Obecny protokół opisuje kroki do uzyskania zakrzepicy żylnej za pomocą modelu zastoju. Ponadto stosujemy nieinwazyjną metodę pomiaru powstawania skrzepliny i ustępowania w czasie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zakrzepica żył głębokich wywołana zastojem u myszy monitorowanych za pomocą ultrasonografii wysokiej częstotliwości
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zakrzepica żylna jest częstym schorzeniem dotykającym 1 - 2% populacji, z roczną częstością występowania 1 na 500. Zakrzepica żylna może prowadzić do śmierci z powodu zatorowości płucnej lub powodować zespół pozakrzepowy, charakteryzujący się przewlekłym bólem nóg, obrzękiem i owrzodzeniem lub przewlekłym nadciśnieniem płucnym prowadzącym do znacznego przewlekłego upośledzenia oddychania. Jest to najczęstsza choroba układu krążenia po zawale mięśnia sercowego i udarze niedokrwiennym i stanowi wyzwanie kliniczne dla wszystkich dyscyplin medycznych, ponieważ może komplikować przebieg innych zaburzeń, takich jak rak, choroby ogólnoustrojowe, operacje i poważne urazy.
Modele eksperymentalne są niezbędne do badania tych mechanizmów. Model zastoju indukuje stałą wielkość skrzepliny i ilościową ilość skrzepliny. Konieczne jest jednak systematyczne podwiązywanie bocznych gałęzi żyły głównej dolnej, aby uniknąć zmienności rozmiarów skrzeplin i błędnej interpretacji danych. Opracowaliśmy nieinwazyjną technikę pomiaru wielkości skrzepliny za pomocą ultrasonografii. Korzystając z tej techniki, możemy ocenić rozwój i ustąpienie skrzepliny w czasie u tego samego zwierzęcia. Podejście to ogranicza liczbę myszy wymaganą do ilościowego określenia zakrzepicy żylnej zgodnie z zasadą zastępowania, zmniejszania i udoskonalania zwierząt w badaniach. Wykazaliśmy, że masa skrzepliny i analiza histologiczna wielkości skrzepliny korelują z pomiarem uzyskanym za pomocą ultrasonografii. Dlatego w obecnym badaniu opisano, jak wywołać zakrzepicę żył głębokich u myszy przy użyciu modelu zastoju żyły głównej dolnej i jak monitorować ją za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości.
Wprowadzenie
1. ŻchZZ może prowadzić do: 1) zgonu z powodu zatorowości płucnej; 2) zespół zakrzepowy, charakteryzujący się przewlekłym bólem nóg, obrzękiem i owrzodzeniem; lub 3) przewlekłe nadciśnienie płucne prowadzące do znacznego przewlekłego upośledzenia oddechowego. Żylna choroba zakrzepowa jest chorobą wieloczynnikową i może wynikać ze zastoju w przepływie krwi, uszkodzenia ścian naczyń krwionośnych i/lub stanów nadkrzepliwości spowodowanych zaburzeniem równowagi między krzepnięciem a układem fibrynolitycznym – jak to zostało opisane ponad sto lat temu przez Virchowa i jest znane jako triada Virchowa.
Ponieważ w większości przypadków niemożliwe jest uzyskanie próbek od ludzi, naukowcy opracowali eksperymentalne modele zwierzęce DVT. Wykorzystano kilka zwierząt, w tym rat2, mouse3, rabbit4, pig5, dog6 i non-human primate7. Myszy mogą być modyfikowane genetycznie i są najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami do badania zakrzepicy żył głębokich. Jednak, podobnie jak u wszystkich zwierząt, u myszy nie obserwuje się spontanicznej zakrzepicy żył głębokich. W ten sposób fizyczne lub chemiczne zmiany ściany żyły są wykorzystywane do wywołania zakrzepicy u myszy. Wcześniej używaliśmy modelu chlorku żelaza do indukowania zakrzepicy w żyle głównej dolnej (IVC) u myszy8,9,10. Model ten ma tę zaletę, że niezawodnie wytwarza skrzepliny okluzyjne w ciągu kilku minut i może być wykorzystany do badania roli leków przeciwzakrzepowych i przeciwpłytkowych podczas ostrej zakrzepicy żył głębokich. Jest to jednak procedura terminalna. Tak więc, aby badać ostre i przewlekłe zakrzepice żył głębokich, bardziej odpowiedni jest model zastoju. W tym modelu tworzenie skrzepliny jest indukowane przez całkowite przerwanie przepływu krwi w IVC, jednym z czynników w triadzie Virchowa dla rozwoju zakrzepicy żył głębokich. Model ten może być używany do badania powstawania i rozdzielczości zakrzepicy żył głębokich, co jest zaletą w porównaniu z modelem FeCl311.
Opracowaliśmy nieinwazyjną metodę śledzenia powstawania skrzepliny i jej ustępowania w czasie, korzystając z systemu ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości mikroobrazowania12. Wcześniej wykazaliśmy, że pomiar zakrzepicy żylnej za pomocą ultradźwięków koreluje korzystnie ze skrzeplinami uzyskanymi patologicznie. Potwierdziliśmy w dwóch kolejnych badaniach, że pomiary uzyskane za pomocą ultradźwięków korelują z masą skrzepliny i obszarem skrzepliny określonym ilościowo za pomocą histochemii9,10. Co ważniejsze, wykazaliśmy, że ultradźwięki o wysokiej częstotliwości mogą być wykorzystywane do monitorowania powstawania zakrzepicy żył głębokich u myszy12. Może być również stosowany do ilościowego określania rozdzielczości skrzepliny w sposób nieinwazyjny.
Tutaj opiszemy protokół umożliwiający tworzenie skrzepliny za pomocą mysiego modelu zakrzepicy wywołanej zastojem oraz jak tworzenie się skrzepliny może być monitorowane nieinwazyjnie w czasie za pomocą ultradźwięków o wysokiej częstotliwości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu McGill w Montrealu, QC, Kanada. Wszystkie wymagane wyposażenie wymieniono w tabeli I.
1. Mysi (C57BL/6J) Protokół zastoju IVC
- Przygotowanie do zabiegu
UWAGA: Jest to operacja przetrwania i dlatego przez cały czas należy przestrzegać właściwej techniki aseptyki. Obejmuje to upewnienie się, że wszystkie materiały są pod ręką, czyszczenie i sterylizację narzędzi przed i między użyciem oraz wyznaczenie sterylnego obszaru na powierzchni roboczej dla wszystkich sterylnych materiałów.- Wysterylizuj wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne w autoklawie. Sterylizator z kulkami szklanymi jest wystarczający do sterylizacji końcówek narzędzi między zwierzętami, jeśli wykonywana jest więcej niż jedna procedura w tym samym czasie.
- Znieczulenie 8-10-tygodniowych samców myszy C57Bl/6 mieszaniną 100% tlenu i 2,5% izofluranu.
UWAGA: W razie potrzeby dostosować przepływ tlenu i izofluranu. - Potwierdź znieczulenie, ściskając kleszczami tylną łapę zwierzęcia między palcami. Brak reakcji na szczypanie wskazuje, że zwierzę jest znieczulone.
- Podawać lek przeciwbólowy o powolnym uwalnianiu (buprenorfina) we wstrzyknięciu podskórnym. Podaj myszom dawkę 1 mg środka przeciwbólowego na 1 kg masy ciała (1 mg/kg).
- Umieść maść do oczu na obu oczach zwierzęcia, aby upewnić się, że rogówka nie zostanie wysuszona na czas zabiegu.
- Podawać podskórnie 0,2 - 0,5 ml płynów izotonicznych na 10 g masy ciała.
- Przymocuj zwierzę na miejscu do stołu operacyjnego za pomocą taśmy chirurgicznej. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej, aby odsłonić brzuch. Wykonaj operację na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii.
- Usuń włosy z brzucha myszy za pomocą kremu do depilacji na 1 - 2 min. W razie potrzeby przetrzyj okolice brzucha gazą i wodą destylowaną.
- Alternatywnie usuń włosy z brzucha, goląc się małą elektryczną maszynką do golenia.
- Wysterylizuj brzuch za pomocą Baxedin (roztwór glukonianu chlorheksydyny BP) przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć. Delikatnie nałóż etanol z gazą, aby uniknąć nadmiernej utraty ciepła spowodowanej odparowaniem alkoholu.
- Odsłonięcie żyły głównej dolnej (IVC)
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj laparotomię, aby otworzyć jamę brzuszną.
- Podnieś skórę kleszczami w dolnej części brzucha i wykonaj pionowe nacięcie równoległe do obu stron kresy białej. Wykonaj pierwsze nacięcie po lewej lub prawej stronie linea alba, w zależności od ręczności operatora. Nacięcie wykonuje się z dala od linii środkowej, aby pomóc w późniejszym obrazowaniu ultrasonograficznym.
- Wykonaj drugie, poziome nacięcie w górnej części brzucha.
UWAGA: Po wniknięciu do jamy brzusznej mięśnie należy "nakręcić", a następnie przebić nożyczkami chirurgicznymi, aby zapobiec uszkodzeniom narządów jamy brzusznej. - Powtórz pionowe i poziome nacięcia na warstwie mięśni brzucha zwierzęcia. Pamiętaj, aby naciągnąć mięśnie podczas penetracji do brzucha, aby nie uszkodzić narządów znajdujących się poniżej.
Uwaga: Podczas wykonywania nacięć należy odsunąć skórę i mięśnie od jelit i innych narządów wewnętrznych, aby ich nie przebić.
- Odchyl skórę i mięsień od nacięcia, aby odsłonić jamę brzuszną.
- Przyłóż gazę zwilżoną roztworem izotonicznym do boków otworu rany i uzewnętrznij jelita. Wywieraj nacisk po obu stronach brzucha, aby wspomóc eksternalizację jelit. Używaj delikatnych ruchów aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby poruszać jelitami. Namocz gazę w roztworze izotonicznym i umieść ją na uzewnętrznionych jelitach.
- Gaza powinna być wstępnie zwilżona przed umieszczeniem na tkance.
- Odsuń na bok tłuszcz otrzewnowy i odsłoń IVC między żyłami nerkowymi i biodrowymi.
- Dokonaj wstępnej identyfikacji oczywistych gałęzi bocznych. Boczna gałąź pojawi się jako mniejsza, ale znacząca żyła, która odgałęzia się od IVC, między żyłami nerkowymi i biodrowymi. Unaczynienie może się znacznie różnić u różnych myszy. Myszy mogą mieć boczne gałęzie obecne po jednej lub obu stronach IVC.
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj laparotomię, aby otworzyć jamę brzuszną.
- Podwiązanie gałęzi bocznych
UWAGA: Jeśli obecne są gałęzie boczne, dla każdego z nich postępuje następująca procedura. Jeśli nie występuje, przejdź do kroku 4: Wstępne założenie szwów pod IVC. Miejsce podwiązania IVC będzie bezpośrednio dystalne w stosunku do lewej żyły nerkowej, niezależnie od obecności bocznych gałęzi.- Wykonaj rozcięcie po każdej stronie bocznej gałęzi. rozwarstwienie to proces wielokrotnego otwierania kleszczy z delikatnym naciskiem, tak aby przebić się przez powięź bez uszkodzenia otaczających naczyń.
ostrożność: Unikaj nakłuwania lub uszkadzania żyły. - Podnieś gałąź i przełóż odcinek jedwabnego szwu 6-0 pod żyłą. Zawsze należy zachować ostrożność podczas podnoszenia lub przenoszenia statków. Najlepiej jest chwycić tłuszcz wokół naczyń, w przeciwnym razie istnieje ryzyko uszkodzenia naczynia.
- Za pomocą kleszczyków do szwów wykonaj chirurgiczne podwiązanie wokół bocznej gałęzi przy użyciu standardowej techniki wiązania węzłów chirurgicznych. Pełne podwiązanie wykonuje się, aby zapewnić 100% zamknięcie żyły. Użyj co najmniej trzech rzutów wiązanych, aby upewnić się, że podwiązanie jest bezpieczne.
- Powtórz krok 1.3 dla pozostałych gałęzi bocznych.
- Wykonaj rozcięcie po każdej stronie bocznej gałęzi. rozwarstwienie to proces wielokrotnego otwierania kleszczy z delikatnym naciskiem, tak aby przebić się przez powięź bez uszkodzenia otaczających naczyń.
- Wypreparowanie aorty brzusznej z IVC
- Wykonaj rozwarstwienie wokół IVC bezpośrednio dystalnie od lewej żyły nerkowej. Aorta brzuszna jest połączona z IVC za pomocą powięzi, dlatego należy wykonać wstępną sekcję zarówno wokół IVC, jak i aorty brzusznej.
Uwaga: Unikaj przekłucia lub uszkodzenia żyły. Nie pękać ani nie przekłuwać żadnego naczynia. Jest to najbardziej krytyczna część procedury, z największym ryzykiem uszkodzenia statku. - Kontynuuj delikatne wywieranie nacisku poprzez rozwarstwienie, aż między aortą a IVC zostanie utworzone przezroczyste okienko.
- Wykonaj rozwarstwienie wokół IVC bezpośrednio dystalnie od lewej żyły nerkowej. Aorta brzuszna jest połączona z IVC za pomocą powięzi, dlatego należy wykonać wstępną sekcję zarówno wokół IVC, jak i aorty brzusznej.
- Zakładanie szwów i podwiązanie IVC
- Przełóż odcinek jedwabnego szwu 6-0 pod IVC i aortą brzuszną.
- Zlokalizuj szew przez okienko utworzone między IVC a aortą. Użyj kleszczy, aby pociągnąć szew i nawlec go między aortę brzuszną a IVC. Ostrożnie przewlecz szew, starając się nie ciągnąć/nie przebijać IVC i aorty brzusznej.
- Wykonaj chirurgiczne podwiązanie wokół IVC za pomocą kleszczy do szwów, zapewniając całkowite zamknięcie żyły. Ponownie należy wykonać podwiązanie natychmiast dystalnie od lewej żyły nerkowej.
- Wykonaj trzy rzuty szwów, aby zabezpieczyć podwiązanie.
UWAGA: Możliwe jest również wprowadzenie szwu pod IVC i aortę przed ich rozdzieleniem jako alternatywna opcja. Alternatywnie można zastosować szwy 7-0 Prolene do podwiązania gałęzi bocznych i IVC.
- Zamykanie ran i opieka pooperacyjna
- Sprawdź, czy aorta brzuszna pozostała nieprzerwana i czy wszystkie boczne gałęzie zostały podwiązane. IVC będzie wyglądał na rozszerzony dystalnie od miejsca podwiązania i nie będzie widoczny przepływ krwi.
- Umieść cały tłuszcz otrzewnowy i jelita z powrotem w jamie brzusznej.
- Zamknij ranę za pomocą kleszczy do szwów i jedwabnego szwu 6-0. Użyj szwu biegowego (prostego ciągłego) i upewnij się, że szew nie będzie zbyt ciasny. Ciasny szew pęknie, gdy zwierzę obudzi się i zacznie poruszać się po klatce.
- Alternatywnie użyj klipsów PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon lub ze stali nierdzewnej do zamykania ran .
- Najpierw zszyj warstwę mięśni brzucha, stosując odpowiednią technikę wiązania szwów.
- Powtórz technikę szycia skóry i sprawdź, czy zamknięcie rany jest wystarczające.
UWAGA: Jeśli używasz tej samej igły i nici do szycia dla wielu zwierząt, sterylizuj je w 70% etanolu przed każdym użyciem. - Usunąć zwierzę z gazu znieczulającego i umieścić je w inkubatorze o temperaturze 34 °C na co najmniej 30 minut.
- Ponownie podawać podskórnie 0,2 - 0,5 ml płynów izotonicznych na 10 g masy ciała. W razie potrzeby płyny można podawać w kolejnych dniach, aby utrzymać przedoperacyjną masę ciała.
- Monitoruj zwierzę aż do wyzdrowienia, aby zapewnić udaną operację i ocenić ogólny stan zdrowia zwierzęcia.
ostrożność: Spodziewaj się lekko zgarbionej postawy w przypadku inwazyjnej procedury, takiej jak ta, ale zwierzę będzie zachowywać się normalnie już 30 minut po operacji. - Umieść zwierzę w jego własnej klatce i nie umieszczaj go z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.
- Ponownie podawaj leki przeciwbólowe codziennie przez okres do 48 godzin po przerwie.
- Umieść jedzenie na podłodze klatki dla zwierzęcia podczas rekonwalescencji. Inna szczególna ostrożność na ogół nie jest wymagana.
- Zbadaj miejsce rany pod kątem zaczerwienienia, obrzęku lub wydzieliny oraz wszelkich innych oznak infekcji.
- W razie potrzeby usuń szwy po 7 - 10 dniach.
- Eutanazję należy przeprowadzić natychmiast, jeśli operacja nie powiedzie się (np. znaczne uszkodzenie naczyń i/lub utrata krwi) lub stan zwierzęcia nie poprawi się po opiece pooperacyjnej. Eutanazja jest zwykle wykonywana po 48 godzinach. W przypadku dłuższych eksperymentów użyj 7-0 Prolene do podwiązania bocznych gałęzi oraz szwów IVC i 5-0 Vicryl do zamknięcia jamy brzusznej.
- Przeprowadzić eutanazję przez znieczulenie zwierzęcia w indukcji, jak opisano wcześniej, z wyjątkiem 5% izofluranu. Następnie następuje uduszenie 100% CO2 podczas znieczulenia.
- Po potwierdzeniu eutanazji przez uduszenie (utrata bicia serca i brak oddechu) należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić całkowitą eutanazję.
2. Protokół ultrasonograficzny wysokiej częstotliwości
UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z Lady Davis Institute Rodent Phenotyping Core SOP dla obrazowania ultradźwiękowego o wysokiej częstotliwości. Protokół ten jest przeprowadzany 24 godziny po operacji, ale można go wykonać wcześniej, o ile zwierzę dobrze reaguje na operację. Protokół można przeprowadzić w dowolnym momencie na zdrowych myszach i często robi się to w celu porównania przed i po operacji.
- Przygotowanie zwierząt
- Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i znieczul zwierzę mieszaniną 100% tlenu i 2,5% izofluranu.
- Włącz monitor tętna i temperatury. Umieść lampę grzewczą nad stołem, aby zwierzę było ciepłe podczas zabiegu.
- Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i nałóż smar do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Umieść zwierzę na platformie analitycznej i przymocuj rurkę znieczulającą do ust/nosa zwierzęcia.
- Podgrzej żel do ultradźwięków do temperatury 37 °C i umieść żel na brzuchu zwierzęcia. Żel ultradźwiękowy jest podgrzewany za pomocą systemu podgrzewania wody, który pompuje ciepłą wodę przez cewki owinięte wokół butelki żelu.
- W celu pomiaru tętna (w razie potrzeby) nałóż żel elektrodowy na 4 elektrody platformy analitycznej i przymocuj łapy zwierzęcia do platformy/elektrod za pomocą taśmy chirurgicznej. Umieścić zwierzę w pozycji leżącej w celu zobrazowania IVC. System obrazowania ultrasonograficznego zawiera platformę analityczną, która jest podgrzewana i zawiera elektrody do monitorowania zwierzęcia.
- W celu pomiaru temperatury nałóż żel elektrodowy na termometr i włóż do odbytnicy zwierzęcia.
- W razie potrzeby wyregulować lampę grzewczą i izofluran, aby zapewnić zwierzęciu komfort, oddychanie w zakresie 30 - 70 uderzeń na minutę i utrzymywanie go w temperaturze 37 °C.
- W razie potrzeby ogol brzuch zwierzęcia lub usuń włosy kremem do depilacji. Stosować przez 1 - 2 minuty i wytrzeć do czysta gazą i wodą destylowaną.
UWAGA: Zbyt dużo włosów może wpłynąć na jakość zdjęć. - Umieść gazę pod lub z boku zwierzęcia, aby złapać nadmiar żelu ultradźwiękowego.
- Obrazowanie IVC i skrzepliny
- Włącz oprogramowanie do obrazowania i rozpocznij nowe badanie.
- Wybierz odpowiednią głowicę skanującą do obrazowania. Zastosowana tutaj głowica skanująca jest przeznaczona do narządów jamy brzusznej (częstotliwość: 35 MHz, ogniskowa: 12,8 mm).
- Zapisz wszelkie istotne informacje o zwierzęciu. Może to obejmować identyfikator zwierzęcia, płeć, wagę, datę urodzenia, odmianę itp.
- Opuść głowicę skanującą w dół, aż dotknie żelu ultradźwiękowego na zwierzęciu.
- Uruchom sondę skanującą, aby rozpocząć obrazowanie 2D zwierzęcia. W tym trybie obrazy są prezentowane jako dwuwymiarowe, w różnych odcieniach szarości.
- Zlokalizuj IVC i aortę brzuszną, przesuwając platformę myszy w płaszczyźnie x i/lub y, jednocześnie przesuwając głowicę skanującą przez płaszczyznę z.
UWAGA: Pojawią się naczynia krwionośne z białymi ścianami i krwią w środku prawie czarną. Aorta brzuszna będzie intensywnie pulsować i mieć grubsze ścianki, podczas gdy IVC będzie miała cieńsze ścianki i będzie się łatwo kompresować/rozszerzać na ekranie obrazu, gdy głowica skanująca będzie poruszana w górę iw dół. Miejsce podwiązania będzie widoczne, ponieważ żyła zostanie rozszerzona, a ściana żyły dojdzie do punktu. Każda skrzeplina utworzona w środku będzie stała w obrazowaniu ultrasonograficznym i nie będzie się łatwo kompresować, tak jak robi to ściana żyły. Żyła ściska się tylko powyżej podwiązania, gdzie nie tworzy się skrzeplina. - Po zlokalizowaniu IVC i miejsca podwiązania, wyśrodkuj je w ognisku ultradźwięków, aby uzyskać najdokładniejszy obraz.
- Jeśli obraz jest zbyt ciemny, aby był wyraźnie widoczny, wyreguluj żel i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
- W razie potrzeby przechyl głowicę skanera o 45° w lewo lub w prawo i ponownie wyreguluj platformę zwierzęcia, aby wyraźnie widzieć żyłę. Odbywa się to w przypadku zakłóceń w głowicy skanującej. W tym scenariuszu żyła musi być zobrazowana pod kątem bocznym, aby uniknąć szwu.
UWAGA: Zakłócenia obrazu są najczęściej spowodowane ciemnymi plamami na skórze zwierzęcia, złym ułożeniem szwów na ranie lub pęcherzykami w żelu do ultradźwięków.
- Za pomocą oprogramowania można fotografować dowolne konstrukcje i dokonywać pomiarów za pomocą dowolnych narzędzi pomiarowych. Typowe pomiary obejmują pole przekroju skrzepliny lub szerokość miejsca podwiązania.
- Zmień tryb obrazowania na Doppler fali tętna, aby dokonać pomiarów przepływu krwi. Ten tryb umożliwia między innymi obrazowanie przepływu krwi w naczyniach krwionośnych i pomiar prędkości przepływu.
- Przechyl platformę analityczną, aby obniżyć tylny koniec zwierzęcia.
- Zmień kąt/położenie głowicy skanującej tak, aby stykała się z żelem pod kątem około 30° od tylnego końca zwierzęcia.
- Zmień położenie platformy dla zwierząt i głowicy skanującej. Przenieś IVC i podwiązanie, jeśli to konieczne.
- Wykonaj pomiary przepływu krwi wokół miejsca podwiązania, aby potwierdzić zastój i wykonaj dowolne żądane zdjęcia. Typowe pomiary przepływu krwi obejmują średnią prędkość, prędkość szczytową lub medianę prędkości.
- Zapisz wszystkie wykonane pomiary lub obrazy.
- Sprzątanie i odzysk zwierząt
- Podnieś głowicę skanera do pozycji początkowej i ustaw platformę zwierzęcia również w pozycji wyjściowej.
- Usuń nadmiar żelu ze zwierzęcia za pomocą gazy. Zrób to delikatnie, aby szew rany nie został pęknięty.
- Wyjmij termometr z odbytnicy zwierzęcia i zdejmij zwierzę z platformy.
- Umieścić zwierzę w klatce i inkubatorze o temperaturze 34 °C.
- Monitoruj zwierzę do czasu wyzdrowienia. Zabieg jest bardzo drobny i nieinwazyjny. Zwierzę szybko się obudzi. Kontynuować monitorowanie zwierzęcia w kolejnych dniach zgodnie z sekcją 1.6 niniejszego protokołu.
- Wyczyść platformę dla zwierząt gazą i środkiem dezynfekującym.
- Wytrzyj głowicę skanera gazą i wodą destylowaną.
ostrożność: Głowicę skanera należy czyścić bardzo delikatnie i wyłącznie wodą destylowaną. - Powtórz krok 2 dla następnego zwierzęcia.
- Jeśli zrobisz to ze wszystkimi obiektami, sprawdź, czy wszystkie obrazy i nagrania zostały zapisane. Następnie wyłącz cały sprzęt i oprogramowanie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Model zakrzepicy żylnej wywołanej zastojem
W modelu stazy myszy są znieczulane, a następnie wykonuje się nacięcie w celu odsłonięcia żyły głównej dolnej (IVC). Nacięcie wykonuje się po lewej lub prawej stronie ciała myszy zamiast laparotomii w linii pośrodkowej, aby nie zakłócać pracy głowicy ultradźwiękowej. Mięśnie brzucha oraz skórę odchyla się, aby odsłonić IVC (Rysunek 1). W pi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Istnieje kilka krytycznych etapów pomyślnego tworzenia się skrzepliny żylnej przy użyciu modelu zastoju. Indukcja zakrzepicy żył jest trudniejsza u starych myszy ze względu na nagromadzenie tłuszczu otaczającego żyłę główną dolną i aortę. Idealnie, myszy poddawane tej procedurze powinny mieć 8-10 tygodni. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie wywołać uszkodzenia śródbłonka w IVC podczas rozwarstwienia i podwiązania. Ponadto bardzo ważne jest, aby trzymać zwierzę w inkubatorze w temperaturze 34 °C przez co najmni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant z Heart and Stroke Foundation of Canada oraz przez The Morris and Bella Fainman Family Foundation. Autorzy pragną podziękować Veronique Michaud za jej pomoc techniczną przy VEVO770 systemie obrazowania ultrasonograficznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 6-0 Szew jedwabny do perma-ręki | Ethicon | 706G | |
| Narzędzia do nauki o nauce | 20830-00 | ||
| Kleszcze do wiązania szwów | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Kleszcze (proste i zakrzywione) | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Sterownik igieł | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Nożyczki sprężynowe Moria | Narzędzia do nauki | 15396-00 | |
| Strzykawki 1ml | Igły BD Biosciences | ||
| 26G | Becton Dickinson & Co. | ||
| VEVO 770 High Resolution Imaging System | Visualsonics | Nie jest już sprzedawany | |
| SR Buprenorphine | ZooPharm | Przekazany LDI przez Vet | |
| Surgery Mikroskop | Leica | Leica M651 | |
| Systan maść do oczu | Alcon | 288/28062-0 | |
| 2x2 sterylna gaza | CDMV | #104148 | |
| Bawełniana końcówka Aplikatory | z | ||
| hipoalergicznej taśmy chirurgicznej JGH Transpore | CDMV | #7411 | |
| Żel ultradźwiękowy (Aquasonic-100) | Dufort & Lavigne | #AKEN4061 | |
| Inkubator | firmy JGH | ||
| Isoflurane | Dispomed | ||
| Komora anestezjologiczna, węże i sprzęt administracyjny | Dispomed Depomed | ||
| Depilator | Nair | ||
| Podgrzewana woda twarda podkładka | Braintree Scientific, Inc. | #HHP-2 | |
| Pompa wodna nagrzewnicy Gaymar TP500 | MATVET Inc. | #R-500305 | |
| Lampa grzewcza na podczerwień | electrimat inc. | #1R175R-PAR | |
| Prope temperatury doodbytnicy myszy | emkaTECHNOLOGIES | ||
| Sterylna woda | Od JGH |
Bibliografia
- Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).
- McGuinness, C. L., et al. Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi. Thromb Haemost. 85 (6), 1018-1024 (2001).
- Singh, I., et al. Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells. Circulation. 107 (6), 869-875 (2003).
- Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits. Ann Nucl Med. 8 (3), 193-199 (1994).
- Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89 (2), 256-263 (2003).
- Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom. J Nucl Med. 41 (6), 1056-1064 (2000).
- Wakefield, T. W., et al. Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy. J Vasc Surg. 31 (2), 309-324 (2000).
- Robins, R. S., et al. Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice. Blood. 121 (4), 692-699 (2013).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis. Blood. 127 (6), 769-777 (2016).
- Laurance, S., et al. Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2017).
- Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. In vivo monitoring of venous thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (3), 447-452 (2012).
- Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).
- Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).
- Luther, N., et al. Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution. Circ Res. , (2016).
- Subramaniam, S., et al. Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development. Blood. 129 (16), 2291-2302 (2017).
- Diaz, J. A., et al. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104 (2), 366-375 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
