Artykuł metodologiczny

Prosty test oparty na cytometrii przepływowej do określenia zależnego od przeciwciał wzmocnienia wirusa dengi in vitro przy użyciu surowicy rekonwalescencyjnej wirusa Zika

DOI:

10.3791/57371

⸱

10 kwietnia 2018

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, Uniformed Services University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prosty i łatwy protokół pomiaru zależnego od przeciwciał wzmocnienia infekcji przez surowicę rekonwalescencyjną wirusa Zika za pomocą Reporter Virus Particles.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że zależne od przeciwciał wzmocnienie infekcji odgrywa główną rolę w patogenezie wirusa dengi. Tradycyjne testy, które mierzą zdolność przeciwciał lub surowicy do wzmacniania infekcji w niedopuszczalnych liniach komórkowych, opierały się na wykorzystaniu produkcji wirusa w pożywce, a następnie testów płytki nazębnej w celu ilościowego określenia infekcji. Niedawno testy te badały zakażenie wirusem dengi (DENV) w liniach komórkowych przy użyciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Oba te podejścia mają ograniczenia, które ograniczają powszechne stosowanie tych technik. W tym miejscu opisujemy prosty test in vitro z wykorzystaniem reporterowych cząstek wirusa dengi (RVP), które eksprymują białko zielonej fluorescencji i komórki K562, w celu zbadania wzmocnienia zależnego od przeciwciał (ADE) infekcji DENV przy użyciu surowicy uzyskanej od makaków rezusów 16 tygodni po zakażeniu wirusem Zika (ZIKV). Technika ta jest niezawodna, wymaga minimalnej manipulacji komórkami, nie wymaga użycia wirusa kompetentnego do replikacji na żywo i może być wykonywana w formacie o wysokiej przepustowości w celu uzyskania odczytu ilościowego za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto test ten można łatwo dostosować do badania wzmocnienia zależnego od przeciwciał (ADE) innych infekcji flawiwirusowych, takich jak wirus żółtej gorączki (YFV), wirus japońskiego zapalenia mózgu koni (JEEV), wirus Zachodniego Nilu (WNV) itp., gdzie dostępne są RVP. Łatwość konfiguracji testu, analizowania danych i interpretowania wyników sprawia, że jest on wysoce podatny na większość warunków laboratoryjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprawa zakażenia zależna od przeciwciał (ADE) to proces, w którym częściowo krzyżowo reagujące odpowiedzi przeciwciał wywołane przez serotyp wirusa zwiększa wychwyt innego serotypu wirusa, prowadząc do zwiększonej replikacji wirusa i wiremii. ADE zostało obszernie udokumentowane w zakażeniach wirusem dengi (DENV), w których dominują cztery główne serotypy. W podgrupie pacjentów ADE jest związane z gorączką krwotoczną denga (DHF). Niedawno wykazaliśmy, że zakażenie wirusem Zika (ZIKV) wywołało znacznie wysoki poziom odpowiedzi przeciwciał reagujących krzyżowo DENV, które spowodowały ADE DENV in vitro i prawdopodobnie przyczyniło się do wzmocnienia wiremii DENV in vivo1,2. Testy wzmacniające zależne od przeciwciał są cennym narzędziem do oceny zdolności przeciwciał do wzmacniania wtórnego zakażenia pokrewnymi wirusami i dostarczają cennych informacji na temat patogenezy zakażeń flawiwirusami oraz dostarczają informacji na temat opracowywania szczepionek.

Opisany tutaj test wykorzystuje RVP DENV wraz z komórkami K562, które są normalnie niedopuszczalne dla infekcji. RVP to strukturalnie nienaruszone, niekompetentne replikacyjnie cząsteczki wirusa DENV, które kodują subgenomowy replikon zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), który ulega ekspresji po pojedynczej rundzie replikacji3. W związku z tym komórki, które zostaną zakażone RVP, fluoryzują na zielono i można je łatwo wykryć za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii. RVP użyte w tym teście zostały uzyskane ze źródeł komercyjnych. Mogą one być jednak generowane przeciwko innym wirusom i wykorzystywane w teście opisanym w tym manuskrypcie. Tymczasem komórki K562 są linią komórkową białaczki z ekspresją receptora FcγIII, która wiąże się z regionem Fc przeciwciał i ulega zakażeniu w obecności subneutralizujących stężeń przeciwciała4,5.

Testy ADE były szeroko stosowane w badaniach nad czynnikami ryzyka ciężkiej gorączki denga oraz do nakreślenia mechanizmów in vitro ADE6,7,8. Opisany tutaj test ADE może być szybko i łatwo wykorzystany do określenia zdolności surowicy do wzmacniania infekcji in vitro przy użyciu RVP i cytometrii przepływowej, w porównaniu z innymi testami stosowanymi obecnie, które wymagają albo oznaczenia jednostek tworzących płytkę miażdżycową (pfu) w komórkach Vero, albo barwienia przeciwciałami zakażonych komórek6,7,8, 9,10,11, które są czasochłonne i pracochłonne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki surowicy użyte do zademonstrowania opisanego tutaj protokołu zostały pobrane od makaków rezusów, które były trzymane i pielęgnowane zgodnie z lokalnymi, stanowymi i federalnymi politykami w akredytowanym przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania, a próbki zostały pobrane za pomocą protokołu udostępniania tkanek.

1. Dzień 1

UWAGA: Wykonaj wszystkie opisane poniżej kroki w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, używanej do hodowli tkanek w laboratorium BSL-2.

  1. Rozmrozić próbki surowicy w temperaturze pokojowej i przenieść 100 μl każdej próbki surowicy do sterylnej probówki. Podgrzewać przez 30 minut w temperaturze 56°C w łaźni wodnej lub termomikserze o regulowanej temperaturze. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbki surowicy w zakresie od 1:1 do 1:1,000 przy użyciu zimnego RPMI-10 (RPMI z 10% płodową surowicą bydlęcą).
  2. Przenieść 10 μl seryjnie rozcieńczonej próbki surowicy do każdego dołka sterylnej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Uwzględnij dwa zestawy studzienek kontrolnych, RPMI-10 tylko z RVP i bez próbki surowicy oraz RPMI-10 tylko bez RVP i bez próbki surowicy. Ustawić każdą próbkę surowicy i kontrolki RPMI-10 w trzech egzemplarzach.
  3. Wyjąć RVP Dengue-1, 2, 3 i 4 z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Natychmiast przenieś rozmrożone RVP na lód. Uzyskać około 170 μl RVP dla każdej próbki surowicy (10 μl RVP x 3 dołki na każde rozcieńczenie surowicy (1:1, 1:10, 1:100, 1:1,000) i 10 μl RVP x 3 dołki dla każdego z RPMI-10 z dołkami kontrolnymi tylko RVP).
  4. Odpipetować 10 μl RVP do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V zawierającej próbkę surowicy i do RPMI-10 z dołkami kontrolnymi RVP (bez surowicy). Nie dodawaj RVP tylko do dołków RPMI-10 (bez próbki surowicy i bez RVP). Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 5–10 razy. Dodaj 10 μl zimnego RPMI-10 zamiast RVP do każdej zimnej studzienki kontrolnej RPMI-10 (bez próbki surowicy i bez RVP).
  5. Przenieść 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V do inkubatora i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 . Podczas inkubacji 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V, oczyść powierzchnię komory bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i włącz światło UV na 15 minut.
  6. Wyjąć z inkubatora w pełni zlewającą się kolbę T75 z komórkami K562, dobrze wymieszać komórki za pomocą sterylnej pipety o pojemności 5 ml i przenieść 5 ml komórek do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Komórki K562 są utrzymywane w RPMI-10 i subhodowane w temperaturze 1 x 106/ml.
  7. Policz liczbę komórek, usuwając 10 μl komórek ze sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wymieszaj z 10 μl błękitu tryphanowego. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić całkowitą liczbę komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  8. Odwirować 15 ml stożkowy z komórkami przy ~1,200 x g przez 10 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w ciepłym RPMI-10 o stężeniu 80 000 komórek/30 μL pożywki (2,66 x 106 komórek / ml).
  9. Wyjąć 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V z inkubatora (krok 1.6), przenieść 30 μl komórek K562 do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 5–10 razy. Przenieść 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V do inkubatora i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 .
  10. Po inkubacji przez 1 godzinę wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i odwirować przy ~1,200 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu zdekantować pożywkę z dołków, obracając płytkę do góry nogami do pojemnika zawierającego 10% wybielacza.
  11. Umyj komórki w każdym dołku, umieszczając je ponownie w 125 μl ciepłego RPMI-10, dokładnie wymieszaj pipetą i odwiruj płytkę przy ~1,200 x g przez 5 minut. Zdekantuj pożywkę, obracając płytkę do góry nogami do pojemnika zawierającego 10% wybielacza. Powtórz ten krok prania dwa razy.
  12. Po umyciu dodać 100 μl ciepłego RPMI-10 do każdej studzienki, wymieszać w górę i w dół pipetą i inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5%CO2.

2. Dzień 3

  1. Wyjąć z inkubatora 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery V zawierającą 100 μl komórek i pożywki/basenika i przenieść ją do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj zawartość każdej studzienki i przenieś komórki i pożywkę na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U lub do wstępnie oznakowanych probówek polipropylenowych o pojemności 5 ml.
  2. Przepłukać każdą studzienkę w 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery V 100 μl 1% paraformaldehydu (PFA) w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i przenieść do odpowiednich studzienek na 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U lub oznakowanych probówkach polipropylenowych o pojemności 5 ml z kroku 2.1, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5% PFA / studzienkę lub probówkę. Dokładnie wymieszaj za pomocą pipety wielokanałowej, przykryj płytkę folią aluminiową i pozostaw w inkubatorze na 30 minut, aby utrwalić komórki.
  3. Przygotuj cytometr przepływowy (patrz na przykład tabela materiałów), uruchamiając niebarwione komórki K562, aby skalibrować rozproszenie boczne i przednie wraz z ustawieniami fluorescencji. Jedynym wymaganym kanałem fluorescencji jest FL1, ponieważ GFP jest jedyną fluorescencją emitowaną przez komórki. Zdobądź ~30 000–50 000 komórek z każdej próbki.
    UWAGA: Do pozyskiwania danych można użyć dowolnego cytometru przepływowego zdolnego do odczytu pojedynczej fluorescencji, ponieważ komórki zakażone RVP będą emitować tylko zieloną fluorescencję ze względu na obecność GFP i nie jest potrzebny żaden inny kanał fluorescencyjny.

3. Analiza danych

  1. Analizuj dane uzyskane na cytometrze przepływowym za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów).
    1. Ustaw pierwszą bramkę na podstawie FSC-A (forward scatter – obszar) vs FSC-H (forward scatter – height), aby uwzględnić pojedyncze komórki i wykluczyć autofluorescencyjne dublety z analizy12. Następnie bramkowane komórki bramkowane singletowo oparte na SSC-A (rozproszenie boczne – obszar) vs FSC-A, aby wykluczyć wszelkie zanieczyszczenia autofluorescencyjne.
    2. Analizuj komórki bramkowane SSC-A i FSC-A pod kątem ekspresji GFP na podstawie SSC-A vs GFP-A. Określ procentową zawartość komórek GFP+ dla każdego rozcieńczenia surowicy i próbek kontrolnych, ustawiając bramkę wokół komórek GFP+.
  2. Określić średni procent komórek GFP+ dla każdej studzienki rozcieńczenia i kontrolnej próbki surowicy, dzieląc całkowity procent komórek GFP+ w studzienkach potrójnych przez 3.
  3. Oblicz zwiększenie krotności infekcji, dzieląc średni odsetek komórek GFP+ w próbkach surowicy dla każdego rozcieńczenia podzielony przez średni odsetek komórek GFP+ w dołku kontrolnym RPMI-10 z RVPs (bez próbki surowicy).
  4. Zwiększ zwiększenie fałdu na wykresie (oś y) w porównaniu z rozcieńczeniem (oś x) i wykonaj analizę statystyczną przy użyciu ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya w celu wielokrotnych porównań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Surowice od 4 makaków rezusów zostały zebrane 16 tygodni po zakażeniu ZIKV i przetestowane pod kątem ich potencjału do wzmacniania infekcji DENV-1, 2, 3 i 4 w komórkach K562. Zwierzęta miały szczytową wiremię ~1 x 105 kopii ZIKV RNA / ml osocza do 3 dnia po zakażeniu, które spadły do poziomów poniżej granicy wykrywalności przez 7 dni po zakażeniu. Nie wykryto wiremii w osoczu po 16 tygodniach od zakażenia. Następnie wykonano test RVP i poddano analizie zebrane dane, zgodnie z o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flawiwirusy, takie jak DENV i ZIKV, mają znaczące dowody na homologię zarówno w swoich strukturalnych, jak i niestrukturalnych białkach, które wytwarzają przeciwciała, które reagują krzyżowo ze sobą13,14. Wykazano, że te krzyżowe odpowiedzi przeciwciał nasilają infekcję zarówno in vivo, jak i in vitro heterologicznym serotypem lub innymi pokrewnymi flawiwirusami 1,2. Możliwość nasilenia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany projekt był wspierany przez fundusze z Uniwersytetu Służb Mundurowych Nauk o Zdrowiu dla JJM. Opinie lub twierdzenia zawarte w niniejszym dokumencie są prywatnymi opiniami autorów i nie mogą być interpretowane jako oficjalne lub odzwierciedlające poglądy Departamentu Obrony, Uniwersytetu Nauk o Zdrowiu Służb Mundurowych ani żadnej innej agencji rządu Stanów Zjednoczonych.

WGV przeprowadziło wszystkie eksperymenty i przeanalizowało dane; JJM zaprojektował i nadzorował badanie; Autorami artykułu są WGW i JJM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DENV 1-4 RVPIntegralny molekularnyRVP-501
K562 komórkiATCCCCL-243
RPMICorning10-040-CV
FBSGE lifesceincesSH 30910.0310% FBS w RPMI-10
Penicylina-StreptomycynaMP biomedyczne1670049100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/ml w RPMI-10
HEPESCellegro25-060-Cl0,025M w RPMI-10
MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100 razy;)SigmaM71451x w RPMI-10
Pirogronian soduCellegro25-000-Cl1mM w RPMI-10
L-glutaminaFisher ScientificMT25005CI 
Sterylne płytki z dnem w kształcie litery VThomas Scientific333-8001-01V
BD Falcon Polipropylenowe probówki FACS 5 mlVWR60819-728
Niesterylne płytki dolne w kształcie litery UFalconRef 353910Wysokoprzepustowa alternatywa dla probówek FACS
5 ml, sterylna, serologicznapipeta DenvilleP7127
200uL sterylne końcówkido pipetSterylneP3020 CPS
20uLDenvilleP1121
Pipeta wielokanałowa 50-200uLDenvilleP3975-8-B
Pipeta wielokanałowa 5-50uLDenvilleP3975-9-B
20% formadehydeTousimis #1008B
Kąpiel wodnaThermoFisherTSCOL35
termomikserEppendorf2231000387Alternatywa dla kąpieli wodnej do inaktywacji ciepła
Inkubator CO2ThermoFisher13-998-213
EtanolSigma AldrichE7023
Wybielacz w płynieFisher ScientificNC9724348
Flowjo 9.8TreeStar, Inc.Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej
BD FACSDiva 6.1.2Cytometr przepływowy Becton Dikinson
BD LSR IIBecton Dikinson
Liquid BleachFisher ScientificNC9724348
końcówki do pipet Denville

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).
  2. Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  3. Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252(2011).
  4. Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
  5. Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
  6. Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
  7. Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
  8. Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
  9. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  10. Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
  11. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
  14. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wirusowe cz stki reporterowekom rki K562surowica z wirusem Zikarozcie czenia seryjneekspresja GFPtest wysokoprzepustowyinfekcja flawiwirusem

Powiązane artykuły