Artykuł metodologiczny

Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

DOI:

10.3791/57356

⸱

1 sierpnia 2018

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół budowy spiralnych peptydów tioeterowych/siarczków winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiol-en/tiol-yne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół przygotowania peptydów na uwięzi tioeterowej za pomocą wewnątrzcząsteczkowej/międzycząsteczkowej hydrotiolacji tiolowej na żywicy. Ponadto protokół ten opisuje przygotowanie peptydów na uwięzi siarczku winylu przy użyciu wewnątrzcząsteczkowej hydrotiolizacji tiol-yny w roztworze między aminokwasami, które posiadają łańcuchy boczne alkenu / alkinu i reszty cysteiny w pozycjach i, i + 4. Peptydy liniowe zsyntetyzowano przy użyciu standardowej syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS) opartej na Fmoc. Hydrotiolowanie tiolu przeprowadza się za pomocą wewnątrzcząsteczkowej reakcji tioenu lub międzycząsteczkowej reakcji tioenowej, w zależności od długości peptydu. W niniejszej pracy przeprowadza się wewnątrzcząsteczkową reakcję tioenową w przypadku krótszych peptydów przy użyciu deprotekcji grup trytylowych reszt cysteinowych na żywicy po pełnej syntezie peptydu liniowego. Żywica jest następnie naświetlana promieniowaniem UV za pomocą fotoinicjatora 4-metoksyacetofenonu (MAP) i 2-hydroksy-1-[4-(2-hydroksyetoksy)-fenylo]-2-metylo-1-propanonu (MMP). Międzycząsteczkową reakcję tiolowo-europejską przeprowadza się przez rozpuszczenie Fmoc-Cys-OH w rozpuszczalniku N,N-dimetyloformamidu (DMF). Jest on następnie reagowany z peptydem przy użyciu pozostałości zawierającej alkeny na żywicy. Następnie makrolaktamizację przeprowadza się przy użyciu heksafluorofosforanu benzotriazole-1-yl-oksytrolidinofosfonium (PyBop), 1-hydroksybenzotriazolu (HoBt) i 4-metylomorfoliny (NMM) jako odczynników aktywujących żywicę. Po makrolaktamizacji synteza peptydu jest kontynuowana przy użyciu standardowego SPPS. W przypadku hydrotiolacji tio-ynu peptyd liniowy jest oddzielany od żywicy, suszony, a następnie rozpuszczany w odgazowanym DMF. Jest on następnie naświetlany światłem UV za pomocą fotoinicjatora 2,2-dimetoksy-2-fenyloacetofenonu (DMPA). Po reakcji DMF jest odparowywany, a surowa pozostałość jest wytrącana i oczyszczana za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Metody te mogą działać w celu uproszczenia wytwarzania cyklicznych peptydów na uwięzi tioeterowej dzięki zastosowaniu chemii tio-enu / ynu, która ma lepszą tolerancję grup funkcyjnych i dobrą wydajność. Wprowadzenie wiązań tioeterowych do peptydów wykorzystuje nukleofilowy charakter reszt cysteiny i jest obojętne na redoks w stosunku do wiązań dwusiarczkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój ligandów do modulowania interakcji białko-białko (PPI) stanowi atrakcyjne podejście do odkrywania nowoczesnych leków. W związku z tym włożono wiele wysiłku w badanie nowych modalności chemicznych, które mogłyby skutecznie modulować PPIs1,2,3. IPP zazwyczaj składają się z płytkich, dużych i/lub przerwanych powierzchni oddziałujących, a małe cząsteczki są zwykle uważane za nieodpowiednie ligandy do modulacji IPP4,5. Przy odpowiedniej odsłoniętej powierzchni oddziałującej, krótkie peptydy, które naśladują cechy strukturalne interfejsów białkowych, są idealnymi kandydatami do rozwiązania tego problemu6,7. Jednak krótkie peptydy są zwykle nieustrukturyzowane w roztworze wodnym. Wynika to z faktu, że cząsteczki wody, które konkurują z wewnątrzcząsteczkową siecią wiązań wodorowych szkieletu peptydowego i dobrze zdefiniowanymi konformacjami, są entropicznie niekorzystne w water8. Ponadto z natury niska stabilność peptydów i przepuszczalność komórek znacznie ograniczają ich zastosowanie w zastosowaniach biologicznych9,10. Zgodnie z analizą Banku Danych o Białkach (PDB), >50% IPP obejmuje krótkie interakcje α-helisa11. W związku z tym opracowano różne metody chemiczne w odniesieniu do stabilizacji spirali. Należą do nich: tworzenie wiązań dwusiarczkowych/tioeterowych12,13,14, metateza zamykania pierścienia15, tworzenie pierścienia laktamowego16, "click" chemistry17, dodawanie perfluoroarenów18,19, oraz tworzenie siarczku winylu20.

Stabilizowane peptydy spiralne są szeroko stosowane dla różnych celów wewnątrzkomórkowych, w tym p53, receptorów estrogenowych, Ras, białek rodziny BCL-2 i innych21,22,23,24. ALRN-6924, całkowicie węglowodorowy zszywany peptyd podwójny inhibitor MDM2 i MDMX, jest obecnie używany do badań klinicznych25. W ciągu ostatnich kilku lat nasza grupa skupiła się na rozwoju nowatorskich metod stabilizacji peptydów z wykorzystaniem reakcji tiol-en i tiol-yne26,27,28. Ogólnie rzecz biorąc, wykazaliśmy, że te reakcje inicjowane światłem są skuteczne w łagodnych warunkach, gdy stosuje się naturalnie obfitą cysteinę. Ponadto wykazaliśmy, że reakcje te mają doskonałą tolerancję grup funkcyjnych, są bioortogonalne i udowodniono, że mają zastosowanie do modyfikacji peptydów i białek29. Powstałe w ten sposób peptydy na uwięzi tioeterowo-siarczkowe winylu znacznie poprawiają przestrzeń chemiczną peptydów ograniczających, zapewniają labilne centrum modyfikacji na uwięzi i udowodniono, że mają zastosowanie w wielu zastosowaniach biologicznych30,31,32. Do tej pory opisano tylko ograniczone doniesienia dotyczące cyklizacji peptydów tiol-en/tiol-yne. W badaniu opublikowanym przez Anseth i wsp. w 2009 r. wykazano wewnątrzcząsteczkową reakcję tiolowo-enową na żywicy w celu cyklizacji peptydów między aktywowanymi alkenami z cysteiną33. W 2015 roku Chou i wsp. Opisał dwuskładnikową reakcję tiol-en, inicjowaną przez rodnik dla zszywania peptydów34 i następną, sekwencyjną reakcję sprzężenia tiol-yne/en35. Niedawno opisaliśmy serię prac opartych na peptydach na uwięzi tioeteru/siarczku winylu20,26,27. Protokół ten opisuje szczegółową syntezę wyżej wymienionych peptydów na uwięzi tioeteru/siarczku winylu w nadziei, że będzie ona pomocna dla szerszej społeczności naukowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie sprzętu

  1. W przypadku ręcznego aparatu do syntezy peptydów należy umieścić kolektor próżniowy (tabela materiałów) w wydajnym dygestorium. Następnie umieść trójdrogowe kurki na kolektorze próżniowym i podłącz je do przewodu gazowego azotu lub argonu. Zakryj wszystkie niewykorzystane wloty gumowymi przegrodami.
  2. Podłącz kolumny wypełnione żywicą (zbiornik 0,8 x 4 cm, 10 ml, patrz tabela materiałów) do kolektora za pomocą trójdrogowych kurków (Rysunek 1). Użyj pompy podłączonej do systemu próżniowego jako filtracji próżniowej lub gumowej gruszki do pipet przez wytłaczanie w celu usunięcia rozpuszczalnika z kolumn.
  3. Użyj fotoreaktora (Rysunek 2), wyposażonego w dziesięć lamp 350 nm (Tabela materiałów) do naświetlania promieniowaniem UV. Podłącz je do zbiornika argonu przez wlot powietrza do fotoreaktora, aby upewnić się, że fotoreaktor jest napełniony argonem przed i podczas fotoreakcji.
  4. Przed włączeniem lampy UV fotoreaktora należy upewnić się, że drzwiczki fotoreaktora są zamknięte na wypadek napromieniowania światłem UV.

2. Przygotowanie żywicy

UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, budowa substratów peptydowych odbywa się przy użyciu protokołów syntezy peptydów w fazie stałej opartych na Fmoc. Przeprowadza się je przy użyciu żywicy amidowej lodowiska, która pozostawia C-końcowy amid pozostały po rozszczepieniu peptydu. Protokół ten jest używany w całym artykule.

UWAGA: N,N-dimetyloformamid (DMF), dichlorometan (DCM), 4-metylomorfolina (NMM) i N,N-diizoproiloetyloamina (DIPEA) są toksyczne i szkodliwe przez wdychanie, spożycie lub kontakt ze skórą. Eter dietylowy jest wysoce łatwopalny. Kwas trifluorooctowy (TFA) jest. 1,2-etanedhiol (EDT) jest silnie cuchnący. Dlatego ze wszystkimi rozpuszczalnikami organicznymi i chemikaliami należy obchodzić się przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne) oraz w osłonie przeciwchemicznej.

  1. Oblicz wymaganą ilość żywicy, korzystając z następującego wzoru:
    Skala (mmol) / (Pojemność żywicy (mmol/g) 1,000 (mg/g)) = Masa żywicy (mg)
    Np. ilość żywicy MBHA amidowej na lodowisku (0,5 mmol/g) na 25 μmol = 0,025 mmol / (0,5 mmol/g 1,000 mg/g) = 50 mg. Następnie zważ 50 mg żywicy w kolumnie i umieść ją na kolektorze próżniowym za pomocą trójdrogowych kurków.
  2. Dodaj 1 - 2 ml DCM do żywicy w kolumnie (0,8 x 4 cm, zbiornik 10 ml). Aby spęcznić żywicę, delikatnie mieszaj ją strumieniem azotu lub argonu przez 10 minut. Następnie usuń rozpuszczalnik za pomocą filtracji próżniowej.

3. N-terminal Fmoc Deprotection and Washing

  1. Przygotować N-końcowy roztwór odprobierający Fmoc: przygotować odpowiednią objętość (200 ml) 50% (v/v) morfoliny w DMF w szklanej butelce.
  2. Do żywicy dodać 1 - 2 ml roztworu odbezpieczającego, delikatnie mieszać przez 10 minut, a następnie odcedzić roztwór za pomocą próżni. Używając DMF (1 - 2 ml) i DCM (1 - 2 ml) w tej kolejności, dokładnie umyj żywicę i naczynie reakcyjne, w sumie 3 razy. Następnie powtórz procedury deprotekcji i prania 1x.

4. Sprzęgło aminokwasów chronione przez Fmoc

  1. Na przykładzie sprzężenia reszty alaniny, w przypadku ręcznej syntezy w skali 25 μmol, zważyć Fmoc-Ala-OH (5 odpowiednik, 41,4 mg), 2-(6-chloro-1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloaminofosforan heksafluorofosforanu (HCTU; odpowiednik 4,9, 50,5 mg) w pojemniku polipropylenowym i rozpuścić go w DMF (0,5 ml).
  2. Dodać DIPEA (odpowiednik 10, 43,5 μl) w celu wytworzenia 0,25-M aktywowanego roztworu aminokwasów (Tabela 1). Po około 1 minutowej wstępnej aktywacji dodaj roztwór do żywicy, a następnie bąbelkuj go zN2 przez około 1 - 2 godziny.
  3. Począwszy od tego kroku, włącz każdy aminokwas w łańcuchu peptydowym jako sekwencję kroków: najpierw deprotekcja N-końcowej grupy Fmoc, a następnie mycie, a następnie sprzężenie aminokwasu poprzez aktywację za pomocą HCTU.
    UWAGA: Dłuższy czas sprzęgania (np. 2 h) jest zalecany, jeśli sprzężenie następuje po sterycznie utrudnionej resztie aminokwasowej [np. Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH]. Alkeny/alkony zawierające nienaturalne aminokwasy są używane w 3 odpowiednikach zamiast 5 i pozostawia się je do reakcji na 3 godziny.
  4. Monitoruj postęp syntezy peptydów za pomocą testów Kaisera lub chloranilu, jak opisano przez Arora i wsp.36 Te testy dostarczają jakościowych ocen obecności lub braku wolnych amin pierwszorzędowych i drugorzędowych. Alternatywnie, około 2 - 3 mg peptydu można odłupać od żywicy i przeanalizować za pomocą LC-MS.

5. Hydrotiolacja tiolu i cyklizacja tiol-yny

  1. Zbuduj łącznik tioeterowy poprzez cyklizację na żywicy (Rysunek 3).
    1. Przygotować około 50 ml roztworu odbezpieczającego Trt (TFA/TIS/DCM 0,03/0,06/1,0). Potraktuj żywicę 5-łożyskową Cys i mS [żywica NH2-R-mS 5-A-A-A-Cys(Trt)-R'-, 50 mg] 1 - 2 ml roztworu odbezpieczającego Trt w kolumnie o pojemności 10 ml. Delikatnie mieszać roztwór przez 10 minut za pomocą N2. Na koniec umyj go DCM (1 -2 ml), aby uzyskać łącznie 3x,
      UWAGA: MS5 reprezentuje blok budulcowy zawierający alkilen (patrz struktura przedstawiona na Rysunek 6) używany do sprzęgania peptydów i cyklizacji tioenów38.
    2. Powtórz procedurę opisaną powyżej, w sumie około 6 razy w celu usunięcia trytylowej grupy ochronnej cysteiny, aż kolor roztworu przestanie być żółty.
    3. Bąbelkowaną N2 przemyć żywicę R-mS 5-A-A-A-Cys(-SH)-R'-[cysteina z wolnym tio(-SH)] DMF (1 - 2 ml) i DCM (1 - 2 ml) w tej kolejności. Żywicę należy obkurczać za pomocą metanolu (1 - 2 ml) przez 2 minuty, a następnie usunąć rozpuszczalnik za pomocą filtracji. Następnie kolejno suszyć żywicę pod parą gazu N2 przez około 5 minut w kolumnie.
    4. Przygotować wcześniej odgazowany DMF w kolbie ustnej, bulgocząc azot przez około 1 godzinę przez długą igłę, która została rozciągnięta w rozpuszczalniku.
    5. Przenieść żywicę do kolby okrągłodennej o pojemności 10 ml przez papier do ważenia. Zawiesić żywicę w 2 ml odgazowanego DMF, a następnie dodać fotoinicjator 2-hydroksy-1-[4-(2-hydroksyetoksy)-fenylo]-2-metylo-1-propanon (MMP; 1 odpowiednik, 5,6 mg), 4-metoksyacetofenon (MAP; 1 odpowiednik, 3,8 mg).
    6. Dodać mieszadło (0,3 cm) do kolby i przykryć kolbę odpowiednią gumową zatyczką, a następnie wyprzeć powietrze z kolby z azotem gazowym za pomocą pompy olejowej.
      UWAGA: Atmosfera obojętna nie jest ściśle wymagana do efektywnej fotoreakcji tioenu w fazie stałej. Jest to jednak bardzo potrzebne do fotoreakcji tio-yny w fazie roztworu w Rysunek 5. W przeciwnym razie siarka utleni się podczas naświetlania promieniami UV.
    7. Umieścić kolbę reakcyjną w fotoreaktorze i mieszać żywicę przez 1 godzinę pod wpływem promieniowania UV w temperaturze pokojowej (Rysunek 2).
      UWAGA: Przed włączeniem fotoreaktora UV lamp upewnij się, że drzwi fotoreaktora są zamknięte na wypadek szkodliwego napromieniowania światłem UV.
      UWAGA: W przypadku nowych sekwencji zaleca się częste pobieranie próbek mieszaniny reakcyjnej podczas fotoreakcji, ponieważ liniowy prekursor peptydowy ma identyczną masę cząsteczkową produktu. Ogólnie rzecz biorąc, peptydy liniowe i cykliczne wykazują znacznie różną hydrofilowość. Można to łatwo odróżnić za pomocą HPLC. Alternatywnie, odczynnik 5,5'-ditiobis-(kwas 2-nitrobenzoesowy) (DTNB) może być również użyty do badania obecności wolnego tiolu37.
    8. Przenieść żywicę z kolby do kolumny i usunąć rozpuszczalnik za pomocą filtracji próżniowej. Umyj i wysusz żywicę zgodnie z opisem w kroku 5.1.3.
    9. Przygotuj około 10 ml koktajlu rozszczepienia (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2,5/2,5) w dygestorium.
    10. Przenieś żywicę do 2-mililitrowego pojemnika polipropylenowego, dodaj 1 ml koktajlu rozszczepiającego (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2,5/2,5) do pojemnika i szczelnie zamknij pojemnik za pomocą zakrętki. Następnie delikatnie wymieszać pojemnik na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 60 obr./min w dygestoriach przez 1,5 - 2 godz.
      UWAGA: TFA jest silnie. Nosić odzież ochronną i pracować w wydajnym dygestorium. EDT jest substancją o silnym cuchre, która musi być obsługiwana w wydajnym dygestorium.
    11. Usunąć koktajl TFA przez odparowanie pod strumieniem gazuN2 w dygestorium. Następnie wytrącić pozostałość za pomocą zimnego eteru dietylowego (1 ml) przez 30 s i wyizolować ją przez odwirowanie przy 12 000 x g przez 2 minuty. Po odwirowaniu delikatnie wylej składnik eterowy. Powtórz etapy wytrącania i wirowania 2x. Odparować pozostałość do sucha.
    12. Na koniec rozpuścić pozostałość w 1 ml H2O/acetonitrylu (2:1) i oczyścić za pomocą HPLC przy użyciu kolumny analitycznej C18 (4,6 x 250 mm, natężenie przepływu 1,0 ml/min). StosowaćH2O(zawierający 0,1% TFA) i czysty acetonitryl jako rozpuszczalniki w gradieniu liniowym 2%/min od 20% do 70% acetonitrylu przez 25 min. Monitoruj widma HPLC przy użyciu długości fal UV 280 nm i 220 nm (tabela 2).
  2. Skonstruuj łącznik tioeterowy poprzez międzycząsteczkową reakcję tioenową, a następnie cyklizuj peptyd przez makrolaktamizację (Rysunek 4).
    1. Zsyntetyzować resztę alkilenu zawierającą liniowy peptydH2N-A-A-A-mS5(2-R'')-R'--żywicę (50 mg) przy użyciu standardowej syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS) na bazie Fmoc, jak opisano w krokach 2 - 4. Następnie umyj i wysusz żywicę zgodnie z opisem w kroku 5.1.3.
    2. Zawiesić żywicę w 10-mililitrowej kolbie okrągłodennej zawierającej 2 ml odgazowanego DMF, jak opisano w kroku 5.1.4.
    3. Dodać fotoinicjator MMP i MAP (MMP: 1 odpowiednik, 5,6 mg; MAP: 1 ekwiwalent, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 odpowiedniki, 25,7 mg) i mieszadło (0,3 cm) do kolby. Zakryj kolbę odpowiednią gumową zatyczką, a następnie użyj pompy olejowej, aby zastąpić powietrze w kolbie azotem.
    4. Umieścić kolbę reakcyjną w fotoreaktorze. Mieszaj przez 1 - 2 godziny pod wpływem promieniowania UV w temperaturze pokojowej (Rysunek 2).
    5. Monitoruj reakcję pod analizą LC-MS: rozszczepić 2 - 3 mg żywicy za pomocą koktajlu łupliwego. Następnie wytrącić pozostałość zimnym eterem dietylowym (300 μl), wyizolować pozostałość przez odwirowanie i odparować pozostałość do sucha, jak opisano w kroku 5.1.11. Następnie rozpuścić pozostałość w 100 μlH2O/acetonitrylu (2:1). Przefiltrować roztwór peptydu za pomocą mikroporowatej warstwy 0,22 μm i przeanalizować go za pomocą LC-MS ze związkiem zjonizowanym w jonizacji elektrorozpylającej (ESI) i działającym w trybie dodatnim.
    6. W razie potrzeby powtórzyć kroki 5.2.2 - 5.2.4, aby upewnić się, że reakcja została przeprowadzona do końca.
    7. Po zakończeniu reakcji fotoaktywnej przenieść żywicę z kolby do kolumny i usunąć rozpuszczalnik za pomocą filtracji próżniowej. Umyj i wysusz żywicę zgodnie z opisem w kroku 5.1.3.
    8. Dodać roztwór DMF heksafluorofosforanu benzotriazole-1-y-ylo-oksytrolidinofosfonium (PyBob; odpowiednik 2,4, 31,2 mg), 1-hydroksybenzotriazolu (HoBt; odpowiednik 2,4, 8,1 mg) i NMM (4 równoważnik, 11 μl) do żywicy w kolumnie do makrolaktamizacji. Bąbelkować ten roztwór z N2 przez 2 godziny.
      1. Ponadto należy monitorować tę reakcję sprzęgania za pomocą LC-MS, jak opisano w kroku 5.2.3. W razie potrzeby powtórz ten krok, aby upewnić się, że reakcja została przeprowadzona do końca.
    9. Wydłuż peptyd za pomocą standardowego SPPS na bazie Fmoc, jak opisano w krokach 3 i 4.
    10. Po zebraniu wszystkich reszt aminokwasowych należy odciąć peptyd od żywicy zgodnie z opisem w krokach 5.1.10 i 5.1.11 i oczyścić go zgodnie z opisem w kroku 5.1.12.
  3. Skonstruuj łącznik siarczku winylu w fazie roztworu (Rysunek 5).
    1. Zsyntetyzuj liniowy peptyd zawierający resztę alkinów przy użyciu standardowego SPPS na bazie Fmoc, jak opisano w krokach 2 - 4. Zsyntetyzuj aminokwas zawierający alkin zgodnie z dobrze ustalonym protokołem, jak opisano w poprzednim badaniu20.
    2. Rozszczepić peptyd z żywicy i wytrącić go za pomocą zimnego eteru dietylowego, jak opisano w krokach 5.1.9 - 5.1.11. Po rozszczepieniu i wytrąceniu żywicy, zebrać peptyd za pomocą wirowania przy 12 000 x g przez 2 minuty.
    3. Wysuszyć powstałą pozostałość w próżni. Rozpuścić pozostałość w odgazowanym DMF (50 ml) w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml w celu osiągnięcia końcowego stężenia 0,5 mM (w oparciu o obciążenie żywicy, 0,025 mmol (1000 mL/L / 0,5 mmol/L) = 50 ml).
      1. Dodać fotoinicjator DMPA (odpowiednik 0,5, 3,2 mg), a następnie odgazowywać roztwór reakcyjny przez 10 minut za pomocą N2 przez długą igłę rozciągniętą w roztworze. Następnie naświetlać próbkę światłem UV w temperaturze pokojowej przez 0,5 - 1 godzinę bez mieszania.
    4. Usunąć DMF w wysokiej próżni i wytrącić surową pozostałość, dodając eter dietylowy w celu rozpuszczenia jego organicznych produktów ubocznych. Następnie wyizolować pozostałość za pomocą wirowania przy 12 000 x g przez 2 minuty. Po odwirowaniu delikatnie wylej składnik eterowy. Odparować pozostałość do sucha. Na koniec rozpuścić pozostałość w 1 mlH2O/acetonitrylu (2:1) i oczyścić ją za pomocą HPLC, jak opisano w kroku 5.1.7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Widma HPLC i MS peptydu Ac-YmS5AAAC-NH2 i jego cyklicznego produktu Ac-Y-(cyklo-1,5)-[mS5AAAC]-NH2, które zostały wygenerowane przy użyciu wewnątrzcząsteczkowej fotoreakcji tiol-en na żywicy, są przedstawione w Rysunek 6B. Stwierdzono, że cykliczny peptyd ma identyczną masę cząsteczkową w stosunku do swojego liniowego prekursora. Zaobserwowano jednak, że jego czas retencji w HPLC jest o około 2 minuty szybszy niż w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W wewnątrzcząsteczkowej cyklizacji tioenu na żywicy opisanej na rysunku 3 stwierdzono, że usunięcie grupy trytylowej reszty cysteiny jest krytycznym krokiem dla późniejszej fotoreakcji. Ponadto stwierdzono, że masa cząsteczkowa peptydu przed i po reakcji jest identyczna, jak pokazano na rysunku 6B. W związku z tym w celu monitorowania reakcji wymagane jest zastosowanie identyfikacji metodą HPLC lub testu DTNB. W przypadku międzycząsteczkowej reakcji tioenowej op...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Grantów Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 21372023, 21778009 i 81701818); Ministerstwa Nauki i Technologii Chińskiej Republiki Ludowej (nr 2015DFA31590); Komitetu ds. Innowacji Naukowych i Technologicznych w Shenzhen (nr 2015 DFA31590); JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 i GJHS20170310093122365); oraz Chińska Fundacja Nauk Podoktoranckich (nr 2017M610704).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żywica MBHA Amide (0,53 mmol/g)HECHENGGRM50407
Standard Aminokwasy chronione FmocGL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-metylo-2-pirolidynonShenzhen endi Biotechnology Co.Ltd.3230szkodliwy
dla skóry N,N-dimetyloformamidEnergiaB020051szkodliwa dla skóry
DichlorometanEnergyW330229szkodliwa dla skóry
N,N-DiizoproyloetyloaminaAldrich9578drażniący
kwas trifluorooctowyJ& K101398
triizopropylosilanJ& K973821
1,2-EthanedithiolJ& K248897Smród
2-(6-chloro-1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloaminowo-heksafluorofosforan GL Biochem (Szanghaj) Sp. z o.o.
MorpholineAldrichM109062drażniący
eter dietylowyAldrich673811łatwopalny
AcetonitrylAldrich9758toksyczność
MetanolAldrich9758toksyczność
2-hydroksy-1-[4-(2-hydroksyetoksy)-fenylo]-2-metylo-1-propanonEnergiaA050035
4-metoksyacetofenonEnergiaA050098
2,2-dimetoksy-2-fenyloacetofenonuEnergiaD070132
5,5'-Ditiobis-(kwas 2-nitrobenzoesowy)J& K281281
Benzotriazol-1-yl-oksytrirolidinofosfonium Energia heksafluorofosforanuE020172
1-hydroksybenzotriazolEnergiaD050256
4-metylomorfolinaEnergiaW320038
Wysokosprawna chromatografia cieczowaSHIMADZULC-30AD
Masa jonizacyjna elektrorozpylaniaSHIMADZULCMS-8030
LiofilizatorLabconcoFreeZone
SpeedVacKolektorSavant
promegaA7231
zawory trójdrogoweKolumny chromatograficzne Bio-Rad7328107
poly-prep Bio-Rad7311550
851012 System zatężania próżniowy Thermo

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, dP., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Chemistry. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , In Press (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides' permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Chemistry. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573(2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

peptydy z wi zaniem tioeterowympeptydy z wi zaniem winylosulforkowymhydrotiolacja tiol enhydrotiolacja tiol ynsynteza peptyd w w fazie sta ejcyklizacja na ywicyna wietlanie UVfotoinicjator MAPfotoinicjator MMPwysokosprawna chromatografia cieczowa

Powiązane artykuły