Artykuł metodologiczny

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

37K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57350

⸱

25 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Howard Hughes Medical Institute, University of California, Berkeley, 3Innovative Genomics Institute, University of California, Berkeley, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Francisco, 5Department of Microbiology and Immunology, University of California, San Francisco, 6Diabetes Center, University of California, San Francisco, 7Chan Zuckerberg Biohub, 8Department of Medicine, University of California, San Francisco, 9UCSF Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 10Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Streszczenie

Specyficzna dla miejsca edycja genomu eukariotycznego za pomocą systemów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (związanych z CRISPR) szybko stała się powszechna wśród badaczy zajmujących się różnorodnymi zagadnieniami biologicznymi. Użytkownicy najczęściej wykorzystują białko Cas9 pochodzące ze Streptococcus pyogenes w kompleksie z łatwym do przeprogramowania przewodnikiem RNA (gRNA). Składniki te są wprowadzane do komórek, a poprzez parowanie zasad z komplementarnym regionem genomu dwuniciowego DNA (dsDNA), enzym rozszczepia obie nici, aby wygenerować pęknięcie dwuniciowe (DSB). Późniejsza naprawa prowadzi albo do losowych zdarzeń insercji lub delecji (indels), albo do włączenia DNA dostarczonego przez eksperymentatora w miejscu pęknięcia.

Użycie oczyszczonego, jednoprowadnicowego RNA i białka Cas9, wstępnie złożonego w RNP i dostarczonego bezpośrednio do komórek, jest skutecznym podejściem do osiągnięcia wysoce efektywnej edycji genów. Edycja RNP szczególnie zwiększa szybkość insercji genów, co często jest trudne do osiągnięcia. W porównaniu z dostarczaniem za pośrednictwem plazmidu, krótsza trwałość Cas9 RNP w komórce prowadzi do mniejszej liczby zdarzeń poza celem.

Pomimo jej zalet, wielu przypadkowych użytkowników edycji genów CRISPR jest mniej zaznajomionych z tą techniką. Aby obniżyć barierę wejścia, przedstawiamy szczegółowe protokoły wdrażania strategii RNP w różnych kontekstach, podkreślając jej wyraźne korzyści i różnorodne zastosowania. Zajmujemy się edycją w dwóch typach pierwotnych komórek ludzkich, limfocytach T i krwiotwórczych komórkach macierzystych/progenitorowych (HSPC). Pokazujemy również, w jaki sposób edycja Cas9 RNP umożliwia łatwą manipulację genetyczną całych organizmów, w tym klasycznego modelu glisty Caenorhabditis elegans i niedawno wprowadzonego modelowego skorupiaka Parhyale hawaiensis.

Wprowadzenie

fSystem CRISPR-Cas9 pozwala naukowcom zmieniać wybrane regiony dowolnego genomu1. Ta szybka i niedroga technologia zrewolucjonizowała badania podstawowe i obiecuje wywrzeć głęboki wpływ na rozwój spersonalizowanych terapii chorób, rolnictwa precyzyjnego i nie tylko2. Edycja CRISPR jest narzędziem demokratyzującym, a wdrożenie systemu w nowym laboratorium nie wymaga szczególnej wiedzy z zakresu inżynierii genomu, a jedynie podstawowych umiejętności z zakresu biologii molekularnej. Naukowcy mogą teraz badać organizmy, które wcześniej były trudne do opanowania, za pomocą kilku alternatywnych metod manipulacji genetycznej3,4. Tylko w ciągu ostatnich pięciu lat edycja genomu CRISPR została wykorzystana do inżynierii ponad 200 różnych gatunków kręgowców, bezkręgowców, roślin i drobnoustrojów.

Dostosowane do prokariotycznego szlaku obronnego CRISPR, podstawowymi elementami wymaganymi do edycji genomu specyficznego dla miejsca są białko Cas9, zazwyczaj pochodzące z S. pyogenes i zoptymalizowane pod kątem kodonów z dodatkowym sygnałem lokalizacji jądrowej (NLS), oraz jego wyspecjalizowany przewodnik RNA5,6. Chociaż nie zostało to tutaj omówione, można również zastosować inne ortologie Cas9 lub endonukleazy CRISPR. Naturalnie występujące gRNA składa się z dwóch oddzielnie transkrybowanych fragmentów, CRISPR RNA (crRNA) i trans-aktywującego crRNA (tracrRNA)7. Te RNA mogą być połączone w pojedynczy transkrypt, znany jako RNA z pojedynczym przewodnikiem (sgRNA)8. Większość edytorów genomu wybiera uproszczony sgRNA9, chociaż regularnie używany jest również podwójny przewodnik10,11. Eksperymentatorzy wybierają cel genomowego DNA składającego się z 20 nukleotydów (nt), upewniając się, że znajduje się on obok krótkiej sygnatury licencyjnej wymaganej do rozpoznania Cas9, zwanej motywem sąsiadującym z protospacerem (PAM), i projektują gRNA, które zawiera komplementarną sekwencję12.

Po wejściu do komórki, kompleks RNP lokalizuje swój genomowy cel, zasada gRNA łączy się z komplementarną nicią DNA, a następnie enzym rozszczepia obie nici DNA, aby wytworzyć dwuniciową przerwę2. Maszyneria naprawy komórek utrwala DSB jedną z co najmniej dwóch dróg: poprzez podatny na błędy szlak niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR), która płynnie włącza DNA zawierające "ramiona" homologii po obu stronach pęknięcia. Pierwszy szlak naprawczy zazwyczaj prowadzi do powstawania indel i w konsekwencji do rozerwania genów, podczas gdy drugi pozwala eksperymentatorom na wstawianie lub zmianę sekwencji DNA1.

Efektywność i dokładność edycji zależą od sposobu, w jaki Cas9 i gRNA dostają się do komórki. Składniki te mogą być dostarczane do hodowanych komórek, zarodków lub organizmów w postaci kwasów nukleinowych lub jako wstępnie złożony kompleks RNP 13,14,15. Typowe metody dostarczania oparte na kwasach nukleinowych obejmują transdukcję, transfekcję lub elektroporację mRNA lub plazmidowego DNA. Białko Cas9 i przewodnik RNA są następnie wytwarzane w komórce i łączą się, tworząc kompleks.

Bezpośrednie dostarczenie RNP wymaga oddzielnego oczyszczania białka Cas9 i prowadzącego RNA. Można to zrobić we własnym zakresie lub można kupić białko i sgRNA od jednego z kilku komercyjnych dostawców. Po pozyskaniu Cas9 i gRNA są mieszane w celu utworzenia enzymatycznie kompetentnego kompleksu RNP i wprowadzane do komórek przez bezpośrednie wstrzyknięcie do zapłodnionych jaj / zarodków, transfekcję na bazie lipidów16 lub elektroporację. Pierwszy raport o edycji RNP dotyczył wstrzyknięcia do gonad C. elegans gonads17. Mikroiniekcja jest nadal preferowanym sposobem wprowadzania RNP do zarodków i całych organizmów, chociaż skuteczność elektroporacji wykazano w zarodkach mouse18,19 i rat20 zarodków. Opisujemy protokoły bezpośredniego wstrzykiwania RNP do zarodków C. elegans gonads i P. hawaiensis i zalecamy specjalistyczny rodzaj elektroporacji w celu dostarczenia RNP podczas edycji pierwotnych komórek ludzkich. Ta metoda, nukleofekcja, obejmuje zoptymalizowane programy elektroporacji i rozwiązania specyficzne dla typu komórki i pozwala RNP wejść zarówno do cytoplazmy, jak i do jądra21.

Edycja genomu za pomocą RNP oferuje kilka wyraźnych korzyści. Ponieważ składniki białka i RNA są wstępnie zmontowane, a jakość można zapewnić przed dostarczeniem, edycja RNP pozwala uniknąć wielu pułapek związanych z dostarczaniem na bazie kwasów nukleinowych. Mianowicie, nie ma ryzyka integracji DNA kodującego Cas9 z genomem gospodarza, mRNA nigdy nie jest narażone na degradację i omija problemy z ekspresją, fałdowaniem i asocjacją gRNA lub białka in vivo22,23. Co więcej, użycie RNP prowadzi do niższej toksyczności i znacznie mniejszej liczby zdarzeń poza celem niż ekspresja oparta na plazmidzie, co jest wynikiem krótszego okresu półtrwania RNP wewnątrz komórki24,25,26,27.

Wreszcie, edycja RNP wyraźnie prowadzi do wysokich wskaźników edycji w różnych ludzkich liniach komórkowych, komórkach pierwotnych, takich jak fibroblasty, embrionalne komórki macierzyste (ESC), indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iSPC), HSPC i limfocyty T16,24,25,26,27,28,29; u bezkręgowców, w tym C. elegans, P. hawaiensis i muszek owocowych3,17,30; u gatunków kręgowców, takich jak danio pręgowany, myszy i szczury31,32; w gatunkach roślin, w tym rzodkiewnik, tytoń, sałata, ryż, winorośl, jabłko, kukurydza i pszenica33,34,35,36; oraz u gatunków Chlamydomonas, Penicillium i Candida37,38,39. Częstotliwość tworzenia indel może być wyższa przy użyciu RNP w porównaniu z dostarczaniem plazmidu, a insercja DNA za pośrednictwem HDR może być łatwiejsza do osiągnięcia25,27,29.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje Cas9 RNP i jest skuteczną, łatwo adaptowalną techniką, którą łatwo zastosować do szerokiej gamy systemów biologicznych40,41, szczególnie w komórkach, które są trudne do pracy w inny sposób oraz w organizmach bez dobrze ugruntowanych systemów do precyzyjnej manipulacji genetycznej. Zaczynamy od opisania, jak zaprojektować, uzyskać i złożyć Cas9 RNP, zanim omówimy jego zastosowanie w różnych modelowych typach komórek i organizmach. Hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe (HSPC) i limfocyty T są edytowane przy użyciu tej samej metody, nukleofekcji, więc są one omówione razem w krokach 2 i 3 tego protokołu. Procedury edycyjne dla języka C. elegans są opisane w krokach 4 i 5 oraz P. Edycja Hawaiensis została omówiona w krokach 6 i 7. Wreszcie, ponieważ powodzenie eksperymentu z edycją genów w dowolnym organizmie można ocenić za pomocą sekwencjonowania genotypu, w kroku 8 przedstawiono podetapy opisujące możliwe metody analizy dla wszystkich komórek i organizmów opisanych w protokole.

Protokół

1. Zgromadzenie RNP

  1. Zaprojektuj eksperyment z dużym wyprzedzeniem, pozyskując z wyprzedzeniem wszystkie składniki RNA, DNA i białka. W pierwszym przejściu należy wypróbować jedną z kontroli dodatnich wymienionych w tabeli 1 i użyć dostępnych w handlu odczynników opisanych w tabeli materiałów, aby zapewnić wiarygodny projekt doświadczalny i integralność materiałów. Aby uzyskać dodatkowe wskazówki dotyczące planowania nowego eksperymentu z edycją genomu, zobacz artykuły na ten temat12,42,43.
    UWAGA: Po złożeniu zgodnie z opisem w kolejnych krokach, przygotowane wcześniej RNP mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.
    1. Po wybraniu genu, który ma być celowany, użyj jednego z bezpłatnych narzędzi online, aby zaprojektować optymalny gRNA44,45,46,47,48. Pamiętaj, aby celować w ekson, jeśli masz nadzieję na wygenerowanie nokautu.
      Uwaga: Narzędzia te pomogą zidentyfikować miejsce docelowe z przylegającą sekwencją PAM S. pyogenes, wynikiem wysokiej jakości i niskim wynikiem poza celem.
    2. Oczyść białko S. pyogenes Cas9 za pomocą opublikowanych metod8 lub kup je od komercyjnego dostawcy.
    3. Przygotuj typowy bufor Cas9 do rozcieńczania RNA, przygotowania RNP i przechowywania białka, który zawiera 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 10% glicerolu i 1 mM TCEP. Zawsze używaj wody wolnej od nukleaz w, które będą używane do ponownego zawieszenia lub rozcieńczenia RNA, aby zapobiec degradacji.
    4. Wyprodukuj przewodnik RNA (tracrRNA i crRNA lub sgRNA) poprzez transkrypcję in vitro przy użyciu opublikowanych metod lub kup go od firmy zajmującej się syntezą kwasów nukleinowych17,21,49,50,51.
    5. W przypadku wstawienia genu zsyntetyzuj lub kup matrycę DNA dawcy.
    6. Porcje białka i RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrozić na lodzie bezpośrednio przed użyciem.
      UWAGA: Każde zamrożenie i rozmrożenie nieznacznie obniża wydajność. Szczegółowe, ogólnodostępne protokoły oczyszczania Cas952 oraz transkrypcji in vitro sgRNAs53 są dostępne gdzie indziej.
  2. Jeśli pracujesz z C. elegans, przejdź do kroku 1.5. W przypadku protokołu P. hawaiensis przejdź do kroku 1.6. Jeśli używasz sgRNA, przejdź do kroku 1.4. Przejdź do kroku 1.3, aby złożyć gRNA do pierwotnej edycji komórek.
  3. Złóż gRNA, mieszając równomolowe ilości tracrRNA i crRNA. Zrób 100 μl z 80 μM gRNA na około 50 eksperymentów edycji genomu.
    1. Inkubować gRNA w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie pozostawić do powolnego ostygnięcia do temperatury pokojowej.
  4. Przygotowanie RNP do edycji limfocytów HSPC i T: Złóż kompleks RNP, mieszając 1 - 2x molową ilość gRNA z 200 pmol białka Cas9 w całkowitej objętości 10 μL. Bardzo powoli dodawać skoncentrowany Cas9 do gRNA (wstępnie rozcieńczonego w buforze Cas9) przez około 30 s, wykonując szybkie ruchy pipetą, doprowadzenie końcowego stężenia Cas9 do 20 μM.
    1. Przygotuj kuwety do elektroporacji.
      UWAGA: Ten protokół jest specyficzny dla systemu komercyjnego, o którym mowa w Tabeli Materiałów, ale edycję RNP można również osiągnąć za pomocą innych urządzeń do elektroporacji.
    2. Dodaj 5 μl (100 pmol, limfocyty T) lub 10 μl (200 pmol, HSPC) RNP do każdej kuwety.
    3. Jeśli wstawiasz nowe DNA, a nie dokonujesz nokautu, dodaj 1 μl jednoniciowego DNA dawcy oligonukleotydów o grubości 100 μM (100 pmol) (ssODN)25,54,55 do kuwet lub dołków płytki.
    4. Przejdź do kroku 2, aby uzyskać następne instrukcje w podstawowym protokole edycji komórek.
  5. Przygotowanie RNP do edycji C. elegans: Złóż kompleks RNP, dodając następujące odczynniki w celu uzyskania końcowej objętości 20 μL (końcowe stężenia podano w nawiasach): Cas9 (2 μM), HEPES pH 7,5 (10 μM), KCl (115 μM), crRNA (12 μM), tracrRNA (40 μM) i w razie potrzeby szablony naprawcze (0,5 μM ssDNA lub do 350 ng/μL dsDNA).
    UWAGA: Skuteczność naprawy za pośrednictwem szablonu DSB za pośrednictwem Cas9 jest proporcjonalna do stężenia konstruktu naprawczego dsDNA; W związku z tym, im wyższe stężenie szablonu naprawczego, tym skuteczniejsza naprawa szablonowa. Wykazano jednak, że wstrzyknięcie mieszanin zawierających więcej niż 350 ng/μl dsDNA zmniejsza żywotność wstrzykniętych robaków. Dlatego najlepiej jest użyć do, ale nie więcej niż 350 ng/μl dsDNA w mieszance, aby zmaksymalizować skuteczność naprawy przy jednoczesnym zminimalizowaniu jej śmiertelności.
    1. Dodaj wiele crRNA, aby celować w wiele loci jednocześnie, zgodnie z potrzebami dla podejścia przesiewowego co-CRISPR/ko-konwersji opisanego w kroku 5.4. Dodając więcej niż jeden crRNA, dodaj każdy z nich sekwencyjnie do mieszanki głównej.
      UWAGA: Ilość każdego crRNA nie musi być taka sama, a nawet podwojenie całkowitego stężenia crRNA w mieszance głównej bez zmiany stężenia Cas9 nie wydaje się zakłócać częstości mutagenezy w określonym locus. Przykłady zostały szczegółowo opisane w Paix et al.56.
    2. Mieszać pipetując i obracać roztwór RNP o stężeniu 16 000 x g przez 5 sekund, aby upewnić się, że roztwór zebrał się na dnie probówki.
    3. Inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 15 m.
    4. Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 1 minutę, aby osadzać wszelkie cząstki, które mogłyby zatkać cienkowierconą igłę do mikroiniekcji. W kolejnych krokach należy użyć supernatantu.
    5. Przejdź do kroku 4, aby zapoznać się z pozostałą częścią protokołu C. elegans.
  6. Przygotowanie RNP do edycji P. hawaiensis: Przygotuj jednorazowe podwielokrotności Cas9, rozcieńczając je wodą bez nukleaz i czerwienią fenolową (do wizualizacji wstrzyknięć) do końcowego stężenia 6,25 μM Cas9 i 0,15% czerwieni fenolowej.
    1. Złóż kompleks RNP, mieszając 2-5x molowy nadmiar gRNA z białkiem Cas9 w całkowitej objętości 6 μl. Dodaj 12 pmol Cas9 do gRNA, doprowadzając końcowe stężenie Cas9 do 2 μM, stężenie gRNA do 4 - 8 μM, a stężenie czerwieni fenolowej do 0,05%.
    2. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zespolić RNP.
    3. Przejdź do kroku 6, aby zapoznać się z następnymi instrukcjami wprotokole edycji P. hawaiensis.

2. Hodowla i przygotowanie komórek

UWAGA: Wykonaj kroki od 2.1.1 do 3.3.3 w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Kup kriokonserwowane ludzkie mobilizowane krew obwodową CD34 + HSPC od dostawcy.
    1. Rozmrozić ~1 x106 HSPC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 3 minuty i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 10 ml pożywki ekspancyjnej bez surowicy ze źródła komercyjnego i wirować mieszaninę o stężeniu 100 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml uzupełnionego SFEM. Umieścić komórki na płytkach 6-dołkowych i hodować je w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 24-48 godzin przed elektroporacją RNP.
    2. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś całkowitą liczbę potrzebnych HSPC (150 000-200 000 HSPC na kuwetę do elektroporacji) do probówki wirówkowej.
    3. Wiruj probówkę o masie 100 x g przez 10 minut, aby otoczkować komórki.
    2. Kup ludzkie pierwotne limfocyty T CD4 + od dostawcy lub wyizoluj je od ludzkiej krwi pełnej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości29.
    1. Przed aktywacją limfocytów T należy wstępnie pokryć 48-dołkowe płytki hodowlane αCD3 (UCHT1) i αCD28 (CD28.2). Pokryć płytki 500 μl 10 μg/ml αCD3 i 10 μg/ml αCD28 w PBS przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: W przypadku niektórych loci NHEJ można osiągnąć bez wstępnej stymulacji, ale uwzględnienie tego kroku maksymalizuje jego skuteczność.
    2. Hodować limfocyty T przez 48 godzin w temperaturze 37 °C na płytkach związanych z przeciwciałami αCD3/αCD28 w kompletnym pożywce RPMI [RPMI-1640 uzupełniony 5 mM HEPES, 2 mM komercyjnej alternatywy dla L-glutaminy, 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny, 50 μM 2-merkaptoetanolu, 5 mM aminokwasów endogennych, 5 mM pirogronianu sodu i 10% (obj./obj.) FBS]. Hoduj limfocyty T o gęstości 2 000 000 limfocytów T w 500 μl pożywki na dołek 48-dołkowej płytki.
    3. Policz limfocyty T za pomocą hemocytometru i przenieś całkowitą liczbę limfocytów T niezbędną do eksperymentu z elektroporacją (100 000-1 000 000 limfocytów T na kuwetę do elektroporacji) do probówki wirówkowej.
    4. Obracaj probówkę o gramaturze 90 x g przez 8 minut, aby ogarnąć komórki. Jeśli komórki zostały rozdzielone gradientem gęstości w ciągu 2 dni, wiruj je w temperaturze 200 x g przez 8 minut.
  3. W przypadku obu typów komórek należy odessać supernatant za pomocą pipety/odkurzacza, usuwając wszelkie pęcherzyki.
    1. Delikatnie zawiesić ogniwa za pomocą 20 μl buforu elektroporacyjnego na kuwetę.
    2. Dodaj 20 μl komórek (150 000-200 000 HSPC lub 100 000-1 000 000 limfocytów T) do każdej kuwety, która zawiera już 10 μl RNP, i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół bez tworzenia pęcherzyków.

3. Elektroporacja RNP

  1. Elektropoturuj kuwety po umieszczeniu ich w nukleofektorze. W przypadku HSPC należy użyć kodu impulsu ER100. W przypadku limfocytów T użyj kodu impulsu EH-115.
  2. Tylko HSPC: Dodać 100 μl uzupełnionej pożywki SFEM (podgrzanej do 37 °C) do każdej kuwety natychmiast po elektroporacji i pozostawić ogniwa do regeneracji przez 10-15 minut.
    1. Przenieść komórki do hodowli na 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem i dodać dodatkowe 100 μl uzupełnionej pożywki SFEM na 24 godziny.
    2. Zmień je na świeżo uzupełnioną pożywkę SFEM i inkubuj przez dodatkowe 24 - 72 godziny.
    3. Usuń komórki w celu ich genotypowania 48-96 godzin po elektroporacji. Wirować komórki w masie 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant przed rozpoczęciem ekstrakcji DNA (krok 8.2).
  3. Tylko limfocyty T: Dodać 80 μl kompletnej pożywki hodowlanej RPMI wstępnie podgrzanej do 37 °C ze zbiornika do każdej kuwety lub studzienki, używając pipety wielokanałowej (jeśli to konieczne).
    1. Inkubować je w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    2. Dodać odpowiednie podłoża, przeciwciała, cytokiny itp. do płytki (płytek) docelowych i wstępnie je ogrzać w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    3. Przenieść 107 μl elektroporowanych ogniw z dołków na okrągłodenną 96-dołkową płytkę za pomocą wielokanałowej pipety (jeśli to konieczne).
  4. Aby uzyskać informacje na temat oceny wyników edycji, przejdź do kroku 8.

4. Przygotowanie C. elegans

  1. 1 dzień przed mikroiniekcją: Przygotuj płatki agarozowe do mikroiniekcji.
    1. Przygotuj 3% (w/v) roztwór agarozy w wodzie, dodając agarozę do wody i doprowadzając roztwór do wrzenia na płycie grzejnej lub w kuchence mikrofalowej.
    2. Ułóż na stole szkiełka podstawowe o wymiarach 24 mm x 50 mm x 1,5 mm i za pomocą szklanej pipety Pasteura umieść na szkiełku małą (~15 μl) kroplę roztworu agarozy. Szybko spłaszcz kroplę agarozy, umieszczając na niej kolejne szkiełko nakrywkowe. Pozwól agarozie zastygnąć, a następnie usuń jedno z szkiełek nakrywkowych.
    3. Pozostaw na noc szkiełko nakrywkowe pokryte agarozą na blacie do góry do wyschnięcia. Po 24 godzinach przechowuj płatki agarozy w czystym, suchym pojemniku.
      UWAGA: Można ich używać w nieskończoność.
  2. Wyciągnij igły do mikroiniekcji: używając kapilar ze szkła borokrzemianowego z włóknami (średnica zewnętrzna 1,0 mm i średnica wewnętrzna 0,58 mm), wyciągnij igły w oparciu o Mello i Fire57 i inne zasoby58. Igły mogą być używane natychmiast lub mogą być przechowywane w czystym, suchym pojemniku, wzmocnionym glinianymi podporami.
  3. W celu utrzymania robaków należy przygotować agar z pożywką do wzrostu nicieni (NGM) przelany na płytki Petriego i nakrapiany bakteriami OP50 (protokoły dotyczące standardowej konserwacji C. elegans i przepisy na podłoża wzrostowe można znaleźć w Stiernagle59).
  4. Przygotowanie robaków do mikroiniekcji: 12-24 godziny przed mikroiniekcją pobrać hermafrodyty w stadium L4 na nową płytkę agarową NG z bakteriami OP50 i inkubować je przez noc w temperaturze 20 °C. Dla każdej mieszanki celu/iniekcji Cas9 wybierz ~30 robaków na płytkę.
  5. Dzień mikroiniekcji: Obciążyć wyciągniętą igłę do mikroiniekcji supernatantem z roztworem RNP przygotowanym w kroku 1.5.
    1. Odpipetować supernatant z kroku 1.5.4 do wyciągniętej pipety kapilarnej i napełnić roztwór z pipety kapilarnej do przygotowanej igły do mikroiniekcji (zwykle obciążenie mniejsze niż 0,1 μl).
  6. Zamontować załadowaną igłę na aparacie do mikroiniekcji podłączonym do mikromanipulatora. Ustawić ciśnienie w aparacie iniekcyjnym na 250 kPa, a ciśnienie równoważące na 25 kPa.
  7. Odłamać obciążoną końcówkę igły, aby uzyskać ostrą krawędź igły. Umieść kwadratowe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 15 mm x 15 mm x 1,5 mm na wierzchu szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 mm x 50 mm x 1,5 mm.
    1. Pokryj jedną krawędź kwadratowego szkiełka nakrywkowego olejem halocarbon 700.
    2. Umieścić igłę w oleju, na krawędzi kwadratowego szkiełka nakrywkowego o średnicy 15 mm.
    3. Używając ręki do prowadzenia stolika mikroskopu i szkiełka nakrywkowego, wyszczotkuj szkiełko w górę i wzdłuż krawędzi igły, jednocześnie wciskając pedał/przycisk wstrzykiwania. Odłamać końcówkę igły do tyłu, zwiększając przepływ płynu na zewnątrz igły. Osiągnij optymalne natężenie przepływu, sprawiając, że mieszanka iniekcyjna przepływa w górę wzdłuż krawędzi igły, tworząc ~1 pęcherzyk/s.
  8. Upewnij się, że robaki L4 pobrane 12-24 godziny przed mikrowstrzyknięciem są młodymi dorosłymi w stadium rozwojowym w dniu wstrzyknięcia. Zbierz młode dorosłe robaki na płytkę z agarem NG, na której brakuje bakterii OP50 i pozwól im czołgać się przez 5 minut. Zmniejsza to ilość bakterii przenoszonych do wkładki iniekcyjnej, minimalizując zatykanie się igły.
  9. Umieścić podkładkę do wstrzykiwań/szkiełko nakrywkowe z agarozą na lunecie sekcyjnym. Za pomocą wykałaczki połóż mały ślad oleju halowęglowego wzdłuż jednej krawędzi podkładki.
  10. Używając kilofa pokrytego olejem, podnieś kilka robaków z płytki agarowej NG i umieść je na ścieżce oleju. Za pomocą cienkiego włoska przymocowanego do pipety, takiej jak wąs do rzęs lub kota, ustaw robaki równolegle, delikatnie wpychając robaki do podkładki agarozowej. Dopóki procedura mikroiniekcji nie jest wygodna, należy montować i wstrzykiwać tylko jednego robaka na raz.
    UWAGA: Sucha agaroza będzie odprowadzać wilgoć z robaków, powodując ich przyleganie do podkładki. W związku z tym należy działać szybko, ponieważ robaki mogą wyschnąć.
    1. Po ustawieniu na miejscu i przymocowaniu do podkładki, pokryj robaki kolejnymi kilkoma kroplami oleju halowęglowego (~20 μL) z końcówki kilofa.

5. Mikroiniekcja gonad C. elegans z RNP i pielęgnacja po iniekcji

UWAGA: Protokół mikroiniekcji jest zaadaptowany z Mello i Fire57i szczegółowo opisany gdzie indziej60,61.

  1. Umieścić szkiełko nakrywkowe z zamontowanymi ślimakami na mikroskopie iniekcyjnym. W małym powiększeniu (obiektyw 5X, okular 10X) należy ustawić robaki prostopadle do igły do wstrzykiwań.
    1. Przełącz się na duże powiększenie (obiektyw 40X, okular 10X), zmień położenie igły w pobliżu ramienia gonady odpowiadającego obszarowi w pobliżu jąder w środkowym i późnym pachytenie.
    2. Za pomocą mikromanipulatora przysuń igłę do robaka, lekko dociskając naskórek. Następnie jedną ręką dotknij boku stolika mikroskopu, aby przebić igłę przez naskórek. Nacisnąć pedał/przycisk wstrzykiwania i powoli napełnić ramię gonady mieszanką do wstrzykiwań i wyjąć igłę.
    3. Powtórz ten krok z drugim ramieniem gonady.
  2. Po wstrzyknięciu robaków usuń szkiełko nakrywkowe/płatek agarozowy i umieść je pod mikroskopem preparacyjnym.
    1. Za pomocą wyciągniętej pipety kapilarnej usunąć olej z robaków, pipetując na nie bufor M9. Wykonaj ten zabieg, aby uwolnić robaki z agaru.
    2. Po 10 minutach, gdy robaki będą się miotać w buforze, przenieś je na płytkę NG-agar z bakteriami OP50 za pomocą wyciągniętej pipety kapilarnej. Umieść płytkę w temperaturze 20 °C na 2-3 godziny, aż robaki zregenerują się i zaczną się poruszać.
  3. Po odzyskaniu należy pojedynczo przenieść robaki na płytki agarowe NG z OP50 i przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 25 °C.
  4. Pozwól robakom, którym wstrzyknięto P0, rosnąć i składać potomstwo przez 3 dni. Przebadaj potomstwo F1.
    1. Jeśli korzystasz z co-CRISPR lub co-conversion62,63,64,65, wybierz potencjalne robaki do badań przesiewowych na podstawie tego, czy mają zmutowany fenotyp genu referencyjnego. Pojedynczo przenieść te oznaczone robaki na nowe płytki agarowe NG z OP50 i pozwolić im złożyć potomstwo F2 w temperaturze 20 °C.
      UWAGA: Fenotyp użyty do badania przesiewowego lub selekcji co-CRISPR powinien zapewnić wczesne oszacowanie sukcesu edycji Cas9.
    2. Jeśli fenotyp co-CRISPR nie jest obecny, należy wstrzyknąć plazmid kontroli dodatniej, aby poprawić skuteczność mikroiniekcji.
      UWAGA: Na przykład, włączenie plazmidu do mieszanki iniekcyjnej, który koduje MYO-2 oznaczony mCherry, pomoże ocenić skuteczność iniekcji. Robaki, którym pomyślnie wstrzyknięto pCFJ90, będą miały potomstwo z fluorescencyjnymi gardłami.
  5. Zbadaj robaki F1 pod kątem obecności pożądanych zmian. Wybierz matkę F1 do indywidualnego dołka na 96-dołkowej płytce, poddaj ją lizie i zbadaj jej DNA przez amplifikację PCR specyficzną dla insercji, analizę sekwencji DNA lub test nukleazy geodezyjnej (CEL-1)66.
    UWAGA: Testy te można przeprowadzić przy użyciu co-CRISPR/co-conversion lub innych systemów przesiewowych lub selekcji65,66,67,68.
  6. Aby uzyskać informacje na temat oceny wyników edycji, przejdź do kroku 8.

6. P. hawaiensis Przygotowanie

  1. Na 1 dzień przed mikroiniekcją należy wzbogacić wczesne zarodki, zakładając "zbiornik na pary" poprzedniego wieczoru; nowo oddzielone samice będą zawierały świeżo zapłodnione zarodki. Patrz Rehm i wsp.69 aby uzyskać szczegółowe informacje.
  2. W dniu mikroiniekcji należy pobrać jednokomórkowe zarodki Parhyale (0-4 godziny po zapłodnieniu), znieczulając ciężarne samice 0,02% olejkiem goździkowym w wodzie morskiej i delikatnie zeskrobując zarodki z brzusznej torby lęgowej za pomocą ciągniętej płomieniem i zaokrąglonej szklanej pipety oraz pary kleszczy #3.

7. P. hawaiensis Mikroiniekcja zarodka z RNP i opieka po iniekcji

  1. Wypełnić wyciągniętą rurkę kapilarną około 1 μl opisanej powyżej mieszanki iniekcyjnej RNP.
  2. Użyj sprasowanego azotu do mikrowstrzyknięcia każdego zarodka, jak opisano w Rehm i wsp.69.
    1. Wstrzyknąć zarodki Parhyale pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą mikrowstrzykiwacza i mikromanipulatora. Załadować 1,5 μl mieszanki iniekcyjnej do tylnej części wyciągniętej rurki kapilarnej (4 cale - 1,0 mm z włóknami, ciągniętej za pomocą aparatu do wyciągania mikropipet) za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki.
    2. Umieścić igłę na aparacie do wstrzykiwań i złamać końcówkę igły (bardzo małą ilość) za pomocą kleszczy pod lunetą sekcyjną. Skalibrować objętość dostarczaną przez wstrzyknięcie do oleju halowęglowego 700 i zmierzenie średnicy pęcherzyka.
    3. Wytnij "koryto" z utwardzacza za pomocą żyletki. Napełnij go do połowy wysterylizowaną wodą morską z filtrem i ułóż zarodki Parhyale w korycie, aby się ustabilizowały.
    4. Wstrzyknąć zarodki za pomocą zestawu do mikroiniekcji, stabilizując każdy zarodek za pomocą kleszczy podczas wstrzyknięcia. Po wstrzyknięciu należy użyć szklanej pipety transferowej, aby przenieść zarodki do świeżego naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm, wypełnionego do połowy wysterylizowaną wodą morską z filtrem.
  3. Jeśli pierwszy podział już nastąpił w celu utworzenia 2-komórkowego zarodka (4-6 godzin po zapłodnieniu), wygeneruj w pełni zmutowane zwierzęta, wstrzykując oba blastomery. Aby zapewnić całkowite rozszczepienie stadium 2-komórkowego, należy wstrzyknąć blastomery za pomocą dekstranu FITC lub TRITC i obserwować, że sygnał jest ograniczony do pojedynczego blastomeru pod fluorescencyjnym zakresem preparacyjnym po wstrzyknięciu.
    1. Alternatywnie, wygeneruj "pół-zmutowane" zwierzęta, wstrzykując tylko jeden z dwóch blastomerów w stadium 2-komórkowym (z grubsza podzielony od lewej do prawej w zależności od tkanki i pozycji wzdłuż osi A-P).
    2. Wstrzyknij jedną komórkę do 8-komórkowego zarodka (7,5-9 godzin po zapłodnieniu), aby ograniczyć edycję do pojedynczej listka zarodkowego. Patrz Gerberding i wsp.70 dla mapy wczesnych linii blastomerów.
  4. Inkubować zarodki w szalkach hodowlanych o średnicy 60 mm (nie więcej niż 25 na szalkę), wypełnionych do połowy wysterylizowaną wodą morską z filtrem, "wstępnie natlenionych" za pomocą bełkotki akwariowej lub przez energiczne potrząsanie.
    1. W celu utrzymania wilgotności umieścić szalki z zarodkami w luźno zamkniętym plastikowym naczyniu wyłożonym mokrymi ręcznikami papierowymi i umieścić je w inkubatorze o temperaturze 26 °C z 12-godzinnym cyklem jasnociemnym.
    2. Przenieś ocalałe zarodki do czystych naczyń z wodą morską co kilka dni.
      UWAGA: Zarodki mogą być hodowane w temperaturze pokojowej, chociaż będą się rozwijać znacznie wolniej.
  5. Rozciąć i utrwalić zarodki na różnych etapach w celu analizy ekspresji poprzez hybrydyzację in situ lub barwienie przeciwciałami (patrz Browne i wsp.71 dla przewodnika inscenizacji oraz dodatkowych odniesień do sekcji i utrwalenia72, hybrydyzacja in situ73, oraz barwienie przeciwciałami74).
    1. Wykonaj igły do rozwarstwiania, nawlekając wygięty kawałek drutu wolframowego o długości około 0,5 cala w koniec igły insulinowej. Naostrzyć igłę w wodorotlenku sodu pod prądem. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml jako uchwytu igły do preparacji.
    2. Napełnij jedną studzienkę 3-dołkowego szklanego naczynia do połowy świeżo przygotowanym roztworem 9 części buforu PEM (0,1 M RUR o pH 6,95, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4), 1-częściową 10x PBS i 1 częścią 32% PFA. Umieść 3-5 zarodków w naczyniu i wbij mały otwór w każdym zarodku, używając ostrej wolframowej igły do wbijania i lekko stępionej do stabilizacji, pozwalając żółtku wypłynąć i utrwalaczowi spłynąć.
    3. Za pomocą pary zaostrzonych igieł wolframowych delikatnie oderwij dwie zewnętrzne błony otaczające zarodek Parhyale. Rozdziel je na utrwalacz, aby zarodki były bardziej wytrzymałe, ale pracuj szybko, aby błona nie przylgnęła do zarodka, co utrudnia usunięcie błony. Pozwól zarodkom utrwalić się łącznie przez 15-20 minut w przypadku barwienia przeciwciał lub 40-50 minut w przypadku hybrydyzacji in situ.
  6. Zobrazuj żywe pisklęta i przeanalizuj je pod kątem fenotypów morfologicznych i behawioralnych lub utrwal je i wybarwij w celu bardziej szczegółowych analiz. Podnieś pisklęta do dojrzałości płciowej w ciągu 2-3 miesięcy, aby ustalić linie nokautujące i transgeniczne (zobacz Kontarakis i Pavlopoulos75, aby uzyskać informacje o pielęgnacji piskląt i inne przydatne szczegóły).

8. Ocena wyników edycji

  1. W razie potrzeby poszukaj wizualnego lub funkcjonalnego fenotypu w edytowanych komórkach lub organizmach.
    UWAGA: Ten proces będzie się znacznie różnił w zależności od aplikacji, a niektóre przykłady są opisane na końcu odpowiednich kroków protokołu powyżej. Po skorygowaniu mutacji sierpowatokrwinkowej w HSPC, przeanalizuj produkcję hemoglobiny przez zróżnicowane erytroblasty przy użyciu HPLC (Rysunek 1A). Nokaut genu receptora IL-2 w limfocytach T można potwierdzić za pomocą barwienia powierzchniowego i cytometrii przepływowej (Rysunek 1B). Aby ocenić fenotypy C. elegans i P. hawaiensis, obserwuj morfologię i zachowanie zwierząt pod mikroskopem świetlnym lub fluorescencyjnym (ryc. 1C i 1D).
  2. Aby określić wydajność i rodzaj wygenerowanych edycji genomu, należy poddać lizie pule edytowanych komórek i wyekstrahować ich genomowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji21.
  3. Aby szybko oszacować powstawanie indelu, amplifikuj PCR co najmniej 200 par zasad wokół miejsca cięcia i wykonaj endonukleazę T71 (T7E1)76 lub test geodezyjny (nukleaza CEL-1)77.
    1. Jeśli formacja indelowa w miejscu cięcia Cas9 lub udany HDR stworzy lub usunie znane miejsce restrykcyjne, rozważ użycie trawienia enzymem restrykcyjnym w celu oszacowania wydajności edycji6. Test polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) może być wygodnym sposobem sprawdzenia wydajności, jeśli jest dostępny.
    2. Aby uzyskać dokładne ilościowe określenie wydajności edycji i określenie dominujących wyników edycji, wyślij amplikon PCR do standardowego sekwencjonowania Sangera ze starterami do przodu i do tyłu.
      UWAGA: W przypadku analizy pojedynczego klonu lub organizmu, analiza wyników Sangera jest prosta, jak pokazano na rysunku Rysunek 2A. Jeśli analizujesz pulę komórek, przeanalizuj chromatogramy za pomocą narzędzia online78, jak pokazano w Rysunek 2B.
    3. Aby uzyskać pełną kwantyfikację i sekwencje wyników edycji, wykonaj głębokie sekwencjonowanie27,54, jak pokazano w Rysunek 2C.
    4. Aby ocenić konkretny zestaw zmian poza celem, należy amplifikować PCR przewidywane miejsca poza celem i wysłać je do NGS. Aby umożliwić wykrywanie translokacji chromosomowych, wykonaj GUIDE-seq79 lub wysokoprzepustowe sekwencjonowanie translokacji całego genomu (HTGTS)80. Aby uzyskać pełny obraz niedocelowych edycji w populacji klonalnej, wykonaj sekwencjonowanie całego genomu (WGS)81,82,83.
      UWAGA: Istnieje wiele metod ilościowego określania zmian genomu w obrębie i poza nim, wyjaśnionych bardziej szczegółowo w różnych artykułach przeglądowych84,85,86.

Wyniki

Niniejsze eksperymenty pokazują, w jaki sposób wstępnie złożone kompleksy RNP Cas9 mogą być wykorzystane do manipulacji genomami komórek pierwotnych oraz całych organizmów. Badacze oczyszczają lub kupują białko Cas9 oraz sgRNA, łączą oba komponenty w celu wstępnego sformowania kompleksu, a następnie wprowadzają RNP do wybranych komórek lub organizmów. Po odczekaniu czasu niezbędnego do zajścia edycji i narodzin potomstwa następnego pokolenia (jeśli dotyczy), należy sprawdzić fenotypy i/lub zebrać komórki do genotypowania. Fenotypy można obserwować za pomocą testów funkcjonalnych, analiz ekspresji, wizualizacji (gołym okiem lub przy użyciu mikroskopii) lub innych metod, w zależności od eksperymentu.

Na przykład HSPC, w których dokonano edycji w celu korekcji mutacji β-globiny odpowiedzialnej za anemię sierpowatą, mogą zostać zróżnicowane do erytrocytów, a następnie poddane analizie pod kątem produkcji zdrowej hemoglobiny lub hemoglobiny sierpowatej27,87 (Rysunek 1A). Limfocyty T, w których zedytowano gen wysokopowinowatego receptora IL-2, CD25 (IL2RA), w celu jego wyciszenia (knock-out), mogą być analizowane za pomocą barwienia powierzchniowego i cytometrii przepływowej8, a także analizowane funkcjonalnie w celu wykrycia odpowiedzi sygnałowej na stymulację IL-2 (Rysunek 1B). Limfocyty T mogą być również przeprogramowane na wiele istotnych klinicznie sposobów, co wymaga oceny różnych fenotypów, w tym skuteczności infekcji HIV89 oraz przeciwnowotworowej skuteczności komórek CAR-T in vivo1.

Stosując podejście przesiewowe oparte na co-CRISPR/co-konwersji, nicienie C. elegans poddawane są edycji jednocześnie w dwóch loci62. HDR w genie referencyjnym dpy-10 z użyciem ssODN jako matrycy naprawczej prowadzi do łatwego do oceny dominującej mutacji typu gain-of-function dpy-10. Heterozygotyczne zwierzęta F1dpy-10(gof) wykazują fenotyp roller (Rol), a homozygotyczne zwierzęta dpy-10(gof) fenotyp dumpy (Dpy). Obecność tego fenotypu wskazuje, że w tych zwierzętach doszło do edycji przez Cas9 i zwiększa szanse na zidentyfikowanie zdarzenia edycji w drugim locus u zwierząt F1 o fenotypie Rol lub Dpy. Udany eksperyment edycji powinien doprowadzić do tego, że 3-50% wstrzykniętych nicieni P0 da 20 lub więcej potomstwa F1 o fenotypie Rol lub Dpy90. Można następnie wybrać zwierzęta nie-Rol, aby przywrócić gen dpy-10 do typu dzikiego i wyselekcjonować homozygotyczną edycję interesującego nas genu. Jako ogólną zasadę przyjmuje się, że stężenie crRNA celującego w referencyjny gen co-CRISPR powinno wynosić połowę stężenia crRNA celującego w gen docelowy. Jeśli nie uda się odzyskać edycji w genie docelowym, można dostosować proporcje obu CRISPR RNA, aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania pożądanej mutacji. Na przykład zwiększenie ilości crRNA dla genu docelowego w stosunku do crRNA genu referencyjnego zwiększy odsetek nicieni posiadających edycje w genie docelowym w populacji nicieni, które posiadają również edycje w locus genu referencyjnego. Częstotliwości co-konwersji są zmienne, ale stawki zazwyczaj wynoszą 20-60%, często prowadząc do uzyskania edycji homozygotycznych w pokoleniu F1 (Rysunek 1C).

P. hawaiensis wyklute osobniki, u których dokonano edycji w celu wyłączenia genu Abdominal-B (Abd-B), wykazują wyraźne anomalie morfologiczne3 (Rysunek 1D). Gen ten jest niezbędny do prawidłowego kształtowania odwłoka, a jego zaburzenie prowadzi do zastąpienia nóg pływających i kotwiczących, które zazwyczaj występują na odwłoku, nogami skaczącymi i chodzącymi o typie klatkowym.

Wyznaczanie wyników edycji genomu na poziomie genotypowym wymaga sekwencjonowania lub przeprowadzenia testu in vitro wykrywającego zmiany w sekwencji. Poniżej przedstawiamy reprezentatywne dane z sekwencjonowania dla naszych modelowych typów komórek i organizmów, ilustrujące różne podejścia do ilościowego określania stopnia edycji. Należy zauważyć, że etykiety na rysunkach są uogólnione, ponieważ wszystkie przedstawione tutaj metody mogą być zastosowane w dowolnym systemie biologicznym.

Metody oparte na sekwencjonowaniu różnią się pod względem złożoności technicznej i szczegółowości wyników. W przypadku populacji klonalnie edytowanych lub łatwo rozdzielnych osobniczych organizmów, osobniki edytowane można sekwencjonować po ekstrakcji genomowego DNA. Standardowe wyniki sekwencjonowania metodą Sangera ujawnią zmianę sekwencji w miejscu cięcia przez Cas9 u danego osobnika, z hipotetycznymi przesunięciami ramki odczytu, które zakłóciłyby jego funkcję (Rycina 2A). Narzędzie online wykorzystywane do sekwencjonowania to kolejne podejście oparte na sekwencjonowaniu metodą Sangera, które można zastosować do populacji mieszanych, a nie tylko do poszczególnych mutantów78. Sekwencje są analizowane za pomocą narzędzia online, które pozwala oszacować ogólną wydajność edycji oraz dominujące wyniki sekwencyjne. Reprezentatywne dane przedstawiono na Rycynie 2B.

Najdokładniejszą opisaną tutaj metodą sekwencjonowania jest sekwencjonowanie głębokie (czasami nazywane wysokoprzepustowym lub sekwencjonowaniem następnej generacji). Metoda ta dostarcza sekwencji DNA z poszczególnych genomów w populacji mieszanej. Takie dane można przedstawić na różne sposoby. W tym przypadku sklasyfikowano poszczególne odczyty sekwencjonowania z edytowanych komórek na podstawie wyniku edycji (Rycina 2C). Większość komórek jest edytowana poprzez ścieżkę NHEJ, co zazwyczaj prowadzi do przerwania genu. W innych przypadkach gen docelowy został zastąpiony alternatywną wersją poprzez HDR27.

Tabela metod edycji genów; HSPC, limfocyty T, C. elegans, P. hawaiensis; sekwencjonowanie i analiza.
Tabela 1: Kontrole pozytywne dla wstępnych eksperymentów edycji genomu. W poniższej tabeli przedstawiono kluczowe informacje niezbędne do przeprowadzenia pierwszego eksperymentu z edycji genomu w każdej z komórek i organizmów opisanych w niniejszym protokole. Przestrzeganie tych parametrów prawdopodobnie pozwoli uzyskać pomyślny wynik, który może posłużyć do przetestowania protokołu lub jako punkt odniesienia do porównań, gdy badacz zacznie celować w geny będące przedmiotem własnych zainteresowań. F: forward (przednia), R: reverse (odwrotna), HDR: homology-directed repair (naprawa sterowana homolgią). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Schemat oceny fenotypu HSPC HBB, limfocytów T CD25, C. elegans yfg oraz P. hawaiensis Abd-B.
Rycina 1Reprezentatywne wyniki fenotypowe edycji pierwotnych ludzkich komórek i organizmów za pomocą kompleksów RNP Cas9. (A) Jest to chromatogram HPLC wykazujący, że po udanej edycji genomu HSPC zróżnicowane do erytroblastów na późnym etapie rozwoju produkują więcej funkcjonalnej hemoglobiny niż hemoglobiny sierpowej. Erytrocyty zmutowane produkują hemoglobinę sierpową (HbS), natomiast komórki poddane udanej edycji będą produkować hemoglobinę prawidłową (HbA i HbA2) oraz hemoglobinę płodową (HbF). Absorbancja została przedstawiona w jednostkach arbitralnych (au). Ten panel został opublikowany po raz pierwszy w pracy DeWitta ei wsp.27Tekst został przedrukowany za zgodą American Association for the Advancement of Science. (B) Po lewej stronie, dla każdego stanu, panel ten przedstawia dane z cytometrii przepływowej wykazujące, że limfocyty T barwione powierzchniowo nie wykazują ekspresji CD25 po CD25 gen został wyłączony za pomocą RNP. Zawartość CD25 przedstawiono na osi x, a wielkość komórek na osi y. Po prawej stronie, dla każdego stanu doświadczalnego, ten panel przedstawia ilościowe oznaczenie fosfo-Stat5 (pStat5) po indukcji IL-2. Sygnalizacja jest zmniejszona w przypadku braku receptora IL-2 (CD25 KO). Zawartość pStat5 naniesiono na oś X, a dane uzyskane dla trzech różnych poziomów stymulacji IL-2 porównano w pionie. (C) Ten panel przedstawia Caenorhabditis elegans celowanie w screening co-CRISPR/co-konwersji dpy-10 jako marker współkonwersji. Dwa gRNA celują w dwa loci, dpy-10 or Twój ulubiony gen (yfg), w tej samej P0-wstrzyknięte zwierzę. HDR w dpy-10 wynikiem jest fenotyp Rol lub Dpy. Wybór Rol- lub Dpy-F1 zwierzęta zwiększają szanse na zidentyfikowanie edycji w drugim locus. (D) Ten panel pokazuje, że typ dziki Parhyale hawaiensis wylęgły mają prawidłowo rozwinięte odwłoki z odnóżami pływakowymi i kotwiczącymi. Abd-B wyklute osobniki z nokautem (F0 osobniki) wykształcają odwłok przekształcony w klatkę piersiową. W rezultacie odnóża pływające i kotwiczące zanikają, a ich miejsce zajmują odnóża skaczące i chodzące, charakterystyczne dla prawidłowo rozwiniętej klatki piersiowej. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza edycji genów; obejmuje sekwencjonowanie metodą Sangera, TIDE, głębokie sekwencjonowanie; wyniki edycji CRISPR Cas9.
Rysunek 2Typowe wyniki metod analizy efektów edycji. (A) Ten panel przedstawia przykłady wyników sekwencjonowania metodą Sangera dla poszczególnych F1 P. hawaiensis organizmy, w tym sekwencja typu dzikiego oraz trzy różne insercje/delecje (indele), które zaburzają funkcję genu poprzez przesunięcie ramki odczytu. (B) Wyniki analizy TIDE pokazują zakres insercji i delecji, które wystąpiły w miejscu docelowym Cas9 w puli sekwencjonowanych limfocytów T. Oś x wskazuje długość danej insercji lub delecji w nukleotydach. (C) Wyniki sekwencjonowania głębokiego wykazują brak edycji genomu bez nukleofekcji lub gRNA oraz skuteczną edycję z zastosowaniem nienaruszonych kompleksów RNP Cas9, pogrupowane według wyników naprawy DNA w HSPC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Dyskusja

Ustanowienie solidnego protokołu edycji genomu w linii komórkowej lub organizmie będącym przedmiotem zainteresowania wymaga optymalizacji i empirycznego przetestowania kilku kluczowych parametrów, omówionych w tej sekcji. Gorąco zachęcamy do wypróbowania kilku wariantów przedstawionych tutaj ogólnych podejść. Kluczowym ograniczeniem tego protokołu jest to, że zastosowanie tych metod do innych komórek lub organizmów może prowadzić do różnych wyników w zależności od badanego gatunku, a projekt eksperymentalny, który prowadzi do wysokowydajnego nokautu genu, może nie sprzyjać insercji DNA. Dlatego zalecamy rozpoczęcie od przedstawionych tutaj metod i rozwiązywanie problemów zgodnie z opisem poniżej.

Rozwiązywanie problemów z jakością odczynnika do edycji genomu:
Wytwarzanie lub kupowanie wysokiej jakości odczynników jest kluczowym krokiem w każdym protokole edycji genomu. Białko Cas9 można oczyścić w laboratorium lub kupić komercyjnie. Wiele protokołów odnotowuje końcowe stężenie Cas9 w recepturach RNP, ale optymalna aktywność edycji genów będzie zależeć od specyficznej aktywności każdego pojedynczego preparatu białka Cas9, która różni się w zależności od źródła. Gdy przedstawiony tutaj protokół zacznie działać, rozważ optymalizację ilości RNP używanej do miareczkowania poziomów Cas9 w celu ustalenia optymalnego stężenia: takiego, które zapewnia wysoce specyficzne docelowe rozszczepienie DNA bez niepotrzebnego rozszczepienia poza celem spowodowanego nadmiernym Cas940.

Czystość i jednorodność RNA może być również wyznacznikiem sukcesu edycji genomu22. Zakupione sgRNA lub oddzielne składniki crRNA i tracrRNA są na ogół odczynnikami wysokiej jakości, a dostępne są różne modyfikacje chemiczne w celu zwalczania problemów z degradacją RNA lub nadania dodatkowych funkcji RNP91. Podczas gdy chemicznie modyfikowane gRNA mogą nie być konieczne do standardowych eksperymentów edycji genomu, niektóre grupy zaobserwowały znacznie wyższą wydajność edycji takich odczynników, więc mogą być warte wypróbowania po opanowaniu procesu i / lub gdy degradacja gRNA wydaje się być problemem22,91. Transkrypcja in vitro, a następnie oczyszczanie żelu jest niedrogą alternatywą, która może być wystarczająca do rutynowych eksperymentów z edycją genomu 17,21,49,50. Co więcej, kilka podejść, które są powszechnie stosowane do wytwarzania jednorodnych populacji gRNA in vivo, w tym wycinanie poszczególnych przewodników na podstawie rybozymu i tRNA, można rozszerzyć na preparat RNA in vitro w celu wytworzenia czystszych produktów92.

Przewodnik po wskazówkach dotyczących projektowania RNA i DNA dawcy:
Przewodnia selekcja RNA jest kluczowym czynnikiem w osiągnięciu wysoce wydajnej edycji na miejscu przy jednoczesnej minimalizacji szans na rozszczepienie poza celem. Aby pomóc w wyborze przewodników, w kilku badaniach wykorzystano wysokoprzepustowe ekrany w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji w celu skompilowania cech sekwencji udanych przewodników 47,79,93,94,95,96. Cechy te zostały wykorzystane do opracowania algorytmów predykcyjnych i narzędzi online, które pomagają w wyborze przewodników 44,45,46,47,48. Takie algorytmy są oparte na ekranach wykorzystujących systemy oparte na DNA do prowadzenia ekspresji RNA. Przewodniki są wyrażane za pomocą promotora Pol III, a zatem ich ekspresja jest podatna na ograniczenia związane z transkrypcją Pol III, takie jak przedwczesne zakończenie w przypadku napotkania śladów uracylu 97,98,99. Jednak zastosowanie RNP wykonanych z syntetyzowanych in vitro przewodnikowych RNA omija te obawy i upraszcza ograniczenia dotyczące projektowania przewodników. Wspólną cechą, która wyłoniła się z tych algorytmów i została potwierdzona w licznych badaniach z wysoce skuteczną edycją genomu, jest obecność puryny, w szczególności guaniny, na końcu 3′ sekwencji specyficznej dla celu przewodnika. Ta funkcja przewodnika odniosła duży sukces wśród organizmów, od ssaków po C. elegans, muszki owocowe i danio pręgowane 65,100,101. Ponadto, w przypadku C. elegans, projektowanie przewodników z dinukleotydem GG na końcu 3′ regionu docelowego przewodnika jest skuteczną strategią przewidywania wysoce skutecznych przewodnikowych RNA65. Najlepiej byłoby przetestować wiele prowadnic równolegle, aby określić, który z nich jest najbardziej skuteczny dla danej aplikacji.

Przy próbie wprowadzenia sekwencji DNA do genomu, kluczowe znaczenie ma również projekt DNA dawcy lub matrycy. Jednoniciowe donory oligonukleotydów (ssODN) są wprowadzane bardziej niezawodnie niż inne typowe matryce naprawcze, liniowe dwuniciowe i plazmidowe DNA 54,55,102. W niektórych loci wydajność HDR można poprawić za pomocą ssODN, które są komplementarne do niedocelowej lub przemieszczonej nici DNA i mają ramiona homologiczne o asymetrycznej długości27,55. Ponieważ matryca naprawcza jest wprowadzana w miejscu cięcia i zawiera docelową sekwencję, należy podjąć kroki, aby zapobiec rozszczepieniu DNA dawcy przez Cas9 przed lub po insercji genomu. Osiąga się to poprzez ciche mutacje w sekwencji PAM lub regionie nasiennym, unikając rozpoznania przez Cas9 przy jednoczesnym zachowaniu funkcji wstawionego genu 21,103. Chociaż nawet zmiany pojedynczego nukleotydu w PAM prawdopodobnie zniosą wiązanie104, spróbuj zmienić co najmniej cztery nukleotydy, aby być bezpiecznym.

Znaczenie i przyszłe zastosowania:
Edycja genomu za pomocą CRISPR-Cas9 stała się potężną metodą umożliwiającą łatwą manipulację genetyczną dowolnym organizmem. Edycja za pomocą Cas9 RNP na początku wymaga nieco więcej wysiłku, ale jest prosta w użyciu po ustaleniu odczynników i protokołów w laboratorium. Edycja komórek ze wstępnie złożonym RNP zamiast plazmidowego DNA prowadzi do wyższej ogólnej wydajności edycji, w tym trudnej do osiągnięcia insercji genu za pomocą HDR, z mniejszą liczbą efektów poza celem 24,25,26,27,29. Co więcej, eksperymentatorzy unikają problemów z ekspresją genów, degradacją RNA, fałdowaniem białek i związkiem między cząsteczkami gRNA i Cas9 syntetyzowanymi oddzielnie w komórce22,23. Edycja RNP pozwala również obejść obawy dotyczące bezpieczeństwa związane z mutagenezą insercyjną i trwałą ekspresją, które mogą wystąpić, gdy metody dostarczania wirusa są stosowane klinicznie14. Ze względu na te zalety wielu naukowców przeprowadzających przedkliniczne eksperymenty potwierdzające słuszność koncepcji faworyzuje edycję RNP do zastosowań terapeutycznych u ludzi. Zarówno metody edycji genomu oparte na RNP in vivo, jak i ex vivo są opracowywane w celu leczenia, a nawet leczenia różnych schorzeń, od chorób genetycznych, takich jak dystrofia mięśniowaDuchenne'a 105 i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa27 po HIV29 i raka11. Co ciekawe, Cas9 RNP jest coraz częściej stosowany jako metoda dostarczania w inżynierii rolniczej, ponieważ umożliwia "wolną od DNA" edycję roślin 33,34,36.

Oświadczenia

Autorzy, Alexander Marson i Jacob E. Corn, są współzałożycielami Spotlight Therapeutics. Jacob E. Corn jest doradcą Mission Therapeutics, a jego laboratorium otrzymało sponsorowane wsparcie badawcze od firm AstraZeneca i Pfizer. Alexander Marson jest doradcą Juno Therapeutics i PACT Therapeutics, a jego laboratorium otrzymało sponsorowane wsparcie badawcze od Juno Therapeutics, Epinomics i Sanofi. Jego laboratorium złożyło również wnioski o patenty związane z technologią Cas9 RNP.

Podziękowania

Dziękujemy wielu poprzednim członkom naszych laboratoriów i społeczności edycji genomu z Bay Area za ich wkład w rozwój tych metod. Dziękujemy Rossowi Wilsonowi za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Badania Alexandra Marsona są wspierane przez dar od Jake'a Aronova i grant National Multiple Sclerosis Society (CA 1074-A-21). Alexander Marson otrzymał nagrodę Career Award for Medical Scientists przyznaną przez Burroughs Wellcome Fund i jest badaczem Chan Zuckerberg Biohub. Badania Jacoba E. Corna są wspierane przez Fundację Li Ka Shing, Instytut Medyczny Heritage Medical Research oraz Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej. Badania Behnoma Farbouda i Barbary J. Meyer są częściowo finansowane z grantu NIGMS R01 GM030702 dla Barbary J. Meyer, która jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa. Badania Erin Jarvis i Nipam H. Patel są częściowo finansowane z grantu NSF IOS-1257379, a Erin Jarvis dziękuje za wsparcie ze strony NSF GRFP i Philomathia Graduate Fellowship.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reagent/Materials
DNA oligonukleotydyIntegrated DNATechnologies-IDTdostarczy niestandardowe sekwencje DNA, w tym te z Tabeli 1
Przewodnikowe RNASynthego-Synthegodostarczy wysokiej jakości sgRNA dla S. pyogenes Cas9, w tym niestandardowe sgRNA zawierające sekwencje docelowe zawarte w Tabeli 1
Oczyszczone białko Cas9 (EnGen  Cas9 NLS, S. pyogenes)New England BiosciencesM0646TJeśli to możliwe, oczyszczanie Cas9 we własnym zakresie lub zakup w lokalnych ośrodkach jest tańszą opcją
Normalne komórki macierzyste/progenitorowe CD34+ krwi obwodowejAllCellsPB032-2
StemSpan SFEM StemCell Technologies09650
StemSpan CC110StemCell Technologies02697
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonzaV4XP-3032
RPMI-1640 Medium, z wodorowęglanem sodu, bez L-glutaminy, płynSigmaR0883-6X500ML
EasySep™ Zestaw do izolacji ludzkich limfocytów T Stemcell17951
płytka do hodowli komórek, 96 dołków, okrągłaFisher Scientific3799
CTS (systemy terapii komórkowej) Dynabeads CD3/CD28Life Tech40203D 
Reombinant Human IL-2UCSF PharmacyNA
SepMate-50 500-pack IVDStemcell Technologies85460
OP50 Escherichia coliCaenorhabditis Genetics CenterOP-50https://cgc.umn.edu/
Agar z pożywką do wzrostu nicieni na szalkach Petriego--Zobacz Stiernagle, T (ref. 59)
Standardowe kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem:  4 cale (100 mm), 1/0,58 OD/IDWorld Precision Instruments1B100F-4
Standardowe kapilary ze szkła borokrzemianowego z pojedynczą lufą: 6 cali (152 mm), 2/1,12 OD/ID Światowe instrumenty precyzyjne1B200-6 
Szkło nakrywkowe; 24 & razy; 50 mmThermo Fisher Scientific12-544E
Szkło nakrywkowe; 22 & razy; 22 mmThermo Fisher Scientific12-518-105K
Apex LE agarozaGenesee Scientific20-102
Olej halowęglowy 700Sigma-Aldrich H8898-100ML
plazmid pCFJ90Addgene19327
Sprężony
mM Naczynia hodowlaneBD
Rurki kapilarne z żarnikiem: 4 cale (1,0 mm) World Precision InstrumentsT2100F-4
Sylgard 184 SzalkiDow Corning
(100 & razy; 15 mm)-
Drut wolframowy (średnica 0,005 cala)Ted Pella
Perfluoroalkoksyalkowy (PFA)-
Sól morska-9
" pipety Pasteura-
fenolowa
bez nukleazy woda-
Sprzęt
4D NucleofectorLonzaAAF-1002X
MZ75  Mikroskop stereoskopowyLeica Poza produkcją. Obecny model to mikroskop fluorescencyjny
Axio Vert35 z odwróconym kontrastem fazowymZeissnieprodukowany. Obecny model to laserowy ściągacz do mikropipet Axio VertA.1
(dla protokołu C. elegans)Sutter Instrument FG-P2000
Mikrowtryskiwacz pikoliter (do protokołu C. elegans)Warner InstrumentsPLI-100A Trójosiowy
mikromanipulator hydrauliczny oleju z joystickiemNarishige InternationalMO-202U
Manipulator zgrubnyNarishige InternationalMMN-1
Ściągacz do mikropipet (do protokołu P. hawaiensis)Sutter Instrument Mikroiniektor P-80/PC
(do protokołu P. hawaiensis)NarishigeIM300
Końcówki do pipet do mikroładowarekEppendorf5242956003
NG-agar
azot-60 Petriego -Czerwień M80,

Bibliografia

  1. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes. Cell. , 1-17 (2016).
  2. Barrangou, R., Horvath, P. A decade of discovery: CRISPR functions and applications. Nature Microbiology. 2, 1-9 (2017).
  3. Martin, A., Serano, J. M., et al. CRISPR/Cas9 mutagenesis reveals versatile roles of Hox genes in crustacean limb specification and evolution. Current Biology. 26 (1), 14-26 (2016).
  4. Goldstein, B., King, N. The future of cell biology: emerging model organisms. Trends in Cell Biology. 26 (11), 818-824 (2016).
  5. Mali, P., Yang, L., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Cong, L., Ran, F. A., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  7. Deltcheva, E., Chylinski, K., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).
  8. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Nowak, C. M., Lawson, S., Zerez, M., Bleris, L. Guide RNA engineering for versatile Cas9 functionality. Nucleic Acids Research. 44 (20), 9555-9564 (2016).
  10. Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. , 1-9 (2013).
  11. Rupp, L. J., Schumann, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated PD-1 disruption enhances anti-tumor efficacy of human chimeric antigen receptor T cells. Scientific Reports. 7 (1), 737(2017).
  12. Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16, 260(2015).
  13. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 2270(2016).
  14. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering delivery vehicles for genome editing. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 7, 637-662 (2016).
  15. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
  16. Zuris, J. A., Thompson, D. B., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  17. Cho, S. W., Lee, J., Carroll, D., Kim, J. -S., Lee, J. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Genetics. 195 (3), 1177-1180 (2013).
  18. Wang, W., Kutny, P. M., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
  19. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
  20. Remy, S., Chenouard, V., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7 (1), 16554(2017).
  21. DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 1-7 (2017).
  22. Hendel, A., Bak, R. O., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nature Biotechnology. 33 (9), 985-989 (2015).
  23. Thyme, S. B., Akhmetova, L., Montague, T. G., Valen, E., Schier, A. F. Internal guide RNA interactions interfere with Cas9-mediated cleavage. Nature Communications. 7, 11750(2016).
  24. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. -S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  25. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766(2014).
  26. Liang, X., Potter, J., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  27. DeWitt, M. A., Magis, W., Bray, N. L., Wang, T. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Science Translational Medicine. 8 (360), (2016).
  28. Ramakrishna, S., Kwaku Dad, A. -B., Beloor, J., Gopalappa, R., Lee, S. -K., Kim, H. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
  29. Schumann, K., Lin, S., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  30. Lee, J. -S., Kwak, S. -J., et al. RNA-guided genome editing in Drosophila with the purified Cas9 protein. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda, MD). 4 (7), 1291-1295 (2014).
  31. Sung, Y. H., Kim, J. M., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
  32. Menoret, S., De Cian, A., et al. Homology-directed repair in rodent zygotes using Cas9 and TALEN engineered proteins. Scientific Reports. 5, 14410(2015).
  33. Woo, J. W., Kim, J., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
  34. Malnoy, M., Viola, R., et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Frontiers in Plant Science. 7, 1904(2016).
  35. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 7, 13274(2016).
  36. Liang, Z., Chen, K., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261(2017).
  37. Shin, S. -E., Lim, J. -M., et al. CRISPR/Cas9-induced knockout and knock-in mutations in Chlamydomonas reinhardtii. Scientific Reports. 6, 27810(2016).
  38. Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 754-764 (2016).
  39. Grahl, N., Demers, E. G., Crocker, A. W., Hogan, D. A. Use of RNA-protein complexes for genome editing in non-albicans Candida species. mSphere. 2 (3), (2017).
  40. Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. A standard methodology to examine on-site mutagenicity as a function of point mutation repair catalyzed by CRISPR/Cas9 and ssODN in human cells. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
  41. Nandal, A., Mallon, B., Telugu, B. P. Efficient generation and editing of feeder-free IPSCs from human pancreatic cells using the CRISPR-Cas9 system. Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  42. Mohr, S. E., Hu, Y., Ewen-Campen, B., Housden, B. E., Viswanatha, R., Perrimon, N. CRISPR guide RNA design for research applications. The FEBS Journal. 283 (17), 3232-3238 (2016).
  43. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (95), e52118(2015).
  44. Hsu, P. D., Scott, D. A., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  45. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  46. Moreno-Mateos, M. A., Vejnar, C. E., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  47. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
  48. Haeussler, M., Schönig, K., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  49. Lo, T. -W., Pickle, C. S., et al. Precise and heritable genome editing in evolutionarily diverse nematodes using TALENs and CRISPR/Cas9 to engineer insertions and deletions. Genetics. 195 (2), 331-348 (2013).
  50. Bassett, A., Liu, J. -L. CRISPR/Cas9 mediated genome engineering in Drosophila. Methods. 69 (2), 128-136 (2014).
  51. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly efficient, rapid and co-CRISPR independent genome editing in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. , Bethesda, MD. (2017).
  52. Hirsh, A. Cas9 expression and purification protocol. protocols.io. , (2017).
  53. DeWitt, M. A., Wong, J. In vitro transcription of guide RNAs. protocols.io. , (2017).
  54. Yang, L., Guell, M., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
  55. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  56. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121-122, 86-93 (2017).
  57. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  58. Sutter Pipette Cookbook. , Available from: https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2017).
  59. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , (2006).
  60. Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook: the online review of C. elegans biology. , (2006).
  61. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
  62. Kim, H., Ishidate, T., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  63. Arribere, J. A., Bell, R. T., Fu, B. X. H., Artiles, K. L., Hartman, P. S., Fire, A. Z. Efficient marker-free recovery of custom genetic modifications with CRISPR/Cas9 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (3), 837-846 (2014).
  64. Ward, J. D. Rapid and precise engineering of the Caenorhabditis elegans genome with lethal mutation co-conversion and inactivation of NHEJ repair. Genetics. 199 (2), 363-377 (2015).
  65. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
  66. Wood, A. J., Lo, T. -W., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307(2011).
  67. Friedland, A. E., Tzur, Y. B., Esvelt, K. M., Colaiácovo, M. P., Church, G. M., Calarco, J. A. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
  68. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nature Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
  69. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (1), (2009).
  70. Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development (Cambridge, England). 129 (24), 5789-5801 (2002).
  71. Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42 (3), New York, NY. 124-149 (2005).
  72. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (1), (2009).
  73. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (1), (2009).
  74. Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (1), (2009).
  75. Kontarakis, Z., Pavlopoulos, A. Transgenesis in non-model organisms: the case of Parhyale. Methods in Molecular Biology. 1196, Clifton, NJ. 145-181 (2014).
  76. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. -S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Research. 19 (7), 1279-1288 (2009).
  77. Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. BioTechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  78. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  79. Tsai, S. Q., Zheng, Z., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  80. Frock, R. L., Hu, J., Meyers, R. M., Ho, Y. -J., Kii, E., Alt, F. W. Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 179-186 (2015).
  81. Smith, C., Gore, A., et al. Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).
  82. Veres, A., Gosis, B. S., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
  83. Kim, D., Bae, S., et al. Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells. Nature Methods. 12 (3), 237-243 (2015).
  84. Hendel, A., Fine, E. J., Bao, G., Porteus, M. H. Quantifying on- and off-target genome editing. Trends in Biotechnology. 33 (2), 132-140 (2015).
  85. O'Geen, H., Yu, A. S., Segal, D. J. How specific is CRISPR/Cas9 really. Current Opinion in Chemical Biology. 29, 72-78 (2015).
  86. Tsai, S. Q., Joung, J. K. Defining and improving the genome-wide specificities of CRISPR-Cas9 nucleases. Nature Reviews Genetics. 17 (5), 300-312 (2016).
  87. Hoban, M. D., Cost, G. J., et al. Correction of the sickle cell disease mutation in human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 125 (17), 2597-2604 (2015).
  88. Simeonov, D. R., Gowen, B. G., et al. Discovery of stimulation-responsive immune enhancers with CRISPR activation. Nature. , (2017).
  89. Hultquist, J. F., Schumann, K., et al. A Cas9 ribonucleoprotein platform for functional genetic studies of HIV-host interactions in primary human T cells. Cell Reports. 17 (5), 1438-1452 (2016).
  90. Paix, A., Wang, Y., et al. Scalable and versatile genome editing using linear DNAs with microhomology to Cas9 sites in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1347-1356 (2014).
  91. Lee, K., Mackley, V. A., et al. Synthetically modified guide RNA and donor DNA are a versatile platform for CRISPR-Cas9 engineering. eLife. 6, (2017).
  92. Minkenberg, B., Wheatley, M., Yang, Y. CRISPR/Cas9-enabled multiplex genome editing and its application. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 111-132 (2017).
  93. Doench, J. G., Fusi, N., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  94. Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. , 1-8 (2014).
  95. Liu, H., Wei, Z., Dominguez, A., Li, Y., Wang, X., Qi, L. S. CRISPR-ERA: a comprehensive design tool for CRISPR-mediated gene editing, repression and activation. Bioinformatics (Oxford, England). 31 (22), 3676-3678 (2015).
  96. Wu, X., Scott, D. A., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology. 32 (7), 670-676 (2014).
  97. Bogenhagen, D. F., Brown, D. D. Nucleotide sequences in Xenopus 5S DNA required for transcription termination. Cell. 24 (1), 261-270 (1981).
  98. Cozzarelli, N. R., Gerrard, S. P., Schlissel, M., Brown, D. D., Bogenhagen, D. F. Purified RNA polymerase III accurately and efficiently terminates transcription of 5S RNA genes. Cell. 34 (3), 829-835 (1983).
  99. Chen, B., Gilbert, L. A., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
  100. Gagnon, J. A., Valen, E., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).
  101. Ren, X., Yang, Z., et al. Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Reports. 9 (3), 1151-1162 (2014).
  102. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  103. Serano, J. M., Martin, A., et al. Comprehensive analysis of Hox gene expression in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Developmental Biology. 409 (1), 297-309 (2016).
  104. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. , 1-17 (2014).
  105. Lee, K., Conboy, M., et al. Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleoprotein and donor DNA in vivo induces homology-directed DNA repair. Nature Biomedical Engineering. 1 (11), 889-901 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

RNP CRISPR Cas9edycja gen wkompleks rybonukleoproteinowyprojektowanie gRNAprotok elektroporacjiedycja limfocyt w Tedycja HSPCmikroiniekcja C elegansiniekcja embrion w Parhyaleanaliza cytometryczna
Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.