencjonowania na dużą skalę, metodą z wyboru pozostaje 3' RACE^4,5. Sekwencje zawarte w produktach cDNA 3' RACE zwykle obejmują tylko część 3' UTR, która zawiera ogon poli(A), miejsce rozszczepienia, PAS i sekwencje przed PAS. W przeciwieństwie do PCR, który wymaga zaprojektowania i użycia specyficznych dla genu starterów do przodu i do tyłu, 3' RACE wymaga tylko dwóch specyficznych dla genu zagnieżdżonych starterów do przodu. W związku z tym PCR wymaga bardziej szczegółowej wiedzy na temat sekwencji nukleotydowej dużego regionu amplifikowanego genu^4,6. Ponieważ 3' RACE wykorzystuje ten sam odwrotny starter, który celuje w ogon poli(A) dla wszystkich poliadenylowanych transkryptów RNA, tylko startery do przodu muszą być specyficzne dla genu, co wymaga jedynie wiedzy o znacznie mniejszym regionie mRNA. Umożliwia to amplifikację regionów, których sekwencje nie są w pełni scharakteryzowane^4,7. Pozwoliło to na wykorzystanie 3' RACE nie tylko do określenia końca 3' genu, ale także do określenia i scharakteryzowania dużych regionów przed PAS, które stanowią znaczną część 3' UTR. Łącząc 5' RACE ze zmodyfikowanym 3' RACE, który zawiera większe części 3' UTR i regiony flankujące, możliwe jest pełne zsekwencjonowanie lub sklonowanie całego transkryptu mRNA od końca 5' do końca 3' ⁸.

Przykładem tego zastosowania zmodyfikowanego 3' RACE jest niedawna identyfikacja nowego transkryptu genu fuzji CCND1-MRCK z linii komórkowych chłoniaka z komórek płaszcza i pacjentów z rakiem. 3' UTR składał się z sekwencji zarówno z genów CCND1, jak i MRCK i był odporny na regulację miRNA⁹. Dwa zagnieżdżone startery skierowane do przodu specyficzne dla CCND1 były komplementarne z obszarem bezpośrednio przylegającym i poniżej kodonu stop CCND1. Chociaż sekwencjonowanie całego transkryptomu wraz ze specyficznymi narzędziami bioinformatycznymi może być wykorzystane do wykrywania fuzji genów w obrębie klasy 3' UTR10, wielu laboratoriom może brakować środków finansowych lub wiedzy bioinformatycznej, aby skorzystać z tej technologii. W związku z tym 3' RACE stanowi alternatywę dla identyfikacji de novo i walidacji nowych genów fuzyjnych z udziałem 3' UTR. Biorąc pod uwagę drastyczny wzrost liczby zgłoszonych genów fuzyjnych, a także odczytanych transkryptów, 3' RACE stał się potężnym narzędziem do charakteryzowania sekwencji genów^11,12. Ponadto ostatnie badania wykazały, że różne sekwencje w obrębie 3' UTR, jak również długość 3' UTR, mogą wpływać na stabilność transkryptu mRNA, lokalizację, translatywalność i funkcję¹³. Częściowo ze względu na zwiększone zainteresowanie mapowaniem transkryptomu, nastąpił wzrost liczby różnych polimeraz DNA opracowywanych do użytku w laboratorium. Ważne jest, aby określić, jakie rodzaje modyfikacji można wprowadzić do protokołu 3' RACE, aby wykorzystać dostępny repertuar polimeraz DNA.

Ta praca informuje o adaptacji 3' RACE do mapowania całego 3' UTR, PAS i miejsca cięcia końca 3' transkryptu ANKHD1 za pomocą zagnieżdżonych starterów w sekcji ANKHD1 transkryptu i dwóch różnych polimeraz DNA.

Protocol

Noś fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne przez cały czas podczas wykonywania wszystkich procedur w tym protokole. Upewnij się, że pojemniki/probówki zawierające odczynnik izotiocyjanianu fenolu i guanidyny są otwierane wyłącznie w certyfikowanym kapturze, a odpady fenolowe należy wyrzucać do przeznaczonego do tego pojemnika. Używaj sterylnych probówek, końcówek i odczynników wolnych od DNAzy/RNAzy.

1. Hodowla komórkowa

1. Hoduj linię komórkową HeLa i dwie linie komórkowe chłoniaka z komórek płaszcza zawiesinowego, Granta-519 i Jeko-1, w DMEM zawierającym 10% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny w wilgotnym inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10 i policzyć za pomocą licznika cząstek¹⁴.
2. W celu ekstrakcji RNA umieść 500 000 komórek/studzienkę na płytce 6-dołkowej (2 ml pożywki na dołek). Po inkubacji przez 24 godziny należy pobrać RNA z komórek.

2. Ekstrakcja RNA

1. Komórki do pobierania
   UWAGA: Z wyjątkiem etapu wirowania, należy wykonać wszystkie wymienione kroki w okapie do hodowli tkankowych, aby zachować sterylność.
   1. Dla komórek zawiesinowych (Jeko-1 i Granta-519):
      1. Przenieść komórki (razem z 2 ml pożywki) do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1,725 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i pozostawić osad komórek na dnie probówki.
      2. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 500 μl jednofazowego odczynnika izotiocyjanianu fenolu i guanidyny do każdej próbki w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dobrze wymieszaj i pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) na 5 minut, odwracając probówkę mikrowirówki co 1 minutę.
   2. Dla komórek adherentnych (HeLa):
      1. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z każdej studzienki. Dodaj 1 ml PBS do każdej studzienki, aby zmyć zanieczyszczenia.
      2. Usunąć PBS i dodać 500 μl jednofazowego odczynnika izotiocyjanianu fenolu i guanidyny do każdej studzienki.
      3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, delikatnie kołysząc. Przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
2. Liza komórek
   1. Zamrażać mieszaninę komórek fenolu i izotiocyjanianu guanidyny w temperaturze -20 °C przez 1 h.
      UWAGA: Mieszankę można pozostawić w temperaturze -20 °C na noc lub do momentu, gdy będzie potrzebna.
   2. Rozmrozić mieszaninę komórek fenolu i izotiocyjanianu guanidyny na lodzie. Dodać 100 μl chloroformu do probówki mikrowirówkowej w kapturze do PCR. Wirować próbkę przez 10 - 15 s, aż mieszanina stanie się różowa i nieprzezroczysta. Inkubować próbkę na lodzie (w temperaturze 4 °C) przez 15 minut.
   3. Odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 20 800 x g i temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć górną bezbarwną fazę wodną (~ 200 μl) i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
3. Wytrącanie RNA
   1. Dodać równą objętość izopropanolu do każdej próbki. Dodaj 1 μl współprecypitentu (patrz tabela materiałów) do każdej próbki, aby działał jako nośnik RNA i pomagał w wizualizacji RNA w kolejnych krokach. Inkubować próbkę w temperaturze -80 °C przez co najmniej 4 godziny. Aby uzyskać najlepsze wyniki, inkubować przez noc w temperaturze -80 °C.
   2. Przenieść próbkę do schłodzonej wirówki. Wirować przez 35 minut w temperaturze 20 800 x g / 4 °C; RNA pojawi się jako niebieska plamka na dnie probówki. Ostrożnie usunąć izopropanol z próbki. Dodaj 500 μl 80% etanolu i ponownie zawieś granulkę, krótko wirując przez 3 s.
   3. Odwirować próbkę o sile 20 800 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć cały etanol z próbki. Pozostawić próbkę do wyschnięcia na powietrzu przez około 10 minut. Zawiesić próbkę w 35 μl wody wolnej od RNAse. Umieścić na bloku grzewczym (65 °C) na 5 minut, aby upewnić się, że RNA jest całkowicie w roztworze, a następnie natychmiast umieścić probówkę na lodzie.
   4. Określić stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru, jak opisano wcześniej, z wyjątkiem użycia 1,5 μl próbki RNA zamiast 1 μL¹⁵. Opcjonalnie uruchom 1 μg całkowitego RNA na 1% żelu agarozowym, aby określić integralność RNA.

3. Leczenie DNazy

1. Po kwantyfikacji RNA należy przeprowadzić obróbkę DNAzy na całkowitym RNA, aby zdegradować dowolne genomowe DNA. Do każdej próbki dodać następujące odczynniki z zestawu DNAzy bez RNAzy, aby uzyskać 20 μl całkowitej mieszaniny reakcyjnej w oddzielnej probówce do mikrowirówki:
   1. Wymieszać 2 μl buforu reakcyjnego DNazy 10X z 4,4 μg całkowitego RNA. Uzupełnić wodą do 14 μl.
   2. Dodać 2 μl DNA wolnego od RNaz. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w obecności 2 μl inhibitora RNazy (z zestawu do odwrotnej transkrypcji).
   3. Dodać 2 μl roztworu zatrzymującego i podgrzewać na bloku grzewczym przez 10 minut w temperaturze 70 °C, aby dezaktywować enzym DNAza.
      UWAGA: Leczenie DNAzy jest opcjonalne.

4. Synteza cDNA

Dla końcowej objętości reakcyjnej 50 μL:

1. Dla końcowej objętości reakcyjnej 50 μl: Przenieść 22 μl RNA poddanego działaniu DNazy do nowej probówki lub przenieść 4 μg całkowitego RNA z dodatkiem wody do całkowitej objętości 22 μl do nowej probówki. Dodać 2 μl startera T7 oligo dT₂₅ z 10 μM roztworu startera. Sekwencja startera T7 oligo dT₂₅ to 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
2. Z zestawu do odwrotnej transkrypcji dodaj 2 μl inhibitora RNazy (20 U/μL), 8 μL 5x buforu reakcyjnego, 4 μL 10 mM dNTP i 2 μL odwrotnej transkryptazy (200 U/μL).
   UWAGA: Ustaw reakcję bez odwrotnej transkryptazy, aby działała jako kontrola ujemna.
3. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 1 godzinę. Przenieść bezpośrednio do lodu. Podgrzej probówkę w temperaturze 75 °C przez 5 minut i umieść probówkę na lodzie.

5. Podstawowe poszukiwanie transkryptu genu fuzyjnego

1. Wzór podkładu
   1. Pobierz sekwencję cDNA z przeglądarki genomu Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) i zidentyfikuj region w ORF docelowego transkryptu (ANKHD1) przed kodonem stop. Skopiuj i wklej cały region (do 700 nukleotydów) zawierający sekwencje przed kodonem stop do obszaru wprowadzania sekwencji w oprogramowaniu do projektowania starterów ().
   2. Wybierz opcję pokaż projekt niestandardowy i wybierz 10 dla liczby starterów, które system powinien wygenerować (wyniki do zwrócenia) i pozostaw wszystkie inne parametry ustawione na domyślne.
   3. Wybierz pięć starterów do przodu i dwa startery odwrotne, które nie zachodzą na siebie. Uporządkować startery i rozpuść w wodzie wolnej od RNAzy/DNAzy do końcowego stężenia 10 μM. Więcej szczegółów na temat ogólnego projektu startera do PCR znajduje się w innym miejscu¹⁶.
2. PCR w celu identyfikacji potencjalnych starterów do użycia w kolejnych 3' RACE
   UWAGA: Aby określić końcowe startery do przodu do użycia w reakcji, przetestuj zaprojektowane startery, ustawiając różne kombinacje starterów do przodu i do tyłu dla zwykłego PCR w kapturze PCR.
   1. Przenieś cDNA (2 μl) do świeżej probówki PCR o pojemności 0,5 ml. Dodać 1 μl startera do przodu i 1 μl startera do tyłu (z 10 mM roztworu startera). Uzupełnić do 12,5 μl, dodając 8,5 μl wody wolnej od nukleaz. Dodać 12,5 μl 2x PCR-to-Gel Master Mix.
   2. Stosować następujące warunki cykli termicznych PCR: 95 °C przez 2 minuty, a następnie 29 cykli po 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min. Ustaw ostatni cykl na 68 °C na 7 min.
   3. Po PCR uruchom produkty na 1% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. Szczegóły elektroforezy są opisane wcześniej, z kilkoma modyfikacjami¹⁷.
      1. Rozpuścić 1 g agarozy w 100 ml buforu tris-acetatu (TAE) w kolbie o pojemności 250 ml. Gotować w kuchence mikrofalowej.
      2. Pozostaw do ostygnięcia na 1 minutę i dodaj 7,5 μl roztworu bromku etydyny (10 mg/ml bulionu) do dygestorium. Dobrze wymieszać, obracając kolbę i wlać do poziomego aparatu żelowego. Pozostawić w temperaturze pokojowej w dygestorium na co najmniej 30 minut, aby żel zastygł.
      3. Przykryj żel 1x buforem TAE i załaduj 10 μl produktu PCR na żel agarozowy wraz z 3 - 5 μl drabinki masy cząsteczkowej DNA. Praca pod napięciem 175 V przez 10 minut. Wizualizację produktów za pomocą imagera, a jeśli potrzebna jest dalsza separacja produktów, uruchom żel na dodatkowe 5 - 10 minut.
3. Wybór zagnieżdżonych podkładów do 3' RACE
   1. Przeanalizuj wyniki żelu agarozowego PCR, aby wybrać startery, które mają wyraźne, mocne, pojedyncze pasmo PCR. Użyj najbardziej 5'-najbardziej spłonkowego (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') razem ze starterem T7 oligodT₂₅ w pierwszym przebiegu PCR.
   2. Wybierz zagnieżdżony starter, który znajduje się za pierwszym starterem (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTAATCT-3') i użyj go ze starterem T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') w drugim zestawie reakcji PCR.

6. Optymalizacja 3' RACE do mapowania 3' UTR przy użyciu dwóch różnych enzymów

UWAGA: Nastąpił wzrost różnorodności polimeraz DNA używanych do PCR; dlatego chcieliśmy określić standardowe warunki, które mogą być stosowane nawet przy użyciu różnych enzymów w reakcjach 3' RACE PCR. Odwrotne startery dla dowolnego transkryptu są utrzymywane na stałym poziomie; Jedyne zmiany dotyczą zagnieżdżonych starterów do przodu, które są specyficzne dla docelowego transkryptu.

1. Protokół 1: 3' RACE przy użyciu zmodyfikowanej polimerazy DNA z Pyrococcus furiosus (Pfu)
   1. Pierwszy PCR
      1. Przenieś 1 μl cDNA do probówki PCR i dodaj 5 μl 10x buforu reakcyjnego Pfu. Dodać 1 μl pierwszego zagnieżdżonego startera do przodu, 1 μl startera T7 oligodT₂₅ i 1 μl dNTP (z 10 mM roztworu).
      2. Uzupełnić do 49 μl całkowitej objętości, dodając 40 μl wody. Dodać 1 μl polimerazy DNA Pfu i dobrze wymieszać. Uruchom PCR, używając profilu PCR w Tabeli 1.
   2. Drugi PCR
      1. Przenieść 2 μl produktów z pierwszego PCR do nowej probówki PCR i wymieszać z 5 μl 10x buforu reakcyjnego PfuUltra II. Dodać 1 μl drugiego zagnieżdżonego startera PCR, 1 μl startera T7 i 1 μl dNTP (10 mM roztworu).
      2. Uzupełnić do 49 μl całkowitej objętości reakcyjnej, dodając 39 μl wody. Dodać 1 μl polimerazy DNA Pfu. Uruchom PCR przy użyciu tego samego profilu PCR, co pierwsza konfiguracja PCR (Tabela 1).
2. Protokół 2: 3' RACE przy użyciu chimerycznej polimerazy DNA składającej się z domeny wiążącej DNA połączonej z mieszanką wzorcową polimerazy PCR podobną do Pyrococcus
   1. Pierwszy PCR
      1. Przenieś 1 μl cDNA do probówki PCR. Dodać 1 μl pierwszego zagnieżdżonego startera do przodu i 1 μl startera T7 oligodT₂₅. Uzupełnić do 25 μl, dodając 22 μl wody.
      2. Dodaj 25 μL 2x PCR Master Mix i dobrze wymieszaj. Należy stosować warunki cykliczne PCR opisane w tabeli 2.
   2. Drugi PCR
      1. Przenieś 2 μl produktów z pierwszego PCR do nowej probówki PCR. Dodać 1 μl drugiego zagnieżdżonego startera PCR razem z 1 μl startera odwrotnego T7.
      2. Uzupełnić do 25 μl, dodając 22 μl wody. Dodaj 25 μL 2X PCR Master Mix. Uruchom PCR przy użyciu tego samego profilu PCR, co pierwsza konfiguracja PCR (Tabela 2).

7. Sprawdź drugi produkt PCR 3' RACE.

1. Weź 5 - 10 μl drugiego produktu PCR (a także produkt z pierwszej rundy PCR, jeśli transkrypt jest obficie wyrażony) i uruchom na żelu agarozowym. Ustawić żel i uruchomić elektroforezę zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki od 5.2.3.1 do 5.2.3.3). Wizualizacja wyników na imagerze.

8. Oczyszczanie i sekwencjonowanie produktu

1. Oczyść żelowe produkty PCR z drugiego PCR za pomocą systemu oczyszczania fragmentu DNA w żelu i PCR zgodnie z protokołem producenta.
2. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera (alternatywnie wyślij oczyszczone w żelu próbki produktu PCR i odpowiednie startery sekwencjonowania do laboratorium sekwencjonowania). Przeanalizuj dane sekwencjonowania po sekwencjonowaniu Sangera.
3. Pobierz oprogramowanie do analizy sekwencji (patrz tabela materiałów) i zaimportuj pliki śledzenia do oprogramowania. Użyj indywidualnych podstawowych wartości QV (wartości jakości) PURE, aby uzyskać informacje o wywołaniu podstawowym¹⁸. Pobierz chromatogram z wysokiej jakości śladami do oglądania.
   Opcjonalnie: Produkt oczyszczony żelem można sklonować za pomocą odpowiedniego zestawu do klonowania, a izolowane klony wysłać do sekwencjonowania metodą Sangera.

Results

Zagnieżdżone wyszukiwanie w przyszłości:

Żel agarozowy od Rysunek 1 pokazuje dwa różne produkty żelowe do PCR (Pasy 1 i 2), które używają tego samego startera do przodu, ale różnych starterów odwrotnych. Tor 3 ma wyraźny produkt PCR i ma wyraźny starter do przodu i do tyłu. Idealnymi starterami do użycia w reakcji opartej na PCR są te, które dają jeden odrębny produkt PCR (tor 3). Star...

Discussion

Pomimo pojawienia się masowych technologii sekwencjonowania równoległego, na podstawie genu po genie, 3' RACE nadal pozostaje najłatwiejszą i najbardziej ekonomiczną metodą identyfikacji PAS i nukleotydów sąsiadujących z ogonem poli(A). Opisana tutaj adaptacja rozszerza się przy użyciu 3' RACE zarówno do amplifikacji, jak i mapowania sekwencji, które zawierają część ORF, kodon stop i cały 3' UTR transkryptu mRNA ANKHD1. Główną zaletą 3' RACE jest to, że po kilku drobnych adaptacjach, produkty z 3' RACE mogą być ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komórki HeLa	ATCC	CCL-2	Linia komórkowa raka szyjki macicy.
Komórki Jeko-1	ATCC	CRL-3006	Linia komórkowa chłoniaka z komórek płaszcza.
Granta-519 komórki	DSMZ	ACC-342	Linia komórkowa chłoniaka z komórek płaszcza.
Płodowa surowica bydlęca	Sigma Aldrich	F6178	Płodowa surowica bydlęca do hodowli komórkowych.
Penicylina/Streptomycyna	ThermoFisherScientific	15140122	Antybiotyk i środek przeciwgrzybiczy.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	pożywka do hodowli komórkowych marki Gibco z GlutaMAX.
Woda wolna od nukleaz	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion Woda wolna od DNazy i RNAzy (bez obróbki DEPC).
Dulbecco' s Roztwór buforowany fosforanami	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Odczynnik Alkohol	Sigma Aldrich	793175	Etanol
Etydyna Roztwór bromku	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol	ThermoFisherScientific	15596026	Monofazowy odczynnik izotiocyjanianu fenolu i guanidyny.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  zawierający barwnik obciążający stosowany w rutynowych szybkich testach PCR i poszukiwaniu starterów.
10mM dNTP	Amresco	N557
Zestaw do leczenia dnazy	bez RNaz	Promega	M6101
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix zawierający chimeryczną polimerazę DNA składającą się z domeny wiążącej DNA połączonej z polimerazą korekcyjną podobną do Pyrococcus i innymi odczynnikami.
Polimeraza DNA PfuUltra II Fusion HS	Agilent Technologies	600670	Zmodyfikowana polimeraza DNA z Pyrococcus furiosus (Pfu).
Zestaw do odwrotnej transkrypcji RevertAid RT	Thermo Fischer	K1691	Służy do  odwrotnej transkrypcji mRNA na  syntezę cDNA. Zestaw zawiera  Inhibitor RNAzy rybolocku, odwrotna transkryptaza M-MuLV RevertAid i inne odczynniki wymienione w manuskrypcie.
Idealna drabinka o rozmiarze 1Kb	5 Prime	2500360	Drabinka DNA o masie cząsteczkowej.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Służy do wizualizacji żelu agarozowego barwionego bromkiem etydyny.
Drabina o niskiej masie cząsteczkowej	New England BioLabs	N3233L	Drabinka DNA o masie cząsteczkowej.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini wirówka	MidSci	C1008-R
Sucha kąpiel	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spektrofotometr.
Szeroki Mini-Sub  System elektroforezy poziomej Cell GT	BioRad	1704469	Sprzęt do elektroforezy - aparatura do konfiguracji żelu
PowerPac Basic Power Supply	Zasilacz BioRad	1645050	do elektroforezy żelowej.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	termocykler PCR.
Wirówka	Eppendorf	5810 R
Wirówka	Eppendorf	5430R
Wizard SV Żel i system oczyszczania fragmentów DNA PCR	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Klonowanie Kit, z One Shot  TOP10 Chemicznie kompetentnych komórek E. coli	ThermoFisherScientific	K280020
Stacja przygotowania MyPCR Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Kaptur dedykowany do pracy PCR.
Dygestoria Hamilton SafeAire II	ThermoFisherNaukowy		dygestorium.
Beckman Coulter Z1  Cząstka  Licznik	Beckman Coulter	6605698	Licznik cząstek. Do liczenia komórek przed poszyciem  do ekstrakcji RNA.
Oprogramowanie Applied Biosystems Sequence Scanner v2.0	Applied Biosystems (przez ThermoFisherScientific)		Oprogramowanie do analizy danych sekwencjonowania Sangera.