Charakterystyka komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej człowieka za pomocą cytometrii przepływowej

Summary

Ten artykuł opisuje metodę analizy zawartości komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej poprzez izolację komórek odpornościowych z tkanki tłuszczowej i późniejszą analizę za pomocą cytometrii przepływowej.

Abstract

Infiltracja komórek odpornościowych w podskórnych i trzewnych złogach tkanki tłuszczowej (AT) prowadzi do stanu zapalnego o niskim stopniu nasilenia, przyczyniając się do rozwoju powikłań związanych z otyłością, takich jak cukrzyca typu 2. Aby ilościowo i jakościowo zbadać podzbiory komórek odpornościowych w ludzkich złogach AT, opracowaliśmy podejście oparte na cytometrii przepływowej. Frakcja naczyniowa zrębu (SVF), zawierająca komórki odpornościowe, jest izolowana z biopsji podskórnych i trzewnych AT przez trawienie kolagenazą. Adipocyty są usuwane po odwirowaniu. Komórki SVF są barwione pod kątem wielu markerów związanych z błoną, wybranych do różnicowania podzbiorów komórek odpornościowych i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. W wyniku tego podejścia można wykryć i określić ilościowo podzbiory makrofagów pro- i przeciwzapalnych, komórki dendrytyczne (DC), limfocyty B, limfocyty T CD4⁺ i CD8⁺ oraz komórki NK. Ta metoda dostarcza szczegółowych informacji o komórkach odpornościowych w AT i ilości każdego określonego podzbioru. Ponieważ dostępnych jest wiele przeciwciał fluorescencyjnych, nasze podejście do cytometrii przepływowej można dostosować do pomiaru różnych innych markerów komórkowych i wewnątrzkomórkowych.

Introduction

Otyłość charakteryzuje się stanem zapalnym o niskim stopniu nasilenia¹ i infiltracją prozapalnych komórek odpornościowych zarówno w trzewnym, jak i podskórnym AT (vAT, sAT). Nagromadzenie prozapalnych komórek odpornościowych w vAT prowadzi do insulinooporności, która jest głównym czynnikiem ryzyka rozwoju cukrzycy typu 2². Komórki odpornościowe zarówno wrodzonego, jak i nabytego układu odpornościowego znajdują się w otyłych AT, takich jak makrofagi, komórki tuczne, neutrofile, limfocyty T CD4 ⁺ i CD8 ⁺ oraz limfocyty B^3,4,5,6,7. Te komórki odpornościowe, wraz z komórkami śródbłonka, komórkami zrębu, progenitorami adipocytów, fibroblastami i perycytami, tworzą SVF⁸ i są głównym źródłem substancji prozapalnych w klasie AT9.

Stan zapalny AT jest powszechnie badany za pomocą takich technik, jak Western blot¹⁰, qPCR¹¹, oraz immunohistochemistry¹¹. Jednak przy stosowaniu tych technik wykorzystuje się całe AT, adipocyty i SVF. Utrudnia to określenie ilości i podzbiorów komórek odpornościowych obecnych w AT. Komórki odpornościowe mają różne markery komórkowe, które je definiują i kategoryzują, takie jak makrofagi. Makrofagi wykazują znaczną niejednorodność zarówno pod względem funkcji, jak i ekspresji markera powierzchni komórki¹². Dlatego często dzieli się je na dwie populacje makrofagów: M1 i M2. Makrofagi M2 są zwykle nazywane alternatywnie aktywowanymi makrofagami^12,13 i znajdują się w AT szczupłych, metabolicznie normalnych ludzi¹⁴. Jednak podczas otyłości następuje fenotypowy przełącznik z makrofagów M2 na makrofagi M1. Te klasycznie aktywowane makrofagi M1 wyrażają CD11C¹² i gromadzą się wokół martwych adipocytów, tworząc struktury przypominające koronę¹³. Wykazano, że makrofagi CD11C⁺ w AT upośledzają działanie insuliny i są związane z insulinoopornością u otyłych ludzi¹⁵. Aby zidentyfikować makrofagi M1 i M2 w AT, opcjonalnie dostępna jest immunohistochemia. Technika ta dostarcza informacji o lokalizacji makrofagów w tkance. Ograniczy to jednak liczbę markerów, które można użyć w jednym barwieniu. Co więcej, jest to również trudne do oszacowania. Dlatego, aby zbadać różne podzbiory komórek odpornościowych w złogach vAT i sAT, opracowaliśmy podejście oparte na cytometrii przepływowej. Takie podejście daje nam możliwość wykorzystania wielu markerów na komórkę z jedną analizą cytometrii przepływowej w celu zdefiniowania podzbiorów komórek i zliczenia liczby każdego podzbioru obecnego w osadach AT.

Protocol

Trzewne i podskórne próbki AT zostały pobrane od osób włączonych do badania zatwierdzonego przez Komisję Etyki Medycznej Jessa Hospital, Hasselt, oraz Hasselt University, Belgia, zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Przygotowanie odczynników

1. Roztwór kolagenazy
   1. Rozpuścić 1 g kolagenazy I w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, bez wapnia i magnezu) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 100 mg/ml. Przygotować 200 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Rozpuścić 1 g kolagenazy XI w 10 ml PBS, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 100 mg/ml. Przygotować 200 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   3. Rozpuścić 10 mg DNazy I w 10 ml PBS, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 10 mg/ml. Przygotować 180 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   4. Dodaj 100 μl kolagenazy I (100 mg / ml), 100 μl kolagenazy XI (100 mg / ml) i 90 μl DNazy I (10 mg / ml) do 10 ml F12 DMEM Ham. Spraw, aby roztwór kolagenazy był świeży dla każdej izolacji.
2. Bufor do lizy erytrocytów
   1. Rozpuścić 0,84 g NH₄Cl w 100 ml ultraczystej wody.
   2. Przed użyciem ustaw pH na 7,4. Przechowywać w szklanej kolbie w temperaturze 4 °C.
   3. Przed użyciem umieścić bufor do lizy erytrocytów na lodzie.
3. Bufor FACS
   1. Rozpuścić 0,5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 100 ml PBS, aby uzyskać 0,5% BSA PBS.
   2. Rozpuścić 65 mg NaN₃ w 100 ml 0,5% BSA PBS, aby otrzymać 10 mM NaN₃ 0,5% BSA PBS. Przechowywać roztwór w szklanej kolbie w temperaturze 4 °C.
   3. Przed użyciem umieścić bufor FACS na lodzie.
      UWAGA: NaN₃ jest wysoce toksyczny. Pracuj pod wyciągiem i noś okulary ochronne i rękawice ochronne dla ochrony podczas obsługi NaN₃.
4. Ludzki blok IgG
   1. Rozpuścić 10 mg ludzkiej IgG w 10 ml PBS, aby uzyskać 1 mg/ml. Przygotować 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Przed użyciem umieść ludzki blok IgG na lodzie.

2. Izolacja SVF od AT

1. Pokrój 1 g biopsji AT na małe kawałki (± 2^mm2) za pomocą skalpela i przenieś do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (np. probówki Falcona). Dodać 10 ml roztworu kolagenazy do każdej próbki AT.
   UWAGA: Całkowicie zamknij pokrywę tubki i przekręć pokrywę o 1/4 obrotu z powrotem.
2. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej pod delikatnym wstrząsaniem (60 cykli/min).
3. Przefiltrować otrzymaną zawiesinę za pomocą filtra 200 μM i zebrać próbkę w nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj 7 ml PBS na wierzch filtra, aby przepłukać filtr i uzyskać wszystkie komórki.
4. Odwirować próbkę o masie 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
5. Usunąć pływającą frakcję adipocytów przez pipetowanie. Osad komórkowy to SVF.
   UWAGA: Usuń frakcję adipocytów, aby uzyskać SVF. Unikaj zanurzania całej końcówki w próbce, ponieważ spowoduje to usunięcie tylko PBS, a nie pływających adipocytów.
6. Zawiesić SVF w 5 ml PBS w celu usunięcia kolagenazy, przefiltrować zawiesinę za pomocą filtra 70 μM, przepłukać filtr 5 ml PBS i odwirować próbkę przy 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml buforu do lizy erytrocytów.
8. Inkubować przez 5 minut na lodzie. Dodać 7 ml PBS po inkubacji.
9. Odwirować próbkę o masie 280 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.

3. Barwienie SVF do analizy cytometrii przepływowej

1. Rozpuścić osad komórkowy w 90 μl buforze FACS o temperaturze 4 °C i dodać 10 μl bloku ludzkiej IgG o stężeniu 1 mg/mL. Podziel zawiesinę komórek na 2 dołki płytki dołkowej w kształcie litery V o średnicy 96 litrów. Umieścić płytkę na lodzie i pozostawić ludzki blok IgG do inkubacji przez 15 minut.
2. Dodać 100 μl buforu FACS do każdej próbki, aby przepłukać i odwirować płytkę przez 5 minut z 280 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, przechylając płytkę do góry nogami jednym płynnym ruchem, bez stukania w płytkę.
   UWAGA: Upewnij się, że pozostał płyn został usunięty z górnej części płytki za pomocą chusteczki, trzymając płytkę do góry nogami.
3. Przygotować koktajle przeciwciał dla podzbiorów makrofagów i DC (panel FACS 1) oraz dla podzbiorów limfocytów T i B (panel FACS 2), jak opisano w Tabeli 1 i Tabeli 2. Objętości opisane w Tabeli 1 i Tabeli 2 są wybierane po optymalizacji stężeń przeciwciał i są wystarczające dla jednej próbki vAT lub sAT.
   UWAGA: W panelu FACS 1 użyj znaczników CD303 i CD141, aby potwierdzić, że^niskie ogniwa CD11C⁺ CD11B są DC. Zaleca się jednak wykluczenie tych markerów z panelu, aby uwzględnić barwienie żywe/martwe. Zarówno panel 1, jak i 2 FACS można połączyć z zestawem do barwienia żywotności LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit, gdy wykluczysz CD303 w panelu 1, ponieważ kanał PE będzie nieużywany. Wykonaj barwienie żywotności zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Ponownie zawiesić osad w koktajlu przeciwciał o pojemności 29,5 μl dla panelu FACS 1 i koktajlu przeciwciał o pojemności 23 μl dla panelu FACS 2. Inkubować przez 30 minut w ciemności na lodzie.
5. Dodać 150 μl buforu FACS do każdej studzienki i ponownie zawiesić osad komórkowy, aby wykonać drugi etap płukania. Odwirować płytkę przez 5 minut w temperaturze 280 x g i temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, przechylając płytkę do góry nogami.
6. Dodaj 150 μl 1% roztworu formaldehydu do każdej studzienki, aby utrwalić komórki. Przenieść zawiesinę komórek z każdej studzienki do odpowiedniej probówki FACS, pipetując pipetą P200. Probówki FACS należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do 7 dni.
   UWAGA: Możliwy jest również pomiar bezpośredni. Dodać 150 μl buforu FACS do każdej studzienki zamiast 1% formaldehydu, przenieść komórki przez pipetowanie pipetą P200 do odpowiednich probówek FACS i przeanalizować komórki.
   UWAGA: Formaldehyd jest bardzo toksyczny. Podczas pracy w dygestoriach należy przygotowywać roztwory formaldehydu, aby uniknąć wdychania, a w celu ochrony należy nosić rękawice i okulary ochronne.

4. Analiza cytometrii przepływowej

1. Przed pierwszym pomiarem należy użyć niebarwionej kontroli ujemnej, aby ustawić rozproszenie do przodu (FSC) i rozproszenie boczne (SSC). Dostosuj napięcia cytometru przepływowego zgodnie z instrukcjami producenta, tak aby wszystkie interesujące nas populacje były widoczne na wykresie FSC i SSC i można było dokonać rozróżnienia między szczątkami a żywymi komórkami.
2. Wykonaj analizę kompensacji wielobarwnej za pomocą kulek wychwytujących przeciwciała zgodnie z protokołem producenta.
3. Przygotować kontrole fluorescencji minus jeden (FMO), sporządzając mieszaninę przeciwciał, ale wyłączając jedno przeciwciało z mieszanki. Zrób to dla każdego przeciwciała, tworząc 8 mieszanin przeciwciał dla panelu FACS 1 i 6 mieszanin przeciwciał dla panelu FACS 2. Te mieszaniny przeciwciał FMO są używane do barwienia SVF, jak opisano wcześniej w tym protokole.
4. Zmierz wszystkie kontrolki FMO i ustaw strategię bramkowania na podstawie kontroli FMO. Użyj kontrolek FMO, aby wykryć możliwą autofluorescencję komórek.
   UWAGA: Usuwając jedno przeciwciało z mieszanki, każdy poziom fluorescencji wykryty w tym kanale jest sygnałem tła/autofluorescencyjnym. W związku z tym, porównując różne wyniki FACS kontroli FMO, bramki można narysować na określonych populacjach, zapewniając, że bramki są oparte na komórkach dodatnich, a nie na autofluorescencji.
5. Wirować rurki FACS z prędkością 800 obr./min przed umieszczeniem ich w cytometrze przepływowym i rozpoczęciem pomiaru.
   UWAGA: Zaleca się co najmniej 50 000 zdarzeń w bramce na żywo, aby upewnić się, że mierzona jest wystarczająca liczba komórek z każdej subpopulacji.

Results

SVF wyizolowany z vAT i sAT został zmierzony za pomocą cytometrii przepływowej. Pomiary cytometrii przepływowej generują wykresy przedstawiające różne populacje komórek w oparciu o markery komórkowe (Rysunek 1A i 1B). Po pierwsze, poprzez wykreślenie szerokości rozproszenia do przodu (FSC-W) i obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A), agregacje komórek można wyeliminować z dalszej analizy poprzez bramkowanie pojedynczych komórek jako o niskim FSC-W. Następnie wybierane są żywe komórki, a resztki komórkowe są wykluczane poprzez bramkowanie komórek o odpowiednim rozmiarze i złożoności za pomocą odpowiednio FSC-A i obszaru rozpraszania bocznego (SSC-A). Martwe komórki są małe i dlatego są widoczne jako odrębna populacja z małym FSC-A. Następnie komórki odpornościowe wybrano za pomocą markera panleukocytów CD45 (Panel 1 i 2, Figura 1A). Aby przeanalizować makrofagi, inne komórki odpornościowe, takie jak limfocyty T (CD3), limfocyty B (CD19), neutrofile (CD66b ⁺ CD11b ⁺) i komórki NK (CD56) zostały wykluczone z dalszej analizy przy użyciu odrębnych przeciwciał skierowanych przeciwko tym komórkom, ale z tym samym fluorochromem. Dalsza podział pozostałych komórek opierała się na ekspresji CD11b i CD11c. W rezultacie uzyskano następujące populacje: makrofagi CD11b⁺, makrofagi CD11b⁺CD11c- i CD11b^{o niskim / -} CD11c⁺ DC (panel FACS 1, Figura 1B). Pomiar średniej intensywności fluorescencji (MFI) pozwolił na ilościowe określenie ekspresji CD303 (plazmocytoidowy marker DC) i CD141 (marker DC) na makrofagach CD11b⁺ CD11c⁺ i CD11b^low/- CD11c⁺ DCs. Ekspresja obu tych markerów była wyższa w komórkach CD11b^low/- CD11c⁺, potwierdzając, że komórki CD11b^low/- CD11c⁺ były DCs (Figura 1C).

Komórki CD45⁺ (Rysunek 1A) zostały podzielone na limfocyty T i B, używając odpowiednio CD3 i CD19. Limfocyty T podzielono na limfocyty pomocnicze T (CD4⁺) i cytotoksyczne limfocyty T (CD8⁺). Na koniec komórki CD3-CD19 wykreślono w celu ilościowego określenia komórek NK za pomocą markera CD56 (panel FACS 2, Rysunek 1D). Liczba komórek w każdej bramce jest określana ilościowo i może być wykorzystana do obliczenia procentu tego typu komórek w stosunku do wszystkich żywych komórek (tabela 3).

Procent żywych komórek może być obliczony dla każdego podmiotu, co pozwala na obliczenie średniej wszystkich osób w grupie na przykład szczupłych lub otyłych mężczyzn wykazujących obfitość specyficznej komórki odpornościowej, tj. prozapalnego makrofaga CD11b⁺ CD11c⁺ w trzewnym AT (Rysunek 2).

Rysunek 1. Strategia bramkowania FACS trzewnej tkanki tłuszczowej. (A) Wykres FACS wszystkich zdarzeń () z intensywnością szerokości rozproszenia do przodu (FSC-W) i intensywnością obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) zawierający bramkę do wyboru tylko pojedynczych komórek (czerwony), a następnie wykres FACS oparty na FSC-A i intensywności obszaru rozproszonego bocznego (SSC-A) zawierający bramkę wybierającą komórki pod napięciem (jasnozielony). Następny wykres z intensywnością fluorescencji SSC-A i CD45 zawiera bramkę selekcjonującą wszystkie komórki CD45⁺ (immunologiczne) (niebieskie). (B) Wykres FACS intensywności fluorescencji CD19, CD3, CD66b i CD56 w porównaniu z intensywnością fluorescencji CD11b oraz bramka wybierająca wszystkie komórki, które są CD19, CD3, CD66b i CD56 ujemne (brązowe) w celu dalszego podziału na populacje. Dalszy podział na kolejnym wykresie w oparciu o intensywność fluorescencji CD11b i CD11c. Wyświetlane są bramki zawierające makrofagi CD11b⁺, CD11c⁺ (ciemnozielone), makrofagi CD11b⁺ CD11c^- (fioletowe) i CD11b^nisko/- CD11c⁺ komórki dendrytyczne (niebieskie). (C) Ilość komórek CD11b⁺, CD11c⁺ lub CD11b^{o niskiej / -} CD11c⁺ (oś Y) wykazująca ich poziomy intensywności fluorescencji (oś X) dla CD303 i CD141 oraz odpowiadająca im kwantyfikacja średniej intensywności fluorescencji (MFI). (D) Wykres FACS przedstawiający poprzednią populację CD45 ⁺ (niebieski) w oparciu o intensywność fluorescencji CD3 i CD19 zawierającą bramki wybierające limfocyty T (magenta), komórki B (ciemnozielone) i komórki nieautofluorescencyjne (zielone) ujemne zarówno dla CD3, jak i CD19. Poniższy wykres opiera się na fluorescencji CD4 i CD8 z bramkami wybierającymi limfocyty T CD4 ⁺ (jasnozielony) i CD8 ⁺ (magenta). Identyczną strategię bramkowania stosuje się w przypadku podskórnej tkanki tłuszczowej. Identyczną strategię bramkowania stosuje się w przypadku podskórnej tkanki tłuszczowej. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Wouters et al.¹⁶ Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Otyły vAT zawiera więcej prozapalnych makrofagów. Ilość makrofagów CD11b⁺ CD11c⁺ przedstawiona jako procent wszystkich żywych komórek w vAT szczupłych i otyłych mężczyzn. Wszystkie dane są ± SEM; N = 20 dla szczupłych i N = 31 dla otyłych. **p ≤ 0,01 w porównaniu z lean. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:

cel	Cel definicji	Obecny w dniu	Fluorochrom	ilość	klon
Płyta CD11B	marker integryny szpikowej	granulocyty, monocyty/makrofagi, komórki dendrytyczneniskie i komórki NK	Zobacz materiał BV421	2,5 μl	ICRF44
Płyta CD19	wspólny antygen komórek B	Rozwój limfocytów B od komórek pro-B do komórek B blastoidów i komórek B osocza	Fitc	3 μL	HIB19
Płyta CD3	wspólny antygen limfocytów T	Limfocyty T, limfocyty T NK i tymocyty	Fitc	3 μL	UCHT1
Płyta CD66B	należy do rodziny glikoprotein podobnych do antygenu rakotwórczego (CEA)	granulocyty	Fitc	5 μL	Zobacz materiał G10F5
Płyta CD56	silnie glikozylowane białko adhezyjne	komórki NK i limfocyty T NK	Fitc	5 μL	Zobacz materiał B159
Płyta CD303	Glikoproteina transbłonowa typu II	plazmocytoidalne komórki dendrytyczne	Pe	1 μL	201A
Płyta CD141	Trombomodulina	monocyty/makrofaginiskie, subpopulacja komórek dendrytycznych	Apc	1 μL	Zobacz materiał M80
CD11C	glikoproteina transbłonowa typu I; integryna αx	monocyty/makrofagi, komórki dendrytyczne, granulocyty, komórki NK (ang. natural nk), podzbiór limfocytów B i T	APC-CY7	0,5 μL	Zobacz materiał Bu15
Płyta CD45	Wspólny antygen leukocytarny	wszystkie ludzkie leukocyty, w tym limfocyty, monocyty, granulocyty, eozynofile i tymocyty	PE-CY7	1 μL	Zobacz materiał HI30
Bufor FACS	-	-	-	7,5 μl	-

Tabela 1. Koktajl przeciwciał dla FACS panel 1 w celu identyfikacji podzbiorów makrofagów i populacji komórek dendrytycznych. Opisana ilość przeciwciał jest przeznaczona do analizy jednej próbki.

powiedział: powiedział:

cel	Cel definicji	Obecny w dniu	Fluorochrom	ilość	klon
Płyta CD19	wspólny antygen komórek B	Rozwój limfocytów B od komórek pro-B do komórek B blastoidów i komórek B osocza	Zobacz materiał BV421	1 μL	HIB19
Płyta CD3	wspólny antygen limfocytów T	Limfocyty T, limfocyty T NK i tymocyty	Silnik V500	3 μL	UCHT1
Płyta CD56	silnie glikozylowane białko adhezyjne	komórki NK i limfocyty T NK	Apc	5 μL	Zobacz materiał HCD56
Płyta CD4	Nadrodzina Ig, glikoproteina transbłonowa typu I	Limfocyty T pomocnicze, tymocyty, monocyty/makrofagi, limfocyty T NK typu II	Certyfikat PerCP-Cy5.5	1 μL	Sterownik RPA-T4
Płyta CD8	α-podjednostka dwucząsteczkowego kompleksu połączonego dwusiarczkiem	cytotoksyczne limfocyty T, tymocyty, podzbiór komórek NK	APC-H7	2 μl	Zobacz materiał SK1
Płyta CD45	Wspólny antygen leukocytarny	wszystkie ludzkie leukocyty, w tym limfocyty, monocyty, granulocyty, eozynofile i tymocyty	PE-CY7	1 μL	Zobacz materiał HI30
Bufor FACS	-	-	-	10 μl	-

Tabela 2. Koktajl przeciwciał do panelu FACS 2w celu identyfikacji populacji komórek T i B. Opisana ilość przeciwciał jest przeznaczona do analizy jednej próbki.

szt. szt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. pkt. TGL pkt.

Panel Makrofagi
Nazwa bramy	# Komórki	% żywego
Pojedyncze komórki	183054
mieszkać	Numer katalogowy: 10477	100
Płyta CD45	Numer katalogowy 4100	Lokal 39,13
Wysypisko-	771	Godzina 7,36
CD11C- CD11B+	Z numerem 430	4.1
CD11C+ CD11B+	Rozdział 104	0,99
CD11C+ CD11Bniski/-	15	0,14
Panel komórek T, komórek B, komórek NK
Nazwa bramy	#Cells	% żywego
Pojedyncze komórki	Numer katalogowy: 34616
mieszkać	Numer katalogowy: 3728	100
Płyta CD45+	Rok 1589	Z dnia 42,62
Ogniwa NK	29	0,78
Płyta CD3+	Okręg wyborczy 953	Godzina 25,56
Płyta CD4+	Rozdział 601	Godzina 16.12
Płyta CD8+	Rozdział 328	8,8
Płyta CD19+	20	0,54

Tabela 3. Liczebność komórek odpornościowych różnych typów komórek w vAT. Liczba komórek w każdej bramce i procent różnych typów komórek na podstawie całkowitej liczby żywych komórek.

Discussion

Metody te opisują, w jaki sposób wyizolować SVF z vAT i sAT oraz określić ilościowo względne ilości komórek odpornościowych w tych tkankach. Ponadto metody określają, w jaki sposób określić ekspresję markerów na określonych typach komórek.

Cytometria przepływowa tkankowych komórek odpornościowych jest potężną techniką fenotypowania stanu immunologicznego tkanek. Kwantyfikacja tkankowych komórek odpornościowych może mieć wiele zastosowań. Jak opisano w wynikach, możliwe jest porównanie obecności określonych komórek odpornościowych między grupami pacjentów (np. szczupłych i otyłych). Ponadto, wykonując również cytometrię przepływową na krwi tych samych pacjentów, można zbadać powiązania między komórkami krążącymi a komórkami tkankowymi. Dzięki tej aplikacji byliśmy w stanie ustalić, że określony podzbiór krążących monocytów jest związany z prozapalnymi makrofagami tkanki tłuszczowej CD11C^{+ 16}.

Modyfikacje opisanego protokołu rozszerzą jego zastosowania, ponieważ liczne dostępne przeciwciała fluorescencyjne sprawiają, że cytometria przepływowa jest bardzo wszechstronna. Dzięki różnym przeciwciałom można rozróżnić prawie wszystkie typy komórek i wykryć ekspresję wielu markerów. Ponadto możliwe jest barwienie markerów wewnątrzkomórkowo poprzez przepuszczalność błony komórkowej, aby umożliwić wewnątrzkomórkowe wiązanie przeciwciał fluorescencyjnych. Cechy te pozwalają na rozróżnienie bardzo zróżnicowanych populacji makrofagów poza nadmiernie uproszczonymi podtypami makrofagów M1 i M2. Oprócz pomiaru ekspresji markerów powierzchniowych, białka (tj. cytokiny) mogą być barwione wewnątrzkomórkowo, dostarczając informacji na temat funkcjonalności makrofagów. Ponadto markery proliferacji, takie jak Ki67, są wykorzystywane do ilościowego określania tempa proliferacji. Jak opisano, rozróżnienie między makrofagami a DC opierało się na poziomach MIF markerów DC. Ogólny marker makrofagów, taki jak CD68, można włączyć do panelu makrofagów (panel FACS 1). Jednak CD68 musi być barwiony wewnątrzkomórkowo, co wymaga przepuszczalności błony komórkowej, co nie jest preferowane i wydłużyłoby protokół. Inne markery makrofagów to markery podzbiorów, takie jak CD163 i CD206 lub CD11c, przy czym ten ostatni jest zintegrowany z przedstawionym tutaj panelem makrofagów.

W naszych panelach FACS nie uwzględniono markera do rozróżniania żywych i martwych komórek, co byłoby preferowane, ponieważ pozwala na dokładniejsze wykluczenie martwych komórek niż użycie FSC i SSC. Często stosowane są barwniki barwiące DNA, jodek propidyny (PI) lub 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), a także barwniki reagujące na wolne aminy, takie jak LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, który jest dostępny w różnych kolorach barwników. Jednak PI i DAPI nie mogą być używane do mocowania komórek. Jak opisano w protokole, barwienie żywotności LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell można zintegrować z obydwoma panelami bez wpływu na ogólną strategię bramkowania FACS.

Ponadto dane są wyrażone jako procent aktywnych komórek, co oznacza, że wszystkie dane są względne. Tylko poprzez wprowadzenie dokładnej, znanej liczby komórek do cytometru przepływowego, możliwe byłoby określenie dokładnej liczby każdego typu komórek. Przybliżoną liczbę komórek można obliczyć po zliczeniu komórek we frakcji SVF za pomocą komory zliczającej. Jednak liczba ta musiałaby zostać dostosowana do ilości tkanki biopsyjnej użytej do wyizolowania SVF, ale ma to ograniczenia w porównaniu z beztłuszczowym i otyłym AT. Podobna masa otyłych AT składa się z mniejszej ilości adipocytów, ponieważ są one wypełnione lipidami i znacznie się rozszerzyły. Może to prowadzić do niedoszacowania liczby komórek odpornościowych, jeśli zostanie przedstawiona jako liczba komórek odpornościowych na gram AT lub na adipocyt.

W badaniach na ludziach włączenie pacjentów odbywa się zwykle przez dłuższy okres czasu, co ma ogromne znaczenie dla standaryzacji procedur eksperymentalnych. W celu porównania danych cytometrii przepływowej między pacjentami istnieje kilka opcji. Jak opisano w niniejszym protokole, komórki mogą być utrwalane przed pomiarem, co pozwala na analizę kilku próbek tego samego dnia. Można to również osiągnąć poprzez zamrożenie SVF przed ich barwieniem, co pozwala na równe barwienie procedury barwienia między wszystkimi próbkami, ale może to mieć wpływ na żywotność komórek. Wreszcie, również wykorzystane w tym badaniu, są koraliki fluorescencyjne do instalowania poziomów kompensacji, a koraliki śledzące cytometr były używane co dwa tygodnie w celu standaryzacji codziennych pomiarów cytometru. Ta ostatnia opcja jest najbardziej efektywna w przypadku pomiaru próbek z badania obejmującego długi okres czasu.

Czynnikiem ograniczającym cytometrię przepływową w ogóle jest zastosowanie fluorescencji. Liczba znaczników fluorescencyjnych, które mogą być wykrywane jednocześnie, jest ograniczona ze względu na nakładanie się widm emisyjnych. Jednak dzięki inteligentnemu rozwojowi panelu FACS i zastosowaniu kilku koktajli przeciwciał na próbkę vAT lub sAT, problem ten można przezwyciężyć zgodnie z opisem w tym protokole. Ważnym aspektem rozwoju paneli FACS są kontrole FMO. Stosując wszystkie przeciwciała panelu z wyjątkiem jednego, można ocenić potencjalne poziomy autofluorescencji, porównując FMO z pełnym panelem. Pozwala to na dokładne bramkowanie populacji, a procedury te powinny być wykonywane podczas konfigurowania nowego panelu FACS. Ponadto nowe generacje urządzeń FACS mogą wykrywać do 50 parametrów, co pozwala na jednoczesne wykrywanie wielu cech na komórkę. Kolejną kwestią związaną z aspektem fluorescencji jest autofluorescencja komórek, w szczególności makrofagów. Po wzbudzeniu komórek laserem FACS (głównie ze wzbudzeniem o długości fali 488 nm), komórki te emitują sygnał fluorescencyjny (głównie <640 nm), który może pokrywać się z widmami emisyjnymi znaczników przeciwciał^17,18. Aby to uwzględnić, należy zmierzyć niebarwione komórki w celu określenia autofluorescencji w każdym kanale. Mając tę wiedzę, należy wybierać fluorochromy, które wykazują siłę sygnału przekraczającą sygnał autofluorescencyjny. Ten autofluorescencyjny sygnał tła powinien być brany pod uwagę przy określaniu strategii bramkowania populacji. W związku z tym, dzięki zastosowaniu tego protokołu i inteligentnej konstrukcji panelu FACS, możliwe jest dogłębne zbadanie podtypów makrofagów fenotypowych. Można scharakteryzować nowe, odrębne makrofagi AT i ich funkcję.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wirówka	Hettich Rotanta 460R	5660
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średnia (DMEM)-Szynka" s F12	Gibco ThermoFisher	31330-095
Kolagenaza XI z Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C7657-1g
Kolagenaza I z Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C0130-1g
DNAza I z trzustki bydlęcej	Sigma Aldrich	DN25
NH4Cl	Merck	1.01145.0500
Surowica bydlęca Albumina	Sigma Aldrich	A4503-100
NaN3	Merck	1.06688.0100
200 µ Strzykawka M Filcons	BD Biosciences	340613
70 µ Filtr M	Greiner Bio-one	542070
Blok Fc / ludzki IgG	Sigma Aldrich	14506
Formaldehyd	Merck	1.04003.2500
CD11b-BV421	Biolegend	301324
CD19-Fitc	BD Biosciences	555412
CD3-Fitc	BD Biosciences	561807
CD66b-FITC	BD Biosciences	555724
CD56-Fitc	Firma BD Biosciences	562794
CD11c-APC-Cy7	337218
Płyta CD45-PE-CY7	Firma BD Biosciences	557748
CD19-BV421	302234
Biolegend CD3-V500	Firma BD Biosciences	561416
CD56-APC	Biolegend	318310
CD4-PerCP-Cy5.5	Biolegend	300528
CD8-APC-H7	BD Biosciences	641400
CD303-PE	Biolegend	354204
CD141-APC	Biolegend	344106
FACS-Canto II	BD Biosciences
96 płytka studzienkowa w kształcie litery V	Greiner Bio-one
PBS PH 7,4	Rurka Gibco ThermoFisher	10010023
FACS 5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna	Corning	352052
IgG z ludzkiej surowicy	Sigma Aldrich	I4506
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD Biosciences	552844
Zestaw cząstek kompensacji przeciwciał przeciw myszom Ig, κ/kontroli negatywnej	BD Biosciences	552843
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy czerwonych barwników martwych komórek	ThermoFisher	L23102
IKA MS 3 podstawowa wytrząsarka	Sigma Aldrich	Z645028-1EA