Method Article

Badanie roli plazmidów wielokopijnych w ewolucji oporności na antybiotyki

DOI:

10.3791/57386

⸱

May 2nd, 2018

 ,  , 
1Department of Animal Health, Universidad Complutense de Madrid, 2Visavet Health Surveillance Centre, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Zoology, University of Oxford, 4Department of Microbiology, Hospital Universitario Ramon y Cajal (IRYCIS) and CIBERESP

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy eksperymentalną metodę testowania roli wielokopijnych plazmidów w ewolucji oporności na antybiotyki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multicopy plazmidów jest niezwykle obfite u prokariontów, ale ich rola w ewolucji bakterii pozostaje słabo poznana. Niedawno wykazaliśmy, że wzrost liczby kopii genów na komórkę dostarczony przez plazmidy wielokopijne może przyspieszyć ewolucję genów kodowanych przez plazmid. W niniejszej pracy przedstawiamy system eksperymentalny do testowania zdolności plazmidów wielokopijnych do promowania ewolucji genów. Korzystając z prostych metod biologii molekularnej, skonstruowaliśmy system modelowy, w którym gen oporności na antybiotyki może zostać wprowadzony do Escherichia coli MG1655, albo w chromosomie, albo w plazmidzie wielokopijnym. Stosujemy podejście ewolucji eksperymentalnej do namnażania różnych szczepów przy rosnących stężeniach antybiotyków i mierzymy przeżywalność populacji bakterii w czasie. Wybór cząsteczki antybiotyku i genu oporności jest taki, że gen może nadawać oporność tylko poprzez nabywanie mutacji. To podejście "ewolucyjnego ratunku" zapewnia prostą metodę testowania potencjału plazmidów wielokopijnych w promowaniu nabycia oporności na antybiotyki. W kolejnym kroku systemu eksperymentalnego scharakteryzowane są molekularne podstawy oporności na antybiotyki. Do identyfikacji mutacji odpowiedzialnych za nabycie antybiotykooporności wykorzystujemy głębokie sekwencjonowanie DNA próbek pobranych z całych populacji i klonów. Na koniec, aby potwierdzić rolę mutacji w badanym genie, rekonstruujemy je na tle rodzicielskim i badamy fenotyp oporności powstałych szczepów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oporność bakterii na antybiotyki jest poważnym problemem zdrowotnym1. Na podstawowym poziomie rozprzestrzenianie się oporności na antybiotyki u bakterii chorobotwórczych jest prostym przykładem ewolucji przez dobór naturalny2,3. Mówiąc prościej, stosowanie antybiotyków generuje selekcję szczepów opornych. Kluczowym problemem w biologii ewolucyjnej jest zatem zrozumienie czynników, które wpływają na zdolność populacji bakterii do ewolucji oporności na antybiotyki. Eksperymenty selekcyjne okazały się bardzo potężnym narzędziem do badania biologii ewolucyjnej bakterii, a ta dziedzina przyniosła niesamowite wglądy w szeroki zakres problemów ewolucyjnych4,5,6. W ewolucji eksperymentalnej populacje bakterii zainicjowane z pojedynczego szczepu rodzicielskiego są seryjnie pasażowane w określonych i ściśle kontrolowanych warunkach. Niektóre mutacje, które zachodzą podczas wzrostu tych kultur, zwiększają przystosowanie bakterii, a te rozprzestrzeniają się w kulturach przez dobór naturalny. Podczas eksperymentu próbki populacji są okresowo konserwowane kriogenicznie w celu stworzenia nieewoluującego zamrożonego zapisu kopalnego. Do scharakteryzowania ewoluujących populacji bakterii można zastosować wiele podejść, ale dwie najpowszechniejsze metody to testy dopasowania, które mierzą zdolność wyewoluowanych bakterii do konkurowania z ich odległymi przodkami, oraz sekwencjonowanie całego genomu, które służy do identyfikacji zmian genetycznych, które napędzają adaptację. Po pionierskich pracach Richarda Lenskiego i współpracowników7,8, standardowym podejściem w ewolucji eksperymentalnej było rzucenie wyzwania stosunkowo niewielkiej liczbie replikowanych populacji (zwykle <10) w celu przystosowania się do nowego wyzwania środowiskowego, takiego jak nowe źródła węgla, temperatura lub drapieżny.

Infekcje wywołane przez bakterie oporne na antybiotyki stają się dużym problemem, gdy oporność jest na tyle wysoka, że nie jest możliwe zwiększenie stężenia antybiotyku do poziomu śmiertelnego w tkankach pacjenta. Klinicyści są zatem zainteresowani tym, co pozwala bakteriom wyewoluować oporność na wysokie dawki antybiotyków, które przekraczają ten próg stężenia antybiotyku, kliniczny punkt krytyczny. Jak to zbadać eksperymentalnie? Jeśli niewielka liczba populacji bakterii zostanie poddana próbie podania wysokiej dawki antybiotyku, jak w eksperymencie w stylu Lenskiego, najbardziej prawdopodobnym wynikiem jest to, że antybiotyk doprowadzi wszystkie populacje do wyginięcia. Jednocześnie, jeśli dawka stosowanego antybiotyku jest niska, poniżej minimalnego stężenia hamującego (MIC) szczepu rodzicielskiego, jest mało prawdopodobne, że populacje bakterii wykształcą klinicznie istotne poziomy oporności, zwłaszcza jeśli oporność wiąże się z dużymi kosztami. Jednym z kompromisów między tymi dwoma scenariuszami jest użycie eksperymentu "ewolucyjnego ratunku"9,10,11. W tym podejściu bardzo duża liczba kultur (zazwyczaj >40) jest prowokowana dawkami antybiotyków, które zwiększają się z czasem, zazwyczaj poprzez podwajanie stężenia antybiotyków każdego dnia12. Cechą charakterystyczną tego eksperymentu jest to, że każda populacja, która nie wyewoluuje zwiększonej odporności, zostanie doprowadzona do wyginięcia. Większość populacji, które zostaną w ten sposób zakwestionowane, zostanie doprowadzona do wyginięcia, ale niewielka mniejszość przetrwa dzięki ewolucji wysokiego poziomu odporności. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób ten eksperymentalny projekt może być wykorzystany do zbadania udziału wielokopijnego plazmidu w ewolucji oporności.

Bakterie nabywają odporność na antybiotyki poprzez dwie główne drogi, mutacje chromosomowe i nabywanie ruchomych elementów genetycznych, głównie plazmidów13. Plazmidy odgrywają kluczową rolę w ewolucji oporności na antybiotyki, ponieważ są zdolne do przenoszenia genów oporności między bakteriami poprzez koniugację14,15. Plazmidy można podzielić na dwie grupy w zależności od ich wielkości i biologii: "małe", z dużą liczbą kopii na komórkę bakteryjną i "duże", z niską liczbą kopii16,17. Rola dużych plazmidów w ewolucji oporności na antybiotyki została obszernie udokumentowana, ponieważ obejmują one plazmidy koniugacyjne, które są kluczowymi czynnikami napędzającymi rozprzestrzenianie się oporności i wielooporności wśród bakterii15. Małe, wielokopijne plazmidy są również niezwykle powszechne u bakterii17,18 i często kodują geny oporności na antybiotyki19. Jednak rola małych plazmidów wielokopijnych w ewolucji oporności na antybiotyki została zbadana w mniejszym stopniu.

W niedawnej pracy zaproponowaliśmy, że plazmidy wielokopijne mogą przyspieszyć ewolucję genów, które przenoszą, zwiększając tempo mutacji genów ze względu na wyższą liczbę kopii genów na komórkę12. Korzystając z modelu eksperymentalnego ze szczepem E. coli MG1655 i genem β-laktamazy blaTEM-1, wykazano, że wielokopijne plazmidy przyspieszają tempo pojawiania się mutacji TEM-1 nadających oporność na cefalosporynę ceftazydymu trzeciej generacji. Wyniki te wskazują, że plazmidy wielokopijne mogą odgrywać ważną rolę w ewolucji oporności na antybiotyki.

Tutaj prezentujemy szczegółowy opis metody, którą opracowaliśmy do badania ewolucji oporności na antybiotyki za pośrednictwem wielu kopii plazmidów. Metoda ta składa się z trzech różnych etapów: po pierwsze, insercja badanego genu do plazmidu wielokopijnego lub chromosomu bakterii gospodarza. Po drugie, wykorzystanie ewolucji eksperymentalnej (ratunek ewolucyjny) do oceny potencjału różnych szczepów do przystosowania się do presji selekcyjnej. I po trzecie, określenie molekularnych podstaw ewolucji za pośrednictwem plazmidu za pomocą sekwencjonowania DNA i rekonstrukcji podejrzewanych mutacji indywidualnie w genotypie rodzicielskim.

Na koniec, mimo że opisany tutaj protokół został zaprojektowany do badania ewolucji oporności na antybiotyki, można argumentować, że ta metoda może być ogólnie przydatna do analizy ewolucji innowacji nabytych przez mutacje w dowolnym genie kodowanym plazmidem wielokopijnym.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa eksperymentalnego systemu kodującego gen oporności na antybiotyki

Uwaga: Tutaj E. coli MG1655 został użyty jako szczep biorcy genu oporności na antybiotyki kodowanego plazmidem lub chromosomem. Gen oporności na antybiotyki jest zakodowany w chromosomie lub plazmidzie wielokopijnym w skądinąd izogenicznym szczepie (Ryc. 1).

  1. Insercja genu oporności na antybiotyki w miejscu integracji faga λ (attB)20 chromosomu MG1655.
    1. Amplifikować regiony o długości 500 pz po obu stronach chromosomalnego miejsca attB metodą PCR. Użyj oligonukleotydów YbhC-F (5'- CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') i attB-R (5'- GCCCGCCACCCTCCGGGGGGTATAAAAAAAGCAGGCTTCA-3') dla lewego regionu homologii i attB-F (5'- AGCGCCCTAGCGCCCCTCTCTTATACTTGAGCGAAA-3') i YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') dla prawego. Amplifikować gen oporności blaTEM-1 za pomocą starterów Tem1-pBAD-F (5'- TGAAGCCTCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGGGG-3') i Tem1-pBAD-R (5'- TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGGCTAGGCT-3'). Zaprojektuj startery o długości około 20 pz (na końcu 5') wykazującej komplementarność do fragmentu, z którym ma być połączone.
    2. Fuzja regionów homologicznych z produktem PCR genu oporności na antybiotyki (w tym jego regionem promotora) za pomocą izotermicznego montażu21, w temperaturze 50 °C przez 30 min.
    3. Elektroporacja ogniw MG1655 zawierających plazmid pKOBEG.
      Uwaga: pKOBEG jest termoczułym wektorem, który zawiera maszynerię λ Red, promującą opartą na homologii wymianę alleli między chromosomem a produktami PCR22.
      1. Użyj 1 μl produktu z kroku 1.1.223 do 40 μl elektrokompetentnych ogniw w kuwetach 2 mm w temperaturze 4 °C i 2,5 kV. Zawieś komórki w 1 ml bulionu LB + 0,2% arabinozy, aby utrzymać ekspresję czerwonej maszynerii λ
        2. .
      2. Przenieść całkowitą objętość do probówki do mikrofuge i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 30 °C (temperatura dopuszczalna dla pKOBEG) z intensywnym wstrząsaniem (200 obr./min w wytrząsarce orbitalnej), aby umożliwić fenotypową ekspresję markerów oporności wprowadzonych do chromosomu.
      3. Umieść komórki na agarze LB zawierającym odpowiedni antybiotyk w celu wybrania genu oporności na antybiotyki (ampicylina lub karbenicylina w dawce 100 mg/l dla blaTEM-1).
    4. Umieść 100 μl na jednej szalce Petriego, a resztę objętości odwiruj, ponownie zawieś w 100 μl świeżego bulionu LB i umieść na innej szalce Petriego. Inkubować przez noc w temperaturze 42 °C.
      Uwaga: Ta temperatura nie jest dopuszczalna dla replikacji pKOBEG. Kolonie zdolne do wzrostu w tych warunkach utracą pKOBEG i będą prezentować gen oporności zintegrowany z miejscem attB (dla uproszczenia ten szczep będzie odtąd nazywany MG1655::resA).
    5. Przeprowadzić test na utratę pKOBEG poprzez replikację kolonii będących przedmiotem zainteresowania na płytkach z chloramfenikolem (antybiotykiem, przeciwko któremu pKOBEG zawiera marker oporności).
      Uwaga: Brak wzrostu na płytkach chloramfenikolu w dopuszczalnej temperaturze 30 ºC wskazuje na brak plazmidu.
    6. W celu weryfikacji klonów, PCR amplifikuje konstrukcję za pomocą zewnętrznych starterów YbhC-Extern (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') i YbhB-Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), weryfikuje za pomocą elektroforezy żelowej prawidłową wielkość amplikonu i sekwencjonuje oczyszczony produkt, aby upewnić się, że sekwencja wprowadzonego genu jest prawidłowa.
  2. Wstawić gen oporności na antybiotyki do plazmidu wielokopijnego.
    Uwaga: Ponieważ plazmidy o bardzo dużej liczbie kopii mają tendencję do narzucania dużego zmniejszenia zdolności gospodarza bakteryjnego, zalecamy stosowanie plazmidów wielokopijnych o naturalnym pochodzeniu replikacji, takich jak p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-type origin of replication24). Te plazmidy zwykle prezentują umiarkowaną liczbę kopii około 15-20 kopii na komórkę.
    1. PCR amplifikuje wybrany gen oporności na antybiotyki (w tym region promotora), fosforyluje produkt PCR i liguje go do amplifikowanego PCR szkieletu plazmidu:
      1. PCR wzmacnia gen oporności na antybiotyki; dla blaTEM-1 należy użyć starterów Tem1-pBAD-F (5'- TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGGGAGGGGGGG-3') i Tem1-pBAD-R (5'- TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGGGGGCT-3').
      2. Fosforylować oczyszczony produkt za pomocą kinazy polinukleotydowej T4, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      3. PCR amplifikuje szkielet plazmidu za pomocą polimerazy o wysokiej wierności i oligonukleotydów pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') i pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').
      4. Zwiąż oba fragmenty PCR za pomocą ligazy T4 zgodnie z wytycznymi producenta.
    2. Poddać elektroporację, jak opisano wcześniej, 40 μl elektrokompetentnych komórek DH5-α E. coli z maksymalnie 1 μl produktu ligacji i wybrać odpowiednie antybiotyki dla genu oporności na antybiotyki (ampicylina lub karbenicylina w dawce 100 mg/L dla blaTEM-1) i szkieletu plazmidowego.
      Uwaga: Uzupełnianie LB arabinozą w tym miejscu nie jest konieczne.
    3. Wyodrębnij plazmid za pomocą komercyjnego zestawu mini-przygotowawczego wybranego przez czytelnika:
      1. Zbierz 5 ml nocnej kultury, odwirowując przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej. Zawiesić komórki w 250 μl roztworu do reprodukcji i dobrze wymieszać. Dodać 250 μl roztworu do lizy i dobrze wymieszać. Dodaj 350 μl neutralizacji i dobrze wymieszaj.
      2. Przenieść supernatant do kolumny wiążącej DNA dostarczonej z zestawem, odwirować przez 1 minutę i odrzucić przepływ. Przemyć dwukrotnie kolumnę 500 μl roztworu myjącego, odwirowując przez jedną minutę i odrzucając przepływ przy każdym płukaniu. Odwirować pustą kolumnę przez dodatkowe 1 minutę w celu usunięcia resztek buforu myjącego.
      3. Umieść kolumnę w czystej probówce i dodaj 50 μl ultraczystej wody do membrany, aby wymyć oczyszczone DNA. Wirować przez 1-2 minuty i zebrać przepływ, który zawiera oczyszczony plazmid. Sekwencjonuje gen będący przedmiotem zainteresowania w plazmidzie za pomocą starterów spoza wstawionej sekwencji, aby potwierdzić, że sekwencja jest poprawna i że przed eksperymentami ewolucyjnymi w genie oporności nie ma mutacji.
    4. Po zweryfikowaniu sekwencji należy poddać elektroporację plazmidu w szczepie E. coli MG1655, jak opisano powyżej.
      Uwaga: Daje to szczep MG1655/pRESA.

2. Ewolucyjne podejście ratunkowe do eksperymentalnego rozwoju oporności na antybiotyki (Rysunek 1)

  1. Na płytkach LB należy rozdzielić badane szczepy: MG1655::resA i MG1655/pRESA oraz podatny szczep rodzicielski, MG1655.
    Uwaga: Plazmid pRESA powinien być stabilny w MG1655, więc nie ma potrzeby dodawania antybiotyków do płytek LB. Wskaźniki mutacji u E. coli są na tyle niskie, że po zweryfikowaniu konstrukcji nie jest konieczne weryfikowanie sekwencji plazmidu na każdym etapie.
  2. Przygotować 96-dołkowe płytki z 200 μl LB w każdym dołku i zaszczepić 48 izolowanych kolonii każdego szczepu w niezależnych studzienkach (jedna płytka na szczep). Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 200 obr./min. Utrzymuj zamrożone zapasy tych populacji założycielskich.
    Uwaga: Aby zapobiec i kontrolować zanieczyszczenie krzyżowe kultur na płytkach 96-dołkowych, należy użyć płytki w szachownicę, interkalując zaszczepione studzienki z pożywką wolną od bakterii na całej płytce 96-dołkowej. Używaj tej konstrukcji płyty podczas całej ewolucji eksperymentalnej.
  3. Rozpocznij ewolucyjny eksperyment ratunkowy od zaszczepienia 2 μl z każdej studzienki z populacji założycielskich w nowych 96-dołkowych płytkach z 198 μl LB w każdej studzience o subhamującym stężeniu badanego antybiotyku. W przypadku ewolucyjnego podejścia ratunkowego należy zacząć od 1/4 lub 1/8 minimalnego stężenia hamującego (MIC, określonego wcześniej25) antybiotyku w LB dla każdego z trzech szczepów i podwoić stężenie antybiotyku na dobę. Użyj tego podejścia, aby zmaksymalizować szanse populacji na nabycie mutacji oporności26. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 200 obr./min przez 20 h.
    Uwaga: Zmierz nocny OD populacji założycielskich. Jeśli istnieją znaczące różnice w OD między szczepami, należy skorygować początkowe inokulum, aby rozpocząć eksperyment z tą samą liczbą komórek na studzienkę.
  4. Każdego dnia mierzyć OD każdej populacji po nocnym posiewie i przeprowadzać transfer kultur, jak opisano w ppkt 2.3, na nowe 96-dołkowe płytki o dwukrotnie wyższym stężeniu antybiotyku niż dzień wcześniej. Inkubować płytki przez 20 godzin w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 200 obr./min.
    Uwaga: Współczynnik rozcieńczenia 1:100 wytwarza około 6-7 pokoleń dziennie.
  5. Równolegle rozmnażać populacje kontrolne każdego szczepu w tych samych warunkach, jak opisano w 2.3 i 2.4, ale przy braku antybiotyków.
    Uwaga: Populacje kontrolne pomogą rozróżnić mutacje powstałe w wyniku obecności antybiotyków i mutacje ogólne pomagające bakteriom przystosować się do warunków eksperymentalnych. Równoległe mutacje powstające przy braku antybiotyków prawdopodobnie pomagają bakteriom przystosować się do warunków eksperymentalnych i nie są związane z opornością na antybiotyki.
  6. Śledź liczbę populacji, które przeżyły każdego dnia, mierząc absorbancję kultur na długości fali 600 nm (OD) za pomocą czytnika płytek.
    Uwaga: Wartości gęstości optycznej niższe niż 0,1 wskazują na wyginięcie populacji. Zobacz Rysunek 2 dla przykładu krzywych przeżycia.
  7. Okresowo (co 3-5 dni) należy przechowywać zamrożone zapasy wszystkich populacji.
  8. Użyj testów log-rank [pakiet "przeżycie" w RStudio (wersja 0.99.486)], aby określić statystyczne różnice w przeżywalności populacji różnych szczepów w czasie przy rosnącym stężeniu antybiotyków12.
    Uwaga: Ten eksperyment określi, czy plazmidy wielokopijne nasilają ewolucję oporności na antybiotyki dla konkretnego badanego antybiotyku i genu.

3. Molekularne podstawy ewolucji oporności na antybiotyki (Rysunek 1)

  1. Wykonaj całkowite ekstrakcje DNA z reprezentatywnej liczby populacji i klonów w różnych szczepach i zabiegach. Uwzględnij szczepy rodzicielskie (MG1655, MG1655::resA i MG1655/pRESA), aby móc wykryć mutacje kumulujące się podczas eksperymentu.
    Uwaga: Przykłady zestawów do ekstrakcji DNA znajdują się w tabeli materiałów. Każdy zestaw ma inne protokoły; Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Określ ilościowo jakość i stężenie DNA. Istnieją różne metody określania jakości i stężenia DNA. Oznaczyć jakość, mierząc stosunki absorbancji 260 nm/280 nm i 260 nm/230 nm. Użyj fluorescencyjnego barwnika wiążącego DNA, aby zmierzyć stężenie DNA zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie elektroforezy w żelu agarozowym, aby potwierdzić, że nie ma degradacji DNA ani zanieczyszczenia RNA.
  3. Zastosuj głębokie sekwencjonowanie DNA z próbek całych populacji i pojedynczych klonów, aby zbadać genetyczne podstawy oporności na antybiotyki.
    Uwaga: Przeprowadziliśmy całe sekwencjonowanie w Wellcome Trust Centre for Human Genetics w Oksfordzie w Wielkiej Brytanii. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz San Millan i wsp. 201612.
  4. Użyj breseq 0.26.1 pipeline27,28 do wykrywania mutacji, używając trybu polimorfizmu do oszacowania częstości mutacji w populacjach. Porównaj różne wyewoluowane genomy z genomem rodzicielskim, aby wykryć mutacje, które nagromadziły się podczas eksperymentu.
  5. Porównaj mutacje nagromadzone równolegle w populacjach kontrolnych z mutacjami w populacjach, które wyewoluowały pod wpływem rosnącego stężenia antybiotyków, aby rozróżnić mutacje pomagające bakteriom przystosować się do ogólnych warunków eksperymentalnych (te występujące w populacjach kontrolnych) i te związane z opornością na antybiotyki (te występujące wyłącznie w populacjach poddanych presji antybiotyków).
    Uwaga: Liczba mutacji równoległych jest zwykle niska, więc można łatwo ocenić różne mutacje równoległe między terapiami. Oprócz mutacji w badanym genie oporności na antybiotyki, jest całkiem prawdopodobne, że zostaną znalezione inne mutacje związane z opornością na antybiotyki w chromosomie, takie mutacje w porynach lub systemach wypływowych12.
  6. Należy zrekonstruować mutacje w genie oporności na antybiotyki w szczepie rodzicielskim, stosując takie samo podejście, jak w sekcji 1 niniejszego protokołu. Postępuj zgodnie z punktami 1.1 i 1.2 protokołu, aby wprowadzić nowe mutacje w tle rodzicielskim (wykorzystując wyewoluowane geny jako matrycę PCR). Przeanalizuj fenotypy oporności na antybiotyki tych nowych konstrukcji, aby potwierdzić rolę mutacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszej poprzedniej pracy badano ewolucję genu β-laktamazy blaTEM-1 w kierunku nadania odporności cefalosporynie trzeciej generacji ceftazydymu12. Gen ten został wybrany, ponieważ, chociaż TEM-1 nie nadaje oporności na ceftazydym, mutacje w blaTEM-1 mogą rozszerzyć zakres aktywności TEM-1 w celu hydrolizy cefalosporyn, takich jak ceftazydym29. Mutacje w enzymach oporności na antybiotyki, takich jak β-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy nowy protokół łączący biologię molekularną, ewolucję eksperymentalną i głębokie sekwencjonowanie DNA, mający na celu zbadanie roli plazmidów wielokopijnych w ewolucji antybiotykooporności u bakterii. Chociaż protokół ten łączy techniki z różnych dziedzin, wszystkie metody wymagane do jego opracowania są proste i można je wykonać w zwykłym laboratorium mikrobiologicznym. Najbardziej krytycznymi etapami w protokole są prawdopodobnie budowa szczepów systemu modelowego oraz rekonstrukcja mutacji zaobserwowanych...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de I+D+i 2013-2016): granty CP15-00012, PI16-00860 i CIBER (CB06/02/0053), współfinansowane przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego ''Droga do osiągnięcia Europy'' (EFRR). JAE jest wspierany przez program Atracción de talento rządu regionu Madryt (2016-T1/BIO-1105) oraz I+D Excelencia hiszpańskiego Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM jest wspierany przez stypendium Miguela Serveta z Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) współfinansowane przez Europejski Fundusz Społeczny "Inwestowanie w Twoją przyszłość" (EFS) i EFRR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TermocyklerBioRadC1000
ElektroporatorBiorRad1652660
Kuwety do elektroporacjiSigma-AldrichZ706078
NanoDrop 2000/2000cThermo Fisher ScientificND-2000Określanie jakości DNA mierzenie stosunków absorbancji 260nm/280nm i 260nm/230nm
InkubatorMemmertUF1060
Inkubator (shaker)Cole-Parmer LtdSI500
Zasilacz do elektroforezyBioRad1645070Elektroforeza w żelu agarozowym
Komora do elektroforezyBioRad1704405Elektroforeza w żelu agarozowym
PippettesBiohit725020, 725050, 725060, 725070
Pipety wielokanałoweBiohit728220, 728230,
728240
Czytnik płytek Synergy HTXBioTekBTS1LF
Pętle inokulacyjneSigma-AldrichI8388
Płytki 96-dołkoweFalcon351172
LBBD DifcoDF0446-17-3
LBAgar Fisher scientificBP1425-500
Phusion PolimerazaThermo Fisher ScientificF533S
Zespół GibsonaNew England BiolabsE2611S
Enzymy resctrictionFermentas FastDigest
AntybiotykiSigma-Aldrich
QIAprep Spin MiniprepQiagen27104Zestaw do ekstrakcji plazmidu
Wizard Zestaw do oczyszczania genomowego DNAZestaw do ekstrakcji gDNAPromegaA1120
DNeasy Blood & Zestawy tkanekQiagen69506zestaw do ekstrakcji gDNA
Kuwety do elektroporacjiSigma-AldrichZ706078
szalki PetriegoSigma-AldrichD9054
KrioprobówkiClearLine390701
płytki 96-dołkowe (-80º Magazynowanie C)Thermo Fisher Scientific249945
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2670Kwantyfikacja stężenia DNA
AgarozaBioRad1613100Elektroforeza w żelu agarozowym
50x bufor TAEBioRad1610743Elektroforeza w żelu agarozowym
T4 Kinaza polinukleotydowaThermo Fisher ScientificEK0031
Ligaza DNA T4Thermo Fisher ScientificEL0014

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
  2. Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
  3. MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
  4. Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
  7. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  8. Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
  9. Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
  10. Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
  11. Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
  12. San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010(2016).
  13. Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
  14. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  15. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  16. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  17. San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
  18. Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
  19. San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
  20. Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937(2016).
  21. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  22. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  23. Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97(2000).
  24. Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
  25. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, USA. (2009).
  26. Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
  27. Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
  28. Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039(2014).
  29. Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
  30. Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
  31. Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
  32. Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multicopy PlasmidsAntibiotic ResistanceExperimental EvolutionEscherichia coliGene Copy NumberPlasmid ConstructionDeep DNA SequencingEvolutionary RescueAntibiotic SelectionMutation Analysis

Related Articles