Method Article

Budowa ulepszonego hipernapędu wielotetrodowego do wielkoskalowej rejestracji neuronalnej u zachowujących się szczurów

DOI:

10.3791/57388

⸱

May 9th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy konstrukcję hipernapędu do druku 3D z osiemnastoma niezależnie regulowanymi tetrodami. Hipernapęd ma za zadanie rejestrować aktywność mózgu swobodnie zachowujących się szczurów przez okres kilku tygodni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitorowanie wzorców aktywności dużej populacji neuronów przez wiele dni u obudzonych zwierząt jest cenną techniką w dziedzinie neuronauki systemowej. Jednym z kluczowych elementów tej techniki jest precyzyjne umieszczenie wielu elektrod w pożądanych obszarach mózgu i utrzymanie ich stabilności. W tym miejscu opisujemy protokół budowy hipernapędu do druku 3D, który zawiera osiemnaście niezależnie regulowanych tetrod i jest specjalnie zaprojektowany do zewnątrzkomórkowego zapisu neuronowego in vivo u swobodnie zachowujących się szczurów. Tetrody przymocowane do mikronapędów mogą być albo indywidualnie przesuwane do wielu obszarów mózgu wzdłuż toru, albo mogą być używane do umieszczania szeregu elektrod na mniejszym obszarze. Wielokrotne tetrody pozwalają na jednoczesne badanie potencjałów czynnościowych z kilkudziesięciu pojedynczych neuronów, a także lokalnych potencjałów pola z populacji neuronów w mózgu podczas aktywnego zachowania. Ponadto projekt przewiduje prostsze oprogramowanie do rysowania 3D, które można łatwo modyfikować w zależności od różnych potrzeb eksperymentalnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W dziedzinie neuronauki systemowej, naukowcy badają neuronalne korelaty leżące u podstaw procesów poznawczych, takich jak nawigacja przestrzenna, pamięć i podejmowanie decyzji. W przypadku tego typu badań kluczowe znaczenie ma monitorowanie aktywności wielu pojedynczych neuronów podczas zachowania zwierząt. W ciągu ostatnich dziesięcioleci poczyniono dwa ważne postępy w celu zaspokojenia eksperymentalnych potrzeb w zakresie zewnątrzkomórkowego zapisu neuronowego u małych zwierząt1,2,3. Pierwszym z nich było opracowanie tetrody, wiązki czterech mikroprzewodów używanych do jednoczesnego rejestrowania aktywności neuronalnej neuronów1,2,4. Różnicowe amplitudy sygnału aktywności w czterech kanałach tetrody pozwalają na izolację aktywności poszczególnych neuronów z wielu jednocześnie zarejestrowanych komórek5. Ponadto elastyczny charakter mikrodrutów pozwala na większą stabilność tetrody, minimalizując względne przemieszczenie między tetrodą a populacją komórek docelowych. Tetrody są obecnie powszechnie stosowane zamiast pojedynczej elektrody w wielu badaniach mózgu u różnych gatunków, w tym gryzoni1,2,6, primates7 i insects8. Drugim było opracowanie hipernapędu przenoszącego wiele niezależnie ruchomych tetrod, który pozwala na jednoczesne monitorowanie aktywności neuronalnej z większych populacji neuronów z wielu lokalizacji nagrywania3,9,10,11,12.

Dostępność niezawodnego i niedrogiego urządzenia rejestrującego wiele tetrod dla małych zwierząt jest ograniczona. Klasyczny hipernapęd, początkowo opracowany przez Bruce'a McNaughtona13, był z powodzeniem używany do nagrań neuronowych u swobodnie zachowujących się szczurów w wielu laboratoriach w ciągu ostatnich dwóch dekad9,10,14,15. Jednak z przyczyn technicznych oryginalne komponenty potrzebne do budowy dysku McNaughton są obecnie bardzo trudne do zdobycia i nie są kompatybilne z ostatnio ulepszonymi interfejsami akwizycji danych. Inny dobrze przyjęty projekt hipernapędu wymaga, aby mikronapędy były indywidualnie wykonywane ręcznie, co może dawać niespójne wyniki i zajmować dużo czasu12. Aby rejestrować aktywność neuronalną z różnych obszarów mózgu u zachowujących się szczurów, opracowaliśmy nowy hipernapęd wykorzystujący technologię stereolitograficzną. Staraliśmy się spełnić następujące wymagania: (1) nowy hipernapęd musi umożliwiać precyzyjne przemieszczanie tetrod w mózgu i zapewniać stabilny zapis z wielu obszarów docelowych; (2) Nowy hipernapęd musi być kompatybilny z niedawno opracowanym systemem Magnetic QuickClip, aby umożliwić łatwe połączenie; oraz (3) nowy hipernapęd może być dokładnie odtworzony przy użyciu łatwo dostępnych materiałów. Tutaj przedstawiamy technikę budowy hipernapędu do druku 3D zawierającego osiemnaście niezależnie ruchomych tetrod, opartych na projekcie McNaughtona. W protokole opisujemy szczegóły procesu wytwarzania nowego hipernapędu, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do rejestrowania potencjałów czynnościowych pojedynczego neuronu i potencjałów pola lokalnego z kory śródwęchowej i śródwęchowej zanosci przez tygodnie u swobodnie zachowującego się szczura podczas naturalnych zadań związanych z żerowaniem.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Stereolitografia modeli 3D

  1. Użyj technik stereolitograficznych, aby wydrukować części i akcesoria hipernapędu. Każdy hipernapęd składa się z osiemnastu czółenek, osiemnastu wahadłowych i po jednym ze wszystkich innych elementów plastiku (Rysunek 1).
    UWAGA: Akcesoria nie są częścią hipernapędu, ale są niezbędne do budowy hipernapędu.

2. Przygotowanie akcesoriów (Rysunek 2).

  1. Przygotowanie stojaka na mikronapędy (Rysunek 2C).
    1. Mniejsze otwory przelotowe i większe otwory nieprzelotowe w szafie należy oczyścić i poszerzyć odpowiednio wiertłem ø 0,71 mm (0,028") i wiertłem ø 0,84 mm (0,033").
    2. Wytnij pręt spawalniczy ø 0,89 mm (0,035") na segmenty o długości 17 mm, zaokrąglij oba końce i włóż każdy pręt prowadzący do otworów ø 0,84 mm (0,033") w stojaku, pozostawiając 11,5 mm na zewnątrz (równo z prętami gwintowanymi).
    3. Całkowicie włóż sześć z płaskim o gwintie 0-80 i długości 15,88 mm (5/8") w szczeliny w stelażu. Upewnij się, że pręty prowadzące i pręty gwintowane są proste i równoległe do siebie. Pozostałą przestrzeń w szczelinach wypełnij rozcieńczonym cementem dentystycznym. Suszyć na powietrzu na blacie przez 15 min.
    4. Przyklej pręty spawalnicze i do stojaka cienkim super klejem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na 15 minut.
  2. Przygotowanie stacji głównej (Rysunek 2E) .
    1. Gwintuj cztery otwory za pomocą gwintownika 2-56 i w razie potrzeby użyj nylonowych 2-56 o długości 4.76 mm (3/16"), aby zabezpieczyć rdzeń w stacji.
  3. Przygotowanie narzędzia tokarskiego (Rysunek 2F) .
    1. Nakręć otwór w uchwycie za pomocą kranu 4-40. Włóż obrobioną końcówkę do szczeliny w uchwycie i zabezpiecz śrubą z kubkiem o długości 4-40 4.76 mm (3/16").
  4. Przygotowanie uchwytu hipernapędu (Rysunek 2G) .
    1. Nagwintuj otwór na za pomocą kranu 8-32. Użyj nylonowej skrzydełkowej o długości 8-32 mm (3/8"), aby zabezpieczyć hipernapęd podczas użytkowania.
  5. Przygotowanie kompleksu do pozycjonowania prętów (Rysunek 2H).
    1. Nawlecz trzpień od strony z większym otworem (górnym) za pomocą gwintownika 8-32 na głębokość około 7 mm. Nawlecz mniejsze otwory (sześć na górze, osiemnaście na dole) za pomocą gwintownika 0-80. W razie potrzeby rozszerz środkowy otwór w górnej części za pomocą wiertła ø 4,76 mm (3/16").
    2. Zamontuj trzpień do góry za pomocą pasowanej o długości 8-32 ø 4.76 mm (3/16"), 6.35 mm (1/4"). Przymocuj spód do góry za pomocą o długości 0-80, 6.35 mm (1/4") podczas użytkowania.

3. Przygotowanie komponentów hipernapędu (Rysunek 3).

  1. Przygotowanie nakrętki hipernapędu (Rysunek 3A).
    1. Za pomocą uchwytu nakrętki (Rysunek 2D), nakręć nakrętkę za pomocą dolnego kranu 3/8-24, aż będzie gładka.
  2. Montaż rdzenia hipernapędu (Rysunek 3B).
    1. Oczyść i rozszerz otwory w rdzeniu za pomocą wierteł o różnych rozmiarach (dwanaście otworów przelotowych z drutem uziemiającym (pierścień wewnętrzny): ø 0,61 mm (0,024"); osiemnaście otworów przelotowych tetrody (pierścień środkowy): ø 0,66 mm (0,026") najpierw, a następnie ø 0,71 mm (0,028"); osiemnaście otworów nieprzelotowych pręta prowadzącego (pierścień zewnętrzny): ø 0,84 mm (0,033")).
    2. Nawlecz dwa otwory przelotowe na górze rdzenia i pozostałe osiem otworów nieprzelotowych (cztery z boku, cztery u dołu) za pomocą kranu 0-80. Użyj dolnego kranu do otworów nieprzelotowych.
    3. Utwórz gwinty zewnętrzne u podstawy rdzenia za pomocą matrycy 3/8-24. Wyreguluj matrycę prawidłowo, aby nakrętka hipernapędu pasowała do nowych gwintów.
    4. W zależności od wymaganej liczby przewodów uziemiających, włóż wiele odcinków metalowych rurek (kaniuli) o długości 6 mm do otworów przewodu uziemiającego w rdzeniu, przyklejając je w razie potrzeby. Spiłuj końce kaniul z drutu uziemiającego, aż zrównają się z zewnętrzną stroną rdzenia, a następnie wyczyść kaniule drutem stalowym ø 0,30 mm (0,012").
    5. Całkowicie włóż osiemnaście z płaskim 0-80 o długości 15,88 mm (5/8") w szczeliny w rdzeniu. Nie zginaj ani nie uszkadzaj gwintów podczas tego procesu.
    6. Za pomocą kompleksu pozycjonowania prętów i stacji rdzeniowej umieść osiemnaście segmentów pręta spawalniczego ø 0,89 mm (0,035") 17 mm nad otworami pręta prowadzącego w rdzeniu i wbij je tak, aby zrównały się ze (około 5 mm).
    7. W razie potrzeby skoryguj położenie prętów spawalniczych i, a następnie dokręć środkową pasowaną i otaczające ją sześć w kompleksie pozycjonowania pręta, aby zabezpieczyć zewnętrzne kierunki prętów w rdzeniu. Przykręć nakrętkę do rdzenia (z kompleksem pozycjonowania pręta) i dopasuj rdzeń do uchwytu hipernapędu, aby umożliwić łatwiejsze ustawienie pod stereoskopem.
    8. Wypełnij szczeliny rozcieńczonym cementem dentystycznym, aby przymocować do rdzenia i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut. Wypełnij 2-3 szczeliny na raz, zanim cement dentystyczny stanie się zbyt gęsty. Zeskrob nadmiar cementu dentystycznego z rdzenia, aby utrzymać prawidłowe dopasowanie do osłony.
    9. Przyklej i pręty do rdzenia cienkim super klejem, pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut.
  3. Montaż mikrodysku (Rysunek 3C) .
    1. Oczyść i rozszerz dwa zewnętrzne otwory w czółenku za pomocą wierteł (mniejszy otwór: wiertło ø 0,61 mm (0,024"); większy otwór: wiertło ø 0,89 mm (0,035").
    2. Włóż wahadłową do podstawy uchwytu. Zwróć uwagę na orientację. Zamknij pokrywę uchwytu, przytrzymaj mocno i powoli przeciągnij przez otwór w pokrywie za pomocą kranu 0-80. Stuknij 2-3 razy, aż będzie gładkie.
    3. Włóż wahadłową do czółenka od strony z mniejszym otworem. Umieść kompleks wahadłowców do góry nogami w podstawie stacji montażowej mikronapędów.
    4. Wytnij 15-milimetrowy odcinek metalowej rurki o rozmiarze 23 i wygładź oba końce, a następnie umieść rurkę nad otworem ø 0.61 mm (0.024"), kierując się szczeliną w pokrywie stacji. Wbij kaniulę w otwór, aż górny koniec zrówna się z pokrywą stacji.
    5. Usuń zewnętrzną połowę górnej końcówki kaniuli za pomocą tarczy szlifierskiej. Oczyść kaniulę metalowym drutem ø 0,30 mm (0,012"). Przyklej kaniulę do czółenka za pomocą cienkiego super kleju, uważając, aby nie przykleić czółenka do czółenka i wysusz na powietrzu przez 15 minut.
    6. Przygotuj co najmniej osiemnaście napędów microdrive, przetestuj je na stojaku na mikronapędy. Upewnij się, że śruba wahadłowa może się płynnie obracać w czółenku i że cały mikronapęd porusza się swobodnie wzdłuż pręta gwintowanego.
  4. Przygotowanie centralnej kolumny (Rysunek 3D).
    1. W razie potrzeby przeszlifuj górną i dolną część środkowej kolumny do poziomu płaskiego. Gwintuj dwa otwory w kolumnie środkowej za pomocą kranu 0-80. Włóż nakrętkę sześciokątną 0-80 (3.18 mm (1/8") szerokości, 1.19 mm (3/64") wysokości) do każdego gniazda.
  5. Przygotowanie czapki hipernapędu (Rysunek 3E).
    1. Za pomocą kleszczy niemagnetycznych przyklej cztery magnesy (o średnicy 3 mm i grubości 1 mm) do czterech studzienek, dopasowując je do biegunów N i S na płytce interfejsu elektrody.
  6. Montaż kaniul prowadzących w wiązkę (Rysunek 3F).
    1. Umieść osiemnaście cienkościennych kaniul o rozmiarze 30 (ID 0,19 mm, 0,0075") w rurkach termokurczliwych ø 2,29 mm (0,09") (o długości 3-5 mm, oddalonych od siebie wzdłuż wiązki o 5-10 mm). Spraw, aby wszystkie kaniule były równo ze sobą na jednym końcu pakietu.
    2. Rurki termokurczliwe obkurczamy za pomocą opalarki, aż wiązka będzie szczelna. Delikatnie ściśnij wiązkę, aby nadać jej pożądany kształt (okrągły lub owalny). Upewnij się, że wszystkie kaniule są we właściwych pozycjach, bez skręcania, krzyżowania się lub zginania.
    3. Zaznacz obszar (y) do na kaniulach. Część nielutowana powinna mieć długość 26 mm, natomiast część lutowana powinna mieć 5-10 mm. Przesuń rurki obkurczające do znaków lutowniczych, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się.
    4. Nałóż topnik na jeden obszar i, obracając wiązkę. Schłodzić w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 minutę. Powtórz ten krok, aby ten sam obszar jeszcze dwa razy. Wygładź lutowaną część przez bez nakładania topnika i materiału wypełniającego. Schłodzić w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 minutę.
    5. Przytnij wiązkę na odpowiednią długość za pomocą tarczy diamentowej z najwyższą prędkością, wypoleruj oba końce, aby dostosować długość (część nielutowana: 26 mm, część lutowana: 5-10 mm według uznania). Oczyść kaniule prowadzące metalowym drutem ø 0,18 mm (0,007") pod stereoskopem.
  7. Przygotowanie tetrod. Podobne procedury zostały opisane8,16,17 .
    1. Wyreguluj wysokość poziomego pręta T i położenie mieszadła magnetycznego tak, aby poziome ramię na skrzyżowaniu pręta T znajdowało się bezpośrednio nad środkiem mieszadła magnetycznego. Zaczep jeden koniec haczyka S o środek małego magnetycznego pręta mieszającego, a następnie sklej je ze sobą. Oczyść przestrzeń do tworzenia tetrody za pomocą chusteczek ze sprężonym powietrzem i etanolem.
    2. Zakrąż dwa końce kawałka pojedynczego drutu tetrodowego o długości około 40 cm, a następnie zabezpiecz kawałkiem miedzianej taśmy.
    3. Podnieś kółko z drutu, przytrzymując miedzianą taśmę. Umieść koniec przeciwny do taśmy miedzianej na poziomym ramieniu pręta T. Delikatnie opuść taśmę miedzianą (podczas gdy drugi koniec nadal znajduje się na drążku T), przekręć raz i umieść taśmę miedzianą na drążku T. Krąg tetrody jest teraz w konfiguracji ósemki ("∞") z miedzianą taśmą umieszczoną na krzyżu poziomego pręta.
    4. Delikatnie przytrzymaj miedzianą taśmę na drążku T jedną ręką. Drugą ręką zaczep wolny koniec haka S (z mieszadłem magnetycznym przymocowanym do drugiego końca) przez dolną część koła z drutu tetrodowego, delikatnie zwolnij hak S i pozwól mu wyprostować cztery druty pod ciężarem haka S.
    5. Dostosuj wysokość poziomego pręta tak, aby spód haka S znajdował się około 1 cm powyżej środka płyty mieszadła magnetycznego.
    6. Zegnij krawędź taśmy miedzianej w dół, aby przymocować ją do poziomego pręta. Zbadaj wzrokiem cztery proste druty tetrody, a następnie usuń wszelkie zanieczyszczenia.
    7. Włącz mieszadło, skręcając cztery druty z prędkością około 60 obr./min, aż kąt między dwoma przeciwległymi nieskręconymi drutami wyniesie około 60°.
    8. Ustaw opalarkę na 210 °C i podgrzej skręcone druty, przesuwając pistolet wzdłuż prostej długości drutów pod różnymi kątami przez 2 minuty, aby połączyć je ze sobą poprzez stopienie powłoki wiążącej VG.
    9. Podnieś hak S z delikatnym mieszaniem i odetnij dolny koniec tetrody cienkimi nożyczkami.
    10. Przytrzymaj palcem taśmę miedzianą na poziomym pręcie, przetnij druty z obu krawędzi taśmy miedzianej nożyczkami i usuń taśmę miedzianą. Przetnij pozostały drut na poziomym pręcie, aby zwolnić tetrodę.
    11. Umieść gotową tetrodę w bezpyłowym pudełku do przechowywania. Przygotuj co najmniej dwadzieścia pięć tetrod.

4. Montaż hipernapędu (Rysunek 4).

  1. Wkładanie kaniul prowadzących do rdzenia hipernapędu (Rysunek 4A).
    1. Zdejmij rurki termokurczliwe i wsuń 4-milimetrowy odcinek rurki silikonowej (ID 1.02 mm (0.04"), OD 2.16 mm (0.085")) wzdłuż wiązki do lutowanej/nielutowanej krawędzi. Zaklinuj szczelinę w przekładce hipernapędu, aby poszerzyć środkowy otwór, umożliwiając przesuwanie się przekładki wokół silikonowej rurki. Usuń klin, gdy przekładka znajduje się na środku silikonowej rurki.
    2. Uporządkuj pozycje kaniul prowadzących w wiązce, umieszczając długie segmenty (10 cm) metalowego drutu ø 0,18 mm (0,007") przez każdą kaniulę w określonym otworze tetrody w rdzeniu hipernapędu, zapobiegając krzyżowaniu się drutów lub kaniul w tym procesie. Zegnij końce przewodów, aby utrzymać je na miejscu.
    3. Przepchnij kaniule przez odpowiednie otwory w rdzeniu, uważając, aby uniknąć zginania lub krzyżowania się między nimi, aż wolny koniec każdej kaniuli znajdzie się co najmniej 2 mm poza górnym końcem otworu tetrody. Zabezpiecz przekładkę, przykręcając nakrętkę do rdzenia, uważając, aby nie dopuścić do obracania się przekładki. Nałóż kroplę bardzo rozcieńczonego cementu dentystycznego z górnej części rdzenia na połączenie kaniul, aby zabezpieczyć ich względne położenie.
    4. Odetnij przewody doprowadzające od przylutowanego końca wiązki i wyjmij je z kaniul, cofając się od wolnego końca.
  2. Montaż mikronapędów na rdzeniu hipernapędu (Rysunek 4B). Szczegółowy układ przestrzenny mikronapędów w hipernapędzie został wcześniej opisany11,13.
    1. Powoli i ostrożnie załaduj mikronapędy na każdy pręt gwintowany rdzenia. Upewnij się, że (1) kaniula mikronapędu o rozmiarze 23 płynnie wchodzi w otwór tetrody, (2) kaniula prowadząca o rozmiarze 30 płynnie wchodzi w kaniulę mikronapędu o rozmiarze 23 i (3) śruba wahadłowa obraca się płynnie wzdłuż pręta gwintowanego. Przykręć mikronapędy do 1,0-1,5 mm powyżej dolnego końca prętów gwintowanych.
    2. Wytnij osiemnaście kawałków rurki poliimidowej (ID 0,11 mm (0,0045"), OD 0,14 mm (0,0055")) na segmenty 38-43 mm (długość wiązki kaniuli prowadzącej plus 7 mm). Wyczyść każdą rurkę drutem stalowym ø 0,08 mm (0,003").
    3. Odwróć rdzeń, ostrożnie włóż rurki poliimidowe do kaniul prowadzących od zalutowanego końca i wepchnij je do końca pod stereoskopem. Odwróć rdzeń do pozycji pionowej i przyklej górny koniec rurki poliimidowej do kaniuli microdrive za pomocą gęstego super kleju. Umieść rdzeń do góry nogami i pozostaw klej do wyschnięcia na 15 minut.
    4. Wytnij dodatkową rurkę poliimidową na górnym końcu, pozostawiając 0,5-1,0 mm na zewnątrz kaniuli mikronapędu.
  3. Montaż przewodów uziemiających (Rysunek 4C).
    1. Z powlekanego drutu stalowego (powlekanego ø 0,20 mm (0,008"), gołego ø 0,13 mm (0,005")) należy przyciąć niezbędną liczbę przewodów uziemiających na długości 25-30 mm). Zdejmij 2 mm izolacji z tworzywa sztucznego z obu końców przewodów i włóż jeden koniec każdego z nich do końców kaniul o długości 30 mm o długości 6-8 mm. Spłaszcz końce kaniul, aby zabezpieczyć połączenie z odpowiednimi przewodami.
    2. Za pomocą narzędzia Dremel przetnij kaniule na pół, aby z każdej z nich utworzyć dwa kompletne przewody uziemiające.
    3. Włóż okrągły koniec kaniuli o rozmiarze 30 do górnego końca kaniuli z drutu uziemiającego w rdzeniu i dociśnij, aby mocno wprowadzić wkładkę.
  4. Montaż płytki interfejsu elektrody (Rysunek 4D).
    1. Włóż kolumnę środkową do rdzenia i zabezpiecz dwiema z gniazdowym 0-80 i długości 7.94 mm (5/16"). W razie potrzeby przyklej, aby centralna kolumna była stabilna w rdzeniu.
    2. Rozszerz części szczelin w płycie EIB-72-QC-Large, które odpowiadają dwóm gwintowanym otworom w kolumnie środkowej, za pomocą kranu ø 1,2 mm. Przymocuj płytkę interfejsu elektrody do kolumny centralnej za pomocą dwóch z stożkowym płaskim 0-80 i długości 3.97 mm (5/32"). Upewnij się, że tablica znajduje się pośrodku i jest bezpieczna.
  5. Podłączanie przewodów uziemiających (Rysunek 4E).
    1. Poprowadź każdy przewód uziemiający wokół kolumny środkowej i podłącz odsłonięty wolny koniec do płytki interfejsu elektrody za pomocą złotego kołka w wyznaczonym otworze uziemiającym.
  6. Wczytywanie tetrod do hipernapędu, zgodnie z wcześniejszym opisem16,17 .
    1. Ostrożnie załaduj każdą tetrodę do poliimidowych rurek mikronapędów, uważając, aby nie zgiąć ich podczas procesu.
    2. Delikatnie wsuń wolne przewody końcowe do wyznaczonych otworów w płytce interfejsu elektrody i podłącz je elektrycznie za pomocą złotych pinów.
    3. Przytnij tetrody pojedynczo na odpowiednią długość. Upewnij się, że część tetrod wystająca z dolnych końców rurek poliimidowych po przecięciu jest prosta, w przeciwnym razie wymień całą tetrodę i przetnij.
  7. Mocowanie tarczy.
    1. Przymocuj osłonę do rdzenia za pomocą czterech z stożkowym płaskim 0-80 3.97 mm (5/32"). Liczby na ekranie powinny zgadzać się z liczbami na płytce interfejsu elektrody.
  8. Poszycie końcówek tetrody.
    1. Płytkie końcówki tetrod za pomocą urządzenia do powlekania NanoZ wyposażonego w złącze ADPT-NZ-EIB-36 i adapter ADPT-EIB-72-QC-HS-3617. Alternatywnie, uporządkuj je ręcznie jeden po drugim, zgodnie z opisem w innym miejscu16. Płytkie końcówki tetrody należy nałożyć przed użyciem (np. dzień przed implantacją), ponieważ impedancja będzie stopniowo wzrastać z czasem po poszyciu. Wymień tetrody, które są zwarte lub zablokowane podczas procesu galwanizacji, przytnij je na odpowiednią długość i ponownie plateruj.
  9. Finalizacja hipernapędu (Rysunek 4F).
    1. Przyklej tetrody do ich rurek poliimidowych zgodnie z wcześniejszym opisem16. Wsuń je wszystkie z powrotem do kaniul prowadzących, aby platerowane końcówki nie były odsłonięte.
    2. Wkręć cztery z gniazdowym 0-80 o długości 6.35 mm (1/4") w cztery otwory w dolnej części rdzenia hipernapędu.
    3. Za pomocą stereoskopu powoli opuść każdą tetrodę, aż końcówka tetrody znajdzie się tuż nad krawędzią kaniuli prowadzącej. W międzyczasie zlokalizuj położenie każdej tetrody w wiązce kaniuli prowadzącej. Mapa położenia tetrody ma kluczowe znaczenie dla rekonstrukcji miejsc nagrań.
    4. Przymocuj nasadkę do napędu i przechowuj hipernapęd w odpowiedni sposób do implantacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy nowo zbudowanego hipernapędu, aby uzyskać wyniki próby. Napęd został wyposażony w tetrody zbudowane z drutu platynowo-irydowego ø 17 μm (0,0007"), pokrytego poliimidem (90%-10%). Końcówki tetrod zostały pokryte czarnym roztworem platyny w celu zmniejszenia impedancji elektrod do zakresu od 100 do 200 kΩ przy 1 kHz. Hipernapęd został wszczepiony 4,6 mm na lewo od linii środkowej i 0,5 mm przed zatoką poprzeczną na czaszce ważącego 550 kg samca szczura Long-Evans. Dodatkowe przewod...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy proces konstruowania nowo opracowanego hipernapędu składającego się z osiemnastu niezależnie poruszających się tetrod. Napęd może być zbudowany z niedrogich części zakupionych w wielu dostępnych sklepach z narzędziami, w połączeniu z komponentami stworzonymi przez druk stereolitograficzny. Hipernapęd może być przewlekle wszczepiany w czaszkę szczura przy użyciu standardowych procedur chirurgicznych i jest w stanie rejestrować zewnątrzkomórkową aktywność neuronalną, podczas gdy zwierzę wykonuje róż...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Moser Lab w Instytucie Neuronauki Systemowej Kavli oraz Centrum Obliczeń Neuronowych Norweskiego Uniwersytetu Nauki i Technologii za przewlekłe procedury rejestracji neuronalnej u szczurów. Praca ta była wspierana przez grant NIH R21 NS098146 oraz długoterminowe stypendium Human Frontier Science Program LT000211/2016-L dla L. Lu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pręt spawalniczyBlue DemonER308L-035-01TStal nierdzewna, średnica 0,035" Śruba
McMaster91771A060Stal nierdzewna, płaski, 0-80  gwint,  5/8"  długość
ŚrubaMcMaster91772A051Stal nierdzewna, stożkowy, 0-80  gwint,  5/32"  długość
ŚrubaMcMaster92196A056Stal nierdzewna, nasadowy, 0-80  gwint,  5/16"  w długości
ŚrubaMcMaster92196A055Stal nierdzewna, nasadowy, 0-80  gwint,  1/4"  długość
ŚrubaMcMaster95868A131Nylon,  gniazdowy, 2-56  gwint,  3/16"  na długość,
Nakrętka śrubowaMcMaster90730A001Stal nierdzewna, wąski sześciokąt,  0-80  Gwint
Śruba pasowanaMcMaster90298A213Stal nierdzewna, gwint 8-32, średnica 3/16", długość 1/4" Śruba
kielichowaMcMaster92313A105Stal nierdzewna, gwint 4-40, długość 3/16"
Śruba skrzydełkowaMcMaster94323A592Nylon, 8-32  gwint,  3/8"  długość,
MagnesApexM3X1MMDIneodymowy, dysk 3 mm X 1 mm
Rurki metalowe MałeczęściB00137QHNSStal nierdzewna, 23 gauge, 0.0253" OD, 0.013" ID, 0.006" ścianka
Rurki metaloweNew England Mała rurkaWykonana na zamówienieStal nierdzewna, 30 gauge, 0,012/0,0125" OD, 0,007/0,008" ID, pełna twarda
rurka termokurczliwaMcMaster7856K720,09" ID przed obkurczeniem, niebieski
Rurka silikonowaA-M Systems8073000,040" ID, 0,085" OD
Rurka poliamidowaA-M Systems8234000,0045" ID, 0,0005" ścianka
Przewód uziemiającyA-M Systems7915000,005" goły, 0,008" powlekany, pół twardy
drut tetrodowyCienki drut kalifornijskiWykonane na zamówienieśrednica 0,0007", platynowo-irydowa (90%-10%), powłoka HML i VG
EIBNeuralynxEIB-72-QC-Large
Złote szpilkiNeuralynxduże szpilki EIB
GwintownikBalax01302-000Rozmiar gwintu M1,2
GwintownikMcMaster2522A8110-80, od dołu
GwintownikMcMaster2522A7710-80 rozmiar gwintu, gwintownik wtykowy
McMaster26955A943/8"-24  rozmiar gwintu, dolna
kranMcMaster2522A7132-56  rozmiar gwintu
GwintownikMcMaster2522A7154-40  rozmiar gwintu
GwintownikMcMaster2522A7188-32  rozmiar gwintu
DieMcMaster2576A4573/8"-24  rozmiar gwintu, 1"
OD WiertłoMcMaster30585A82Przekrój drutu  65,  Wiertło o średnicy 0,035"
McMaster30585A83Grubość drutu  66,  Wiertło o średnicy 0,033 cala
McMaster30585A87Przekrój drutu  70,  Wiertło o średnicy 0,028"
McMaster30585A88Przekrój drutu  71,  Wiertło o średnicy 0,026"
McMaster30585A91Przekrój drutu  73,  Wiertło o średnicy 0,024"
McMaster8870A233/16"  o średnicy
Tarcza DremelWagner31MPokryta diamentem, średnica 22 mm, grubość 0,17 mm
Drut stalowyPrecision Brand21212o średnicy 0,012 cala, w pełni twardy
drut stalowyPrecision Brand21007średnicy 0,007 cala, w pełni twardy
Drut stalowyAM Systems792700średnicy 0,003 cala, pół twardy
Super klejLoctiteLT-40640# 406
Super klejLoctiteLT-41550# 415
Akrylowy proszek dentystyczny Koszulki223-3773Coral
Dental akrylowe w płynieTeets223-4003
o o

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
  2. Wilson, M. A., McNaughton, B. L. Dynamics of the hippocampal ensemble code for space. Science. 261 (5124), 1055-1058 (1993).
  3. Gothard, K. M., Skaggs, W. E., Moore, K. M., McNaughton, B. L. Binding of hippocampal CA1 neural activity to multiple reference frames in a landmark-based navigation task. J Neurosci. 16 (2), 823-835 (1996).
  4. Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J Neurosci Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
  5. Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
  6. Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18 (12), 1230-1238 (2008).
  7. Skaggs, W. E., et al. EEG sharp waves and sparse ensemble unit activity in the macaque hippocampus. J Neurophysiol. 98 (2), 898-910 (2007).
  8. Guo, P., Pollack, A. J., Varga, A. G., Martin, J. P., Ritzmann, R. E. Extracellular wire tetrode recording in brain of freely walking insects. J Vis Exp. (86), (2014).
  9. Knierim, J. J., McNaughton, B. L., Poe, G. R. Three-dimensional spatial selectivity of hippocampal neurons during space flight. Nat Neurosci. 3 (3), 209-210 (2000).
  10. Leutgeb, S., et al. Independent codes for spatial and episodic memory in hippocampal neuronal ensembles. Science. 309 (5734), 619-623 (2005).
  11. Lansink, C. S., et al. A split microdrive for simultaneous multi-electrode recordings from two brain areas in awake small animals. J Neurosci Methods. 162 (1-2), 129-138 (2007).
  12. Kloosterman, F., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: drive fabrication. J Vis Exp. (26), (2009).
  13. McNaughton, B. L. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US5928143 (1999).
  14. Redish, A. D., et al. Independence of firing correlates of anatomically proximate hippocampal pyramidal cells. J Neurosci. 21 (5), RC134(2001).
  15. Schmitzer-Torbert, N., Redish, A. D. Neuronal activity in the rodent dorsal striatum in sequential navigation: separation of spatial and reward responses on the multiple T task. J Neurophysiol. 91 (5), 2259-2272 (2004).
  16. Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. (26), (2009).
  17. Chang, E. H., Frattini, S. A., Robbiati, S., Huerta, P. T. Construction of microdrive arrays for chronic neural recordings in awake behaving mice. J Vis Exp. (77), e50470(2013).
  18. Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568(2012).
  19. Siegle, J. H., et al. Chronically implanted hyperdrive for cortical recording and optogenetic control in behaving mice. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2011, 7529-7532 (2011).
  20. Brunetti, P. M., et al. Design and fabrication of ultralight weight, adjustable multi-electrode probes for electrophysiological recordings in mice. J Vis Exp. (91), e51675(2014).
  21. Hull, C. W. Google Patents. , Available from: https://www.google.com/patents/US4575330 (1986).
  22. Ludvig, N., Potter, P. E., Fox, S. E. Simultaneous single-cell recording and microdialysis within the same brain site in freely behaving rats: a novel neurobiological method. J Neurosci Methods. 55 (1), 31-40 (1994).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Tetrode HyperdriveNeural RecordingBehaving Rats3D Printable DeviceIndependent Tetrode AdjustmentExtracellular Neural RecordingAction Potential DetectionLocal Field PotentialGuide Cannula AssemblyMicrodrive Construction

Related Articles