Oznaczanie titracji ELISA jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor

Podsumowanie

Opisano szczegółowe protokoły wykonywania titracji ELISA. Ponadto przedstawiono nowy algorytm do oceny titracji ELISA i uzyskania stałej dysocjacji wiązania rozpuszczalnego ligandu z receptorem unieruchomionym na płytce mikrotytlacyjnej.

Streszczenie

Stała dysocjacji opisuje interakcję między dwoma partnerami w równowadze wiązania i jest miarą ich powinowactwa. Jest to kluczowy parametr do porównania różnych ligandów, np., inhibitorów konkurencyjnych, izoform białkowych i mutantów, pod względem ich siły wiązania z partnerem wiązującym. Stałe dysocjacji są określane poprzez wykreślanie stężeń związanego wobec wolnego ligandu jako krzywych wiązania. Natomiast krzywe tytulacyjne, w których sygnał proporcjonalny do stężenia związanego ligandu jest wykreślany względem całkowitego stężenia dodanego ligandu, są znacznie łatwiejsze do zapisania. Sygnał może być wykrywany spektroskopowo i przez enzymowo-związany immunosorbentowy test (ELISA). Jest to przykładowe w protokole dla testu ELISA tytulacyjnego, który mierzy wiązanie pochodzącego od jadu węży rodocetyny do jego unieruchomionego domeny docelowej α2β1 integrinu. Testy ELISA tytulacyjne są wszechstronne i szeroko stosowane. Każda para oddziałujących białek może być użyta jako unieruchomiony receptor i rozpuszczalny ligand, pod warunkiem że oba białka są czyste, a ich stężenia są znane. Dotąd trudnością było określenie stałej dysocjacji na podstawie krzywej tytulacyjnej. W niniejszym badaniu, wprowadzona zostaje matematyczna funkcja leżąca u podstaw krzywych tytulacyjnych. Bez jakiejkolwiek błędnej graficznej oceny wydajności nasycenia, ten algorytm pozwala na przetwarzanie danych surowych (intensywności sygnału w różnych stężeniach dodanego ligandu) bezpośrednio przez matematyczną ocenę poprzez regresję nieliniową. Dlatego wiele krzywych tytulacyjnych może być zapisywanych jednocześnie i przekształcanych w zestaw charakterystycznych parametrów, w tym stałej dysocjacji i stężenia aktywnego wiązaniowo receptora, a następnie mogą być oceniane statystycznie. W połączeniu z tym algorytmem, testy ELISA tytulacyjne mają zaletę bezpośredniego prezentowania stałej dysocjacji. Dlatego mogą być używane bardziej efektywnie w przyszłości.

Wprowadzenie

Konstanta dysocjacji K jest kluczowym parametrem opisującym powinowactwo receptora (R) do jego ligandu (L). Na podstawie prawa działania mas, K jest zdefiniowane dla równowagi, w której kompleks receptor-ligand RL dysocjuje się na receptor R i ligand L:

            Równanie 1

przy czym indeksy f oznaczają stan wolny/niezwiązany receptora i ligandu. Stężenie kompleksu receptor-ligand, RL, jest identyczne z stężeniem związanego ligandu Lb. Ponieważ całkowite stężenie receptora Rt jest sumą wolnego receptora Rf i związanego z ligandem receptora Rb = Lb, konstancie dysocjacji można także przypisać:

         Równanie 2

Dlatego też wydajność nasycenia Y, zdefiniowana jako ułamek związanego ligandu Lb w odniesieniu do całkowitego stężenia receptora Rt,

         Równanie 3

zależy od stężenia wolnego ligandu Lf:

         Równanie 4

Ta hiperboliczna relacja opisuje krzywą wiązania receptora-ligandu, a jej wykres przedstawia stężenie związanego ligandu Lb jako funkcję stężenia wolnego ligandu Lf. Z krzywej wiązania można wyprowadzić stałą dysocjacji K jako stężenie wolnego ligandu przy połowie maksymalnej wydajności nasycenia. Co więcej, różne algorytmy liniaryzacji krzywych wiązania zostały ustanowione, takie jak podwójny wykres odwrotny Klotza^1,2, lub transformacje według Scatcharda czy Hanesa (przegląd Bisswangera³). Jednakże wszystkie algorytmy cierpią na problem, że maksymalna wartość wydajności nasycenia, która jest osiągana asymptotycznie przy wysokich stężeniach wolnego ligandu na krzywej wiązania, musi być oszacowana w graficznej przed-ewaluacji i dlatego jest podatna na błędy.

Poza tym, oznaczanie krzywej wiązania wymaga ilościowego rozdzielenia wolnego i związanego ligandu podczas równowagi wiązania. W tym celu wolny ligand musi zostać oddzielony od związanego z receptorem ligandu i ilościowo określony. Dlatego też ligand i receptor muszą różnić się swoimi właściwościami, takimi jak niebiałkowy ligand w przeciwieństwie do białkowego receptora. Jeśli oba partnerzy wiązania są białkami, muszą być rozróżnialne pod względem ich wielkości, ładunków lub innych cech molekularnych. Niemniej jednak, ilościowe oznaczanie stężeń ligandu w małych skalach wiązania jest trudnym zadaniem. Radioaktywne oznaczanie ligandu było często konieczne, aby wykryć niską koncentrację związanego ligandu, szczególnie jeśli znaczne ilości receptorów nie były dostępne lub nie były przystępne cenowo. Co więcej, związany z receptorem ligand może się dysocjować w sposób niezaniedbywalny podczas i po izolacji. Dlatego też złożone metody, takie jak filtracja żelowa w równowadze⁴, elektroforeza kapilarna⁵ i impulsowa proteoliza⁶, są wymagane do ilościowego określania związanego z receptorem ligandu i jego oddzielania od wolnego ligandu.

W przeciwieństwie do tych badań wiązania, eksperymenty tytulacyjne nie wymagają ilościowego rozdzielenia związanego i wolnego ligandu. W tym celu receptor o stałym stężeniu jest titrowany różnymi stężeniami dodanego ligandu. Poprzez wiązanie się z receptorem, związany ligand ma właściwość biofizyczną, która odróżnia go od wolnego ligandu i jest mierzalna, np. przez fotometrię, fluorometrię lub wykrycie przeciwciał. Dlatego też sygnał S, który jest proporcjonalny do wydajności nasycenia Y i w konsekwencji także do stężenia związanego z receptorem ligandu (Lb), jest wykrywany jako funkcja całkowitego stężenia dodanego ligandu (Lt). Oba parametry, sygnał S i całkowite stężenie dodanego ligandu są określane w sposób bezpośredni i łatwiejszy niż stężenia związanego i wolnego ligandu. Szczególnie, wykrycie związanego z receptorem ligandu przez immunosorbujący test enzymatyczny (ELISA) pozwoliło na zmniejszenie objętości próbek poniżej 100 µL, jak również na równoległe pomiary kilku stężeń ligandu w płytkach mikrotytrowym. W titracji ELISA, receptor jest fizycznie adsorbowany na płytce mikrotytrowej w

Protokół

1. Stock Solutions

1. Aby przygotować 100 mL 10x TBS pH 7.4, rozpuść 6,06 g TRIS i 8,77 g NaCl w 90 mL zdejonizowanej wody, dostosuj pH do 7,4 za pomocą 37% roztworu HCl, uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.
2. Aby przygotować 100 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7.4, rozpuść 23,83 g HEPES w 90 mL zdejonizowanej wody, dostosuj pH do 7,4 za pomocą 1,5 M NaOH, uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.
3. Aby przygotować 100 mL 5 M NaCl, rozpuść 29,2 g NaCl w 90 mL zdejonizowanej wody. Uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.
4. Aby przygotować 100 mL 1 M MgCl₂ roztworu, rozpuść 20,33 g MgCl₂ · 6H₂O w 90 mL zdejonizowanej wody. Uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.
5. Aby przygotować 5% wyłączonej termicznie BSA w wodzie, odważyć 2,5 g BSA (frakcja V, pH 7,0) w 50 mL probówce i rozpuścić w 45 mL zdejonizowanej wody. Uzupełnić roztwór do 50 mL zdejonizowaną wodą i podgrzać w kąpieli wodnej w temperaturze 68 °C przez 45 min. Ochłodzić w łaźni lodowej i przechowywać w temperaturze -20 °C.
6. Przygotować wodny 25% roztwór glutaraldehydu.
   OSTRZEŻENIE: Glutaraldehyd jest szkodliwy w przypadku połknięcia, toksyczny przy inhalacji i powoduje oparzenia. Należy nosić odzież ochronną, rękawiczki i ochronę oczu/twarzy.
7. Wytwarzać królicze antysera jak opisano wcześniej¹⁹. Tytuł antyseru został określony zgodnie ze standardowymi protokołami²⁰.
8. Przygotować przeciwkrólicze immunoglobulinowe przeciwciała od kozy sprzężone z fosfatazą alkaliczną.
9. Aby przygotować 100 mL 0,1 M glicyny, rozpuść 0,75 g glicyny w 90 mL zdejonizowanej wody. Dostosuj pH do 10,4 za pomocą 1,5 M NaOH, uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.
10. Aby przygotować 100 mL 0,5 M Zn(II)-octanu, rozpuść 10,98 g Zn(II)-octanu · 2H₂O w 90 mL zdejonizowanej wody. Uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.
11. Aby przygotować 100 mL 1,5 M NaOH, rozpuść 6,0 g NaOH w 90 mL zdejonizowanej wody. Uzupełnij objętość do 100 mL zdejonizowaną wodą i przefiltruj roztwór.

2. Prepare Buffers and Working Solutions

1. Rozcieńcz 5 mL 10x TBS pH 7.4, z 45 mL zdejonizowanej wody i dodaj 100 µL 1 M MgCl₂ roztworu stockowego. Przechowuj w temperaturze pokojowej. TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ roztwór służy do imobilizowania receptora i mycia płytki mikrotytrowań.
2. Rozcieńcz 10 mL 5% wyłączonej termicznie BSA w wodzie i 5 mL 10x TBS, pH 7.4 z zdejonizowaną wodą do 50 mL. Dodaj 100 µL 1 M MgCl₂ stock solution i dobrze wymieszaj roztwór. Przechowuj na lodzie i składuj na dalsze eksperymenty w temperaturze -20 °C. Należy zauważyć, że 2,5 mL 1% BSA w TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ są wymagane dla każdej krzywej tytulacji.
3. Rozcieńcz 2,5 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7.4 i 1,5 mL 5 M NaCl do 50 mL zdejonizowaną wodą, dodaj 100 µL 1 M MgCl₂ roztworu i dobrze wymieszaj roztwór, aby przygotować 50 mL HBS, pH 7.4: 50 mM HEPES/NaOH, 150 mM NaCl.
4. Dodaj 5 µL 1M MgCl₂ stock solution i 2 µL 0,5 M Zn(II)-octanu stock solution do 5 mL 0,1 M glicyny roztworu, pH 10,4, aby przygotować bufor fosfatazy alkalicznej (AP) (0,1 M glicyny roztwór, pH 10,4, 1 mM MgCl₂, 0,2 mM Zn(II)-octanu).

3. Imobilization of the Receptor (Integrin α2A-Domain) to a Microtiter Plate

1. Rozcieńcz stock solution integrinu α2A-domain w TBS, pH 7.4, 2 mM MgCl₂ do końcowej koncentracji 5 µg/mL.
   UWAGA: Objętość roztworu powłokowego wynosi 650 µL dla jednej krzywej tytulacji obejmującej rząd 12 komórek półpłytki mikrotytrowań.
2. Wypełnij każdą komórkę rzędu na półpłytce mikrotytrowań 50 µL/komórka 5 µg/mL roztworu powłokowego integrinu α2

Wyniki

Po wykonaniu ELISA, żółty kolor przekonwertowanego substratu alkalicznej fosfatazy, para-nitrofenolanu, wskazuje, że ilość związanego ligandu rodocetyny maleje wraz ze zmniejszaniem się stężeń dodanej rodocetyny z kolumn 1 do 11 (Rysunek 1). Bezbarwne dołki w dołkach wolnych od rodocetyny w kolumnie 12 pokazują niski poziom sygnału tła.

Ilościowe pomiary fotometryczne przy 405 nm dostarczaj...

Dyskusja

Titracja ELISA to wszechstronny system testowy do określania dysocjacji interakcji receptor-ligand. Ponieważ titracja ELISA omija konieczność efektywnego oddzielania wolnych i związanych ligandów oraz analizy ich stężeń ilościowo, znacznie więcej badań i publikacji zastosowało titrację ELISA zamiast rejestrowania krzywych wiązania. Co więcej, titracje ELISA są łatwe do wykonania i wymagają stosunkowo niewielkich ilości receptora i ligandu. Aby uzyskać dokładną analizę stałych dysocjacji, należy stosować czyste preparaty ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
TRIS	neoFrox	1125KG001
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
NaCl	Applichem	1,316,591,214
MgCl2	Merck	172571
integrin a2A, dzikiego typu i mutantnego, rekombinowane		izolowane w laboratorium autora
NiNTA superflow column	Qiagen, Germany	30821
Coomassie-Brilliant Blue R250	Serva	35050
oznaczenie kwasu bicinchoninowego (BCA), zestaw do oznaczania stężenia białka	Fisher Scientific	23225
albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V	Applichem	A1391
25 % roztwór glutaraldehydu	Merck	354400
przeciwciała przeciw immunoglobulinom króliczym od kozy, sprzężone z fosfatazą zasadową	Sigma-Aldrich	A9919
Glycine	Applichem	A1377
Zn(II)-acetate	Applichem	A4324
NaOH	Applichem	A1551
Tabletka podłoża do fosfatazy zasadowej (5 mg)	Sigma-Aldrich	S0942
Półpowierzchniowa płytka mikrotytrowcowa Costar	Thermo Scientific	Corning 3690
mikro probówki reakcyjne	Eppendorf	30120086
Czytnik płytek ELISA	BioTek	Synergy HT