Izolacja ludzkich komórek śródbłonka z normalnego raka jelita grubego i raka jelita grubego - ulepszony protokół

Podsumowanie

Komórki śródbłonka guza są ważnymi determinantami mikrośrodowiska guza i przebiegu choroby. W tym miejscu opisano protokół izolacji czystych i żywotnych komórek śródbłonka z ludzkiego raka jelita grubego i normalnej okrężnicy, który ma być stosowany w testach narkotykowych i badaniach nad patogenezą.

Streszczenie

Pierwotne komórki wyizolowane z ludzkich nowotworów są cennymi narzędziami do identyfikacji mechanizmów chorobotwórczych przyczyniających się do rozwoju i postępu choroby. W szczególności komórki śródbłonka (EC) stanowiące wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych bezpośrednio uczestniczą w dostarczaniu tlenu, dostarczaniu składników odżywczych i usuwaniu produktów przemiany materii do i z guzów, a tym samym są wyraźnie zaangażowane w tworzenie mikrośrodowiska guza (TME). Komórki śródbłonka nowotworu (TEC) mogą być wykorzystywane jako biosensory komórkowe mikrośrodowiska wewnątrznowotworowego ustanowionego przez komunikację między komórkami guza i zrębu. TEC służą również jako cele terapii. W związku z tym w hodowli komórki te umożliwiają badania nad mechanizmami odpowiedzi lub oporności na leczenie antyangiogenne. Niedawno odkryto, że TEC wyizolowane z ludzkiego raka jelita grubego (CRC) wykazują efekty podobne do pamięciowych w oparciu o specyficzne TME, z którego pochodzą. Co więcej, te TEC aktywnie przyczyniają się do powstania specyficznego TME poprzez wydzielanie różnych czynników. Na przykład TEC w prognostycznie korzystnym Th1-TME wydzielają antyangiogenny czynnik supresyjny nowotworu wydzielający białko, kwaśny i bogaty w cysteinopodobne 1 (SPARCL1). SPARCL1 reguluje homeostazę naczyń oraz hamuje proliferację i migrację komórek nowotworowych. W związku z tym hodowle czystych, żywotnych TEC wyizolowanych z ludzkich guzów litych są cennym narzędziem do badań funkcjonalnych nad rolą układu naczyniowego w nowotworzeniu nowotworów. W tym miejscu opisano nowy, aktualny protokół izolacji pierwotnego EC od normalnej okrężnicy, a także CRC. Technika opiera się na mechanicznym i enzymatycznym trawieniu tkanek, znakowaniu immunologicznym i sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) komórek potrójnie dodatnich (CD31, VE-kadheryna, CD105). Dzięki temu protokołowi żywotne hodowle TEC lub normalnych komórek śródbłonka (NEC) mogą być izolowane z tkanek okrężnicy ze wskaźnikiem sukcesu 62,12% po poddaniu sortowaniu FACS (41 czystych kultur EC z 66 próbek tkanek). W związku z tym protokół ten zapewnia solidne podejście do izolowania ludzkich kultur EC od normalnej okrężnicy i CRC.

Wprowadzenie

Mikrośrodowisko guza (TME) definiuje się jako ścisłą interakcję komórek nowotworowych ze zrębem guza, który składa się z komórek takich jak komórki śródbłonka (EC), perycyty, fibroblasty, komórki mięśni gładkich lub komórki odpornościowe. Komunikacja między tymi przedziałami komórkowymi może być napędzana przez czynniki parakrynne (np. angiogenne czynniki wzrostu, cytokiny), przez macierz zewnątrzkomórkową lub bezpośredni kontakt komórka-komórka. Przedział zrębu może sprzyjać lub przeciwdziałać inicjacji lub progresji guza, w zależności od ustalonego TME.

Zdolność guza do łączenia się z systemem naczyń krwionośnych jest kluczem do postępu i przerzutów choroby. System naczyń krwionośnych umożliwia guzowi przede wszystkim dostęp do dostarczania tlenu i składników odżywczych, a także usuwanie produktów przemiany materii^1,2,3. EC stanowią wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych, a zatem są ważnymi składnikami komórkowymi, które aktywnie uczestniczą w tym procesie. Powszechnie wiadomo, że komórki śródbłonka nowotworu (TEC) różnią się od odpowiadających im normalnych komórek śródbłonka (NEC) wieloma cechami, takimi jak zaburzona hierarchia drzewa naczyniowego, nieszczelność naczynia lub zmniejszone dojrzewanie, czego przykładem jest zmniejszona liczba perycytów/komórek ściennych, które są tylko luźno związane z klasą EC4.

Stąd, TEC są cennymi narzędziami komórkowymi do badania kancerogenezy. Uważano, że TEC przede wszystkim sprzyjają wzrostowi i progresji guza³. W ten sposób TEC mogą być wykorzystywane jako bioczujniki, które umożliwiają monitorowanie i identyfikację procesów patogennych, które inicjują, sprzyjają lub przeciwdziałają nowotworom. Co więcej, są one celami terapeutycznymi w clinic⁵. W związku z tym wyizolowane TEC i odpowiadające im NEC mogą być również wykorzystywane jako narzędzia do zrozumienia mechanizmów odpowiedzi lub oporności na leczenie antyangiogenne.

W przeszłości opracowaliśmy protokół izolowania tych komórek^{6,7 i stwierdziliśmy,} że TEC nie tylko różnią się od NEC, ale także różnią się od siebie w zależności od TME, z którego pochodzą⁸. Dzięki temu podejściu wykazano, że TEC w niektórych TME mogą aktywnie przeciwdziałać wzrostowi i progresji guza poprzez wydzielanie antyangiogennych białek supresyjnych guza, takich jak SPARCL1. Wskazuje to, że TEC aktywnie przyczyniają się do ustanowienia prognostycznie korzystnego TME w ludzkim raku jelita grubego (CRC)⁸.

Poprzednie badania próbowały wyizolować ludzkie TEC z guzów litych. Ważnym celem tych badań była m.in. identyfikacja nowych markerów komórek śródbłonka nowotworu (TEMs)⁹. Zastosowano strategię natychmiastowego użycia TEC po mikrodysekcji laserowej w celu uniknięcia zmiany lub utraty fenotypu TEC w hodowli. Jednak badania uzupełniające zidentyfikowały zanieczyszczającą populację komórek ściennych jako poważną wadę tego podejścia¹⁰. Nasze laboratorium jako pierwsze opracowało protokół, który pozwolił na izolację czystych, żywotnych TEC od pacjentów z CRC^6,7. Wybrano podejście z wieloma rundami selekcji komórek magnetycznych (MACS) TEC, które zapewniło wysoką czystość izolowanych kultur EC. Takie podejście wymagało jednak stosunkowo długiego okresu uprawy (średnio 6 tygodni), co zwiększało ryzyko artefaktów wywołanych kulturą. W związku z tym, w kolejnym etapie, celem było skrócenie czasu uprawy między operacją a zbiorem pierwszej czystej kultury. Aby osiągnąć ten cel, opracowano ulepszony protokół wykorzystujący połączoną mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanek początkowego guza, a następnie sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) potrójnie znakowanego EC. Skróciło to czas izolacji średnio do trzech tygodni, co zaowocowało czystymi hodowlami TEC i NEC o zwiększonej żywotności w badaniach funkcjonalnych. Izolacja czysto żywotnych kultur TEC i NEC z tkanek ludzkich o wysokim wskaźniku powodzenia może otworzyć nowe możliwości testowania leków specyficznych dla pacjenta podczas opracowywania zindywidualizowanych schematów terapii. Podejście oparte na izolacji zostało szczegółowo opisane w poniższych punktach.

Protokół

Proces izolacji został zatwierdzony przez lokalną komisję etyczną Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Erlangen (#159_15 B, TuMiC-study). Kryteria włączenia pacjenta były następujące: CRC, UICC stadium I-IV, brak historii nieswoistego zapalenia jelit i brak leczenia neoadjuwantowego.

1. Chirurgia i przygotowanie tkanki do izolacji pojedynczej komórki

1. Próbkę należy pobrać chirurgicznie od pacjenta z rakiem jelita grubego (tkanka raka >0,5 g, centralny guz niemartwiczy; normalna tkanka okrężnicy >10 cm od miejsca guza).
2. Uzyskane fragmenty tkanek to przeważnie <1 g dla raka, ale >1 g dla normalnej okrężnicy. W przypadku uzyskania kawałków o masie >1 g, należy je podzielić na wiele kawałków o masie 1 g za pomocą świeżego skalpela w celu dalszej obróbki tkanek.
   UWAGA: Jeśli fragment tkanki nowotworowej jest mniejszy niż 0,5 g od początku, izolacja zwykle kończy się niepowodzeniem.
3. Zebrać świeże, nieutrwalone kawałki tkanek za pomocą sterylnych kleszczy w 40 ml lodowatego zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) uzupełnionego penicyliną/streptomycyną/amfosferycyną B (1% HBSS-pen/strep/ampho) w 50-mililitrowych probówkach wirówkowych i szybko przenieść je do laboratorium.
   UWAGA: Tkanka jelita grubego jest często silnie zanieczyszczona bakteriami/grzybami od samego początku. Podczas całej procedury izolacji, do wszystkich roztworów należy dodać wstrzykiwacz/paciorkowiec/amfo w celu wyeliminowania organizmów skażających.
4. Umyć każdy fragment tkanki co najmniej 4 razy za pomocą 40 ml lodowatego długopisu HBSS/paciorkowca/ampułki (patrz krok 1.3) w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml, przenosząc kawałki tkanki sekwencyjnie z jednej probówki wirówkowej do następnej probówki za pomocą sterylnych kleszczy.
   1. Czyste kleszcze po każdym kroku z 70% etanolem.
   2. Użyj oddzielnych kleszczy do raka i normalnych fragmentów tkanki okrężnicy.
   3. Zważ wszystkie kawałki tkanki.
      UWAGA: Nie kładź kawałków tkanek bezpośrednio na wadze do ważenia. Po umyciu zważyć ostatnią probówkę wirówkową zawierającą tkankę przed i po wprowadzeniu kawałków tkanki. Oblicz wagę poszczególnych fragmentów tkanki przez odejmowanie.

2. Generowanie zawieszenia pojedynczej komórki

Uwaga: Zaleca się, aby tkanka była zawsze nawilżona.

1. Jeśli istnieje, usuń przyczepiony tłuszcz, inną tkankę nienowotworową lub potencjalnie martwicze części tkanki z próbki chirurgicznej, przenosząc fragmenty tkanki na sterylną szalkę Petriego do hodowli komórek za pomocą sterylnych kleszczy.
   1. Utrzymuj kawałki tkanek nawilżone przez cały czas, dodając 3-5 ml HBSS-pen/strep/ampho.
   2. Przytnij kawałki tkanki za pomocą świeżego, sterylnego skalpela (Rysunek 1). Skonsultuj się z patologiem w przypadku, gdy identyfikacja tkanek jest niejasna.
2. Zmiel pozostałą tkankę na małe kawałki (około 2 × 2 × 2 mm³) za pomocą świeżego skalpela z zakrzywionym ostrzem. Przenieść fragmenty tkanek za pomocą sterylnych kleszczy do probówek dysocjacyjnych tkanek (na przykład probówek gentleMACS C) wstępnie napełnionych wstępnie podgrzaną (37 °C) pożywką do hodowli komórkowych (zmodyfikowana pożywka podstawowa Dulbecco Eagle Medium [DMEM]) zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Staraj się używać skalpela jak narzędzia do kołysania. Nie ściskaj komórek, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
3. Trawić/dysocjować fragmenty tkanek za pomocą dysocjatora tkanek (takiego jak dysocjator gentleMACS Octo) w połączeniu z zestawem do dysocjacji guza dla tkanki ludzkiej za pomocą programu "37C_h_TDK_1" zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Odwirować probówki dysocjacyjne przez 1 minutę przy 300 x g w temperaturze pokojowej (RT).
5. Dodać 10 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) DMEM uzupełnionego 0,5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (DMEM-Low) do każdej probówki za pomocą pipety serologicznej i przefiltrować zawiesinę komórkową za pomocą sitka do komórek (wielkość porów 100 μm) na wierzchu probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, pipetując zawiesinę komórek na górze filtra.
6. Dodać ponownie 10 ml DMEM-Low do każdej probówki MAC za pomocą pipety serologicznej i przenieść pozostałe komórki do sitka komórkowego na górze probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
7. Raz przemyć sitko do komórek dodatkowymi 10 ml pożywki DMEM-Low za pomocą pipety serologicznej.
8. Odwirować zawiesinę komórek przez 7 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
9. Zawieś komórki w 5 ml wstępnie podgrzanego śródbłonka podłoża podstawnego (EBM)-2-mikronaczyniowego (MV) (Lonza) uzupełnionego wstrzykiwaczem/paciorkowiec/amfo w tej samej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
10. Zawiesina komórek płytkowych w kolbie do hodowli komórek T-25 wstępnie pokryta przez noc 1,5% soli fizjologicznej buforowanej żelatyno-fosforanową (PBS) w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
11. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} dokładnie umyć komórki około 5 ml PBS i dodać 5 ml świeżej pożywki.
12. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ aż do 80-90% zbiegu (zwykle 5 - 7 dni) z 48-godzinnymi przerwami na odnowienie pożywki.

3. FACS-sortowanie komórek śródbłonka

UWAGA: Staraj się unikać utraty komórek w dowolnym momencie, np. ograniczając procedurę barwienia do inkubacji komórek w pojedynczej probówce z odczynnikiem.

1. Odłączyć komórki z 1 ml akutazy (około 10 min) i dodać 4 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki EBM-2-MV.
2. Określić liczbę komórek za pomocą automatycznego urządzenia do liczenia komórek (zakres 10 - 25 μm).
3. Odwirować zawiesinę komórek przez 4 minuty z 250 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
4. Ponownie zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym buforze FACS (1x PBS, 2,5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 5 mM EDTA pH 8,0, 10 μM Y-27632) zgodnie z liczbą komórek (5 x 10⁶/ml).
5. Dodać przeciwciała barwiące FACS w zależności od liczby komórek/objętości buforu FACS: CD31-FITC (100 μL/ml = 1/10), CD144/naczyniowa śródbłonek (VE)-kadheryna-PE (100 μL/ml = 1/10), CD105-APC (25 μL/ml = 1/40), mieszać i inkubować przez 7 minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem; delikatnie strzepnąć i inkubować przez kolejne 8 minut (do całkowitego czasu inkubacji 15 min).
6. Dodać 2 ml buforu FACS do znakowanej zawiesiny komórek za pomocą pipety serologicznej.
7. Wirować przez 4 minuty z 250 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
8. Przemyć dwa razy, dodając 2 ml buforu FACS, a następnie przeprowadzić wirowanie przez 4 minuty przy 250 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
9. Zawiesić komórki w 500 μl wstępnie podgrzanego EBM-2-MV-pen/strep/ampho i przenieść komórki do urządzenia sortującego FACS.
   1. Komórki śródbłonka szybko umrą podczas procesu sortowania, jeśli instrument FACS zostanie schłodzony. W związku z tym należy przeprowadzić sortowanie komórek śródbłonka w temperaturze pokojowej, a następnie natychmiast przenieść pobrane komórki do inkubatora w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Instrument FACS jest zwykle niesterylny!
10. Sortuj/zbieraj potrójnie dodatnie komórki bezpośrednio do naczynia do hodowli komórkowych (np. 24-dołkowej płytki wstępnie pokrytej przez noc 1,5% żelatyną-PBS) wypełnionej 0,5 ml wstępnie podgrzanej świeżej pożywki (EBM-2-MV-pen/strep/ampho).
    UWAGA: Sprawdź zawiesinę komórek po sortowaniu za pomocą mikroskopu. Jeśli komórki grupują się razem, spróbuj uzyskać równomierny rozkład komórek w naczyniu do hodowli komórkowych, mieszając je powoli lub dodając pożywkę.
11. Hodować komórki do 90 - 100% zbiegu z 48-godzinnymi przerwami na odnawianie pożywki i roznywać komórki do pożądanej wielkości szalki hodowlanej (płytka 24-dołkowa → 12-dołkowa → szalka 3,5 cm → T-25 → T-75).

4. Pobieranie i charakterystyka czystych komórek śródbłonka

1. Zbierz komórki przy 90 - 100% zbieżności i scharakteryzuj je odpowiednią metodą (np. FACS, cytochemia, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR) lub testy funkcji komórek śródbłonka^7,8).
2. Analizuj izolowane komórki za pomocą dowolnej wybranej metody charakterystyki.

Wyniki

Opisano tutaj izolację NEC i TEC z ludzkiego CRC poprzez połączoną mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki, a następnie FACS-sortowanie sterowane markerami CD31/CD105/VE-cadherin (Rysunek 1A). Niniejszy protokół stanowi ulepszoną metodę z krótszym czasem oczekiwania do pierwszego zbioru czystych, żywych komórek śródbłonka w porównaniu do poprzedniego protokołu opartego na MACS⁷.

Komórki NEC i TEC wyizolowano z ludzkiego CRC w następujących krokach: (1) przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek poprzez połączoną mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki oraz hodowla tych komórek do 80 - 90% konfluencji (Rysunek 1), (2) potrójne znakowanie EC przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami CD31/CD105/VE-cadherin oraz (3) sortowanie FACS odpowiednich komórek potrójnie dodatnich (Rysunek 2A). Warto zaznaczyć, że krytycznym krokiem dla sukcesu procedury izolacji i żywotności komórek jest szybkie poddanie materiału chirurgicznego procedurze izolacji (przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek <1 godzina po resekcji). Dzięki sortowaniu FACS wyizolowano średnio 12 500 TEC (n = 12) i 17 800 NEC (n = 12, Rysunek 2B, lewa strona), co stanowiło średnio 3,6 i 5,6% całkowitej populacji komórek (Rysunek 2B, prawa strona). Następnie komórki namnażano do osiągnięcia poziomu T-75 (określonego jako pasaż 1), po czym je zbierano lub poddawano dalszej analizie. Należy odnotować, że przy zastosowaniu poprzedniego protokołu opartego na MACS osiągnięto średnią skuteczność izolacji na poziomie 49,6% (n = 58 czystych TEC z n = 117 pacjentów⁸), a czyste kultury EC były dostępne średnio 6 tygodni po operacji. Stosując nowy protokół oparty na FACS opisany w niniejszej pracy, pierwsze czyste kultury EC uzyskano średnio 3 tygodnie po operacji, przy skuteczności izolacji wynoszącej 62,1% (n = 41 czystych kultur EC uzyskanych z n = 66 zawiesin pojedynczych komórek poddanych sortowaniu FACS). Tym samym osiągnięto wzrost wskaźnika izolacji o 12,5% przy jednoczesnym skróceniu czasu hodowli z 6 do 3 tygodni. Redukcja czasu hodowli doprowadziła do poprawy żywotności komórek i wydłużenia ich czasu życia, co wiązało się z mniejszą ekspozycją na indukcję potencjalnych artefaktów zależnych od hodowli w ugruntowanych kulturach.

Charakterystykę czystości EC przeprowadzono w pierwszej kolejności za pomocą cytochemii CD31 (Rycina 3A). Jeśli hodowle były wolne od komórek CD31-ujemnych (Rycina 3A, TEC i NEC), poddano je bardziej szczegółowemu typowaniu komórkowemu za pomocą ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) (Rycina 3B). Wykorzystano startery specyficzne dla typów komórek: EC (CD31, CD105, VE-cadherin oraz czynnik von Willebranda [vWF]), leukocytów (CD45), komórek nabłonkowych (cytokeratyna [CK]-20) oraz komórek mięśni gładkich/fibroblastów (dezmina) (Rycina 3B). Dzięki temu typowaniu opartemu na qPCR można wykryć potencjalne zanieczyszczenie hodowli EC innymi komórkami w zakresie 0,1 - 2%, w zależności od typu komórek⁸.

Warto zauważyć, że wcześniej zgłosiliśmy preferencyjną utratę ekspresji białka vWF w kulturach TEC w porównaniu z odpowiadającymi im kulturami NEC⁷. Wyniki te można potwierdzić za pomocą nowo opracowanego protokołu izolacji (Rysunek 3C, średnia utrata Ct NEC-TEC = 0,687, p = 0,173, test t-Studenta dla prób zależnych). Kultury, które pomyślnie przeszły te kontrole jakości, zostały przetestowane pod kątem zakażenia mykoplazmami, a następnie wykorzystane w dalszych eksperymentach.

Rysunek 1: Czyste komórki śródbłonka mogą zostać wyizolowane z prawidłowej okrężnicy człowieka oraz z CRC za pomocą sortowania FACS. (A) Schemat blokowy kluczowych etapów procesu izolacji EC. (B) Tkankę tłuszczową (żółta), inne części nietumorowe lub potencjalnie martwicze fragmenty tkanki (brązowe) usunięto z materiału chirurgicznego (panel lewy i środkowy), a następnie guz rozdrobniono na sześciany o długości boku 2 - 3 mm przed dysocjacją tkanki (panel prawy). (C) Zawiesinę pojedynczych komórek otrzymaną po dysocjacji tkanki (panel lewy) inkubowano przez 24 h w naczyniach hodowlanych. Następnie komórki nieprzylegające usunięto poprzez delikatne przemywanie PBS (panel środkowy), a komórki namnażano do osiągnięcia 80 - 90% konfluencji przed sortowaniem FACS (panel prawy). Obrazy w dolnym panelu (C) uzyskano za pomocą mikroskopii fazokontrastowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Średnio 3,6 - 5,6% komórek w zawiesinie pojedynczych komórek wyizolowanych od pacjentów z ludzkim CRC i posortowanych metodą FACS stanowiły potrójnie dodatnie EC. (A) NEC i TEC zostały posortowane metodą FACS przy użyciu potrójnego znakowania komórek przeciwciałami anty-CD31, -CD105 i -VE-cadherin. (B) Za pomocą sortowania FACS (komórki dodatnie dla CD31, CD105 i VE-cadherin, panel lewy) z ludzkiego prawidłowego jelita grubego lub CRC można wyizolować średnio 12 500 TEC (n = 12) i 17 800 NEC (n = 12), co stanowi średnio 3,6 i 5,6% (panel prawy) całkowitej użytej populacji komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: NEC i TEC z ludzkiego CRC wykazują ekspresję typowych markerów komórek śródbłonkowych. Normalne komórki śródbłonka jelita grubego (NEC, n = 10) oraz nowotworowe komórki śródbłonka (TEC, n = 10) z ludzkiego CRC są pozytywne dla CD31 (marker EC), CD105 (marker EC), VE-cadherin (marker EC) i vWF (marker EC) oraz negatywne dla CK20 (marker komórek CRC), desminy (marker fibroblastów/SMC) i CD45 (marker leukocytów), co określono za pomocą (A) immunocytochemii CD31 (komórki pozytywne = czerwone) oraz (B) RT-qPCR (punkty danych poniżej przerywanej linii to próbki zidentyfikowane jako negatywne). (C) Ekspresja vWF określona za pomocą RT-qPCR dla odpowiadających próbek TEC/NEC od tych samych pacjentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Do tej pory do wyizolowania czystych i żywotnych NEC i TEC z ludzkich tkanek stałych zastosowano głównie trzy różne metody, a mianowicie: (1) wzbogacanie immunomagnetyczne, (2) mikrodysekcja laserowa i (3) sortowanie frakcji EC za pomocą FACS. W większości publikacji stosowano immunomagnetyczne wzbogacanie komórek po wytworzeniu zawiesiny pojedynczej komórki w procesie rozpadu mechanicznego 11,12,13. Na przykład immunomagnetyczne oczyszczanie ludzkiego mikronaczyniowego EC skóry (HDMEC) za pomocą przeciwciał E-selektyny po leczeniu czynnikiem martwicy nowotworów (TNF) α z napletków^{noworodków 13} opisano w celu izolacji ludzkiego EC z glejaka przez trawienie tkankowe, gradient perkolu i selekcję przy użyciu przeciwciał anty-CD31/CD105 i VE-kadheryny¹² lub przeciwciał anty-CD105 z ludzkiego raka piersi¹¹. Protokoły, w których stosowano mikrodysekcję laserową lub sortowanie FACS, były rzadziej zgłaszane. Mikrodysekcję laserową wykorzystano na przykład do identyfikacji potencjalnych markerów komórek śródbłonka guza (TEM) w EC pochodzących z ludzkiego raka jelita grubego z analizą komórek bezpośrednio po sekcji⁹. Sortowanie FACS przy użyciu przeciwciał anty-CD31 udało się zademonstrować w celu wyizolowania frakcji EC z niezróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych¹⁴.

Podejścia te mają różne zalety i wady, które należy wziąć pod uwagę. Zaletą podejścia opartego na immunomagnetyzmie jest to, że nie jest wymagany skomplikowany sprzęt, selekcję można przeprowadzić w dowolnym momencie, a wzbogacanie komórek jest szybkie (około 15 minut) w porównaniu z sortowaniem FACS (około 1 godzina). Brak macierzy przez dłuższy okres czasu może indukować śmierć komórki EC przez anoikis. W związku z tym zastosowano dodanie inhibitora kinazy rho Y-27632 do buforu FACS w celu zapobieżenia anoikis¹⁵ komórek.

Wadą wzbogacania immunomagnetycznego jest to, że w celu osiągnięcia czystości powyżej 99% wymagane jest wiele rund selekcji. Co więcej, hodowla komórek między wzbogaceniami jest wymagana do regeneracji komórek, co zwiększa wiek kultur wspierających artefakty wywołane kulturą. Mikrodysekcja laserowa ma tę zaletę, że komórki mogą być natychmiast wykorzystane, co zmniejsza artefakty wywołane hodowlą, ale obejmuje ryzyko zanieczyszczenia przez komórki z sąsiednich obszarów tkanek¹⁰. Co więcej, mikrodysekcja nie jest ustalana w każdym laboratorium. Do wad podejścia opartego na sortowaniu opartym na FACS należą, podobnie jak w przypadku mikrodysekcji laserowej, to, że sprzęt jest skomplikowany i kosztowny. W związku z tym ten sprzęt może nie być dostępny w dowolnym momencie. W warunkach klinicznych, w których nie można dokładnie zaplanować dostępności tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, może to stanowić dodatkową wadę.

Jednak głównymi zaletami sortowania FACS jest to, że frakcja EC może być znakowana równolegle przez wiele przeciwciał. W ten sposób można zastosować rygorystyczną strategię bramkowania, która zapewni wysoką czystość. Z doświadczenia wynika, że nie było wymagane ponowne sortowanie frakcji EC, w przeciwieństwie do poprzedniego protokołu opartego na MACS, w którym trzeba było zastosować wiele rund selekcji. Doprowadziło to do znacznego skrócenia czasu hodowli do uzyskania czystości z sześciu tygodni (podejście MACS) do trzech tygodni w podejściu FACS, co zaowocowało poprawą żywotności komórek, umożliwiając wydłużenie okna czasowego analizy. Wreszcie, stosując strategię opartą na sortowaniu opartym na FACS, można było osiągnąć poprawę ogólnego wskaźnika powodzenia izolacji (wzrost o 12,5%). Podsumowując, strategia oparta na sortowaniu FACS, wykorzystująca 3 przeciwciała równolegle po trawieniu tkanek przez połączone mechaniczne i enzymatyczne trawienie tkanek, miała wiele zalet, które sprawiły, że protokół ten stał się metodą z wyboru do izolacji TEC i NEC z ludzkiego raka jelita grubego i okrężnicy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HBSS 1x	Gibco firmy Life Technologies	14175-053
Penicylina-streptomycyna	Gibco firmy Life Technologies	15140-122
amfoterycyna B	Gibco firmy Life Technologies	15290-026
Skalpele, jednorazowe	pióro	nr 23
gentleMACS dysocjator octo	Miltenyi Biotec	130-095-937
GentleMACS C-tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
do dysocjacji ludzkich guzów	Miltenyi Biotec	130-095-929
DMEM	Gibco firmy Life Technologies	21969-035
EGM-2-MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Sitko do komórek, 100 i mikro; m	Falcon	352360
Mostek Pro Accutase	Gibco by Life Technologies	A11105-01
Licznik komórek, automatyczny	licznik redlic	Z1
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503
CD31-FITC	BD Pharmingen	555445
CD144/VE-cadherin-PE	BD Pharmingen	560410
CD105-APC	BD Pharmingen	562408
żelatyna ze skóry bydlęcej	Sigma-Aldrich	G9391
FACS-Urządzenie sortujące	Beckman Coulter	MoFlo XDP