Implantacja elektroprzędzonych przeszczepów naczyniowych o zoptymalizowanej strukturze w modelu szczurzym

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę elektroprzędzenia do wytwarzania przeszczepów naczyniowych PCL z grubymi włóknami i dużymi porami, oraz opisujemy protokół oceny wydajności in vivo w szczurzym modelu wymiany aorty brzusznej.

Streszczenie

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania makroporowatego przeszczepu naczyniowego PCL i opisujemy protokół oceny za pomocą szczurzego modelu wymiany aorty brzusznej. Elektroprzędzone przeszczepy naczyniowe często mają stosunkowo małe pory, które ograniczają infiltrację komórek do przeszczepów i utrudniają regenerację i przebudowę tętnic nowo-czerwonych. W tym badaniu przeszczepy naczyniowe PCL z grubszymi włóknami (5 - 6 μm) i większymi porami (~30 μm) zostały wytworzone przy użyciu zmodyfikowanej techniki przetwarzania. Długoterminową wydajność przeszczepu oceniano poprzez implantację w modelu aorty brzusznej szczura. Analiza ultrasonograficzna wykazała, że przeszczepy pozostały nienaruszone, bez tętniaka czy zwężenia, które wystąpiły nawet po 12 miesiącach od implantacji. Makroporowata struktura poprawiła wrastanie komórek, a tym samym sprzyjała regeneracji tkanek po 3 miesiącach. Co ważniejsze, nie było oznak niekorzystnej przebudowy, takiej jak zwapnienie w obrębie ściany przeszczepu po 12 miesiącach. W związku z tym elektroprzędzone przeszczepy naczyniowe PCL ze zmodyfikowanym przetwarzaniem makroporowatym mają potencjał, aby stać się substytutem tętnicy dla długotrwałej implantacji.

Wprowadzenie

Przeszczepy naczyniowe wykonane z syntetycznych polimerów są szeroko stosowane w klinikach do terapii chorób sercowo-naczyniowych (CVD). Niestety, w przypadku przeszczepów naczyniowych o małej średnicy (D <6 mm) nie ma dostępnych skutecznych produktów ze względu na niską drożność wywołaną zmniejszoną prędkością przepływu krwi, co często prowadzi do zakrzepicy, przerostu błony wewnętrznej i innych powikłań¹.

Inżynieria tkankowa dostarcza alternatywnej strategii realizacji długoterminowej drożności i homeostazy opartej na regeneracji i rekonstrukcji naczyń sterowanych przez rusztowanie. Mówiąc szczegółowo, przeszczep naczyniowy, jako trójwymiarowy szablon, może zapewniać mechaniczne wsparcie i wskazówki strukturalne podczas regeneracji tkanki naczyniowej oraz wpływać na funkcje komórkowe, w tym adhezję komórek, migrację, proliferację i wydzielanie macierzy zewnątrzkomórkowej². Do tej pory różne polimery syntetyczne były oceniane pod kątem zastosowań w inżynierii tkanki naczyniowej. Wśród tych polimerów, poli(ε-kaprolakton) (PCL) był intensywnie badany ze względu na dobrą kompatybilność komórkową i powolną degradację trwającą od kilku miesięcy do dwóch lat³. W modelu aorty szczurzej^4,5,6, przeszczepy naczyniowe PCL przetwarzane metodą elektroprzędzenia wykazywały doskonałą integralność strukturalną i drożność, a także stale zwiększoną inwazję komórek i neowaskularyzację w ścianie przeszczepu przez okres do 6 miesięcy. Jednak niekorzystną przebudowę tkanek, w tym regresję komórek i naczyń włosowatych oraz zwapnienie, obserwowano również w dłuższych punktach czasowych, do 18 miesięcy.

Celularyzacja przeszczepu naczyniowego jest kluczowym czynnikiem determinującym regenerację i remolding tkanek⁷. Elektroprzędzenie, jako wszechstronna technika, jest szeroko stosowane do przygotowania przeszczepów naczyniowych o strukturze nanowłóknistej⁸. Niestety, stosunkowo mała struktura porów często prowadzi do niewystarczającej infiltracji komórek w elektroprzędzonym przeszczepie naczyniowym, co ogranicza późniejszą regenerację tkanek. Aby rozwiązać ten problem, próbowano różnych technik zwiększania wielkości porów i ogólnej porowatości, w tym ługowania solą/polimerem^9,10, modyfikacja aparatury kolektora, obróbka końcowa promieniowaniem laserowym¹¹, itp. W rzeczywistości struktura przeszczepów elektroprzędzonych (w tym średnica włókna, wielkość porów i porowatość) jest ściśle związana z warunkami przetwarzania^12,13. Podczas elektroprzędzenia średnicę włókna można łatwo kontrolować, zmieniając parametry, takie jak stężenie roztworu polimeru, natężenie przepływu, napięcie itp. ^14,15, w związku z czym rozmiar porów i porowatość zostały odpowiednio zwiększone.

Niedawno opisaliśmy zmodyfikowany elektroprzędzony przeszczep PCL o strukturze makroporowatej (włókna o średnicy 5 - 7 μm i porach 30 - 40 μm). Implantacja in vivo poprzez wymianę aorty brzusznej szczura wykazała wysoki wskaźnik drożności, a także dobrą endotelializację i regenerację mięśni gładkich po 3 miesiącach od operacji¹⁶. Co ważniejsze, nawet po roku od implantacji nie można było zaobserwować niekorzystnej przebudowy tkanki, w tym zwapnienia i regresji komórek.

Protokół

Wykorzystanie zwierząt doświadczalnych zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Nankai i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych.

1. Produkcja elektroprzędzonych przeszczepów PCL

UWAGA: W tym przypadku technika elektroprzędzenia została wykorzystana do produkcji przeszczepów naczyniowych.

1. Przygotować roztwory PCL o stężeniu 25% i 10% wag., rozpuszczając PCL w mieszaninie odpowiednio metanolu i chloroformu (stosunek objętościowy 1:5) w temperaturze pokojowej (RT) przez 12 godzin.
2. Załaduj roztwór PCL do szklanej strzykawki o pojemności 10 ml.
3. Umieścić strzykawkę z igłą 21-G.
4. Umieść trzpień ze stali nierdzewnej (o średnicy 2 mm, długości 25 cm) na przyrządzie do zbierania.
5. W przypadku przeszczepów z grubszych włókien jako parametry elektroprzędzenia należy użyć roztworu PCL o stężeniu 25 % wag., odległości roboczej 17 cm od końcówki igły do kolektora, natężenia przepływu 8 ml / h i napięcia 11 kV. W przypadku przeszczepów z cieńszych włókien jako parametry elektroprzędzenia należy użyć roztworu PCL o stężeniu 10 % wag., odległości roboczej 20 cm od końcówki igły do kolektora, natężeniu przepływu 2 ml / h i napięciu 18 kV.
6. Upewnij się, że uzyskane przeszczepy są umieszczane w próżni przez noc w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika. Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed zabiegiem i utrzymuj aseptyczną technikę przez cały czas.
7. Przed implantacją należy zdezynfekować przeszczepy, zanurzając je w 10 ml 75% etanolu na 30 minut, a następnie wystawiając je na działanie światła UV przez noc.
8. Pomiary wielkości włókien i porów: Oblicz średnią średnicę włókna za pomocą oprogramowania ImageJ na podstawie obrazów ze skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
9. Badania mechaniczne rusztowań:
   1. Pokrój rusztowania rurowe na odcinki o długości 3 mm za pomocą żyletki. Zmierz grubość rusztowań za pomocą mikrometru.
   2. Rusztowania rurowe należy umieścić na maszynie wytrzymałościowej o nośności 100 N.
   3. Zacisnąć rusztowania z zachowaniem odległości między zaciskami 1 mm i ciągnąć wzdłużnie z prędkością 10 mm/min aż do pęknięcia. Zmierz wytrzymałość na rozciąganie i wydłużenie końcowe przy zerwaniu. Obliczyć moduł Younga z początkowego obszaru liniowego (do 5% odkształcenia) krzywej naprężenie-odkształcenie.

2. Model implantacji aorty brzusznej u szczura

UWAGA: Wszystkie materiały i narzędzia używane w chirurgii są sterylne. Podczas zabiegu należy upewnić się, że operator nosi maskę z gazy i sterylne rękawiczki, aby uniknąć infekcji. Upewnij się, że temperatura w pomieszczeniu jest utrzymywana na poziomie 27 - 30 °C, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia. Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC dotyczącymi analgezji.

1. Jako biorców przeszczepu naczyniowego należy użyć samców szczurów Sprague Dawley o wadze 240 - 270 g. Upewnij się, że szczur był na czczo 24 godziny przed operacją. Celem poszczenia szczurów przez 24 godziny jest wystarczające opróżnienie kału w przewodzie pokarmowym, a tym samym poszerzenie horyzontu operatora.
2. Chwyć za tylną szyję szczura i trzymaj głowę w dół, włóż igłę sprężynową do jamy brzusznej dolnej części brzucha. Skłonić szczura do znieczulenia hydratem chloralu (330 mg/kg) za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego.
3. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, upewniając się, że szczur ma rozluźnione mięśnie i stabilny oddech. Umieść szczura pod mikroskopem operacyjnym w pozycji leżącej.
4. Nałóż wazelinę okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Przed zabiegiem należy podać lek przeciwzakrzepowy (100 UI/kg) z heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej (50 UI/ml) we wstrzyknięciu do żyły ogonowej.
5. Zgol sierść w przedniej ścianie brzucha za pomocą żyletki i oczyść skórę roztworem jodu i roztworem alkoholu medycznego.
6. Wykonaj nacięcie laparotomii w linii środkowej nożyczkami chirurgicznymi i upewnij się, że nacięcie ma około 4 - 5 cm długości, a następnie odsłoń jamę brzuszną.
7. Cofnij i owiń jelita gazą zwilżoną najlepiej roztworem soli fizjologicznej.
8. Dokładnie wypreparuj aortę brzuszną.
9. Zidentyfikuj i podwiąż wszystkie małe gałęzie za pomocą nylonowych szwów 9-0 z monofilamentu.
10. Zacisnąć izolowany odcinek (do 1 cm długości) aorty za pomocą dwóch zacisków naczyniowych. Aorta może pozostać zaciśnięta przez 20-30 minut.
11. Przeciąć aortę brzuszną między dwoma zaciskami za pomocą mikronożyczek, aby utworzyć miejsca zespolenia.
12. Przepłukać oba końce aorty roztworem soli fizjologicznej w postaci heparynizacji (50 UI/ml) w celu usunięcia resztek krwi.
13. Odklej przydankę za pomocą mikronożyczek.
14. Zespolej przeszczep o średnicy wewnętrznej 2 mm i długości 1 cm z aortą brzuszną szczura za pomocą wzoru szwów ósemkowych za pomocą nylonowych szwów 9-0 z monofilamentu.
15. Najpierw wykonaj cztery zespolenia zgodnie z kolejnością godzin 9, 3, 12 i 6 po stronie bliższej, a następnie zespol przycięte krawędzie w 4 szwach między dwoma szwami. Po wykonaniu szwu proksymalnego należy zszyć stronę dystalną tą samą metodą.
    UWAGA: Każdy ścieg jest wymagany, aby upewnić się, że strona natywna jest lekko osadzona w przeszczepie.
16. Zdejmij dystalny zacisk, aby krew mogła przepływać do przeszczepu, a następnie usuń proksymalny zacisk.
17. Dociśnij końce szwu, aby zatrzymać krwawienie, za pomocą sterylnego wacika lub małej gąbki z gazy. Naciskaj przez około 3 minuty, aż do hemostazy.
18. Wróć jelita do jamy brzusznej.
19. Przepłukać jamę brzuszną ciepłym roztworem soli fizjologicznej z gentamycyną (320 j./ml).
20. Zszyj ścianę brzucha za pomocą nylonowego szwu 3-0 odpowiednio w warstwie mięśniowej i skórnej.
21. Umieść szczura w czystej i suchej klatce i umieść poduszkę grzewczą pod klatką, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia, a następnie poczekaj, aż szczur dojdzie do siebie po znieczuleniu. Opiekuj się zwierzęciem, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
22. Po odzyskaniu przytomności umieść szczura w pojedynczej klatce z jedzeniem i wodą. Nałóż jod na ranę, aby zapobiec infekcji po zabiegu. Zwróć szczura do towarzystwa innych zwierząt, aż w pełni wyzdrowieje.
23. Eutanazja szczurów zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi w określonych z góry punktach czasowych.

Wyniki

Przeszczepy PCL zostały eksplantowane po 3 i 12 miesiącach od operacji i przeanalizowane za pomocą standardowych technik histologicznych dla hematoksyliny i eozyny (H&E), trichromu Massona, Verhoeffa-van Giesona (VVG), Von Kossy oraz barwienia immunofluorescencyjnego dla α-SMA, MYH, vWF i elastyny. Obrazy histologiczne wykonano przy użyciu mikroskopu pionowego, a obrazy immunofluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Dyskusja

Naciek komórkowy ma kluczowe znaczenie dla regeneracji i przebudowy przeszczepu naczyniowego in vivo¹⁶. Ograniczona infiltracja komórek jest często związana ze stosunkowo małymi porami przeszczepu, które utrudniają migrację komórek do ściany przeszczepu. Aby rozwiązać tę trudność, opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę przygotowania elektroprzędzonych przeszczepów naczyniowych PCL o strukturze dużych porów. W szczegółach wielkość porów zwiększała się wraz ze wzrostem grubości włókien, którą m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Granulki poli(ε-kaprolaktonu) (PCL) (Mn=80 000)	Sigma	704067
Metanol	Tianjin Chemical Reagent Company	1060
Alkohol	Tianjin Chemical Reagent Company	1083
Chloroform	Tianjin Chemical Reagent Company	A1007
Sacharoza	Tianjin Fengchuan Firma	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Szczury Sprague Dawley	Laboratorium Centrum Zwierząt Akademii Wojskowych Nauk
Sól fizjologiczna	Hebei Tiancheng Firma
Hydrat chloralu	Firma chemiczna Tianjin Ruijinte	2223
Heparyna sodu do wstrzykiwań	Tianjin Biochem Firma
Siarczan gentamycyny do wstrzykiwań	Jiangsu Lianshui Firma
Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-&alfa;-SMA	Abcam	ab7817
Mysie przeciwciało pierwotne przeciw gładkiemu MYH	Abcam	ab683
Poliklonalne przeciwciało przeciw elastynie szczurów	królika Abcam	ab23748
Królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko czynnikowi von Willebranda	Abcam	ab6994
Kozia anty-mysia IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150117
Kozia anty-królicza IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150077
5% normalna surowica kozia	Zhongshan Golden bridge	ZLI9022
Hematoksylina i eozyna (H& E)	Beijing leagene biotech	DH0006
Trichrom	Massona Beijing leagene biotech	DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG)	Beijing leagene biotech	DC0059
Von Kossa	Beijing leagene biotech	DS0003
Igły do szwów chirurgicznych z gwintem, jedwab 3-0	firma zajmująca się zaopatrzeniem medycznym Shanghai Jinhuan	G3002b
Igły do szwów chirurgicznych z nitką, jedwab 9-0	Shanghai Jinhuan firma medyczna	H901