Artykuł metodologiczny

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

DOI:

10.3791/57353

⸱

21 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, MS-0314, University of Nevada, 2Integrated Neuroscience Graduate Program, University of Nevada

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność owadów do nawigacji w kierunku źródeł zapachu zależy od aktywności ich neuronów receptorów węchowych pierwszego rzędu (ORN). Chociaż wygenerowano znaczną ilość informacji na temat reakcji ORN na substancje zapachowe, rola określonych ORN w kierowaniu reakcjami behawioralnymi pozostaje słabo poznana. Komplikacje w analizach zachowania wynikają z różnej lotności substancji zapachowych, które aktywują poszczególne ORN, wielu ORN aktywowanych przez pojedyncze substancje zapachowe oraz trudności w odtworzeniu naturalnie obserwowanych zmian czasowych bodźców węchowych przy użyciu konwencjonalnych metod dostarczania zapachów w laboratorium. W tym miejscu opisujemy protokół, który analizuje zachowanie larw Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną stymulację optogenetyczną jego ORN. Zastosowana tu technologia optogenetyczna pozwala na specyficzność aktywacji ORN i precyzyjną kontrolę czasowych wzorców aktywacji ORN. Odpowiedni ruch larw jest śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania. Zastępując bodźce zapachowe bodźcami świetlnymi, metoda ta pozwala na bardziej precyzyjną kontrolę indywidualnej aktywacji ORN w celu zbadania jej wpływu na zachowanie larw. Nasza metoda może zostać rozszerzona o badanie wpływu neuronów projekcyjnych drugiego rzędu (PN), a także neuronów lokalnych (LN) na zachowanie larw. Metoda ta umożliwi zatem kompleksową analizę funkcji obwodów węchowych i uzupełni badania nad tym, jak aktywność neuronów węchowych przekłada się na reakcje behawioralne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Informacje węchowe w środowisku larwy Drosophila są wykrywane tylko przez 21 funkcjonalnie odrębnych ORN, których aktywność ostatecznie determinuje zachowanie larw1,2,3,4. Jednak stosunkowo niewiele wiadomo na temat logiki, za pomocą której informacje sensoryczne są kodowane w działaniach tych 21 ORN-ów. Istnieje zatem potrzeba eksperymentalnego zmierzenia funkcjonalnego wkładu każdej larwy ORN w zachowanie.

Chociaż profil reakcji sensorycznej całego repertuaru larw ORN Drosophila został szczegółowo zbadany1,4,5, wkład poszczególnych ORN-ów w obwód węchowy, a tym samym w zachowanie nawigacyjne, pozostaje w dużej mierze nieznany. Dotychczasowe trudności w badaniach nad zachowaniem larw wynikają z niemożności przestrzennej i czasowej aktywacji pojedynczych ORN. Panel substancji zapachowych, które specyficznie aktywują 19 z 21 larw Drosophila ORN, został niedawno opisany 1. Każdy środek zapachowy w panelu, w niskich stężeniach, wywołuje reakcję fizjologiczną tylko ze swojego pokrewnego ORN. Jednak przy wyższych stężeniach, które są zwykle używane do konwencjonalnych testów behawioralnych, każdy środek zapachowy wywołuje reakcje fizjologiczne z wielu ORNs1,5,6. Co więcej, substancje zapachowe w tym panelu mają różną lotność, co komplikuje interpretację badań behawioralnych, które zależą od tworzenia stabilnych gradientów zapachu7,8. Wreszcie, naturalnie występujące bodźce zapachowe mają komponent czasowy, który jest trudny do odtworzenia w warunkach laboratoryjnych. Dlatego ważne jest, aby opracować metodę, która może mierzyć zachowanie larw, jednocześnie aktywując poszczególne ORN w sposób przestrzenny i czasowy.

Tutaj demonstrujemy metodę, która ma przewagę nad poprzednio opisanymi testami śledzenia larw1,8. Test śledzenia opisany w Gershow et al. wykorzystuje elektronicznie sterowane zawory do utrzymania stabilnego gradientu zapachu w zachowaniu arena8. Jednak ze względu na poziom skomplikowanej inżynierii związanej z budową zestawu bodźców zapachowych, metoda ta jest trudna do odtworzenia w innych laboratoriach. Co więcej, nierozwiązane pozostają kwestie związane ze stosowaniem naodorantów do specyficznej aktywacji pojedynczych ORN-ów. Test śledzenia opisany w Mathew et al. wykorzystuje prostszy system dostarczania zapachu, ale wynikowy gradient zapachu zależy od lotności testowego środka zapachowego i jest niestabilny przez długi czas trwania testu1. Tak więc, zastępując bodźce zapachowe bodźcami świetlnymi, nasza metoda ma zalety specyficzności i precyzyjnej czasowej kontroli aktywacji ORN i nie jest zależna od tworzenia gradientów zapachowych o różnej sile.

Nasza metoda jest łatwa do skonfigurowania i jest odpowiednia dla badaczy zainteresowanych mierzeniem aspektów nawigacji larw Drosophila. Technika ta może być zaadaptowana do innych systemów modelowych, pod warunkiem, że badacz jest w stanie sterować ekspresją CsChrimson w wybranym neuronie (neuronach) swojego ulubionego systemu. CsChrimson to przesunięta ku czerwieni wersja rodopsyny kanałowej. Jest aktywowany na długościach fal, które są niewidoczne dla systemu fototaksji larwy. Dzięki temu jesteśmy w stanie manipulować aktywnością neuronów ze specyficznością, niezawodnością i odtwarzalnością9. Modyfikując specjalnie napisane oprogramowanie w celu uwzględnienia zmian wielkości badanych, metodę tę można łatwo dostosować do pełzających larw innych gatunków owadów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowanie areny zachowań i przygotowanie sprzętu umożliwiającego stymulację optogenetyczną na arenie zachowań

  1. Aby zbudować arenę zachowań pozbawionych światła, skonstruuj pudełko o wymiarach 89 x 61 x 66 cm3 (35" dł. x 24" szer. x 26 "wys.) wykonane z czarnych kolorowych arkuszy akrylowych z pleksi (o grubości 3 mm) (patrz tabela materiałów). Materiały do budowy takiego pudełka powinny być dostępne w lokalnych sklepach ze sprzętem. Umieść to pudełko na blacie stołu w pokoju zachowań (Rysunek 1A).
  2. Zamontuj monochromatyczną kamerę CCD USB 3.0 wyposażoną w długoprzepustowy filtr podczerwieni 830 nm i obiektyw 8 mm F1.4 z mocowaniem C (patrz tabela materiałów) na środku sufitu czarnej skrzynki. Umieść dwie taśmy LED na podczerwień (patrz Tabela Materiałów) na blacie stołu, aby oświetlić larwy w ciemnej arenie (Rysunek 1A).
  3. Aby zbudować platformę LED, zaopatrz się w kwadratową płytę aluminiową o wymiarach 22 cm × 22 cm (najlepiej pomalowaną natryskowo z matowym czarnym wykończeniem, aby wyeliminować wszelkie odbicia). Na środku płytki za pomocą metalowego noża wytnij otwór, który jest wystarczająco duży, aby zmieścił się wokół kamery CCD.
  4. Przykryj metalową płytkę czerwonymi taśmami LED (patrz Tabela materiałów). przewody taśmy świetlnej LED szeregowo i wprowadź przewody taśmy do przekaźnika transoptora sterowanego mikroprocesorem Raspberry Pi 2B (patrz tabela materiałów) (Rysunek 1B i 2).
  5. Zainstaluj i skonfiguruj system operacyjny oparty na Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux na procesorze Raspberry Pi przed podłączeniem przekaźnika transoptora do taśm LED. Podłącz zasilacz do zasilania taśm LED i transoptora (Rysunek 2) (patrz Tabela materiałów). Zamontuj platformę LED wokół kamery CCD (Rysunek 1B).
    UWAGA: System operacyjny Ubuntu Mate v16.04 jest dostępny bezpłatnie. Zestaw prostych poleceń opartych na Pythonie można łatwo dostosować do programowania wzorców bodźców świetlnych LED (patrz plik ze składnią).
  6. Zapewnij jednorodne natężenie promieniowania w różnych punktach areny zachowania. Zmierz bezwzględne natężenie promieniowania na powierzchni areny za pomocą spektrometru i określ, że wynosi ono ~1,3 W/m2 na całej powierzchni areny.
    UWAGA: Przy tej intensywności nie zaobserwowano znaczących zmian temperatury w trakcie eksperymentów. W innym badaniu10 zastosowano wyższe natężenie promieniowania ~1,9 W/m2 i nie zaobserwowano żadnych zmian temperatury w trakcie eksperymentów.

2. Przygotowanie larw Drosophila do analiz behawioralnych

  1. Utrzymuj muchy na standardowym pokarmie dla much (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 25 °C, 50-60% wilgotności względnej i 12 godzin/12 godzin cyklu jasnego/ciemnego.
  2. W celu ekspresji CsChrimson w pojedynczej parze ORN, krzyżuj dziewicze samice z linii UAS-IVS-CsChrimson z samcami z linii OrX-Gal4 ("X" odpowiada jednemu z 21 genów receptora zapachu larw (Or), które są jednoznacznie wyrażane w każdej z 21 par ORN)9,11.
    1. Alternatywnie, w celu ekspresji CsChrimson we wszystkich 21 larwalnych ORN, krzyżuj dziewicze samice z linii UAS-IVS-CsChrimson z samcami z linii Orco-Gal4 ("Orco" to koreceptor, który ulega ekspresji we wszystkich 21 ORN).
    2. W tych eksperymentach należy używać linii UAS-IVS-CsChrimson jako elementu sterującego.
      UWAGA: Wymienione tutaj zapasy much są dostępne w Bloomington Drosophila Stock Center (patrz Tabela materiałów).
  3. Gdy samce i samice much w krzyżówce będą mogły łączyć się w pary i składać jaja przez 48 godzin, przenieś dorosłe osobniki do świeżej fiolki.
    1. Na powierzchnię fiolki z żywnością zawierającą jaja dodać 400 μl mieszaniny zawierającej 400 μM all-trans retinalu (ATR) rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku (DMSO) i 89 mM sacharozy rozpuszczonej w wodzie destylowanej.
      UWAGA: Niewielka ilość sacharozy sprzyja żerowaniu larw roztworu ATR. ATR jest kofaktorem wymaganym do regulacji w górę wyrażenia CsChrimson9,10. ATR jest światłoczuły.
    2. Po dodaniu ATR do fiolek z żywnością zawierających jaja, należy inkubować fiolki w ciemności przez dodatkowe 72 godziny
      UWAGA: Chociaż w tym badaniu i w dwóch poprzednich badaniach nie zaobserwowano wpływu karmienia ATR na zachowanie larw, zaleca się kontrolowanie skutków karmienia ATR poprzez poddanie linii testowych tej samej ilości powyższej mieszaniny, która nie zawiera ATR.
  4. Wydobyć larwy trzeciego stadium (~120 godzin po złożeniu jaj) z powierzchni pokarmu much, unosząc je na wodzie za pomocą roztworu sacharozy o dużej gęstości (15%). Za pomocą mikropipety P1000 oddzielić larwy unoszące się na powierzchni roztworu sacharozy do szklanej zlewki o pojemności 1000 ml.
  5. Przemyj larwy 3–4 razy, za każdym razem wymieniając 800 ml świeżej wody destylowanej w szklanej zlewce. Pozwól larwom odpocząć przez 10 minut przed poddaniem ich testowi behawioralnemu.

3. Test zachowania

  1. Utrzymuj stałą temperaturę (w zakresie 22–25 °C) i wilgotność (od 50 do 60% wilgotności względnej) w pomieszczeniu behawioralnym.
  2. Przygotować pożywkę dla larw, wlewając 150 ml stopionej agarozy (1,5%) do kwadratowej szalki Petriego o wymiarach 22 cm x 22 cm. Do każdej próby testu wlewa się jedną szalkę Petriego, 8-10 prób na eksperyment. Pozwól agarozie zestalić się i ostygnąć przez 1-2 godziny na szalkach Petriego przed użyciem ich w teście zachowania.
    1. Przenieś nie więcej niż 20 przygotowanych larw trzeciego stadium do środka szalki Petriego (Rysunek 1C). Przykryj szalkę Petriego pokrywką. Umieść szalkę Petriego na arenie zachowania pod kamerą CCD.
      UWAGA: W zależności od eksperymentu, testy zachowania są zwykle przeprowadzane przez 3–5 minut. Jeśli w teście zostanie użyty środek nawaniający w celu zapewnienia wskazówek, zaobserwowano, że wynikowy gradient zapachu pozostaje stabilny przez około 5 minut1. Dłuższe czasy oznaczania nie są zalecane. W tych punktach czasowych nie zaobserwowano szkodliwego wpływu na larwy spowodowanego odwodnieniem lub długotrwałą ekspozycją na światło czerwone o długości fali 630 nm.
  3. Włącz źródło światła LED na podczerwień 850 nm, aby wyświetlić larwy na filmie. Uruchom kamerę CCD, aby zarejestrować ruch larw.
  4. Korzystając z oprogramowania powiązanego z procesorem Raspberry Pi, zaprogramuj procedurę podawania odpowiednich wzorców stymulacji światłem czerwonym.
    UWAGA: Zestaw prostych poleceń opartych na Pythonie można łatwo dostosować do programowania wzorców bodźców świetlnych LED (patrz plik ze składnią).

4. Przetwarzanie i analiza danych

  1. Zaimportuj nagrane wideo z każdej próby do dowolnego dostępnego oprogramowania do programowania, takiego jak Matlab.
  2. Uzyskaj współrzędne XY każdej larwy w filmie w funkcji czasu. Opierając się na ograniczeniach oprogramowania śledzącego, w jednym filmie można śledzić 15–20 larw w trzecim stadium rozwojowym1,8.
    UWAGA: Dostępny jest zestaw prostych kodów Matlab ("Tracklarva"), które można łatwo dostosować do odpowiednich warunków (patrz plik ze składnią). Ten program łączy wszystkie próby w eksperymencie i wyprowadza współrzędne XY każdej larwy przez cały czas trwania testu (patrz składnia kodu poniżej). Alternatywnie można skorzystać z kilku programów opartych na otwartym kodzie źródłowym, które są swobodnie dostępne dla badaczy. Na przykład. JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.
  3. Użyj wygenerowanych współrzędnych XY, aby wykreślić trajektorie larw i dalej analizować lokomocję larw.
    1. Do analiz behawioralnych należy używać statystyk nawigacyjnych, takich jak prędkość, krzywizna ścieżki, kąt kursu, aby podzielić trajektorie poszczególnych larw na naprzemienne sekwencje biegów i zakrętów.
    2. Przebiegi są definiowane jako ciągłe okresy ruchu do przodu. Obraca oddzielne kolejne przebiegi. Zakręty są oznaczane, gdy zmiany kątów orientacji trajektorii wynosiły >45° (patrz plik ze składnią).
  4. Oblicz średnie wartości prędkości biegu, długości biegu, kierunku biegu i innych parametrów zgodnie z wymaganiami.
    UWAGA: Dostępny jest zestaw prostych składni do wyodrębniania "biegów" i "zatrzymań" z trajektorii larw (patrz plik ze składnią). Proste funkcje oparte na Matlabie lub Excelu można zastosować do wyodrębnionych danych w celu obliczenia wartości "prędkości biegu", "długości przebiegu" itp.
  5. Przedstaw dane dla każdej metryki behawioralnej jako średnią ± SEM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować specyfikę aktywacji ORN, nasza metoda została z powodzeniem zastosowana do określenia wpływu dwóch różnych aktywacji ORN (ORN::7a i ORN::42a) (ORN wyrażających Or7a lub Or42a) na zachowanie larw (Rysunek 3). Zgodnie z ostatnimi badaniami, że poszczególne larwy ORN są funkcjonalnie różne1,10,13, nasze reprezentatywne dane pokazują, że gdy ORN::7a wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisaliśmy metodę, która pozwala na pomiar zachowania larw Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną aktywację neuronów węchowych. Opisane wcześniej metody śledzenia larw 1,8 wykorzystują różne technologie dostarczania zapachów do aktywacji ORN. Jednak metody te nie mogą kontrolować ani swoistości, ani czasowych wzorców aktywacji ORN. Nasza metoda przezwycięża te deficyty poprzez wykorzystanie bodźców świetlnych zamiast bodźców ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze startowe z University of Nevada, Reno oraz przez NIGMS z National Institute of Health w ramach grantu numer P20 GM103650.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kamera video do rejestrowania ruchu larw
CCD Edmund Optics106215
Adapter gwintu filtra M52 na M55Edmund Optics59-446
2" Uchwyt filtra z gwintem kwadratowym do soczewek obrazowych Edmund Optics59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass FilterEdmund Optics46-066
Electronics do konfiguracji optogenetycznej
Raspberry Pi 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
3-kanałowy programowalny zasilacznewegg.com9SIA3C62037092
8 Przekaźnik transoptora kanałowegoamazon.com6454319
630nm Czterorzędowe taśmy LEDenvironmentallights.comczerwone3528-450-reel
850nm Taśmy LEDenvironmentallights.comwp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
MatlabMathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
Inne przedmiotyPlexiglass
akrylowyHome DepotMC1184848bl
Fly food i inne odczynniki
Nutrifly Pokarm dla muchGenesee Scientific66-112
Agaroza w proszkuGenesee Scientific20-102
22cm X 22cm kwadratowa szalka PetriVWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
SacharozaSigma-Aldrich84097
Wszystkie trans-siatkówkoweSigma-AldrichR2500
muchy
UAS-IVS-CsChrimson  Bloomington Drosophila Stock Center55134
Orco-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center26818
Or42a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center9970
Or7a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center23907

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
  9. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
  10. Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
  11. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  12. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
  13. Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
  14. Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
  15. Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
  16. Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
  17. Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Funkcja obwod w w chowychanaliza d ugo ci przebieg wekspresja CsChrimsonarena z diodami LED w podczerwieniagarowe pod o e do pe zanialarwy trzeciego instaruanaliza przy u yciu specjalistycznego oprogramowania

Powiązane artykuły