Method Article

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowiska komórkowe składają się z różnych sygnałów, takich jak czynniki wzrostu, matryce zewnątrzkomórkowe i interakcje międzykomórkowe. Te sygnały są dobrze zaaranżowane i mają kluczowe znaczenie w regulacji funkcji komórek w żywym systemie. Chociaż wielu badaczy próbowało zbadać korelację między czynnikami środowiskowymi a pożądanymi funkcjami komórkowymi, wiele pozostaje niewiadomych. Wynika to w dużej mierze z braku odpowiedniej metodologii naśladowania takich sygnałów środowiskowych in vitro i jednoczesnego testowania różnych sygnałów środowiskowych na komórkach. W tym miejscu przedstawiamy zintegrowaną platformę kanałów mikroprzepływowych i matrycę nanowłókien, a następnie analizę pojedynczych komórek o wysokiej zawartości, w celu zbadania fenotypów komórek macierzystych zmienionych przez różne czynniki środowiskowe. Aby zademonstrować zastosowanie tej platformy, badanie koncentruje się na fenotypach samoodnawiających się ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). W tym miejscu przedstawiamy procedury przygotowania macierzy nanowłókien oraz strukturę mikroprzepływową w procesie wytwarzania macierzy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME). Ponadto opisano ogólne etapy profilowania pojedynczych komórek, barwienia komórek wieloma markerami fluorescencyjnymi, wielokrotnego obrazowania fluorescencyjnego i analiz statystycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC)1,2 samoodnawiają się bez ograniczeń i różnicują w różne linie tkankowe, co może zrewolucjonizować rozwój leków, terapie komórkowe, inżynierię tkankową i medycynę regeneracyjną3,4,5,6. Płytki do hodowli ogólnej i płytki do mikromiareczkowania nie są jednak zaprojektowane tak, aby umożliwić precyzyjną fizyczną i chemiczną manipulację komórkami na poziomie komórkowym w zakresie od nano- do mikrometrów, co jest krytycznym czynnikiem eks....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja tablicy MACME

Uwaga: Wszystkie materiały i wyposażenie są wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. Przygotowanie masek do układu z nanowłókien i formy do struktury mikroprzepływowej
    1. Twórz trójwymiarowe (3D) obrazy masek używanych do układów nanowłókien i form do struktur mikroprzepływowych za pomocą pakietów oprogramowania do grafiki komputerowej 3D (Tabela 1).
      nuta: Obrazy 3D są odczytywane i drukowane przez drukarkę 3D. Wydrukowane maski i forma mają te same wymiary z obrazami 3D zdefiniowanymi za pomocą oprogramowania graficznego w kroku 1.1.1.
      2. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tablice MACME: Projekt i wykonanie: W połączeniu z technologią nanowłókien, wykorzystaliśmy wcześniej stosowane techniki mikroprzepływowej hodowli komórek i badań przesiewowych, aby zidentyfikować optymalne warunki do samoodnawiania lub różnicowania hPSC35,36 (Rysunek 1). Doskonale nadaje się to do tworzenia solidnych, wysokoprzepustowych testów opartych na komórkach, ponieważ komory .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia pierwszą metodę badań przesiewowych w celu ustanowienia solidnego systemu hodowli na potrzeby utrzymania kwalifikowanych komórek hPSC. Po pierwsze, opisaliśmy, jak przygotować platformę z różnymi sztucznymi ECM i gęstościami wysiewu komórek za pomocą urządzenia mikroprzepływowego zintegrowanego z układem nanowłókien, macierzą MACME. Po drugie, przeprowadzono ilościowe fenotypowanie pojedynczych komórek w oparciu o obrazy50 w celu oceny indywidualnych wyników i zachowań kom.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Prof. N. Nakatsuji z iCeMS, Uniwersytet w Kioto, za dostarczenie ludzkich komórek ES. Dziękujemy również prof. A. Maruyamie z Tokyo Institute of Technology za wsparcie w wykorzystaniu mikroskopu sił atomowych. Fundusze zostały hojnie zapewnione przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 i 24656502); Finansowanie zostało również zapewnione przez Organizację Rozwoju Nowej Energii i Technologii Przemysłowych (NEDO) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Terumo. WPI-iCeMS jest wspierany przez World Premier International Research Centre Initiative (WPI), Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT), Japonia. C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polistyren (PS)Sigma#182435Średnia Mw: 290 000, średnia Mn: 130 000
Polimetyloglutarymid (PMGI)MicroChemG113113
Żelatyna (GT)SigmaG2625Ze skóry świni,
zestaw elastomerów silikonowych typu A Sylgard 184Doe Corning Toray#1064291Utwardzacz PDMS i baza elastomeru silikonowego są elementami tego zestawu.
OpenSCADJest to bezpłatne oprogramowanie do grafiki komputerowej 3D (http://www.openscad.org/) służące do projektowania formy urządzenia mikroprzepływowego.
AutoCAD 2014AutodeskJest to oprogramowanie do grafiki komputerowej 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) służące do projektowania maski używanej do przygotowania matrycy z nanowłókien.
Drukarka 3D, AGILISTA-3000Keyence
Żywica utwardzana promieniami UV, AR-M2KeyenceJest to używane do drukowania 3D przez Agilista.
Kwas octowySigma#338826≥ 99,99%
octan etyluSigma#270989Bezwodny, 99,8%
Tetrahydrofuran (THF)Sigma#401757
MSP-30TUrządzenieNapylanie magnetronowe
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811Jest to polistyrenowa płytka bazowa, na której tworzony jest układ nanowłókien. Ten rozmiar płytki to zwykle 127,7 x 85,5 mm.
Pistoletowa maszyna do wyładowań koronowychShinko Electric & OprzyrządowanieCFG-500To poręczne urządzenie służy do generowania korony w celu aktywacji dolnej powierzchni warstwy PDMS w kroku 1.5 "Montaż macierzy MACME" w protokole.
Strzykawka 5 mlTerumoSS-05SZ
igła ze stali nierdzewnej (rozmiar 23)Nipro#2166Średnica zewnętrzna i długość wynoszą odpowiednio 0,6 i 32 mm.
Zasilacz wysokonapięciowyTechDempaz
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid, chlorowodorekDojindoW001
N-hydroksysukcynimidSigma#56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning#354277Białko to jest określane w protokole jako matryca żelowa błony podstawnej.
CellAdhere Vitronectin, Człowiek, RoztwórSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940Pożywka hodowlana bez karmy, bez ksenotypów do utrzymania ludzkich komórek ES i iPS
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
Enzym TrypLE Express (1X), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific#12605028Jest to rekombinowana proteaza podobna do trypsyny do dysocjacji przylegających komórek ssaków.
Zestaw do obrazowania Click-iT EdU z Alexa Fluor 647 AzidesThermo Fisher ScientificC10086Fluorescencyjne znakowanie proliferujących komórek w barwieniu fluorescencyjnym na płytce przeprowadzono zgodnie z instrukcją obsługi tego zestawu.
Aneksyna V, koniugat Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 Przeciwciało (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875Jest to przeciwciało drugorzędowe stosowane w barwieniu komórek fluorescencyjnych na płytce.
ECLIPSE Ti-ENikonJest to odwrócony mikroskop fluorescencyjny wyposażony w obiektyw CFI Plan Fluor 4×/0,13 N.A. (Nikon), kamerę CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), lampę rtęciową (Intensilight, Nikon), stolik automatyczny XYZ (stolik z napędem Ti-S-ER z enkoderami, Nikon) oraz kostki filtrujące dla czterech kanałów fluorescencyjnych (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonJest to oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego służące do automatycznej akwizycji obrazu.
CellProfiler, wersja 2.1.0Jest to bezpłatne, otwarte oprogramowanie do analizy obrazu komórki (http://cellprofiler.org/).
Analiza RSOM jest wykonywana przez pakiet kohonen tego oprogramowania. Jest to dostępne bezpłatnie (https://www.r-project.org/).
Klaster 3.0Jest to oprogramowanie klastrowe typu open source (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Za pomocą tego oprogramowania wykonywane jest nienadzorowane grupowanie hierarchiczne.
Java TreeViewTo oprogramowanie typu open source (http://jtreeview.sourceforge.net/) służy do wizualizacji danych klastrowych w postaci mapy cieplnej i dendrogramu.
H9 ludzka embrionalna komórka macierzystaBank komórek macierzystych WiCellWA09
próżniowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles