Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

DOI:

10.3791/57372

⸱

16 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe RNA hamującego małą próbę jest ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. W niniejszym artykule przedstawiono rozwój i walidację modeli i metod ekspozycji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych uszkodzeń nabłonka rogówki wywołanych fluorowodorem i chloropikryną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uraz oka wywołany przez toksyny jest prawdziwym zagrożeniem dla oka, ponieważ chemikalia mogą szybko spowodować znaczne uszkodzenia tkanek. Leczenie uszkodzenia rogówki wywołanego przez toksyny jest na ogół wspomagające, ponieważ nie istnieją żadne specyficzne terapie do leczenia tych urazów. W wysiłkach na rzecz opracowania metod leczenia i terapii w celu ochrony przed narażeniem, ważne może być zrozumienie molekularnych i komórkowych mechanizmów tych urazów. Sugerujemy, że wykorzystanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych małego hamującego RNA (siRNA) może być ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. siRNA to dwuniciowe cząsteczki RNA, które mają długość 19-25 nukleotydów i wykorzystują potranskrypcyjny szlak wyciszania genów do degradacji mRNA, które mają homologię do siRNA. Wynikające z tego zmniejszenie ekspresji określonego genu można następnie badać w komórkach narażonych na działanie substancji toksycznych, aby ustalić funkcję tego genu w odpowiedzi komórkowej na substancję toksyczną. W artykule przedstawiono opracowanie i walidację modeli i metod ekspozycji in vitro w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych (HTS) uszkodzeń oczu wywołanych fluorowodorem (HF) i chloropikryną (CP). Chociaż wybraliśmy te dwie substancje toksyczne, nasze metody mają zastosowanie do badania innych substancji toksycznych z niewielkimi modyfikacjami protokołu narażenia na substancje toksyczne. Do badania wybrano dużą linię komórkową nabłonka rogówki SV40 z dużym antygenem T unieśmiertelnionym ludzkim nabłonkiem rogówki SV40-HCEC. Żywotność komórek i produkcja IL-8 zostały wybrane jako punkty końcowe w protokole badań przesiewowych. Przedstawiono kilka wyzwań związanych z opracowaniem metod ekspozycji na substancje toksyczne i hodowli komórkowych odpowiednich do badań HTS. Ustanowienie modeli HTS dla tych substancji toksycznych pozwala na dalsze badania w celu lepszego zrozumienia mechanizmu uszkodzenia i badań przesiewowych w poszukiwaniu potencjalnych metod leczenia chemicznego uszkodzenia oczu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uraz oka wywołany przez toksyny jest prawdziwym zagrożeniem dla oka, ponieważ chemikalia mogą szybko spowodować znaczne uszkodzenia tkanek. Niestety, leczenie uszkodzeń rogówki wywołanych toksynami jest tylko ogólnie wspomagające, ponieważ nie istnieją żadne specyficzne terapie do leczenia tych urazów. Obecna strategia leczenia jest niespecyficzna i obejmuje przede wszystkim miejscowe leczenie terapeutyczne, takie jak lubrykanty, antybiotyki i cykloplegia, a następnie leki przeciwzapalne (np. sterydy) po ponownym nabłonku rogówki1,2. Pomimo najlepszych obecnie dostępnych opcji terapeutycznych, długoterminowe rokowanie jest na ogół złe z powodu postępującego zmętnienia rogówki i neowaskularyzacji2,3.

Modele zwierzęce były tradycyjnie używane do badania toksyczności chemicznej i zrozumienia mechanizmów urazów. Jednak badania na zwierzętach są czasochłonne i kosztowne. Podejmowane są również wysiłki na rzecz ograniczenia testów na zwierzętach. Na przykład przepisy REACH (WE 1907/2006) w Unii Europejskiej zawierają przepisy mające na celu ograniczenie testów na zwierzętach. Przepisy obejmują wymóg, aby przedsiębiorstwa dzieliły się danymi w celu uniknięcia testów na zwierzętach i uzyskania zgody Europejskiej Agencji Chemikaliów przed przeprowadzeniem proponowanych testów na zwierzętach. Zgodnie z przepisami rozporządzenia REACH testy na zwierzętach powinny być stosowane w ostateczności. Istnieje również europejskie rozporządzenie w sprawie kosmetyków (WE 1223/2009), które stopniowo zniosło testowanie kosmetyków na zwierzętach. Kiedy przeprowadzane są badania na zwierzętach, kierują się zasadami 3R (Refinement, Reduction, and Replacement), które zapewniają ramy do prowadzenia bardziej humanitarnych badań na zwierzętach, zmniejszania liczby wykorzystywanych zwierząt i stosowania alternatyw bez udziału zwierząt, jeśli to możliwe. Z tych powodów dziedzina toksykologii starała się przyjąć testy in vitro, które mogą zapewnić wgląd w molekularne mechanizmy toksyczności i mogą być wykonywane w wyższej przepustowości4. Jest to podejście toksykologiczne funkcjonalne, w którym substancje toksyczne są definiowane na podstawie ich funkcji, a nie wyłącznie na podstawie ich składu chemicznego. Idąc o krok dalej, toksykogenomika funkcjonalna stara się zrozumieć rolę, jaką określone geny odgrywają w działaniu substancji toksycznych5. Dzięki zastosowaniu technologii siRNA, badania przesiewowe w celu zbadania funkcji genów w molekularnych i komórkowych odpowiedziach na substancje toksyczne mogą być wykonywane z dużą przepustowością. siRNA to dwuniciowe cząsteczki RNA o długości 19-25 nukleotydów, które wykorzystują potranskrypcyjny szlak wyciszania genów obecny we wszystkich komórkach ssaków6. Są one wytwarzane syntetycznie i zaprojektowane tak, aby celować w określony gen. Po wprowadzeniu do komórki siRNA jest przetwarzane, a jedna nić, nić prowadząca, jest ładowana do kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC). SiRNA kieruje RISC do komplementarnego regionu w cząsteczce mRNA, a RISC degraduje mRNA. Powoduje to zmniejszenie ekspresji określonego genu. Wynikające z tego zmniejszenie ekspresji określonego genu można następnie badać w komórkach narażonych na działanie substancji toksycznych, aby ustalić funkcję tego genu w odpowiedzi komórkowej na substancję toksyczną. Takie podejście zostało wykorzystane do lepszego zrozumienia mechanizmów wrażliwości na rycynę i zależnej od AHR indukcji CYP1A17,8.

Lista Oceny Ryzyka Terroryzmu Chemicznego (CTRA) oraz lista toksycznych chemikaliów przemysłowych (TIC) zawierają wyszczególnione wybrane substancje chemiczne na podstawie ich toksyczności i potencjału do uwolnienia podczas zdarzenia terrorystycznego, wojennego lub wypadku przemysłowego9. Stosujemy podejście toksykogenomiczne oparte na wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych siRNA (HTS) do badania substancji toksycznych z listy CTRA, które zostały zidentyfikowane jako narażone na wysokie ryzyko użycia w incydencie terrorystycznym. Tradycyjna toksykologia ma na celu zrozumienie niekorzystnego wpływu, jaki chemikalia wywierają na organizmy żywe; Mamy jednak dalsze pragnienie zrozumienia mechanizmów urazu, aby pomóc w rozwoju terapii i podejść terapeutycznych, a być może także odkryć cząsteczki, które mogą być celem rozwoju terapeutycznego. Wysiłek ten pod pewnymi względami można uznać za analogiczny do zastosowania wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA i testów komórkowych w procesie odkrywania leków10. Główna różnica polega na tym, że odkrywanie leków zazwyczaj poszukuje pojedynczego celu do odkrycia terapeutycznego, podczas gdy w naszym podejściu jest raczej mało prawdopodobne, aby istniał pojedynczy cel o wysokiej wartości terapeutycznej w leczeniu narażenia na toksyny. Przewidujemy, że każdy skuteczny paradygmat leczenia narażenia na toksyny będzie wymagał wieloaspektowego podejścia w celu osiągnięcia wysokiej wartości terapeutycznej, a dane toksykogenomiczne mogą stanowić istotną informację o skutecznym paradygmacie leczenia.

Automatyzacja laboratoryjna wprowadza metodologię wysokiej przepustowości do laboratoriów spoza przemysłu farmaceutycznego lub biotechnologicznego. Badania in vitro w naszym instytucie były historycznie tradycyjnymi testami o niskiej przepustowości11,12,13. W ciągu ostatnich kilku lat nasze laboratorium przestawiło się na wykorzystanie robotyki laboratoryjnej do wykonywania wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA. W niniejszym artykule przedstawiono udoskonalenie modeli komórek oka oraz opracowanie metod ekspozycji in vitro na fluorowodór (HF) i chloropikrynę (CP) odpowiednich do wysokoprzepustowych badań przesiewowych siRNA. Naszym celem jest zidentyfikowanie cząsteczek, które regulują uszkodzenia komórek w odpowiedzi na te toksyny. Cele wybranej przez nas biblioteki siRNA obejmują receptory sprzężone z białkiem G, kinazy białkowe, proteazy, fosfatazy, kanały jonowe i inne potencjalnie ulegające uleczanie cele. HF i CP zostały wybrane do badania poprzez porównanie agentów z listy CTRA z raportami ToxNet dotyczącymi wypadków przemysłowych w celu znalezienia tych, którzy stwarzają największe ryzyko urazu oka poprzez ekspozycję na opary9,14. CP (wzór chemiczny Cl3CNO2, numer CAS 76-06-2) był pierwotnie używany jako gaz łzawiący w klasie WWI15. Obecnie jest używany jako fumigant rolniczy i działa jako nematocyd, fungicyd i insektycyd16. Fluorowodór (HF) jest stosowany w procesach takich jak alkilowanie w rafineriach ropy naftowej i elektrochemiczne fluorowanie związków organicznych17. HF (wzór chemiczny HF, numer CAS 62778-11-4) jest gazem, ale w postaci wodnej jest kwasem fluorowodorowym (HFA, numer CAS 7664-39-3). Dlatego zdecydowaliśmy się na użycie HFA w naszych modelach ekspozycji w komórkach. Do badania wybrano dużą linię komórkową nabłonka rogówki SV40 z dużym antygenem T unieśmiertelnionym ludzkim nabłonkiem rogówki SV40-HCEC. Żywotność komórek i marker stanu zapalnego IL-8 zostały wybrane jako punkty końcowe, ponieważ cele, które są zaangażowane w uszkodzenie komórki, powinny być odzwierciedlone w śmierci komórki i odpowiedzi zapalnej. W szczególności, jeśli cel miałby odgrywać rolę ochronną w ekspozycji na toksyny, śmierć komórki i/lub produkcja cytokin zapalnych powinna wzrosnąć, gdy ekspresja docelowa jest hamowana przez siRNA. Odwrotnie byłoby w przypadku celów, które odgrywają negatywną rolę. Ponadto przewlekły stan zapalny wydaje się odgrywać rolę w patologii rogówki po ekspozycji, a interwencja w szlaki śmierci komórki może poprawić wyniki kliniczne2,18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Utrzymanie kultur komórkowych

  1. Hoduj linię komórkową SV40-HCEC w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 90% w DMEM F-12 z 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% L-glutaminą, 10 μg / L naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF) i 5 mg / L insuliny.
  2. Linię komórkową należy przechodzić przez linię komórkową co 3 do 4 dni (w zależności od gęstości wysiewu), aby upewnić się, że konfluencja nigdy nie przekroczy 80% podczas utrzymania kultury.
  3. Oderwać komórki od kolb za pomocą roztworu oddzielającego (14 ml roztworu na każde 150cm2 kolby) i inkubować w temperaturze 37 °C nie dłużej niż 8 minut.
  4. Zneutralizować roztwór oddzielający równą objętością pożywki do hodowli komórkowych i zagnieździć komórki w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml przez odwirowanie przez 7 minut przy 160 x g.
  5. Ponownie zawiesić osad komórkowy w podłożu (20 ml na każde 150cm2 kolby).
  6. Policz komórki za pomocą automatycznego ręcznego licznika komórek i wysiewaj je w nowych kolbach o gęstości, która pozwoli im rosnąć przez 3 do 4 dni bez przekraczania 80% konfluencji.

2. Komórki płytkowe do eksperymentów

  1. Sprawdź kolby SV40-HCEC za pomocą mikroskopii światła z kontrastem fazowym, aby upewnić się, że konfluencja jest mniejsza niż 80% i ocenić ogólny stan zdrowia komórek.
  2. Odłącz, osadzać, ponownie zawiesić i policzyć SV40-HCEC od kolb zgodnie z opisem w krokach od 1.3 do 1.6 konserwacji hodowli komórkowych. Użyj pożywki SV40-HCEC zawierającej 0,5 μg/ml hydrokortyzonu (pożywka HCORT) do ponownego zawieszenia komórek.
  3. W jednorazowej butelce z pożywką przygotuj zawiesinę SV40-HCEC o stężeniu 17 857 komórek/ml we wstępnie podgrzanym podłożu HCORT.
    1. Przygotować wystarczającą objętość zawiesiny komórkowej w stosunku do liczby płytek, które mają być wysiane.
    2. Zasiaj co najmniej 14 x 96-dołkowych płytek z komórkami dla każdej płytki biblioteki siRNA, która ma być badana.
  4. Zakręcić butelką, aby równomiernie zawiesić komórki, wlać wystarczającą objętość zawiesiny komórek do zbiornika na gnieździe wytrząsarki orbitalnej automatycznego urządzenia do obsługi płynów i przechowywać butelkę zawierającą zawiesinę komórek na płycie grzewczej o temperaturze 37 °C podczas procesu powlekania komórek.
  5. Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby dodać komórki do płytek o gęstości 1000 komórek na dołek (5000 komórek/cm2) w 70 μl podłoża na dołek płytki 96-dołkowej. Na wszystkich etapach należy używać pipetowania z prędkością 50 μl/s.
    1. Wytrząsarka orbitalna powinna pracować z prędkością 100 obr./min w sposób ciągły podczas procesu wysiewu.
    2. Wymieszaj zawiesinę komórek trzykrotnie (objętość mieszanki 140 μl) za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy.
    3. Odessać 140 μl zawiesiny komórkowej i dozować 70 μl do każdej studzienki na dwóch płytkach do hodowli komórkowych.
    4. Powtarzać kroki 2.5.3 i 2.5.4, aż wszystkie płytki zostaną obsiane komórkami.
    5. W razie potrzeby uzupełnij zbiornik zawiesiny komórkowej podczas procesu wysiewu.
  6. Po wysianiu płytek należy je wyjąć z automatycznego urządzenia do obsługi płynów i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej przed przeniesieniem do inkubatora do hodowli komórkowych.
  7. Następnego ranka należy ocenić gęstość komórek w każdym dołku dla każdej płytki za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania, który jest umieszczony w inkubatorze do hodowli komórkowych i wykluczyć z badania wszelkie płytki, które mają studzienki wewnętrzne, które nie zlewają się w zakresie od 15% do 22%.

3. Komórki transfekcyjne z siRNA

  1. Uzyskaj płytki biblioteki siRNA od dostawcy wstępnie skonfigurowane tak, aby zawierały 80 celów siRNA na płytkę (patrz Rysunek 4), z kolumnami 1 i 12 pozostawionymi pustymi.
  2. Rozpuść płytkę biblioteki siRNA z buforem siRNA do końcowego stężenia 2 pmol/μL dla każdej studzienki siRNA zgodnie z instrukcjami producenta19.
  3. Transfekcję komórek należy przeprowadzić 24 godziny po wysiewie za pomocą 4 pmol/studzienkę siRNA i 0,3 μl/studzienkę odczynnika do transfekcji. Wykonaj wszystkie kroki zgodnie z protokołem producenta odczynnika do transfekcji (patrz Rysunek 4 dla układu płytki)20.
    1. Wszystkie transfekcje należy wykonać za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, a na wszystkich etapach należy użyć pipetowania z prędkością 25 μl/s. Użyj wstępnie skonfigurowanych skrzynek na końcówki, aby zaadresować tylko te dołki, które będą transfekowane.
    2. Użyj górnej połowy płytki bibliotecznej, aby transfekować zestaw sześciu powtórzonych płytek zwanych "zestawem górnych płytek" (sześć powtórzeń na siRNA, n = 6).
    3. Użyj dolnej połowy płytki bibliotecznej, aby transfekować inny zestaw sześciu płytek replikatów, zwany "zestawem dolnych płytek" (sześć powtórzeń na siRNA, n = 6).
    4. Użyj terminu "pełny zestaw płytek", aby opisać 12 płytek komórkowych, które zostały transfekowane biblioteką siRNA.
    5. Studnie transfekcyjne B2-B6 wszystkich płytek w pełnym zestawie płytek z ujemną pulą siRNA po transfekcji wszystkich górnych i dolnych zestawów płytek za pomocą biblioteki siRNA.
    6. Również studnie transfekcyjne B2-B6 z innych dwóch płytek, które nie otrzymują biblioteki siRNA i będą służyć jako nienaświetlone kontrole (jedna dla górnego zestawu płytek i jedna dla dolnego zestawu płytek), z ujemną pulą siRNA.
  4. Inkubować wszystkie płytki komórkowe w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 4 godziny po dodaniu wszystkich mieszanek transfekcyjnych i mieszać delikatnie stukając co godzinę.
  5. Za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy dwukrotnie umyć wszystkie dołki płytek wstępnie podgrzanym podłożem HCORT rozcieńczonym w stosunku 1:5 w PBS. Na wszystkich etapach należy używać pipetowania z prędkością 50 μl/s.
    1. Odessać 100 μl z każdej studzienki i wyrzucić je do zbiornika na odpady.
    2. Dodać do każdej studzienki 100 μl/basenik wstępnie podgrzany pożywkę HCORT rozcieńczoną w stosunku 1:5 w PBS, która znajduje się w innym zbiorniku o objętości wystarczającej dla liczby płytek.
    3. Powtórz kroki 3.5.1 i 3.5.2 dla każdej płytki.
      1. W razie potrzeby opróżnij zbiornik na odpady.
      2. W razie potrzeby napełnić zbiornik pożywką HCORT rozcieńczoną w stosunku 1:5 w PBS.
    4. Odessać 100 μl z każdej studzienki i wyrzucić je do zbiornika na odpady.
  6. Ponownie napełnić wszystkie studzienki płytek wstępnie podgrzanym podłożem HCORT o pojemności 100 μl/studzienkę, które znajduje się w innym zbiorniku o objętości pożywki wystarczającej do liczby płytek.
    1. W razie potrzeby napełnij zbiornik pożywką.
  7. Użyj studzienek C2-C6 wszystkich płytek jako kontroli nietransfekowanych.
  8. Studzienki B7-B11 i C7-C11 wszystkich płytek należy przechowywać w stanie nietransfekowanym, aby mogły być używane jako kontrole narkotyków i nośników pod kątem narażenia na działanie substancji toksycznych.

4. Uzupełnij komórki następnego dnia

  1. Użyj zautomatyzowanej maszyny do obsługi cieczy, aby ponownie wprowadzić wszystkie dołki płytek. Na wszystkich etapach należy używać pipetowania z prędkością 50 μl/s.
    1. Odessać 100 μl z każdej studzienki i wyrzucić je do zbiornika na odpady.
    2. Ponownie nakarmić każdą studzienkę 100 μl/studzienkę wstępnie podgrzaną pożywką HCORT, która znajduje się w innym zbiorniku i ma wystarczającą objętość pożywki dla liczby płytek, które mają zostać poddane reflacji.
    3. W razie potrzeby powtórz kroki 4.1.1 i 4.1.2, aby ponownie wprowadzić wszystkie płytki komórkowe.
      1. W razie potrzeby opróżnij zbiornik na odpady.
      2. W razie potrzeby napełnij zbiornik pożywką.

5. Dodatek do kontroli pozytywnej

  1. Dwa dni po transfekcji i dwie godziny przed narażeniem przygotować 62,5 μM roztwór kardamoniny kontroli dodatniej w pożywce HCORT do użycia do ekspozycji na HFA i dodać do rzędu B 8-rzędowego zbiornika do rozcieńczania.
    1. Do ekspozycji CP należy przygotować i użyć roztworu SKF 86002 o stężeniu 25 μM.
    2. Przygotować objętość kontroli dodatniej wystarczającą do liczby płytek, które mają być badane.
  2. Przygotować 0,625% roztwór DMSO w pożywce HCORT (kontrola nośnika) i dodać do rzędu C tego samego zbiornika.
    1. Do ekspozycji na CP przygotuj i użyj 0,5% roztworu DMSO.
    2. Przygotować objętość kontroli pojazdu wystarczającą do liczby tabliczek, które mają być badane.
  3. Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby dodać kontrole dodatnie i nośnikowe do studzienek B7-B11 i C7-C11 każdej płytki komórkowej i użyj prędkości pipetowania 50 μl/s na wszystkich etapach. Użyj wstępnie skonfigurowanych skrzynek końcówek, aby zająć się tylko tymi studniami, które otrzymają kontrole dodatnie i pojazdowe.
    1. Usunąć 10 μl pożywki z dołków B7-B11 i C7-C11 z każdej płytki komórkowej i wyrzucić ją do rzędów G i H 8-rzędowego zbiornika do rozcieńczania.
    2. Przenieść 10 μl kontroli dodatniej i nośnika do tych studzienek i wymieszać 3 razy.
  4. Umieść te płytki komórkowe z powrotem w inkubatorze.
  5. Powtarzać kroki od 5.3 do 5.4 do momentu, gdy wszystkie płytki komórkowe otrzymają dodatnie wyniki kontroli i kontroli nośnika.

6. Ekspozycja HF hodowanych komórek

UWAGA: HFA jest i bardzo toksyczny.

  1. Wszystkie czynności związane z narażeniem na działanie substancji chemicznych należy wykonywać w okapie oparowym w podwójnych rękawicach nitrylowych, fartuchu laboratoryjnym, jednorazowych ochraniaczach rękawów z polietylenu i okularach ochronnych.
    1. Zakup HFA jako rozwiązania 48%.
    2. Rozcieńczyć HFA do 1% ultraczystą wodą i przechowywać w 5 ml porcji w grubościennych fiolkach z polietylenu o grubości 10 ml w celu poprawy bezpieczeństwa.
    3. Końcówki i zbiorniki pipet, które miały kontakt z HFA, oraz wszelkie resztki płynnego HFA należy odkazić 2,5% glukonianem wapnia przed ich usunięciem do strumienia odpadów niebezpiecznych.
  2. Dla każdej badanej płytki biblioteki siRNA przygotuj roztwór pożywki o stężeniu 0,0036%, dodając 288 μl 1% HFA do 80 ml wstępnie podgrzanej pożywki HCORT w butelce o pojemności 150 ml.
    1. Zakręcić butelką i inkubować rozcieńczony HFA w inkubatorze o temperaturze 37 °C w dygestorii chemicznej przez 10 minut.
  3. Ponownie wymieszać roztwór pożywki HFA, obracając butelkę, a następnie dodać roztwór pożywki HFA do zbiornika odczynnika na podgrzewaczu do talerzy.
  4. Wykonaj ekspozycję z dwoma technikami pracującymi w tandemie.
    1. Poproś technika po prawej stronie, aby zassał 100 μl z każdej z wewnętrznych studzienek płytki celi za pomocą 12-kanałowego pipetora, a następnie przekazał płytkę technikowi po lewej stronie.
    2. Poproś technika po lewej stronie, aby dodał 100 μl roztworu pożywki HFA na studzienkę.
    3. Powtórzyć kroki 6.4.1 i 6.4.2 dla wszystkich płytek komórkowych, które mają być narażone na działanie substancji toksycznych.
    4. Powtórzyć również kroki 6.4.1 i 6.4.2 dla nienaświetlonych płytek kontrolnych, używając świeżej pożywki HCORT zamiast roztworu pożywki HFA.
  5. Umieścić płytki w inkubatorze pod wyciągiem chemicznym na 20 minut, a następnie umieścić je z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  6. Powtórzyć etap dodawania kontroli dodatniej (etapy 5.1-5.5), jak pokazano poprzednio, po naświetleniu wszystkich płytek i powrocie do inkubatora do hodowli komórkowych.

7. Ekspozycja CP hodowanych komórek

UWAGA: CP jest bardzo toksyczny i drażniący.

  1. Wszystkie czynności związane z narażeniem na działanie substancji chemicznych należy wykonywać w okapie oparowym w podwójnych rękawicach nitrylowych, fartuchu laboratoryjnym, jednorazowych ochraniaczach rękawów z polietylenu i okularach ochronnych.
    1. Zdobądź CP.
    2. Rozcieńczyć CP do 5% w DMSO i przechowywać w 10 ml podwielokrotnościach w 10 ml fiolkach scyntylacyjnych w celu poprawy bezpieczeństwa.
    3. Końcówki i zbiorniki pipet, które miały kontakt z CP oraz wszelkie resztki cieczy CP należy odkazić 2,5% wodorosiarczynem sodu przed ich unieszkodliwieniem w strumieniu odpadów niebezpiecznych.
  2. Przygotować wystarczającą objętość wstępnie podgrzanego podłoża HCORT zawierającego 1x Pen/Strep i wstępnie podgrzany PBS dla liczby płytek, które mają być naświetlane.
  3. Dla każdego zestawu płytek górnych lub zestawów płytek dolnych dodać 8,04 μl 5% CP w DMSO do 50 ml podwielokrotności wstępnie podgrzanej pożywki HCORT i dobrze wymieszać, aby uzyskać końcowe stężenie CP 0,0008%. Szczelnie zamknąć probówkę i inkubować roztwór w inkubatorze o temperaturze 37 °C w dygestorium chemicznym przez 1 godzinę.
    1. Dodać CP do 50 ml podwielokrotności pożywki w taki sposób, aby każdy odsłonięty zestaw górnych płytek i dolny zestaw płytek otrzymał substancję toksyczną dokładnie 1 godzinę po dodaniu CP do 50 ml podwielokrotności pożywki.
  4. Wyjąć zestaw górnych płytek i 1 nienaświetloną płytkę kontrolną z inkubatora do hodowli komórkowych i umieścić je w dygestoriach chemicznych pod koniec okresu inkubacji.
  5. Wymieszać roztwór CP przez odwrócenie probówki, a następnie zdekantować go do zbiornika odczynnika pod koniec 1-godzinnego okresu inkubacji.
  6. Wykonaj ekspozycję z dwoma technikami pracującymi w tandemie.
    1. Poproś technika po prawej stronie, aby zassał 100 μl z każdej z wewnętrznych studzienek płytki celi za pomocą 12-kanałowego pipetora, a następnie przekazał płytkę technikowi po lewej stronie.
    2. Poproś technika po lewej stronie, aby dodał 100 μl na studzienkę roztworu pożywki CP.
    3. Powtórzyć kroki 7.6.1 i 7.6.2 dla wszystkich płytek komórkowych zestawu płytek górnych, które mają być narażone na działanie substancji toksycznych.
    4. Powtórz również kroki 7.6.1 i 7.6.2 dla nienaświetlonych płytek kontrolnych, używając świeżej pożywki HCORT zamiast roztworu pożywki CP.
  7. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C w dygestoriach chemicznych na 10 minut.
  8. Dodać wystarczającą objętość pożywki PBS i HCORT zawierającej 1x Pen/Strep do zbiorników odczynników pod koniec 10-minutowego okresu inkubacji.
  9. Usunąć roztwór CP z płytek komórkowych za pomocą pipetara 12-kanałowego i zastąpić go roztworem 100 μl na studzienkę PBS pod koniec 10-minutowego okresu inkubacji.
  10. Natychmiast usunąć PBS z płytek komórkowych i zastąpić go 100 μl na studzienkę pożywki HCORT zawierającej 1x Pen/Strep.
  11. Powtórz również kroki 7.9 i 7.10 dla nienaświetlonych płytek kontrolnych.
  12. Umieść płytki komórkowe z powrotem w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.
  13. Powtórz kroki od 7.3 do 7.12 dla zestawu płyt dolnych.
  14. Powtórzyć etap dodawania kontroli dodatniej (etapy 5.1-5.5) zgodnie z poprzednim opisem, po naświetleniu wszystkich płytek i powrocie do inkubatora do hodowli komórkowych.

8. Pobieranie próbek i oznaczanie żywotności komórek

  1. Dwadzieścia cztery godziny po ekspozycji przygotować roztwór 0,5 mg/ml substratu MTT w PBS zawierający 10 g/l glukozy i ogrzać do 37 °C21. Przygotować 10 ml substratu dla każdej płytki, która ma być oznaczona.
  2. Aby uzyskać liczbę płytek, które mają być oznaczone, dodać wystarczającą objętość roztworu substratu MTT do zbiornika w zautomatyzowanym urządzeniu do obsługi cieczy.
  3. Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby pobrać próbkę i dodać substrat MTT przy użyciu prędkości pipetowania 50 μl/s na wszystkich etapach. Wstępnie skonfiguruj skrzynki końcówek, aby adresować tylko te dołki, które mają być badane.
    1. Odessać 95 μl pożywki z wewnętrznych 60 dołków płytki komórkowej i umieścić 42,5 μl na każdej z dwóch 384-dołkowych płytek do przechowywania.
    2. Natychmiast dodać 100 μl roztworu substratu MTT do płytki komórkowej na studzienkę i inkubować je w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 1,5 godziny.
    3. W razie potrzeby napełnij zbiornik roztworem substratu MTT.
  4. Inkubować płytki komórkowe w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 1 godzinę.
  5. Uszczelnić płytki do przechowywania w 384 dołkach i przechowywać je w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.
  6. Powtórz kroki od 8.3 do 8.5 dla wszystkich zestawów blach górnych i dolnych oraz skojarzonych niewidocznych elementów sterujących.
    1. W razie potrzeby należy ponownie użyć końcówek między powtórzeniami, ale umyć je podczas dodawania roztworu substratu MTT i podczas przełączania między zestawami płytek.
  7. Po 1 godzinnej inkubacji dodać wystarczającą ilość DMSO do zbiornika na automatycznym urządzeniu do obsługi cieczy.
  8. Użyj automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, aby dodać DMSO i użyj prędkości pipetowania 50 μl/s na wszystkich etapach.
    1. Odessać 100 μl z każdej z wewnętrznych studzienek płytek komórkowych i wylać roztwór substratu MTT do zbiornika na odpady.
      1. W razie potrzeby opróżnij zbiornik na odpady.
    2. Pokryj każdą studzienkę 100 μL DMSO.
      1. W razie potrzeby napełnij zbiornik DMSO.
  9. Potrząsaj talerzami na wytrząsarce przez 3 minuty.
  10. Zmierzyć absorbancję przy 570 i 690 nm za pomocą spektrofotometru płytkowego.
  11. Odejmij tło i oblicz % żywotności komórek, dzieląc wartości ekspozycji absorbancji przez nienaświetlone kontrole. Użyj średniej nieeksponowanej ujemnej puli kontrolnej siRNA, aby obliczyć % żywotności komórek dla wszystkich celów.

9. Pomiar stężenia IL-8 w supernatantach hodowli komórkowych

  1. Zmierzyć stężenie IL-8 w supernatantach hodowli komórkowych za pomocą testu na bazie kulek bez płukania zgodnie z instrukcjami producenta22. Utwórz układ płytki testowej, aby pomieścić próbki i krzywą standardową.
  2. Wyjąć 384-dołkowe płytki do przechowywania z zamrażarki o temperaturze -80 °C, rozmrozić w temperaturze pokojowej i krótko odwirować płytki w celu zebrania próbki na dnie studzienek.
  3. Aby uzyskać liczbę płytek testowych, które mają być uruchomione, należy wykonać wystarczającą objętość kulek akceptorowych anty-IL-8 i biotynylowanego przeciwciała anty-IL-8 w buforze testowym dołączonym do zestawu. Stosować stosunek 50 μl kulek akceptorowych anty-IL8 i 50 μl biotynylowanego przeciwciała anty-IL8 na 9,9 ml buforu do oznaczania.
    1. Za pomocą pipetora wielokanałowego dodaj mieszaninę kulek/przeciwciał do czarnej 384-dołkowej płytki do przechowywania.
      1. Dodać kulkę akceptorową/przeciwciało do studzienek przeznaczonych do użycia dla próbek i krzywej wzorcowej zgodnie z układem płytki testowej.
      2. Dodać wystarczającą objętość do każdego dołka, aby uzyskać liczbę płytek testowych, które mają być uruchomione.
  4. Rozpuść wzorzec IL-8 do 1000 pg/ml przy użyciu pożywki do hodowli komórkowych zawierającej 354 μM NaCl. Przygotować objętość wystarczającą do liczby płytek do oznaczania, które mają być uruchomione.
  5. Wykonać osiem podwójnych seryjnych rozcieńczeń krzywej wzorcowej.
  6. Dodać krzywą wzorcową w trzech egzemplarzach do odpowiednich dołków czarnej 384-dołkowej płytki do przechowywania zgodnie z układem płytki do oznaczania. Dodać wystarczającą objętość do każdego dołka, aby uzyskać liczbę płytek testowych, które mają być uruchomione.
    1. Podobnie dodać pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą 354 μM NaCl bez IL-8 do pomiaru tła.
  7. Użyj zautomatyzowanej obsługi cieczy, aby wykonać test. Użyj wstępnie skonfigurowanych skrzynek końcówek, aby adresować tylko dołki wyznaczone przez układ płytki testowej. Na wszystkich etapach należy używać pipetowania z prędkością 50 μl/s.
    1. Przenieść 8 μl mieszaniny granulek akceptorowych i przeciwciał do studzienek na płytkich płytkach testowych z białymi 384 dołkami.
      1. Dodawać tylko do studzienek przeznaczonych dla próbek i krzywej wzorcowej zgodnie z układem płytki do oznaczania.
    2. Przenieść 2 μl krzywej wzorcowej do odpowiednich dołków płytkich do oznaczania płytkich studzienek zgodnie z układem płytki do oznaczania.
    3. Przygotować roztwór 3,54 M NaCl i dodać objętość wystarczającą do liczby płytek do oznaczenia do płytkiego zbiornika na automatycznym urządzeniu do obsługi cieczy.
    4. Dostosuj stężenie soli w próbkach do stężenia krzywej wzorcowej, przenosząc 4,5 μl roztworu NaCl do próbek na czarnych 384-dołkowych płytkach do przechowywania.
    5. Wymieszać próbki trzykrotnie, stosując objętość mieszania 30 μl, i przenieść 2 μl próbek na białe, płytkie płytkie do oznaczania zgodnie z układem płytek do oznaczania.
      1. Wymieniaj końcówki między płytkami próbnymi.
    6. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.
    7. Aby określić liczbę płytek testowych, które mają być uruchomione, należy umieścić wystarczającą ilość kulek akceptorowych w buforze testowym. Użyć proporcji 200 μl wtórnych kulek akceptorowych na 12,3 ml buforu testowego.
    8. Za pomocą pipetora wielokanałowego dodaj dodatkowe kulki do czarnej 384-dołkowej płytki do przechowywania.
      1. Dodaj wtórne kulki do dołków przeznaczonych do użycia dla próbek i krzywej wzorcowej zgodnie z układem płytki testowej.
      2. Dodać wystarczającą objętość do każdego dołka, aby uzyskać liczbę płytek testowych, które mają być uruchomione.
    9. Za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy przenieś 10 μl kulek wtórnych do dołków na białych płytkach do oznaczania płytkich studzienek z 384 dołkami.
      1. Dodaj tylko do studzienek, w których otrzymano próbki i krzywą wzorcową zgodnie z układem płytki testowej i umyj końcówki między każdą płytką.
    10. Inkubować przez kolejną godzinę w ciemności w temperaturze pokojowej.
  8. Uszczelnić płytki testowe przezroczystymi plombami i zeskanować za pomocą czytnika płytek kompatybilnego z testem. Do skanowania należy użyć odległości 0,2 mm między płytką a detektorem, czasu wzbudzenia 180 ms i czasu pomiaru 550 ms.
  9. Zaimportuj surowe dane z testów IL-8 do arkusza kalkulacyjnego.
  10. Użyj automatycznego dopasowania krzywej dla standardowej krzywej testów IL-8, a następnie przekonwertuj surowe dane na pg/ml dla każdej próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie metody ekspozycji

Udoskonaliliśmy i oceniliśmy przydatność ludzkiej linii komórkowej nabłonka rogówki SV40-HCEC do wykorzystania w badaniach HTS. SV40-HCEC zostały uwiecznione przy użyciu dużego antygenu T SV-40 i były prezentem od Dhanajay Pal23. W procesie opracowywania metodologii narażenia zbadano zbyt wiele zmiennych, aby można je było zwięźle przedstawić w niniejszym dok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule opisano nasze metody i wyniki dotyczące opracowania wysokoprzepustowego modelu przesiewowego komórek nabłonka rogówki do badania urazów HF i CP. Przedstawiamy również wyniki pierwotnego badania przesiewowego siRNA w kierunku uszkodzenia HF. Opracowanie modeli HTS do badania urazów TIC wiązało się z wieloma wyzwaniami. Metody, które udało nam się znaleźć w literaturze związanej z badaniem HF, HFA lub CP w modelach hodowli komórkowych były mało pomocne. Większość badań in vitro nad jonami flu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

ZASTRZEŻENIE: Poglądy wyrażone w tym artykule są poglądami autora (autorów) i nie odzwierciedlają oficjalnej polityki Departamentu Armii, Departamentu Obrony ani rządu USA. Badania te były wspierane przez umowę międzyagencyjną między NIH/NIAID a USAMRICD, a częściowo przez powołanie do Programu Uczestnictwa w Badaniach Podyplomowych w Instytucie Badań Medycznych Armii Stanów Zjednoczonych Obrony Chemicznej, administrowanym przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy umowy międzyagencyjnej między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a USAMRMC.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez National Institutes of Health CounterACT Program Interagency Agreement # AOD13015-001. Chcielibyśmy podziękować Stephanie Froberg i Peterowi Hurstowi za ich wysiłek i wiedzę na temat produkcji wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Platforma do przenoszenia płynów BravoAgilent lub odpowiednikG5409A Wytrząsarka
pipetująca
jednostka główna
Bravo 384ST jednorazowa głowica końcówkiAgilent lub równoważnaOpcja 179384-kanałowa głowica do pipetowania z małą końcówką
Bravo 96 250 μ L sterylne końcówki barieroweAgilent lub odpowiednik19477-022
Bravo 384 30 μ L sterylne końcówki barieroweAgilent lub odpowiednik19133-212
Bravo 384 70 μ L sterylne końcówki barieroweAgilent lub odpowiednik19133-212
Wielomodowy czytnik płytek EnSpirePerkin Elmer lub odpowiednik2300-0000Detektor testowy AlphaLISA ze wzbudzeniem laserowym dużej mocy
IL-8 (człowiek) Zestaw detekcyjny AlphaLISA Perkin Elmer lub równoważnyAL224Fna bazie kulek bez mycia
ProxiPlate-384 Plus białe mikropłytkie dołek 384Perkin Elmer lub równoważny6008359
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen lub równoważny13778500Odczynnik do transfekcji
Opti-MEM 1 Reduced SerumMedium Invitrogen lub równoważny31985070
TrypLE ExpressGibco lub równoważny12605010Roztwór do odrywania komórek
IncuCyte ZoomEssen Instruments lub równoważnyESSEN BIOSCI 4473Mikroskop automatyczny w inkubatorze
ChloropikrynaTrinity Produkcja lub równoważnaNie dotyczyToksyczność ostra i działanie drażniące
Pożywka do hodowli komórkowych DMEM-F12Invitrogen lub równoważny11330-057Zawiera HEPES
Płodowa surowica bydlęcaInvitrogen lub 1891471
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (stopień hodowli komórkowej)Invitrogen lub równoważnyE9644-.2MG
Rekombinowana insulina ludzka (klasa hodowli komórkowej)Invitrogen lub równoważny12585-014
Roztwór penicyliny i streptomycyny (stopień czystości w hodowli komórkowej)Invitrogen lub równoważny15140122
Hydrokortyzon (klasa hodowli komórkowej)Sigma lub równoważnyH0888-10G
Glukoza  (klasa hodowli komórkowej)Sigma lub odpowiednikG7021
PBS  (klasa hodowli komórkowej)Sigma lub równoważnyP5493
siRNADharmacon lub równoważnyróżne
bromek tetrazolowy błękitu tiazolylowegoSigma lub równoważnyM5655Podłoże do oznaczania MTT
Bufor siRNATermiczne lub równoważneB002000
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowychCorning lub równoważneCLS3595
hodowla komórkowa T150 kolbyCorning lub odpowiednikCLS430825
kaptur do hodowli komórkowych BSL-2Nuaire lub równoważnyNU-540
300 mL zbiorniki robotyczneThermo lub odpowiednik12-565-572 
96 zbiorników automatyki z przegrodamiThermo lub równoważny1064-15-8
500 ml sterylne jednorazowe butelki do przechowywaniaCorning lub równoważnyCLS430282
Zgrzewarka mikropłytkowaThermo lub równoważnaAB-1443A Folia
termozgrzewalna MicroplateThermo lub równoważnaAB-0475
KardamoninaTocris lub odpowiednik2509Przeciwzapalny, stosowany jako kontrola pozytywna
SKF 86002 Tocris lub równoważny2008Przeciwzapalny, stosowany jako kontrola pozytywna
DMSOSigma lub równoważnyD8418
48% kwas fluorowodorowySigma lub równoważny339261Toksyczność i ostra
1000 μ L Pipety jednokanałoweRainin lub równoważne17014382
200 μ L Pipetery jednokanałoweRainin lub równoważne17014391
20 μ L Pipety jednokanałoweRainin lub równoważne17014392
1000 μ L Pipetery 12-kanałoweRainin lub równoważne17014497
200 μ L Pipety 12-kanałoweRainin lub równoważne17013810
20 μ L Pipety 12-kanałoweRainin lub równoważne17013808
Końcówki do pipet 1000 μ LRainin lub równoważne17002920
końcówki do pipet 200 μ LRainin lub równoważny17014294
końcówki do pipet 20 μ LRainin lub równoważny17002928
Wyciąg chemicznyJamestown Metal ProductsMHCO_229
384-dołkowe płytki do przechowywania próbekTermiczne lub równoważne262261
Chlorek soduSigma lub równoważnyS6191
Rurki stożkowe 50 mlThermo lub równoważne14-959-49A
Pipety serologiczne 50 mlCorning lub równoważny07-200-576
Pipety serologiczne 25 mlCorning lub równoważne07-200-575
Pipety serologiczne 10 mlCorning lub równoważne07-200-574
Pipety serologiczne 5 mlCorning lub równoważne07-200-573
SV40-HCEC unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka rogówkiN/A N/A/AOgniwa te nie są dostępne na rynku, ale można je uzyskać od badaczy cytowanych w artykule
Sceptor Handheld Automated Cell CounterMillipore lub równoważnyPHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) InstrumentAffymetrix lub równoważny00-0372
Affymetrix 24- i 96-matrycowe płytkiAffymetrix lub równoważne901257; 901434
Draegger rurka HFDraeger lub równoważna8103251
Rurka Draegger CPDraeger lub równoważna8103421
PompaDraeger lub równoważna6400000
Przezroczyste uszczelki płytkoweResesarch Products International lub równoważne202502
Zbiorniki odczynnikówVistaLab Technologies lub równoważne3054-1000
XlfitIDBS lub równoważnyN/Aużywany do automatycznego dopasowywania krzywych
płytkowa Bravo Agilent lub odpowiednik Opcja 159 Jednorazowa głowica końcówki Bravo 96LT Agilent lub odpowiednik Opcja 178 96-kanałowa głowica pipetująca z dużą końcówką Jednorazowa głowica Bravo 96ST Agilent lub odpowiednik Opcja 177 96-kanałowe pipetowanie z małą końcówką test równoważna N dodatek Excel

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110(2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  15. Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
  16. Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
  20. Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394(2007).
  41. ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki nab onka rog wkiekspozycja na kwas fluorowodorowytoksyczno chloropikrynytest ywotno ci kom rekprodukcja IL 8zautomatyzowany system dozowania cieczywysiew na p ytk 96 do kowprotok testu MTTdetekcja IL 8 oparta na kuleczkach

Powiązane artykuły