Method Article

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowiska komórkowe składają się z różnych sygnałów, takich jak czynniki wzrostu, matryce zewnątrzkomórkowe i interakcje międzykomórkowe. Te sygnały są dobrze zaaranżowane i mają kluczowe znaczenie w regulacji funkcji komórek w żywym systemie. Chociaż wielu badaczy próbowało zbadać korelację między czynnikami środowiskowymi a pożądanymi funkcjami komórkowymi, wiele pozostaje niewiadomych. Wynika to w dużej mierze z braku odpowiedniej metodologii naśladowania takich sygnałów środowiskowych in vitro i jednoczesnego testowania różnych sygnałów środowiskowych na komórkach. W tym miejscu przedstawiamy zintegrowaną platformę kanałów mikroprzepływowych i matrycę nanowłókien, a następnie analizę pojedynczych komórek o wysokiej zawartości, w celu zbadania fenotypów komórek macierzystych zmienionych przez różne czynniki środowiskowe. Aby zademonstrować zastosowanie tej platformy, badanie koncentruje się na fenotypach samoodnawiających się ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). W tym miejscu przedstawiamy procedury przygotowania macierzy nanowłókien oraz strukturę mikroprzepływową w procesie wytwarzania macierzy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME). Ponadto opisano ogólne etapy profilowania pojedynczych komórek, barwienia komórek wieloma markerami fluorescencyjnymi, wielokrotnego obrazowania fluorescencyjnego i analiz statystycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC)1,2 samoodnawiają się bez ograniczeń i różnicują w różne linie tkankowe, co może zrewolucjonizować rozwój leków, terapie komórkowe, inżynierię tkankową i medycynę regeneracyjną3,4,5,6. Płytki do hodowli ogólnej i płytki do mikromiareczkowania nie są jednak zaprojektowane tak, aby umożliwić precyzyjną fizyczną i chemiczną manipulację komórkami na poziomie komórkowym w zakresie od nano- do mikrometrów, co jest krytycznym czynnikiem ekspansji komórkowej, samoodnowy i różnicowania. Aby rozwiązać ten problem, w badaniach zbadano rolę mikrośrodowisk komórkowych w regulowaniu decyzji dotyczących losu komórki i funkcji komórek4. W ostatnich latach przeprowadza się coraz więcej badań mających na celu rekonstrukcję mikrośrodowisk komórkowych in vitro7,8. Procesy nano- i mikroprodukcji stworzyły te mikrośrodowiska poprzez manipulację chemikaliami9,10,11,12,13,14,15,16,17 i fizyczny18,19,20 wskazówek środowiskowych. Do tej pory nie było doniesień pozwalających na systematyczne badanie mechanizmów leżących u podstaw chemicznych i fizycznych sygnałów środowiskowych wpływających na decyzje i funkcje dotyczące losu komórek w ramach jednej platformy.

Tutaj wprowadzamy strategię opartą na prostych zasadach projektowania, aby stworzyć solidną platformę przesiewową (Rysunek 1). Po pierwsze, opisujemy procedurę rozwoju zintegrowanej platformy do tworzenia wszechstronnych, sztucznych mikrośrodowisk komórkowych przy użyciu macierzy nanowłókien i struktury mikroprzepływowej: tablicy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) (Rysunek 1A i 2A). Układ nanowłókien ma 12 różnych mikrośrodowisk w różnych kombinacjach materiałów i gęstości nanowłókien. Do wytworzenia nanowłókien wykorzystano elektroprzędzenie. Materiały z nanowłókien, takie jak polistyren (PS)21, polimethylglutarimid (PMGI)22 i żelatyna (GT)23, zostały zaprojektowane w celu przetestowania ich właściwości chemicznych, które mogą wpływać na adhezję komórek i utrzymanie pluripotencji (Rysunek 2B). Gęstości nanowłókien zmieniano poprzez zmianę czasu elektroprzędzenia, a wygenerowane nanowłókna zdefiniowano zgodnie z ich gęstościami (DNF, gdzie D = XLow/Niski/Średni/Wysoki). Struktura mikroprzepływowa składa się z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierającego 48 komór do hodowli komórkowych, które można umieścić wzdłuż standardowych wymiarów 96-dołkowej mikropłytki. PDMS jest biokompatybilnym i wymienialnym gazowo polimerem powszechnie używanym do produkcji urządzeń mikroprzepływowych24. Każdy kanał mikroprzepływowy został zaprojektowany tak, aby miał 700 μm szerokości i 8,4 mm długości i miał dwa wloty na krawędziach (Tabela 1). Komory miały różne wysokości (250, 500 i 1000 μm), aby manipulować początkowymi gęstościami wysiewu komórek (0,3, 0,6 i 1,2 × 105 komórek/cm2), co może korelować z przeżywalnością, proliferacją i różnicowaniem hPSCs25 (Rysunek 2C). Liczba komórek wysianych w komorze jest proporcjonalna do gęstości kolumny nad dnem komory, a zatem początkowa gęstość wysiewu komórek była kontrolowana poprzez wprowadzenie tej samej zawiesiny komórek do komór hodowlanych o różnych wysokościach. Wszystkie kanały zostały zaprojektowane tak, aby ≥ 250 μm-high26, aby zminimalizować wpływ niskiego napięcia tlenowego27 i naprężenia ścinającego28 na komórkach. Wysokości kanałów 250, 500 i 1000 μm są tutaj skracane jako XCD z X = odpowiednio niskie, średnie i wysokie. Środowiska o wyraźnej gęstości nanowłókien i początkowej gęstości zasiewu komórek zostały skrócone do "gęstości Material_NF density_Cell" (np. GT_HighNF_HighCD: środowisko charakteryzujące się nanowłóknami GT o dużej gęstości i wysoką początkową gęstością wysiewu komórek).

Następnie opisujemy, jak przeprowadzać analizy pojedynczych komórek, aby systematycznie badać zachowanie komórek w odpowiedzi na czynniki środowiskowe (Rysunek 1B). Jako dowód słuszności koncepcji zidentyfikowaliśmy optymalne środowisko komórkowe dla samoodnawiania się hPSC, które jest kluczową funkcją dla utrzymania hPSC ( Rysunek 1B)29. Cytometria oparta na obrazie, a następnie analizy statystyczne, pozwalają na ilościową interpretację indywidualnych odpowiedzi fenotypowych komórek na środowisko komórkowe. Wśród różnych funkcji komórkowych, w artykule przedstawiono szczegółową procedurę identyfikacji optymalnych warunków utrzymania samoodnawiania się hPSC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja tablicy MACME

Uwaga: Wszystkie materiały i wyposażenie są wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. Przygotowanie masek do układu z nanowłókien i formy do struktury mikroprzepływowej
    1. Twórz trójwymiarowe (3D) obrazy masek używanych do układów nanowłókien i form do struktur mikroprzepływowych za pomocą pakietów oprogramowania do grafiki komputerowej 3D (Tabela 1).
      nuta: Obrazy 3D są odczytywane i drukowane przez drukarkę 3D. Wydrukowane maski i forma mają te same wymiary z obrazami 3D zdefiniowanymi za pomocą oprogramowania graficznego w kroku 1.1.1.
    2. Wydrukuj maski i formę na podstawie tych projektów za pomocą drukarki 3D.
      nuta: W tym protokole użyto drukarki 3D przypominającej atrament z żywicą utwardzaną promieniami UV30. Rozdzielczość drukarki wynosiła 635 × 400 dpi i 15 μm odpowiednio w X, Y i Z, jednak rzeczywista rozdzielczość X, Y była około czterokrotnie niższa.
  2. Przygotowanie macierzy nanowłókien (Rysunek 3A)
    1. Przygotuj roztwory polimerowe do elektroprzędzenia.
      1. Rozcieńczyć 13% płyn PMGI z tetrahydrofuranem o stężeniu 9% (w/v)22.
      2. Rozpuść 0,08 g PS (średnia liczbowa masa cząsteczkowa (Mn): 130 000) w THF: dimetyloformamid (stosunek objętości 1:1) 21, i dodaj THF: dimetyloformamid, aby zwiększyć objętość do końcowego 1 ml (8% (w/v) roztworu PS).
      3. Rozpuść 0,1 g GT w wodzie: kwas octowy: octan etylu (stosunek objętości 1:1,6:2,1) i dodaj wodę:kwas octowy:octan etylu, aby zwiększyć objętość do końcowego 1 ml (10% (w/v) roztworu GT) zgodnie z opisem23,31.
    2. Za pomocą rozpylarki magnetronowej nałóż cienką warstwę platyny o grubości 5 nm na płytkę bazową z polistyrenu (PS) (127,7 × 85,5 mm), która służy jako katoda w układzie do elektroprzędzenia.
    3. Załaduj każdy roztwór polimeru do strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę ze stali nierdzewnej 23 G.
    4. Umieścić i zakotwiczyć strzykawkę z igłą na pompie strzykawkowej w odległości 12 cm od kolektora urządzenia do elektroprzędzenia.
    5. Podłączyć igłę strzykawki do źródła zasilania pod wysokim napięciem i ustawić na 11 kV.
    6. Ustaw szybkość pompowania na 0,2 ml/h.
    7. Utrzymuj temperaturę i wilgotność na poziomie 30 °C i < 30% (v/v).
    8. Umieść maskę na płytce podstawowej przygotowanej w kroku 1.2.2.
    9. Wytwórz nanowłókna na płycie bazowej przez otwory maski o różnych gęstościach, zmieniając czas elektroprzędzenia (np. 20, 60, 90 i 180 s).
    10. Zdejmij maskę z płytki podstawy.
      nuta. Etanol można rozpylić na elektroprzędzone nanowłókna GT przed zdjęciem maski, aby uniknąć odklejania się nanowłókien GT wraz z maską.
    11. Powtarzaj kroki 1.2.4-1.2.10 aż do zakończenia wytwarzania matrycy z nanowłókien.
    12. Umieścić matrycę z nanowłókien w eksykatorze w temperaturze 25 °C na 16 godzin w celu odparowania pozostałego rozpuszczalnika.
    13. Usieciowane nanowłókna GT z 0,2 M chlorowodorkiem 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i 0,2 M N-hydroksysukcynimidu (NHS) w etanolu w temperaturze 25 °C przez 4 godziny 23.
    14. Wypłucz nanowłókna GT dwukrotnie 99,5% (v/v) etanolem i wysusz próżniowo w temperaturze 25 °C przez 16 godzin.
  3. Wytwarzanie struktur mikroprzepływowych (Rysunek 3B)
    1. Wymieszać 2 g utwardzacza PDMS i 20 g bazy PDMS (stosunek wagowy 1:10; Przed PDMS). 24
    2. Wlej mieszaninę pre-PDMS na formę wykonaną w kroku 1.2.
    3. Odgazować mieszaninę pre-PDMS w eksykatorze przez 30 minut.
    4. Mieszaninę pre-PDMS utwardzić w piecu w temperaturze 65 °C przez 16 godzin.
  4. Montaż tablic MACME (Rysunek 3B)
    1. Oderwij strukturę PDMS utwardzoną w kroku 1.3.4 od formy i wyczyść 70% (v/v) etanolem.
    2. Leczenie atmosferycznego wyładowania koronowego na dolnej stronie struktury PDMS32.
      nuta: W tym protokole korona jest wyładowywana na całej powierzchni warstwy 3 lub 4 razy za pomocą "poręcznego" aparatu do wyładowań koronowych. Obróbka plazmą tlenową została zastąpiona atmosferycznym wyładowaniem koronowym w celu zmiany przyczepności powierzchni.
    3. Szybko zmontuj strukturę PDMS za pomocą układu nanowłókien.
    4. Piec w piekarniku w temperaturze 65°C przez 2 dni.

2. Wczytywanie hESC do tablicy MACME

  1. W przypadku rutynowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H9 (hESC), należy utrzymywać komórki w wolnym od kseno, chemicznie zdefiniowanym pożywce hodowlanej w celu utrzymania hPSC33 uzupełniony inhibitorem 10 μM Y-27632 ROCK34 (nazwana pożywką hPSC) w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli komórkowych pokrytym macierzyą żelową błony podstawnej (MG).
  2. Pasaż komórek co 4 do 7 dni za pomocą rekombinowanej proteazy podobnej do trypsyny.
  3. Wysterylizuj macierz MACME 99,5% etanolem, ładując do komór na 10 minut, a następnie usuń etanol. Powtórz ten krok 3 razy.
  4. Wprowadzić 12 μl MG, 10 μg/ml witronektyny (VN) i 0,1% (w/v) GT do komór hodowlanych kontrolnych i inkubować komory w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby pokryć je na powierzchni komory.
    nuta: W tym protokole MG, VN i GT zostały wybrane jako białka referencyjne do adhezji i hodowli komórek. Ponieważ MG i VN są standardowymi matrycami hodowli komórkowych stosowanymi do utrzymania samoodnawiania się hPSC, stosuje się je jako kontrole pozytywne; jako kontrole ujemne zastosowano dwuwymiarową powłokę GT (2DGT) lub niepowłokową (NC).
  5. Wprowadzić wstępnie podgrzaną pożywkę hPSC do wszystkich komór matrycy MACME. Inkubować komory przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Przemyć H9 hESC wyhodowany na szalce o średnicy 35 mm za pomocą DPBS, dodać 0,5 ml rekombinowanej proteazy trypsynopodobnej do naczynia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 minutę i ostrożnie odessać tylko supernatanty zmieszane z proteazą.
    nuta: Na etapie aspiracji komórki nie są odłączane.
  7. Natychmiast dodaj pożywkę hPSC, delikatnie dozuj pożywkę do powierzchni naczynia kilkakrotnie, aby zdysocjować komórki i przenieś odłączone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  8. Wirować przy 200 x g przez 3 min. Odessać supernatant i zawiesić komórki w wstępnie podgrzanym podłożu hPSC.
  9. Wprowadzić 12 μl zawiesiny komórek (1,2 × 106 komórek/ml) do każdej komory mikroprzepływowej.
    nuta: Wprowadzić komórki do jednej komory z drugiej za pomocą mikropipety. Ponieważ liczba komórek wysiewanych do komór jest proporcjonalna do gęstości kolumny nad dnem komory, początkowa gęstość wysiewu komórek może być kontrolowana, nawet jeśli użyto próbek z tej samej zawiesiny komórek. Upewnij się, że pipetowanie odbywa się delikatnie. Po załadowaniu usuń nadmiar podłoża z komór za pomocą patyczka z bawełnianą końcówką. Macierz MACME jest kompatybilna zarówno z powszechnie stosowanymi pipetami laboratoryjnymi, jak i automatycznymi systemami pipetowania i nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu.
  10. Zmieniaj pożywkę hPSC co 12 godzin i posiew przez 4 dni.
    nuta: Stałe objętości pożywki (1,6, 3,2 i 6,4 μl) są utrzymywane dzięki zastosowaniu komór o różnych rozmiarach. Hoduj komórki w warunkach statycznych, aby zminimalizować naprężenia ścinające, z wyjątkiem wymiany pożywki do hodowli komórkowych35,36.

3. Ilościowe profilowanie pojedynczych komórek

  1. Barwienie komórek fluorescencyjnych na płytce
    Uwaga:     Aby przeanalizować zmiany fenotypowe samoodnawiających się hPSC, w protokole tym wybrano trzy kluczowe markery fenotypowe dla tego protokołu: OCT4, 5-etynylo-2'-deoksyurydynę (EdU) i Aneksynę V, aby zmierzyć odpowiednio stan pluripotencji, proliferacji i apoptozy (Rysunek 2b). 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) służy do identyfikacji jąder komórkowych. OCT4 jest jednym z krytycznych czynników transkrypcyjnych pluripotencji.
    1. Inkubować hESC H9 w macierzach MACME w pożywce hPSC uzupełnionej 10 μM alkinem EdU w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Po przemyciu buforem wiążącym anekcynę (10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), wybarwić komórki pomarańczowo-fluorescencyjnym barwnikiem sprzężonym z Aneksyną V w temperaturze 20 °C przez 15 min.
    3. Utrwalić komórki w PBS za pomocą 4% (v/v) paraformaldehydu w temperaturze 20 °C przez 15 minut, a następnie dwukrotnie przepłukać komórki PBS.
    4. Przepuszczalność komórek za pomocą PBS z 0,3% (v/v) Triton X-100 w temperaturze 20 °C przez 16 godzin
      nuta: Paraformaldehyd osłabia wiązanie między plastikową płytą podstawy a strukturą mikroprzepływową PDMS. W związku z tym odłączenie warstwy PDMS od macierzy w kroku 3.2.1 można również wykonać zaraz po tym kroku.
    5. Inkubować komórki w buforze reakcyjnym na bazie Tris z azydkiem barwnika czerwonofluorescencyjnego w temperaturze 20 °C przez 30 minut.
    6. Inkubować komórki w buforze blokującym (PBS z 5% (v/v) normalną surowicą kozią, 5% (v/v) normalną surowicą osła, 3% (w/v) albuminą surowicy bydlęcej, 0,1% (v/v) Tween-20 i 0,1% (w/v) N-dodecylo-β-D-maltozydem) w temperaturze 4 °C przez 16 godzin.
    7. Inkubować w PBS z 0,5% (v/v) roztworem Triton X-100 i ludzkim przeciwciałem OCT3/4 (mysią IgG) w temperaturze 4 °C przez 16 godzin.
    8. Inkubować w buforze blokującym z IgG (H+L) (H+L) znakowanymi barwnikiem zielono-fluorescencyjnym w temperaturze 37°C przez 60 minut.
    9. Inkubować w PBS z DAPI w temperaturze 20 °C przez 30 minut.
    10. Zamień PBS-DAPI na PBS.
    11. Zachowaj macierz MACME w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania obrazu.
  2. Akwizycja obrazu (Rysunek 4)
    1. Oderwij strukturę mikroprzepływową PDMS od macierzy MACME.
    2. Usuń resztki PBS z macierzy MACME, nałóż 90% (v/v) glicerolu w PBS na komórki i umieść szkiełka nakrywkowe na wybarwionych komórkach.
    3. Ustaw płytkę do góry nogami na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
    4. Automatyczne uzyskiwanie 12-bitowych kolorowych obrazów przy użyciu wszystkich zmotoryzowanych komponentów (stolika, filtrów, migawki i systemów ostrości), które były sterowane przez oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego.
      nuta. W tym protokole czasy ekspozycji są dostosowywane tak, aby osiągały wartości bliskie maksymalnym wartościom intensywności (najwyższa intensywność pikseli: 4096), ale bez nasycenia, dla każdego obrazu, DAPI, OCT4, Aneksyny V i EdU.
  3. Komputerowe przetwarzanie obrazu i kwantyfikacja sygnału fluorescencji (Rysunek 5)
    Uwaga:     Poniższa analiza obrazu komórki jest wykonywana w oparciu o wcześniej opisaną metodę37.
    1. Konwertuj kolorowe obrazy na skalę szarości.
    2. Oblicz pojedynczą wartość progową dla każdego obrazu DAPI za pomocą metody Otsu i sklasyfikuj piksele powyżej progu jako pierwszy plan i poniżej jako tło. Upewnij się, że wartość pierwszego planu odpowiada intensywności fluorescencji DAPI.
      nuta: Proces analizy obrazu składa się z 5 kroków; identyfikacja obiektów pierwotnych na obrazach DAPI, identyfikacja obiektów wtórnych odpowiednio na obrazach OCT4, Aneksyny V i EdU oraz pomiar intensywności obiektu. Rysunek 3 przedstawia obrazy graficznego interfejsu użytkownika (GUI) dotyczące ustawień przetwarzania obrazu.
    3. Zmierz intensywność fluorescencji OCT4 i EdU na każdym obrazie.
    4. Zidentyfikować obszar zabarwiony załącznikiem V za pomocą metody propagacji i określić ilościowo intensywność fluorescencji.
  4. 3.4. Analiza statystyczna w celu wizualizacji poszczególnych fenotypów komórkowych w obrazowaniu pojedynczych komórek
    1. Znormalizuj wejściowe intensywności fluorescencyjne każdego markera fenotypowego, centrując i skalując te zmienne, aby nadać im równą wagę.
    2. Wykonaj analizę mapy samoorganizującej się (SOM) przy użyciu środowiska programowego do obliczeń statystycznych i grafiki, zgodnie z opisem w poprzednich badaniach38,39.
      1. Utwórz 25 węzłów SOM z charakterystycznymi czterema "wektorami książki kodowej" odpowiadającymi intensywnościom fluorescencji czterech markerów: DAPI, EdU, Annexin V i OCT4.
      2. Przypisz poszczególne komórki w każdym mikrośrodowisku do "zwycięskiego" (najbardziej podobnego) węzła i wykreśl jako częstość komórki, zgodnie z którą wektory książki kodowej zwycięskiego węzła są aktualizowane przy użyciu średniej ważonej, gdzie waga jest szybkością uczenia się (tutaj domyślnie 0,05).
        nuta: Pomiń dane z komór zawierających mniej niż 1000 komórek, ponieważ zestawy danych zawierające kilka komórek nie dostarczyły statystycznie istotnych wyników SOM.
    3. Wykonaj nienadzorowane grupowanie hierarchiczne z wartościami węzła SOM, korzystając z metody średniego powiązania opartej na korelacji Pearsona przez oprogramowanie do grupowania40.
    4. Renderuj dane klastrowania w widokach dendrogramu i mapy cieplnej41.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tablice MACME: Projekt i wykonanie: W połączeniu z technologią nanowłókien, wykorzystaliśmy wcześniej stosowane techniki mikroprzepływowej hodowli komórek i badań przesiewowych, aby zidentyfikować optymalne warunki do samoodnawiania lub różnicowania hPSC35,36 (Rysunek 1). Doskonale nadaje się to do tworzenia solidnych, wysokoprzepustowych testów opartych na komórkach, ponieważ komory ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia pierwszą metodę badań przesiewowych w celu ustanowienia solidnego systemu hodowli na potrzeby utrzymania kwalifikowanych komórek hPSC. Po pierwsze, opisaliśmy, jak przygotować platformę z różnymi sztucznymi ECM i gęstościami wysiewu komórek za pomocą urządzenia mikroprzepływowego zintegrowanego z układem nanowłókien, macierzą MACME. Po drugie, przeprowadzono ilościowe fenotypowanie pojedynczych komórek w oparciu o obrazy50 w celu oceny indywidualnych wyników i zachowań kom...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Prof. N. Nakatsuji z iCeMS, Uniwersytet w Kioto, za dostarczenie ludzkich komórek ES. Dziękujemy również prof. A. Maruyamie z Tokyo Institute of Technology za wsparcie w wykorzystaniu mikroskopu sił atomowych. Fundusze zostały hojnie zapewnione przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 i 24656502); Finansowanie zostało również zapewnione przez Organizację Rozwoju Nowej Energii i Technologii Przemysłowych (NEDO) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Terumo. WPI-iCeMS jest wspierany przez World Premier International Research Centre Initiative (WPI), Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT), Japonia. Część tych prac była wspierana przez Kyoto University Nanotechnology Hub oraz AIST Nano-Processing Facility w ramach projektu "Nanotechnology Platform Project" sponsorowanego przez MEXT z Japonii.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polistyren (PS)Sigma#182435Średnia Mw: 290 000, średnia Mn: 130 000
Polimetyloglutarymid (PMGI)MicroChemG113113
Żelatyna (GT)SigmaG2625Ze skóry świni,
zestaw elastomerów silikonowych typu A Sylgard 184Doe Corning Toray#1064291Utwardzacz PDMS i baza elastomeru silikonowego są elementami tego zestawu.
OpenSCADJest to bezpłatne oprogramowanie do grafiki komputerowej 3D (http://www.openscad.org/) służące do projektowania formy urządzenia mikroprzepływowego.
AutoCAD 2014AutodeskJest to oprogramowanie do grafiki komputerowej 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) służące do projektowania maski używanej do przygotowania matrycy z nanowłókien.
Drukarka 3D, AGILISTA-3000Keyence
Żywica utwardzana promieniami UV, AR-M2KeyenceJest to używane do drukowania 3D przez Agilista.
Kwas octowySigma#338826≥ 99,99%
octan etyluSigma#270989Bezwodny, 99,8%
Tetrahydrofuran (THF)Sigma#401757
MSP-30TUrządzenieNapylanie magnetronowe
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811Jest to polistyrenowa płytka bazowa, na której tworzony jest układ nanowłókien. Ten rozmiar płytki to zwykle 127,7 x 85,5 mm.
Pistoletowa maszyna do wyładowań koronowychShinko Electric & OprzyrządowanieCFG-500To poręczne urządzenie służy do generowania korony w celu aktywacji dolnej powierzchni warstwy PDMS w kroku 1.5 "Montaż macierzy MACME" w protokole.
Strzykawka 5 mlTerumoSS-05SZ
igła ze stali nierdzewnej (rozmiar 23)Nipro#2166Średnica zewnętrzna i długość wynoszą odpowiednio 0,6 i 32 mm.
Zasilacz wysokonapięciowyTechDempaz
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid, chlorowodorekDojindoW001
N-hydroksysukcynimidSigma#56480
Matrigel hESC-Qualified MatrixCorning#354277Białko to jest określane w protokole jako matryca żelowa błony podstawnej.
CellAdhere Vitronectin, Człowiek, RoztwórSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940Pożywka hodowlana bez karmy, bez ksenotypów do utrzymania ludzkich komórek ES i iPS
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
Enzym TrypLE Express (1X), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific#12605028Jest to rekombinowana proteaza podobna do trypsyny do dysocjacji przylegających komórek ssaków.
Zestaw do obrazowania Click-iT EdU z Alexa Fluor 647 AzidesThermo Fisher ScientificC10086Fluorescencyjne znakowanie proliferujących komórek w barwieniu fluorescencyjnym na płytce przeprowadzono zgodnie z instrukcją obsługi tego zestawu.
Aneksyna V, koniugat Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 Przeciwciało (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Donkey Anti-Mouse IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875Jest to przeciwciało drugorzędowe stosowane w barwieniu komórek fluorescencyjnych na płytce.
ECLIPSE Ti-ENikonJest to odwrócony mikroskop fluorescencyjny wyposażony w obiektyw CFI Plan Fluor 4×/0,13 N.A. (Nikon), kamerę CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), lampę rtęciową (Intensilight, Nikon), stolik automatyczny XYZ (stolik z napędem Ti-S-ER z enkoderami, Nikon) oraz kostki filtrujące dla czterech kanałów fluorescencyjnych (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonJest to oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego służące do automatycznej akwizycji obrazu.
CellProfiler, wersja 2.1.0Jest to bezpłatne, otwarte oprogramowanie do analizy obrazu komórki (http://cellprofiler.org/).
Analiza RSOM jest wykonywana przez pakiet kohonen tego oprogramowania. Jest to dostępne bezpłatnie (https://www.r-project.org/).
Klaster 3.0Jest to oprogramowanie klastrowe typu open source (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Za pomocą tego oprogramowania wykonywane jest nienadzorowane grupowanie hierarchiczne.
Java TreeViewTo oprogramowanie typu open source (http://jtreeview.sourceforge.net/) służy do wizualizacji danych klastrowych w postaci mapy cieplnej i dendrogramu.
H9 ludzka embrionalna komórka macierzystaBank komórek macierzystych WiCellWA09
próżniowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
  4. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  5. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  6. Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
  7. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  8. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  9. Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
  10. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
  11. Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  12. Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
  13. Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
  14. Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
  15. Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
  16. Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
  17. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  18. Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
  19. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
  20. Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
  21. Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
  22. Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
  23. Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
  24. Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
  25. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  26. Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
  27. Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
  28. Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
  29. Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
  30. Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
  31. Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
  32. Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
  33. Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
  34. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  35. Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
  36. Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
  37. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  38. Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
  39. Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
  40. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  41. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  42. Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
  43. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
  44. Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473(2014).
  45. Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
  46. Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
  47. Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
  48. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
  49. Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
  50. Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
  51. Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
  52. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
  53. Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment ArrayNanofiber Array FabricationMicrofluidic Structure AssemblyElectrospinning ProcessStem Cell PhenotypingSingle Cell ProfilingFluorescence ImagingSOM AnalysishPSC Self RenewalPDMS Molding

Related Articles