Izolacja i hodowla pierwotnych komórek nasierdzia pochodzących z próbek serca dorosłego i płodu ludzkiego

Podsumowanie

Nasierdzie odgrywa kluczową rolę w rozwoju i naprawie serca, dostarczając komórek i czynników wzrostu do ściany mięśnia sercowego. W tym miejscu opisujemy metodę hodowli ludzkich pierwotnych komórek nasierdziowych, która umożliwia badanie i porównanie ich cech rozwojowych i dorosłych.

Streszczenie

Nasierdzie, warstwa komórek nabłonkowych pokrywająca mięsień sercowy, odgrywa istotną rolę podczas rozwoju serca, jak również w odpowiedzi naprawczej serca po urazie niedokrwiennym. Po aktywacji komórki nasierdzia przechodzą proces znany jako przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT), aby dostarczyć komórki do regenerującego się mięśnia sercowego. Ponadto nasierdzie przyczynia się do wydzielania niezbędnych czynników parakrynnych. Aby w pełni docenić potencjał regeneracyjny nasierdzia, potrzebny jest model komórki ludzkiej. W tym miejscu przedstawiamy nowy model hodowli komórkowej w celu uzyskania pierwotnych komórek pochodnych nasierdzia (EPDC) z tkanki serca ludzkiego dorosłego i płodu. Aby wyizolować EPDC, nasierdzie jest wycinane z zewnątrz próbki serca i przetwarzane na zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie EPDC są siane i hodowane w pożywce EPDC zawierającej inhibitor kinazy 5 ALK SB431542 w celu utrzymania ich fenotypu nabłonkowego. EMT jest indukowany przez stymulację TGFβ. Metoda ta po raz pierwszy umożliwia badanie procesu EMT w ludzkim nasierdziu w kontrolowanych warunkach i ułatwia uzyskanie lepszego wglądu w sekretom EPDC, które mogą wspomagać regenerację serca. Co więcej, to jednolite podejście pozwala na bezpośrednie porównanie zachowań nasierdziowych u dorosłych i płodów.

Wprowadzenie

Nasierdzie, jednokomórkowa warstwa nabłonkowa otaczająca serce, ma kluczowe znaczenie dla rozwoju i naprawy serca (recenzowane w Smits et al.¹). Rozwojowo, nasierdzie powstaje z narządu przesierdziowego, małej struktury znajdującej się u podstawy rozwijającego się serca. Około dnia rozwojowego E9.5 u myszy i 4 tygodnie po zapłodnieniu u człowieka, komórki zaczynają migrować z tej struktury kalafiora i pokrywają rozwijający się mięsień sercowy². Po utworzeniu pojedynczej warstwy komórek nabłonka część komórek nasierdzia ulega przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT). Podczas EMT komórki tracą swoje cechy nabłonkowe, takie jak zrosty komórka-komórka, i uzyskują fenotyp mezenchymalny, który daje im zdolność do migracji do rozwijającego się mięśnia sercowego. Uformowane komórki pochodne nasierdzia (EPDC) mogą różnicować się w kilka typów komórek serca, w tym fibroblasty, komórki mięśni gładkich i potencjalnie kardiomiocyty i komórki śródbłonka³, chociaż różnicowanie dwóch ostatnich populacji komórek pozostaje przedmiotem debaty (przegląd w Smits et al.⁴). Ponadto, epicardium dostarcza instruktażowe sygnały parakrynne do mięśnia sercowego, aby regulować jego wzrost i unaczynienie5^,6,7^,8. Liczne badania wykazały, że upośledzone tworzenie nasierdzia prowadzi do wad rozwojowych mięśnia sercowego^9,10, vasculature¹¹, and conduction system¹², podkreślając istotny wkład nasierdzia w tworzenie serca.

Chociaż w sercu dorosłego nasierdzia występuje jako warstwa uśpiona, ulega reaktywacji po niedokrwieniu¹³. Reaktywacja nasierdzia po urazie podsumowuje kilka procesów opisanych dla rozwoju serca, w tym proliferację i EMT¹⁴, choć mniej skutecznie. Co ciekawe, chociaż dokładny mechanizm nie jest w pełni zrozumiały, wkład nasierdzia w naprawę można poprawić poprzez leczenie np. tymozyną β4¹⁵ lub zmodyfikowanym mRNA¹⁶, co skutkuje poprawą funkcji serca po zawale mięśnia sercowego. Nasierdzie jest zatem uważane za interesujące źródło komórek wspomagające endogenną naprawę uszkodzonego serca.

Mechanizmy rozwoju serca są często rekapitulowane podczas urazu, choć w mniej efektywny sposób. W poszukiwaniu aktywatorów nasierdzia niezwykle ważne jest, abyśmy mogli określić i porównać pełną pojemność nasierdzia płodu i dorosłego osobnika. Ponadto z terapeutycznego punktu widzenia ważne jest, abyśmy oprócz doświadczeń na zwierzętach poszerzali wiedzę dotyczącą odpowiedzi ludzkiego nasierdzia. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania i hodowli komórek pochodzących z nasierdzia ludzkiego dorosłego i płodu (EPDC) w morfologii podobnej do komórek nabłonkowych oraz indukowania EMT. Dzięki temu modelowi staramy się zbadać i porównać zachowanie dorosłych i płodowych komórek nasierdziowych.

Główną zaletą tego protokołu jest użycie ludzkiego materiału nasierdziowego, który nie został dokładnie zbadany. Co ważne, opisany protokół izolacji i hodowli komórkowej zapewnia jedną, jednolitą metodę uzyskiwania EPDC zarówno płodu, jak i dorosłego bruku, umożliwiając bezpośrednie porównanie tych dwóch źródeł komórek. Dodatkowo, ponieważ nasierdzie jest izolowane na podstawie jego lokalizacji, zapewnia się, że komórki są faktycznie wyprowadzone nasierdziowo¹⁷.

Chociaż metody izolacji ludzkiego EPDC zostały już wcześniej ustalone, opierają się one głównie na protokołach przerastania, gdzie fragmenty tkanki sercowej lub nasierdziowej są umieszczane na szalce do hodowli komórek^18,19. Podejście to selekcjonuje zatem specyficznie komórki, które częściowo tracą fenotyp nabłonka w celu migracji i które są bardziej podatne na spontaniczne EMT. W obecnym protokole nasierdzie jest najpierw przetwarzane na roztwór jednokomórkowy, który pozwala izolowanym EPDC utrzymać stan nabłonka. Metoda ta zapewnia zatem solidny model in vitro do badania EMT nasierdzia.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na próbkach tkanek ludzkich zostały zatwierdzone przez komisję etyki Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie i są zgodne z Deklaracją Helsińską. Wszystkie etapy są wykonywane za pomocą sterylnego sprzętu w komorze przepływowej do hodowli komórkowych.

1. Przygotowania

1. Przygotuj pożywkę EPDC, mieszając zmodyfikowaną pożywkę Eagle's firmy Dulbecco (DMEM o niskiej zawartości glukozy) i pożywkę 199 (M199) w stosunku 1:1. Dodać 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą (FBS, inaktywowaną termicznie przez 25 minut w temperaturze 56 °C) i uzupełnić 100 j./ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Podgrzej podłoże EPDC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Podgrzej trypsynę 0,25%/EDTA (1:1) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Pokryj studzienki żelatyną. Dodać 0,1% żelatyny/PBS do każdego dołka i inkubować płytki przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 °C. Wytyczne dotyczące wymaganej płytki do hodowli komórkowej podsumowano w tabeli 1. Ostrożnie usuń cały płyn przed posiewaniem komórek.
4. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM SB431542 (SB), rozcieńczony w DMSO (UWAGA). Przygotować 50 μl porcji w polipropylenowych probówkach wirówkowych ze stożkowym dnem, takich jak probówki Eppendorfa, i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Należy pamiętać, że podwielokrotności SB można rozmrozić tylko raz.

2. Pobieranie i przechowywanie próbek serca dorosłego i płodowego

1. Dorosłe małżowiny uszne należy przechowywać bezpośrednio po usunięciu podczas operacji w probówce o pojemności 50 ml z 15 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny w temperaturze 4 °C. Próbki mają zwykle wielkość 3 - 5 cm i mogą być przechowywane do 48 godzin po sekcji.
2. Serca płodów uzyskane z materiału poronnego należy przechowywać w pożywce EPDC w temperaturze 4 °C do 24 godzin po izolacji. W tym protokole należy użyć próbek w wieku ciążowym od 12 do 22 tygodni. Należy pamiętać, że całe serce może być użyte do izolacji nasierdzia.

3. Izolacja warstwy nasierdziowej

1. W komorze z przepływem laminarnym przygotować 100-milimetrowe naczynie do hodowli komórkowych z PBS i umieścić oddzielną kroplę (~200 μL) PBS w pokrywce. Napełnij probówkę o pojemności 15 ml wstępnie podgrzanym podłożem EPDC o pojemności 5 ml.
2. Umieść tkankę w naczyniu do hodowli komórkowych wypełnionym PBS. Upewnij się, że tkanka jest często nawilżana podczas zabiegu.
3. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego usuń jak najwięcej warstwy nasierdzia z próbki tkanki, odklejając ją za pomocą kleszczy.
   Uwaga: Nasierdzie można rozpoznać jako bardzo cienką, przezroczystą warstwę ściśle przylegającą do zewnętrznej części serca (Ryc. 1A). Staraj się unikać zanieczyszczenia tkanką tłuszczową i naczyniami krwionośnymi nasierdzia, ponieważ utrudni to izolację.
4. Zbierz kawałki tkanki nasierdzia w kropli PBS na pokrywie.
5. Pokrój tkankę nasierdzia na małe kawałki (0,5 mm³) za pomocą skalpela (Ryc. 1B) lub używając ostrych końcówek małych kleszczy. Zwróć uwagę, że kawałki powinny być w stanie przejść przez końcówkę pipety P1,000 (krok 3.6).
6. Dodaj 1 ml trypsyny do tkanki nasierdzia i zbierz kawałki oraz trypsynę za pomocą końcówki do pipety P1,000. Przenieś tkankę do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml ( Rysunek 1C).
7. Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut, wstrząsając z prędkością ~60 obr./min.
8. Wyjmij rurkę z łaźni wodnej i wyczyść zewnętrzną część rurki 70% etanolem.
9. Pozwól, aby tkanka opadła na dno probówki (Rysunek 1D) i ostrożnie przenieś supernatant zawierający komórki nasierdzia do 15-mililitrowej probówki zawierającej 5 ml pożywki EPDC, aby dezaktywować trypsynę.
10. Uzupełnij pozostałą tkankę w stożkowej probówce wirówkowej 1 ml trypsyny i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.
11. Powtórz kroki od 3.7 do 3.10 dwa razy. Na ostatnim etapie, po łącznie 30 minutach inkubacji trypsyny, przenieś zarówno supernatant, jak i pozostałą tkankę nasierdzia do probówki zawierającej podłoże EPDC.
12. Gdy wszystkie komórki zostaną zebrane w pożywce EPDC, delikatnie przepuść zawiesinę przez 10-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 19 do nowej probówki o rozmiarze 15 ml, aby mechanicznie zdysocjować komórki (Rysunek 1E).
    Uwaga: Upewnij się, że zawiesina jest homogenizowana przez pipetowanie w górę i w dół przed przepuszczeniem roztworu przez igłę, aby zapobiec zatkaniu igły.
13. Aby dalej dysocjować komórki, powtórz krok 3.12 z igłą o rozmiarze 21.
14. Umieść sitko do komórek o wielkości 100 μm na probówce o pojemności 50 ml i przenieś pożywkę zawierającą komórki nasierdzia na sitko za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby usunąć wszystkie pozostałe grudki (Rysunek 1F).
15. Umyj sitko, aby zebrać resztki komórek, pipetując 5 ml pożywki EPDC na sitko.
16. Odpipetować zawiesinę komórek z probówki o pojemności 50 ml do probówki o pojemności 15 ml. Ponieważ komórki opadają na dno probówki, przed pipetowaniem delikatnie wstrząsnąć roztworem.
    Uwaga: Chociaż ten krok nie jest konieczny, mniejsza rurka pomaga w wizualizacji osadu po odwirowaniu.
17. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (Rysunek 1G).
18. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek (Rysunek 1H) w wymaganej objętości podłoża EPDC (Tabela 1).
    Uwaga: W przypadku płodowych EPDC należy bezpośrednio użyć pożywki EPDC zawierającej 10 μM inhibitora kinazy ALK5 (EPDC+SB). Dorosłe komórki można posiać bez SB podczas pierwszego pasażu.
19. Zawiesinę komórkową należy umieścić na płytkach hodowlanych pokrytych żelatyną (Rysunek 1I). Wielkość studzienki zależy od wielkości próbki tkanki nasierdzia (tabela 1). Należy pamiętać, że niska konfluencja wywoła wystąpienie EMT.
20. Umieścić komórki w inkubatorze na co najmniej 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ , aby umożliwić komórki przyczepieniu się do płytki hodowlanej.

4. Kultura EPDC

1. Uzupełniaj pożywkę EPDC+SB co najmniej co 3 dni.
2. Sprawdzaj komórki co najmniej co 3 dni za pomocą mikroskopu. Gdy komórki osiągną zbieg, tj. gdy płytka hodowlana jest całkowicie pokryta komórkami, należy przepuścić komórki w stosunku powierzchniowym 1:2. Należy pamiętać, że osiągnięcie konfluencji może zająć ~5 - 10 dni.
   1. Zassać pożywkę za pomocą pipety lub systemu aspiracyjnego z, np. szklaną pipetą.
   2. Ostrożnie umyj komórki, dodając do nich PBS. Delikatnie zakręć płytką i zassaj PBS.
   3. Dodaj trypsynę do talerza. Delikatnie obrócić płytkę, aby pokryć wszystkie komórki trypsyną i inkubować płytkę przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Użyj jak najmniejszej ilości trypsyny (wskazanie: 200 μL na dołek płytki 6-dołkowej)
   4. Postukaj w płytkę, aby mechanicznie odłączyć komórki od spodu płytki. Użyj mikroskopu, aby wizualnie sprawdzić, czy komórki się odłączyły. Jeśli nie, inkubuj płytkę do hodowli komórkowej przez dodatkową minutę.
   5. Dodać wymaganą objętość pożywki EPDC+SB do komórek, ponownie zawiesić przez pipetowanie w górę iw dół, a następnie przenieść zawiesinę komórek na nową płytkę hodowlaną pokrytą żelatyną.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, komórki mogą być utrzymywane w morfologii brukowej do przejścia 8.

5. Indukcja EMT w EPDC

1. Aby indukować EMT, należy zdysocjować komórki trypsyną i przenieść komórki do nowych studzienek pokrytych żelatyną w stosunku powierzchniowym 1:2 w pożywce EPDC+SB, jak opisano w 4, i inkubować przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
2. Sprawdź, czy zbieg wynosi 50 - 70% i czy EPDC mają morfologię kostki brukowej.
   UWAGA: Konfluencja wpływa na zdolność EPDC do poddania się EMT.
3. Odessać pożywkę z komórek i dokładnie przemyć komórki PBS (patrz kroki 4.2.1 - 4.2.2).
4. Stymulować komórki 1 ng/ml TGFβ3 w pożywce EPDC i umieszczać je w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 5 dni. Należy pamiętać, że podczas stymulacji podłoże EPDC zawierające TGFβ3 nie musi być uzupełniane.
5. Monitoruj komórki codziennie. Po 5 dniach komórki, które przeszły EMT, są rozpoznawane na podstawie morfologii w kształcie wrzeciona (Rysunek 2A).
6. Hodowla wrzecionowatych EPDC zgodnie z metodą opisaną w pkt 4 bez dodawania SB lub TGFβ do pożywki EPDC. Należy pamiętać, że ogólnie rzecz biorąc, wrzecionowate EPDC mogą być hodowane do pasażu 20.
7. Zweryfikuj występowanie EMT za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego przy użyciu przeciwciał przeciwko mezenchymalnym markerom αSMA lub wimentynie lub falloidynie w celu wykrycia tworzenia włókien stresowych F-aktyny (Figura 2B) lub za pomocą qRT-PCR dla genów związanych z EMT (np. WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Kadheryna, MMP3, Ślimak, Ślimak) (Rysunek 2C i Tabela 2).

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiamy prosty protokół izolacji EPDCs z tkanki serca dorosłego człowieka oraz płodu (Ryc. 1). Protokół ten wykorzystuje łatwo dostępną lokalizację epikardium na zewnętrznej powierzchni serca (Ryc. 1A). Barwienie uszka serca po sekcji wykazuje, że epikardium WT1+ zostaje usunięte, podczas gdy leżąca pod nim podepikardialna macierz zewnątrzkomórkowa i tkanka mięśnia sercowego pozostają nienaruszone (

Dyskusja

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek nasierdzia pochodzących z ludzkich serc dorosłych i płodów. Obszerna charakterystyka tych komórek została wcześniej opublikowana¹⁷. Wykazaliśmy, że oba typy komórek mogą być utrzymywane jako nabłonkowe komórki przypominające bruk, gdy są hodowane z inhibitorem kinazy ALK5 SB431542. EMT jest integralną częścią aktywacji nasierdzia in vivo zarówno podczas rozwoju, jak i odpowiedzi po urazie. EMT można badać za pomoc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Surowica bydlęca dla płodu	Gibco	10270-106
Trypsyna 0,25%	Invitrogen	25200-056
Sól sodowa penicyliny G	Roth	HP48
Siarczan streptomycyny	Roth	HP66
Trypsyna 1:250 z trzustki bydlęcej	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Żelatyna ze skóry świni	Sigma-Aldrich	G1890
Płytki hodowlane 6 dołków	Greiner bio-one	657160
Płytki hodowlane 12 dołków	Corning	3512
Płytki hodowlane 24 dołki	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Merck	102931
100-1000&mikro; L Filtrowane końcówki do pipet	Corning	4809
10 ml Pibuła	Greiner bio-one	607180
Pibuła 5 ml	Greiner bio-one	606180
Naczynie do hodowli komórkowych 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Lub domowe i sterylizowane
probówki Eppendorf 1,5 ml	Eppendorf
Probówki wirówkowe 15 ml	Greiner bio-one	188271
50 ml probówki wirówkowe	Greiner bio-one	227261
10 ml	305959		Becton Dickinson
19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Igły o rozmiarze 21	Becton Dickinson	304432
Sita siatkowe EASY, 100 i mikro; m	Greiner bio-one	542000
TGFβ 3	R& D systems	243-B3
Monoklonalna antyaktyna, α-Smooth Muscle Sigma		A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Kontroler pipet	Integra	155 015
Stereomikroskop	Leica	M80
Mikroskop światła odwróconego	Wirówka Olympus	CK2
	Eppendorf	5702
Kąpiel wodna	GFL	1083

0030120086 Igły do