Method Article

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

DOI:

10.3791/57330

⸱

April 25th, 2018

 , 
1Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, 2Purdue University Center for Cancer Research, Purdue Institute for Inflammation, Immunology and Infectious Diseases (PI4D), Purdue Institute for Integrative Neuroscience (PIIN), Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioelektryczność, endogenna sygnalizacja elektryczna za pośrednictwem kanałów jonowych i pomp znajdujących się na błonie komórkowej, odgrywa ważną rolę w procesach sygnalizacji pobudliwych komórek nerwowych i mięśniowych oraz wielu innych procesach biologicznych, takich jak wzorce rozwoju embrionalnego. Istnieje jednak potrzeba monitorowania aktywności elektrycznej in vivo w embriogenezie kręgowców. Postępy w dziedzinie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników napięcia (GEVI) umożliwiły znalezienie rozwiązania tego problemu. Tutaj opisujemy, jak stworzyć transgeniczny wskaźnik napięcia danio pręgowanego na przykładzie ustalonego wskaźnika napięcia, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1). W tym badaniu wybrano zestaw Tol2 i wszechobecny promotor danio pręgowanego, ubi. Wyjaśniamy również procesy klonowania specyficznego dla miejsca Gateway, transgenezy danio pręgowanego opartej na transpozonach Tol2 oraz proces obrazowania zarodków ryb we wczesnym stadium i guzów ryb przy użyciu zwykłych mikroskopów epifluorescencyjnych. Korzystając z tej żyłki ryb, odkryliśmy, że podczas embriogenezy danio pręgowanego i ruchu larw ryb zachodzą zmiany napięcia elektrycznego. Ponadto zaobserwowano, że w kilku złośliwych guzach osłonki nerwów obwodowych u danio pręgowanego komórki nowotworowe były na ogół spolaryzowane w porównaniu z otaczającymi je normalnymi tkankami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioelektryczność odnosi się do endogennej sygnalizacji elektrycznej, w której pośredniczą kanały jonowe i pompy umieszczone na błonie komórkowej1. Wymiana jonowa przez błonę komórkową oraz sprzężony potencjał elektryczny i zmiany prądu są niezbędne dla procesów sygnalizacyjnych pobudliwych komórek nerwowych i mięśniowych. Ponadto bioelektryczność i gradienty jonów pełnią wiele innych ważnych funkcji biologicznych, w tym magazynowanie energii, biosyntezę i transport metabolitów. Odkryto również sygnalizację bioelektryczną jako regulator tworzenia wzorców embrionalnych, takich jak osie ciała, cykl komórkowy i różnicowanie komórek1. W związku z tym ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wielu chorób wrodzonych u ludzi, które wynikają z nieprawidłowej regulacji tego typu sygnalizacji. Chociaż patch clamp jest szeroko stosowany do rejestrowania pojedynczych komórek, nadal jest daleki od ideału do jednoczesnego monitorowania wielu komórek podczas rozwoju embrionalnego in vivo. Co więcej, małe cząsteczki wrażliwe na napięcie również nie są idealne do zastosowań in vivo ze względu na ich specyfikę, czułość i toksyczność.

Stworzenie różnych genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników napięcia (GEVI) oferuje nowy mechanizm przezwyciężenia tego problemu i pozwala na łatwe zastosowanie do badania rozwoju embrionalnego, mimo że pierwotnie były one przeznaczone do monitorowania komórek nerwowych2,3. Jednym z obecnie dostępnych GEVI jest Accelerated Sensor of Action Potentials 1 (ASAP1)4. Składa się z zewnątrzkomórkowej pętli domeny wyczuwającej napięcie wrażliwej na napięcie fosfatazy i koliście permutowanego białka zielonej fluorescencji. Dlatego ASAP1 umożliwia wizualizację zmian potencjału elektrycznego komórek (polaryzacja: jasnozielona; depolaryzacja: ciemnozielona). ASAP1 ma kinetykę włączania i wyłączania 2 ms i może śledzić zmianę potencjału podprogowego4. W ten sposób to narzędzie genetyczne pozwala na osiągnięcie nowego poziomu skuteczności w monitorowaniu bioelektrycznym żywych komórek w czasie rzeczywistym. Pogłębienie wiedzy na temat roli bioelektryczności w rozwoju embrionalnym i wielu chorobach człowieka, takich jak rak, rzuci nowe światło na mechanizmy leżące u ich podstaw, co ma kluczowe znaczenie dla leczenia i zapobiegania chorobom.

Udowodniono, że danio pręgowany jest potężnym modelem zwierzęcym do badania biologii rozwojowej i chorób ludzkich, w tym raka5,6. Mają 70% wspólnych genów ortologicznych z ludźmi i mają podobną biologię kręgowców7. Danio pręgowany zapewnia stosunkowo łatwą pielęgnację, duży rozmiar lęgu jaj, łatwą genetykę, łatwą transgenezę i przezroczysty zewnętrzny rozwój embrionalny, co czyni je doskonałym systemem do obrazowania in vivo5,6. Z dużym źródłem zmutowanych linii ryb i w pełni zsekwencjonowanym genomem, danio pręgowany zapewni stosunkowo nieograniczony zakres odkryć naukowych.

Aby zbadać aktywność elektryczną komórek w czasie rzeczywistym in vivo, korzystamy z systemu modeli danio pręgowanego i ASAP1. W tym artykule opisujemy, jak włączyć fluorescencyjny bioczujnik napięcia ASAP1 do genomu danio pręgowanego za pomocą transgenezy transpozonu Tol2 i wizualizować komórkową aktywność elektryczną podczas rozwoju embrionalnego, ruchu larw ryb i żywego guza.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany jest trzymany w obiekcie dla zwierząt zatwierdzonym przez AAALAC, a wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC).

1. Przygotowanie konstruktu plazmidu transpozonu Tol2

UWAGA: Tol2, transpozon, który został odkryty u ryb medaka, był szeroko stosowany w społeczności badawczej danio pręgowanego8,9. Został on pomyślnie zaadoptowany do specyficznego dla lokacji systemu klonowania opartego na rekombinacji Gateway i znanego jako Tol2 kit10. Zestaw Tol2 pozwala na wygodniejszy sposób tworzenia niestandardowych konstrukcji ekspresji, jednocześnie zwiększając efektywność transgenezy. W związku z tym łatwo było podjąć decyzję, aby skorzystać z tego systemu i stworzyć wszechobecną linię ekspresji ASAP1 do danio pręgowanego przy użyciu zwalidowanego promotora ubikwityny do napędzania ASAP111.

  1. Tworzenie środkowego wpisu ASAP1 konstrukcji: pDONR221-ASAP1
    1. Zdobądź genetycznie kodowany konstrukt czujnika napięcia ASAP1, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (Plasmid#52519) od Addgene. Aby wzmocnić region kodowania ASAP1, skonfiguruj PCR przy użyciu niestandardowych starterów (attB1-ASAP1F i attB2-ASAP1R) otoczonych sekwencjami attB na końcu 5' starterów (Rysunek 1). Polimeraza DNA Phusion została wybrana ze względu na jej wysoką skuteczność, a warunki PCR zostały zoptymalizowane w oparciu o wcześniej opublikowany protokół12.
    2. Załaduj 50 μl produktów PCR do 1% żelu TAE za pomocą zwykłej pipety z końcówkami o pojemności 200 μl i wykonuj elektroforezę przy napięciu 160 V w poziomym zbiorniku żelu przez około 30 minut.
    3. Sprawdź żel pod transiluminatorem UV (353 nm), wytnij żądane pasmo za pomocą ostrza/skalpela pod transiluminatorem UV, jak wcześniej opublikowano13,14, i umieść próbkę DNA zawierającą żel w czystej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    4. Wykonaj oczyszczanie żelu dla produktów ASAP1 PCR. Odzyskaj DNA z wyciętego żelu za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania żelu DNA zgodnie z instrukcjami producenta i eluuj DNA do 20 μl wody. Pobrać 1 μl jako próbkę i zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, używając wody jako pustego elementu sterującego15.
    5. Weź 100 ng oczyszczonego produktu PCR i wymieszaj go ze 150 ng plazmidu pDONR221 w 10 μl buforu TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0)16. Dodać 2 μl klonazy BP II do reakcji i inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez noc.
    6. Drugiego dnia dodać 1 μl proteinazy K do reakcji i inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    7. Wykonaj transformację. Przenieść reakcję i wymieszać ją z 50 μl kompetentnych komórek E. coli Top10 i inkubować komórki na lodzie przez 30 minut. Następnie przenieść probówkę reakcyjną do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 1 minutę. Natychmiast wyjmij probówkę i inkubuj na lodzie przez 2 minuty. Następnie umieścić probówkę w wytrząsarce o temperaturze 37 °C i inkubować przez 1 godzinę.
    8. Wyjmij probówkę i ułóż komórki na płytce LB z kanamycyną. Następnie inkubować płytkę przez noc (16-18 godzin) w temperaturze 37 °C.
    9. Wybierz pojedyncze i dobrze oddzielone kolonie i zaszczep je w probówkach do hodowli komórkowych o pojemności 14 ml z 3 ml pożywki LB. Hodować je przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce o prędkości obrotowej 250 obr./min (prędkość obrotowa na minutę).
    10. Wykonaj miniprep za pomocą komercyjnego zestawu miniprep zgodnie z jego instrukcją obsługi17.
    11. Sekwencjonowanie plazmidów 3-4 z sekwencjonowaniem Sangera w celu identyfikacji dodatnich klonów pDONR221-ASAP1 przy użyciu starterów sekwencjonowania M13F i M13R.
  2. Tworzenie konstruktu Tol2 do mikroiniekcji: pDestTol2-ubi-ASAP1
    1. Wybierz zweryfikowany sekwencjonowanie klon pDONR221-ASAP1 i zmierz jego stężenie DNA za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcją oprogramowania, używając wody jako ślepej próby15.
    2. Weź 100 μg pDONR221-ASAP1 i wymieszaj go ze 100 μg 5-końcowego plazmidu zestawu Tol2 (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 μg p3E-polyA (zestaw Tol2 #302) i 150 μg pDestTol2pA2 (zestaw Tol2 #394). Dostosować całkowitą objętość do 8 μl za pomocą buforu TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dobrze wymieszać przez krótki wir trwający 2-5 s. Następnie dodaj 2 μl LR Clonase II plus i inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez noc.
    3. Drugiego dnia dodać 1 μl proteinazy K do reakcji za pomocą pipety 10 μl i inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    4. Wykonaj transformację i zidentyfikuj pozytywne klony, jak opisano powyżej (kroki 1.1.7-11).
    5. Zmierz stężenie DNA zweryfikowanego sekwencjonująco klonu pDestTol2-ubi-ASAP1 (Rysunek 1B) za pomocą spektrofotometru15. Zwykle stężenie wynosi około 200 ng / μL.

2. Przygotuj mRNA transpozazy Tol2 i roztwór do wstrzykiwań

  1. Smuga zapasu glicerolu E. coli plazmidu transpozazy pCS2FA (zestaw Tol2 #396) na płytkę LB (ze 100 μg / ml ampicyliny) za pomocą wysterylizowanej pętli inokulacyjnej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez noc. Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w 3 ml LB (100 μg/ml ampicyliny) za pomocą wysterylizowanej końcówki do pipety o pojemności 10 μl. Hodować przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce o prędkości obrotowej 250 obr./min.
  2. Wykonaj miniprep na kulturze E. coli za pomocą komercyjnego zestawu do miniprepu, postępując zgodnie z instrukcją obsługi. Eluować plazmidowe DNA do 30-50 μl buforu TE za pomocą 1-minutowej wirówki przy 14 000 obr./min i zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
  3. Linearyzuj 1-2 μg plazmidu endonukleazą Not I i oczyść DNA za pomocą zestawu do czyszczenia DNA zgodnie z instrukcją obsługi po strawieniu Not I. Wypłucz DNA do 5 μl wody, wirując z prędkością 14 000 obr./min przez 1 minutę. Przewidywane stężenie to około 200-300 ng/μL.
  4. Wykonaj transkrypcję in vitro z linearyzowaną transpozazą pCS2FA jako matrycą DNA przy użyciu komercyjnego zestawu do transkrypcji SP6.
  5. Po zakończeniu reakcji oczyść mRNA transpozazy Tol2 za pomocą dostępnego w handlu zestawu do czyszczenia RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec eluuj mRNA do 20 μl wody wolnej od RNAazy i zmierz stężenie RNA w spektrofotometrze. Oczekiwane stężenie wynosi około 1-3 μg/μL. W razie potrzeby próbki można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  6. Przygotować roztwór do mikroiniekcji, mieszając 20 ng/μl mRNA transpozazy pDestTol2-ubi-ASAP1 i transpozazy Tol2 (100 ng/μl) w probówce do mikrowirówek metodą pipetowania. Aby zapobiec degradacji kwasów nukleinowych spowodowanej wielokrotnym rozmrażaniem i ponownym zamrażaniem, należy podać 6 μl na probówkę i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. Mikroiniekcja

  1. Ustaw 4-6 zbiorników hodowlanych z co najmniej 2 samcami i 2 samicami po południu przed wstrzyknięciem. Ryb tych nie wolno karmić po południu. Ten krok zmniejszy ilość odpadów rybnych i zaoszczędzi czas na ich oczyszczenie następnego ranka, a także pomoże wywołać reakcję hodowlaną.
  2. Następnego ranka należy wyjąć przygotowany roztwór do wstrzykiwań (konstrukt pDestTol2-ubi-ASAP1 i mRNA Tol2) z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić go na lodzie.
  3. Pociągnij przegrody w zbiornikach hodowlanych ryb i pozwól rybom na łączenie się w pary. Ogólnie rzecz biorąc, ryby składają jaja w ciągu 20-30 minut po wyciągnięciu przegrody. Jeśli nie, odczekaj 1-2 godziny dłużej. Niektóre ryby mogą w ogóle nie składać jaj. W takim przypadku powtórz ten eksperyment w celu pobrania zarodków ryb.
  4. Czekając, upewnij się, że są przygotowane igły z końcówką złamaną pod kątem tworzącą skośną krawędź za pomocą kleszczy lub łamiąc się na delikatnej wycieraczce zadaniowej.
    1. Wyciągnąć igły ze szkła kapilarnego na ściągaczu do mikropipet, stosując następujące parametry: ciepło 545; ciągnięcie 60; prędkość 80; czas 250; ciśnienie 500. Przełam igłę kleszczami pod lunetą preparacyjną (z linijką okularową do oszacowania średnicy), trzymając kleszcze pod kątem około 45°. Pożądane średnice igieł mogą być zmienne w zależności od ustawień mikrowstrzykiwaczy, ale mniejsza średnica jest preferowana w celu zmniejszenia śmiertelności zarodków.
  5. Gdy ryby złożą jaja, zbierz je na szalkę Petriego o średnicy 10 cm i przynieś do lunety preparucyjnej. Usuń wszystkie nieprawidłowe zarodki i odchody ryb.
  6. Odpipetować zapłodnione zarodki do przygotowanej 3% formy wtryskowej agarozy. Usuń nadmiar wody, aby pomóc utrzymać zarodki na miejscu.
  7. Gdy wszystkie rzędy zostaną wypełnione żywotnymi zarodkami, ułóż je tak, aby wszystkie pojedyncze komórki były skierowane w tym samym kierunku w kierunku igły, czyli pod kątem około 45° w poziomie. To znacznie ułatwi późniejsze wstrzykiwanie.
  8. Zakładając rękawice, użyj końcówki do pipety o pojemności 20 μl i usuń 5 μl przygotowanej konstrukcji z probówki na lodzie.
  9. Ostrożnie włóż końcówkę do tylnego końca uszkodzonej rurki kapilarnej aż do miejsca, w którym zaczyna się zwężać, aby odczynnik znalazł się jak najbliżej końcówki. Jeśli nadal znajdują się pęcherzyki powietrza, potrząśnij igłą, uważając, aby nie złamać końcówki.
  10. Wprowadzić igłę prosto do uchwytu igły do mikroiniekcji i ostrożnie dokręcić, aż igła pozostanie na swoim miejscu. Ustaw kąt na około 45°.
  11. Po przygotowaniu i założeniu igły włącz mikroskop i zbiornik z gazem. Komercyjne zbiorniki CO2 są na ogół dobre do tego celu. Objętość wtrysku jest regulowana przez ciśnienie utrzymywania i wyrzucania: około 0,5 psi dla podtrzymania i 30 psi dla wyrzutu. Pamiętaj, aby sprawdzić, czy roztwór pojawia się po naciśnięciu pedału.
  12. Za pomocą mikrometru stopniowego z kroplą oleju mineralnego dostosuj objętość i przepływ roztworu do średnicy ~150 μm (około 2 nL). Upewnij się, że przeciwciśnienie pozwoli na wypłynięcie niewielkiej ilości z igły. Jeśli nie ma wystarczającego ciśnienia wstecznego, działanie kapilarne spowoduje, że płyn dostanie się do igły i zniszczy mRNA.
  13. Po skalibrowaniu igły należy rozpocząć wstrzykiwanie konstruktu do pojedynczej komórki zapłodnionych zarodków.
    UWAGA: Wymaga to dużej ilości praktyki, cierpliwości i finezji, ponieważ błona komórkowa jest trudna do przebicia. Ważne jest, aby wstrzyknąć roztwór do komórki, a nie do żółtka, w celu wytworzenia transgenicznego danio pręgowanego. Różni się to od iniekcji morfolino. Nie ma znaczenia, po której stronie igła wejdzie do komórki, o ile konstrukt wejdzie do komórki. Transgeneza będzie miała bardzo niski wskaźnik sukcesu, jeśli zostanie wstrzyknięta do żółtka zamiast do komórki. Ważne jest również wstrzyknięcie w stadium jednokomórkowym, w przeciwnym razie powstaną somatyczne ryby chimery. Zmniejszy to ryzyko przedostania się transgenu do komórek rozrodczych.
  14. Użyj krawędzi nacięcia na żel, aby zapewnić podkład, który utrzymuje zarodek na miejscu i umożliwia igłę wywieranie nacisku bez przesuwania zarodka. Gdy końcówka igły znajdzie się w pojedynczej komórce, naciśnij pedał, aby uwolnić żądaną ilość roztworu. Powtórz ten proces dla wszystkich zarodków.
  15. Po zakończeniu przenieś wstrzyknięte zarodki do oznakowanego naczynia, wypłukując je z nacięcia agarozowego wodą z systemu rybnego i jednorazową pipetą transferową o pojemności 3,4 ml. Przechowuj zarodki w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C, aby mogły się rozwinąć. Sprawdzaj przez cały dzień, usuwając martwe zarodki ryb i zastąp wodę 0,1% błękitem metylenowym w wodzie dla ryb.
  16. Około 6-8 godzin po wstrzyknięciu należy pobrać 10 pojedynczych zarodków ryb, którym wstrzyknięto zarodki ryb i przygotować z nich genomowe DNA za pomocą metody Hotshot18.
  17. Następnego ranka użyj mikroskopu preparacyjnego z fluorescencyjnym źródłem światła, aby posortować zarodki wykazujące GFP w tkankach innych niż żółtkowe. Te zarodki ryb powinny zawierać wstrzyknięty konstrukt.
  18. Wykonaj test akcyzowy Tol2, aby sprawdzić aktywność transpozonu, jak opisano wcześniej19. Jeśli można wykryć wycięty plazmid, zachowaj wstrzyknięte zarodki ryb i wyhoduj je. Jeśli nie można wykryć wyciętego plazmidu, należy powtórzyć proces syntezy mRNA Tol2 i mikroiniekcji, aż do uzyskania pozytywnych wyników testu akcyzowego Tol2.

4. Ustanowienie transgenicznej ryby ASAP1, Tg(ubi:ASAP1)

  1. Wychowaj wstrzykniętą rybę (pokolenie F0) do dorosłości, jak opisano wcześniej w książce o danio pręgowanym20. Zwykle trwa to około 4 miesięcy.
  2. Weź pojedynczą dorosłą rybę F0 i skrzyżuj ją z pojedynczą rybą typu dzikiego przeciwnej płci. Zbieraj zarodki ryb po rozmnażaniu później w ciągu dnia. Zebrane zarodki ryb należy przechowywać w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C w wodzie dla ryb o zawartości 0,1% błękitu metylenowego.
  3. Trzeciego dnia należy sprawdzić zarodki ryb pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym z filtrem GFP. Posortuj zarodki zielonych ryb, jeśli takie istnieją, i wychowaj je do dorosłości jako transgeniczne ryby pokolenia F1, Tg(ubi:ASAP1).
    UWAGA: Stosunek mendlowski nie jest oczekiwany, ponieważ większość rodzicielskich ryb F0 to chimery genetyczne linii zarodkowej.
  4. Skrzyżuj pojedynczą dorosłą rybę F1 z rybą typu dzikiego i zbierz zarodki ryb. Posortuj zarodki zielonych ryb i wychowaj je do dorosłości jako ryby pokolenia F2.
    UWAGA: Zarodki ryb zielonych i niezielonych powinny być zbliżone do 1:1, jeśli występuje pojedynczy transgen.
  5. Aby zobaczyć zmiany potencjału elektrycznego w guzie, takie jak złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST), skrzyżuj ryby Tg generacji F2 (ubi: ASAP1) z rybami rpl35hi258 / wt. Wiadomo, że widoczne guzy zaczynają pojawiać się u dorosłych w wieku 6-8 miesięcy21,22.

5. Obrazowanie

  1. Aby zobrazować zarodki danio pręgowanego, weź wiele ryb założycielskich pokolenia F2 i skrzyżuj je z rybami typu dzikiego w indywidualnych parach. Zbieraj zarodki ryb na różnych pożądanych etapach rozwoju zgodnie z przewodnikiem po klasyfikacji danio pręgowanego23.
  2. We wczesnych stadiach zarodków ryb należy ostrożnie obrać i usunąć kosmówkę zarodków za pomocą kleszczy pod lunetą preparacyjną na szalce Petriego o średnicy 10 cm z wodą z systemu rybnego.
  3. Przenieś kilka zarodków ryb na wklęsłe szkiełko z 3% metylocelulozą za pomocą jednorazowej pipety do przenoszenia o pojemności 3,4 ml. Dostosuj zarodki do pożądanych pozycji, aby wyświetlić aktywność komórkową GFP za pomocą igły pod fluorescencyjnym zakresem preparacji.
  4. W przypadku etapów ruchomych zarodków ryb (starszych niż 12 stadiów somitów) należy użyć 0,05% mezylanu tricainy do znieczulenia zarodków ryb przed przeniesieniem ich na szkiełka. Krótko mówiąc, zarodki ryb pojawiały się w 0,05% mezylanie tricainy w wodzie dla ryb, aż przestały pływać i straciły równowagę ciała. Dodaj również kroplę 0,05% mesylanu tricainy z metylocelulozą na szkiełku.
  5. W przypadku mniej niż 12 zarodków ryb w stadium somitowym należy użyć mikroskopu złożonego epi-fluorescencji z kompatybilną kamerą i oprogramowaniem do obrazowania. W przypadku zarodków ryb w stadium starszym niż 12 somitów należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego.
  6. Aby zobrazować napięcie komórek nowotworowych, najpierw zidentyfikuj ryby z guzami MPNST. Następnie znieczulij rybę 0,05% mesylanem tricainy. W celu zobrazowania całego wierzchowca umieść rybę na szalce Petriego o średnicy 10 cm. Aby zobaczyć aktywność elektryczną komórek nowotworowych, guzy ryb można wyciąć po obrazowaniu całego wierzchowca.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W udanym wstrzyknięciu, ponad 50% wstrzykniętych zarodków ryb będzie wykazywać pewien stopień zielonej fluorescencji w komórkach somatycznych, a większość z nich będzie pozytywna w teście akcyzowym transpozonu Tol2 (Rysunek 2). Po 2-4 pokoleniach krzyżowania z rybami typu dzikiego (do momentu, gdy ryby fluorescencyjne osiągną 50%, oczekiwany stosunek mendlowski), transgeniczne ryby wykorzystano w eksperymencie obrazowania w celu śledzenia potencjałów błony komórkowej p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż aktywność elektryczna na poziomie komórkowym i tkankowym podczas rozwoju embrionalnego i chorób człowieka została odkryta dawno temu, dynamiczne zmiany elektryczne in vivo i ich role biologiczne nadal pozostają w dużej mierze nieznane. Jednym z głównych wyzwań jest wizualizacja i ilościowe określenie zmian elektrycznych. Technologia patch clamp jest przełomem w śledzeniu pojedynczych komórek, ale jej zastosowanie do zarodków kręgowców jest ograniczone, ponieważ składają się one z wielu komórek. Obecne ch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca badawcza opisana w tej publikacji była wspierana przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach Award Number R35GM124913, Purdue University incentive program PI4D oraz PVM Internal Competitive Basic Research Funds Program. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy agentów finansujących. Dziękujemy Koichi Kawakamiemu za konstrukt Tol2, Michaelowi Linowi za konstrukt ASAP1 i Leonardowi Zonowi za konstrukt promotora ubi za pomocą Addgene.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14 ml probówki do hodowli komórkowychVWR60818-725Kultura E.Coli
Zbiornik do elektroforezy agarozyThermo ScientificOwl B2ELETEROFOREZA DNA
Agaroza RAAmrescoN605-500GDo wytwarzania żeli iniekcyjnych
Attb1-ASAP1-F starterIDT DNAGGGGACAAGTTTGTACAAAAAA
GCAGGCTTCACCATGGAGACGA
CTGTGAGGTATGAACA		Amplifikacja regionu kodowania ASAP1 do subklonowania
Attb2-ASAP1-R starterIDT DNAGGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC
AAGTTGTTTCTCTCTGTGAAGCCA		ASAP1 amplifikacja regionu kodowania do subklonowania
Luneta do sekcji w jasnym poluNikonSMZ 745Dechorionacja, mikroiniekcja, montaż
Kamera kolorowaZeissAxioCam MRcZarodek rybny Zapis obrazu
Szkiełko wklęsłeVWR48336-001Do przetrzymywania zarodków ryb podczas procesu obrazowania
Jednorazowa pipeta transferowa 3,4 mlThermo Scientific13-711-9AMZarodki ryb i transfer wody
Enzym endonukleazy, Nie INEBR0189LDo linearyzacji plazmidowego DNA
Epifuorescencyjny zakres związkówZeissAxio Imager.A2Ryba obrazowanie zarodków
Epifuorescencyjna stereoskopowa luneta preparcyjnaZeissStereo Discovery.V12Obrazowanie zarodków ryb
Fluorescencyjne źródło światłaDynamika światła Lumendynamics X-cite seris 120Źródło światła do mikroskopów fluorescencyjnych
Kleszcze #5WPI500342Dechorionacja i łamanie igieł
Gateway BP Clonase II Mieszanka enzymówThermo Scientific11789020Klonowanie rekombinacji Gateway BP
Gateway LR Clonase II Plusenzym Thermo Scientific12538120Gateway LR klonowanie rekombinacji
Żelowy zestaw do odzyskiwania DNAZymo ResearchD4002Oczyszczanie żelu DNA
Końcówka ładującaEppendorf930001007Do ładowania roztworu do wstrzykiwań do igieł kapilarycznych
Metyloceluloza (1600cPs)Alfa Aesar43146Montowanie zarodków rybnych
Błękit metylenowySigma-AldrichM9140Tłumi ogniska grzybów na szalkach Petriego
Forma do mikroiniekcjiAdaptacyjne narzędzia naukoweTU-1Do przygotowania tacki na formy agaorse do przechowywania zarodków ryb podczas iniekcji
MikrowtryskiwaczWPIPneumatyczna pompa pikopompująca PV820Wtryskiwacz mikroiniekcyjny
MikromanipulatorWPIMikroiniektor MM3301ROperacja mikroiniekcji Ściągacz
do mikropipetPrzyrząd SutterP-1000Do przygotowania igły kapilarnej
Olej mineralnyAmrescoJ217-500mlDo kalibracji objętości iniekcji
mMESSAGE Zestaw do transkrypcji mMACHINE SP6Thermo ScientificAM1340transkrypcja mRNA in vitro
Aparat monokolorowyZeissAxioCam MRmRejestracja obrazu zarodków ryb
Zestaw do miniprzygotowania plazmiduZymo ResearchD4020Przygotuj niewielką ilość plazmidowego DNA
Plastikowe szalki PetriegoVWR25384-088Do przechowywania ryb lub zarodków ryb podczas procesu obrazowania
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1015Czyszczenie mRNA po transkrypcji in vitro
SpektrofotometrThermo ScientificNanoDrop 2000Do pomiaru stężeń DNA i RNA
Etap MikrometrAm ScopeMR100Kalibracja objętości mikroiniekcji
TermocyklerBio-RadT100Amplifikacja DNA do klonowania genów
Cienkościenna kapilary szklaneWPITW100F-4Surowe szkło do wytwarzania igły kapilarnej
Starter Tol2-exL1IDT DNAGCACAACACCAGAAATGCCCTCTest akcyzowy Tol2
Starter Tol2-exRIDT DNAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGTol2 test akcyzowy
TOP10 Chemicznie kompetentny E. coliThermo ScientificC404006Używany do transformacji podczas klonowania genów
Mesylan trikainySigma-AldrichA5040Do znieczulania ryb lub zarodków ryb
Oświetlacz UV Trans-Illuminator 302nmUVPM-20VWizualizacja DNA
Kąpiel wodnaThermo Scientific2853Do procesu transformacji klonowania genów

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
  2. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
  3. Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
  4. St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
  5. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  6. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  7. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
  8. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  9. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  13. Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
  14. Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  18. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).
  19. Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
  20. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).
  21. Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139(2004).
  22. Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
  23. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  24. Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734(2013).
  25. Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
  26. Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094(2014).
  27. Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  28. Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
  29. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  30. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transgenic ZebrafishCellular Electrical ActivityGenetically Encoded Voltage IndicatorsASAP1 ReporterTol2 TransposonGateway CloningMicroinjection TechniqueEpifluorescence MicroscopyMembrane Potential ChangesMalignant Peripheral Nerve Sheath Tumors

Related Articles