Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Summary

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Abstract

Bioelektryczność, endogenna sygnalizacja elektryczna za pośrednictwem kanałów jonowych i pomp znajdujących się na błonie komórkowej, odgrywa ważną rolę w procesach sygnalizacji pobudliwych komórek nerwowych i mięśniowych oraz wielu innych procesach biologicznych, takich jak wzorce rozwoju embrionalnego. Istnieje jednak potrzeba monitorowania aktywności elektrycznej in vivo w embriogenezie kręgowców. Postępy w dziedzinie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników napięcia (GEVI) umożliwiły znalezienie rozwiązania tego problemu. Tutaj opisujemy, jak stworzyć transgeniczny wskaźnik napięcia danio pręgowanego na przykładzie ustalonego wskaźnika napięcia, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1). W tym badaniu wybrano zestaw Tol2 i wszechobecny promotor danio pręgowanego, ubi. Wyjaśniamy również procesy klonowania specyficznego dla miejsca Gateway, transgenezy danio pręgowanego opartej na transpozonach Tol2 oraz proces obrazowania zarodków ryb we wczesnym stadium i guzów ryb przy użyciu zwykłych mikroskopów epifluorescencyjnych. Korzystając z tej żyłki ryb, odkryliśmy, że podczas embriogenezy danio pręgowanego i ruchu larw ryb zachodzą zmiany napięcia elektrycznego. Ponadto zaobserwowano, że w kilku złośliwych guzach osłonki nerwów obwodowych u danio pręgowanego komórki nowotworowe były na ogół spolaryzowane w porównaniu z otaczającymi je normalnymi tkankami.

Introduction

Bioelektryczność odnosi się do endogennej sygnalizacji elektrycznej, w której pośredniczą kanały jonowe i pompy umieszczone na błonie komórkowej¹. Wymiana jonowa przez błonę komórkową oraz sprzężony potencjał elektryczny i zmiany prądu są niezbędne dla procesów sygnalizacyjnych pobudliwych komórek nerwowych i mięśniowych. Ponadto bioelektryczność i gradienty jonów pełnią wiele innych ważnych funkcji biologicznych, w tym magazynowanie energii, biosyntezę i transport metabolitów. Odkryto również sygnalizację bioelektryczną jako regulator tworzenia wzorców embrionalnych, takich jak osie ciała, cykl komórkowy i różnicowanie komórek

Protocol

Danio pręgowany jest trzymany w obiekcie dla zwierząt zatwierdzonym przez AAALAC, a wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC).

1. Przygotowanie konstruktu plazmidu transpozonu Tol2

UWAGA: Tol2, transpozon, który został odkryty u ryb medaka, był szeroko stosowany w społeczności badawczej danio pręgowanego^8,9. Został on pomyślnie zaadoptowany do specyficznego dla lokacji systemu klonowania opartego na rekombinacji Gateway i znanego jako Tol2 kit¹⁰

Results

W udanym wstrzyknięciu, ponad 50% wstrzykniętych zarodków ryb będzie wykazywać pewien stopień zielonej fluorescencji w komórkach somatycznych, a większość z nich będzie pozytywna w teście akcyzowym transpozonu Tol2 (Rysunek 2). Po 2-4 pokoleniach krzyżowania z rybami typu dzikiego (do momentu, gdy ryby fluorescencyjne osiągną 50%, oczekiwany stosunek mendlowski), transgeniczne ryby wykorzystano w eksperymencie obrazowania w celu śledzenia potencjałów błony komórkowej p.......

Discussion

Chociaż aktywność elektryczna na poziomie komórkowym i tkankowym podczas rozwoju embrionalnego i chorób człowieka została odkryta dawno temu, dynamiczne zmiany elektryczne in vivo i ich role biologiczne nadal pozostają w dużej mierze nieznane. Jednym z głównych wyzwań jest wizualizacja i ilościowe określenie zmian elektrycznych. Technologia patch clamp jest przełomem w śledzeniu pojedynczych komórek, ale jej zastosowanie do zarodków kręgowców jest ograniczone, ponieważ składają się one z wielu komórek. Obecne ch.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 ml probówki do hodowli komórkowych	VWR	60818-725	Kultura E.Coli
Zbiornik do elektroforezy agarozy	Thermo Scientific	Owl B2	ELETEROFOREZA DNA
Agaroza RA	Amresco	N605-500G	Do wytwarzania żeli iniekcyjnych
Attb1-ASAP1-F starter	IDT DNA	GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA	Amplifikacja regionu kodowania ASAP1 do subklonowania
Attb2-ASAP1-R starter	IDT DNA	GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTCTCTGTGAAGCCA	ASAP1 amplifikacja regionu kodowania do subklonowania
Luneta do sekcji w jasnym polu	Nikon	SMZ 745	Dechorionacja, mikroiniekcja, montaż
Kamera kolorowa	Zeiss	AxioCam MRc	Zarodek rybny Zapis obrazu
Szkiełko wklęsłe	VWR	48336-001	Do przetrzymywania zarodków ryb podczas procesu obrazowania
Jednorazowa pipeta transferowa 3,4 ml	Thermo Scientific	13-711-9AM	Zarodki ryb i transfer wody
Enzym endonukleazy, Nie I	NEB	R0189L	Do linearyzacji plazmidowego DNA
Epifuorescencyjny zakres związków	Zeiss	Axio Imager.A2	Ryba obrazowanie zarodków
Epifuorescencyjna stereoskopowa luneta preparcyjna	Zeiss	Stereo Discovery.V12	Obrazowanie zarodków ryb
Fluorescencyjne źródło światła	Dynamika światła Lumen	dynamics X-cite seris 120	Źródło światła do mikroskopów fluorescencyjnych
Kleszcze #5	WPI	500342	Dechorionacja i łamanie igieł
Gateway BP Clonase II Mieszanka enzymów	Thermo Scientific	11789020	Klonowanie rekombinacji Gateway BP
Gateway LR Clonase II Plus	enzym Thermo Scientific	12538120	Gateway LR klonowanie rekombinacji
Żelowy zestaw do odzyskiwania DNA	Zymo Research	D4002	Oczyszczanie żelu DNA
Końcówka ładująca	Eppendorf	930001007	Do ładowania roztworu do wstrzykiwań do igieł kapilarycznych
Metyloceluloza (1600cPs)	Alfa Aesar	43146	Montowanie zarodków rybnych
Błękit metylenowy	Sigma-Aldrich	M9140	Tłumi ogniska grzybów na szalkach Petriego
Forma do mikroiniekcji	Adaptacyjne narzędzia naukowe	TU-1	Do przygotowania tacki na formy agaorse do przechowywania zarodków ryb podczas iniekcji
Mikrowtryskiwacz	WPI	Pneumatyczna pompa pikopompująca PV820	Wtryskiwacz mikroiniekcyjny
Mikromanipulator	WPI	Mikroiniektor MM3301R	Operacja mikroiniekcji Ściągacz
do mikropipet	Przyrząd Sutter	P-1000	Do przygotowania igły kapilarnej
Olej mineralny	Amresco	J217-500ml	Do kalibracji objętości iniekcji
mMESSAGE Zestaw do transkrypcji mMACHINE SP6	Thermo Scientific	AM1340	transkrypcja mRNA in vitro
Aparat monokolorowy	Zeiss	AxioCam MRm	Rejestracja obrazu zarodków ryb
Zestaw do miniprzygotowania plazmidu	Zymo Research	D4020	Przygotuj niewielką ilość plazmidowego DNA
Plastikowe szalki Petriego	VWR	25384-088	Do przechowywania ryb lub zarodków ryb podczas procesu obrazowania
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015	Czyszczenie mRNA po transkrypcji in vitro
Spektrofotometr	Thermo Scientific	NanoDrop 2000	Do pomiaru stężeń DNA i RNA
Etap Mikrometr	Am Scope	MR100	Kalibracja objętości mikroiniekcji
Termocykler	Bio-Rad	T100	Amplifikacja DNA do klonowania genów
Cienkościenna kapilary szklane	WPI	TW100F-4	Surowe szkło do wytwarzania igły kapilarnej
Starter Tol2-exL1	IDT DNA	GCACAACACCAGAAATGCCCTC	Test akcyzowy Tol2
Starter Tol2-exR	IDT DNA	ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG	Tol2 test akcyzowy
TOP10 Chemicznie kompetentny E. coli	Thermo Scientific	C404006	Używany do transformacji podczas klonowania genów
Mesylan trikainy	Sigma-Aldrich	A5040	Do znieczulania ryb lub zarodków ryb
Oświetlacz UV Trans-Illuminator 302nm	UVP	M-20V	Wizualizacja DNA
Kąpiel wodna	Thermo Scientific	2853	Do procesu transformacji klonowania genów